Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta sen sivuvaikutuksia, doketakseli (DTX) on edelleen ensilinjan hoitoa vastaan kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC). Siksi strategiat kasvattaa antituumoriteholla ja vähentää sen sivuvaikutuksia kriittisesti tarvitaan. Kohdistaminen konstitutiivisen Endoplasmakalvosto (ER) stressi syöpäsoluissa on tutkittavana kuin Chemosensiti- lähestymistapaa. Oletimme, että samanaikainen induktio ER-stressi ja tukahduttaminen PI3K /AKT selviytymisreittiin tulee tehokkaampaa lähestymistapaa. Vuonna CRPC solulinjassa, C4-2B, havaitsimme merkittävää (p 0,005) tehostaminen DTX aiheuttaman sytotoksisuuden seuraavat coexposure jotta thapsigargin ja AKT-estäjällä. Koska nämä kaksi agenttia eivät kliinisesti hyväksytty, me tutkimme, yhdistelmä nelfinaviiria (NFR) ja curcumin (CUR), joka tunnetaan kohdistaa molemmat metaboliareitit, voidaan samalla lisätä DTX sytotoksisuuden CRPC soluissa. 24 tunnin kuluessa altistuksen jälkeen fysiologisiin pitoisuuksia NFR (5 uM) ja CUR (5 uM) merkittävästi (p 0,005) parannettu sytotoksisuus oli ilmeistä, joilla on alhainen pitoisuus DTX (10 nM). Tämä 3-lääkeyhdistelmä lisääntynyt nopeasti apoptoosin aggressiivinen C4-2B soluissa, mutta ei RWPE-1 soluissa tai ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen (PrEC). Vertaileva molekyyli tutkimukset paljastivat, että tämä 3-lääkeyhdistelmä aiheutti selvempi tukahduttaminen fosforyloidun-AKT ja korkeammat induktion fosforyloitu-eIF2α in C4-2B-soluissa, verrattuna RWPE-1-soluja. Akuutti altistus (3-9 tuntia) tähän 3-lääkeyhdistelmä tehostettua ER-stressin aiheuttama proapoptoottisten markkereita eli ATF4, CHOP ja TRIB3. Paljon pienempinä pitoisuuksina, krooninen (3 viikkoa) saamiset Näistä kolmesta aineesta rajusti pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (CFU) by C4-2B soluja.

In vivo

tutkimuksissa, joissa käytettiin hiiriä, jotka sisältävät C4-2B tuumoriksenografteja osoittivat merkittävää (p 0,05) lisääminen DTX: n (10 mg /kg) tuumorin vastaista tehoa seuraavat coexposure on NFR (20 mg /kg) CUR (100 mg /kg). Immunohistokemiallista (IHC) analysoi kasvaimen ilmoitetuissa laski Ki-67-värjäys ja lisääntynyt TUNEL intensiteetti hiirillä on 3-lääkeyhdistelmän. Siksi subverting ER-stressi kohti apoptoosin avulla apuaine hoidon NFR ja CUR voi chemosensitize CRPC solut DTX terapia.

Citation: Mathur A, Abd Elmageed ZY, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel- Mageed AB, et ai. (2014) subverting ER-stressi kohti Apoptoosi Nelfinaviiria ja Curcumin Coexposure täydentää Doketakselia Teho kastraatio Kestää eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10,1371 /journal.pone.0103109

Editor: Allen Gao, UC Davis Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 tammikuu 2014; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 14 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tukivat avustuksia puolustusministeriön, DEM (# PC080811) ja A.B.A. (# PC081598), ja varoja Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten Yhdysvalloissa. Alkukäsittelykustannukset lokalisoitu kasvainten koostuu leikkaus ja säteily, jonka jälkeen androgeenien puute hoitoa (ADT). Kuitenkin ADT vaikuttaa vain keskimäärin 18-24 kuukautta, ja toistumisen kastraation resistenttien eturauhassyövän (CRPC) sanelee sairastuvuutta ja kuolleisuutta potilailla [1]. Vaikka uudempi ja tehokkaampi androgeenireseptorin (AR) antagonistit, esim. MDV-3100 (enzalutamide), ovat osoittaneet joitakin lupaus, vastus on jo kohdannut klinikalla [2]. Siksi kemoterapian kanssa taksaanien edelleen huume potilaiden aggressiivisten ja metastaattinen CRPCs. Kuitenkin turvallinen ja tehokas strategia lisätä tehoa taksaanien edustaa tyydyttämättömiä kliinisen tarpeen.

Doketakseli (DTX), mikrotubulusten vastainen aine, hyväksyttiin US FDA on tärkein hoitoa vastaan ​​CRPC [3 ]. Vaikka aluksi tehokasta, DTX-pohjainen hoito on vasta osoittanut mediaanielossaolosta 18-20 kuukautta ja vaste oli ainoastaan ​​50%. Lisäksi DTX osoittaa merkittäviä haitallisia vaikutuksia potilaille, joilla on samanaikaisia ​​edellytyksiä, jotka toimeksiannon annoksen pienentämisen, mikä lisää mahdollisuutta valinta resistenttien kloonien. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että vastustuskyvyn kehittyminen pitkäaikaisen hoidon DTX voi esiintyä johtuen säätelyä PI3K /AKT signalointi CRPC soluissa [4], [5]. Siksi downregulation PI3K /AKT signalointi CRPC soluissa tulisi lisätä tehoa tämän kemoterapeuttisen aineen [6].

Aggressiivinen syöpäsolut ovat myös omiaan pakenemasta kemoterapiaa moduloimalla master säätelyreittejä jotka sanelevat niiden selviytyminen tai kuolema päätös tekeminen kykyjä. Tältä osin valvonta proteiinin translaation kautta upeasti säännellyn ER-stressi Cascade on osoitettu edistävän tuumorisolun eloonjäämistä ja paeta apoptoosin [7]. Suora yhteys aggressiivinen kasvain fenotyyppi ja lisääntynyt ilmentyminen ER-stressi markkeri, BiP /Grp78, on dokumentoitu [8] – [10]. Itse asiassa useat viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että ER-stressi voi helpottaa pysyviä kasvaimen kasvua ja niiden terapeuttista vastus. Siksi tutkijat ovat ehdottaneet, että kohdentaminen ER-stressi voi olla voimakas Kemoherkistävien strategia [11] – [13]. Wu et ai, (2009) osoittivat, että ER-stressi indusoija methylseleninic happoa (MSA) herkistää PC-3-soluja sytotoksisia vaikutuksia paklitakselin ja DTX [11]. Luonnolliset yhdisteet kuten epigallokatekiinigallaattia, joka on polyfenoliyhdistepitoisuus vihreää teetä, voi parantaa kemoterapia tehoa glioblastoomasoluissa lisäämällä ER-stressi [14]. Kuitenkin tehoa samanaikaisesti alas-säätely PI3K /AKT selviytymisreittiin ja ylössäätely ER-stressin aiheuttaman apoptoosin niin voimakas Chemosensiti- lähestymistapa ei ole testattu.

Tutkimukset osoittavat selvästi rajat välisten neuvottelujen useiden signaalitransduktioteitä jotka säätelevät solujen kohtalo päätökset, ER-stressi induktio syöpäsoluissa [7], [15] (viitataan kuvioon. 1A on kuvattu yksityiskohtaisesti). Lievä taso ER-stressi aktivoi selviytymisen vastaus nimeltään taitettuna Protein Response (UPR). Kuitenkin vakava ER-stressi heikentää tätä UPR kohti pro-apoptoottisen reitin, joka sanelee ilmentymistä ER-stressin aiheuttama transkriptiotekijöille ATF4 ja CHOP, ja ER-stressin aiheuttama kuolema anturi TRIB3. Mielenkiintoista, lievissä ER-stressi, alhainen TRIB3 tasot toimivat negatiivisena säätelijänä ATF4 ja CHOP joka suosii solujen eloonjäämistä. Kuitenkin aikana vaikean ER-stressi, korkea ATF4 ja CHOP lisätä TRIB3 ilmaisun ja rinnakkaisen tukahduttaminen AKT, jotka suosivat apoptoosin [16] – [18]. Siksi TRIB3 näyttää toimivan masterina ”molekyyli kytkin” hengissä

vs.

Kuoleman signalointi syöpäsoluissa meneillään ER-stressi (Fig. 1 B). Näin ollen, farmakologiset aineet, jotka indusoivat korkeat TRIB3 tasoilla on herkistää syöpäsolut kemoterapiaa.

(A). Normaaleissa homeostatic olosuhteissa ATF6, IRE1 ja PERK proteiinit ovat sitoutuneet BiP /Grp78 ER kalvo. Avatun proteiinivaste (UPR) vapauttaa nämä ER-stressi antureiden BIP. Vapautetaan ATF6 siirtyy tumaan laajentaa XBP-1-geenin ilmentymisen. Parallel aktivointi IRE1 mahdollistaa silmukoinnin XBP-1-mRNA: n, joka koodaa transkriptiotekijää, joka stimuloi useiden stressin indusoima geenien. Julkaistu PERK aktivoi eIF2α, joka sitten estää käännöksen cap-riippuvaisten proteiinien edelleen suojaamaan soluja UPR etenemistä. Siten cross-neuvottelut näiden ER-stressi muuntimet toimivat rinnakkais- väyliä helpottamaan solujen eloonjäämistä ja palauttaa solujen homeostaasin jälkeen lieviä ja ohimeneviä ER-stressi. Kuitenkin alle pitkittynyt tai vaikea ER-stressi, korkki riippumaton käännös ATF4 jatkuu. Nuclear ATF4 tasoja purkamaan solun homeostaasin tehostamalla ilmentymistä ER-stressi kuolema antureita, CHOP ja TRIB3. (B). TRIB3 toimii ”molekyyli kytkin”, joka määrää solun eloonjäämistä tai solukuolemaan päätöksiä seuraavista ER-stressi. Alhainen TRIB3 toimintojen kautta negatiivista palautetta silmukan tukahduttaa ATF4 ja CHOP ilmaisun, mikä mahdollistaa solujen eloonjäämistä (vasen paneeli). Kuitenkin korkea TRIB3 alas-säätelee AKT selviytymisreittiin, mutta ei tukahduttaa ATF4 ja CHOP joka edelleen tuottaa hallitsemattomasti tasoja TRIB3. Tämä epätasapaino heikentävät UPR ja ER-stressi vastaukset selviytymisen tila kohti apoptoosin (oikea paneeli).

Thapsigargin (Tg), tunnettu ER-stressi indusoija, voivat herkistää PC-3-solujen sekä paklitakselin ja DTX [11]. Lisäksi AKT-estäjällä (Akti-IV) voidaan herkistää sekä HeLa- ja SKOV3-solulinjoja sisplatiinin ja etoposidin [19]. Nämä kokeelliset yhdisteitä ei voida käyttää potilailla, koska ne ilmenevät merkittävä

in vivo

toksisuutta [11], [19]. Lisäksi kliininen hyväksytään uusia aineita, jotka turvallisuustavoitteet AKT ja ER-stressi olisi kallis ja aikaa vievä prosessi. Tässä suhteessa lääkeaine uudelleensijoitus on tulossa erittäin palkitsevaa syöpälääkkeen ja Kemoherkistävien strategia [20]. Olemme tutkineet, onko kaksi hyväksyttyä farmakologiset aineet, eli nelfinaviiri ja kurkumiini, joka tunnetaan kohdistaa ER-stressi ja AKT polkuja, voidaan lisätä DTX: n tuumorin vastaista tehoa vastaan ​​CRPC soluja.

nelfinaviiri (NFR) on yksi ensimmäisistä HIV-1-proteaasi-inhibiittorit (HPI) on kliinisesti hyväksytty [21], [22], ja se on tällä hetkellä sijoitetaan uudelleen kuin syövän vastaisen aineen, ja (ClinicalTrials.gov). Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että NFR voi sekä chemosensitize ja radiosensitize erilaisia ​​kasvainsoluja [23] – [28]. Sen herkistävät vaikutukset on liitetty induktioon ER-stressi ja esto AKT-reitin [28]. Todellakin, ritonaviiri, toinen HPI kanssa samanlainen vaikutusmekanismi, osoitettiin myös parantaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on DTX on erittäin aggressiivinen PCa solulinja, DU-145 [29]. Kuitenkin herkistävä vaikutus NFR vain esillä pitoisuuksina ≥10 uM, joka on korkeampi kuin sen turvallinen ja fysiologisesti saavutettavissa tasoilla, eli 4,5-6 uM [30], [31]. Siksi yhdistelmä NFR toiseen turvallinen yhdiste, joka vastaavasti on suunnattu ER-stressi ja AKT reitit voivat olla tehokkaampia.

Curcumin (CUR) on aktiivinen komponentti

Curcuma longa

, Itä -Indian kasvi. Tämä phytochemical on tunnettu tulehdusta ja syövän ominaisuuksia ja useat laboratoriot tutkivat sitä n käyttökelpoisuus kemoterapian lisänä [32]. Itse asiassa, CUR on osoitettu estävän PI3K /AKT-reitin ja aiheuttavat pieniä määriä ER-stressi, erityisesti syöpäsoluja [33], [34]. Keuhkojen syöpäsoluja, CUR osoittivat synergististä antituumorivaikutuksia yhdistettynä DTX [35]. Äskettäin CUR osoitettiin myös laukaista solukuolema paksusuolen syövän soluihin ER-stressiä autophagy [36]. Kuitenkin samanlainen NFR,

in vitro

Kemoherkistävien vaikutukset CUR näkyivät vain suurilla pitoisuuksilla (≥10 uM), joka on vaikea saavuttaa

in vivo

[37], [38 ]. Siksi me arveltu, että CUR ja NFR yhdistelmää tulee voimakkaasti lisätä yksittäisten Kemoherkistävien kykyjä.

Tutkimukset käyttäen C4-2B soluja (a CRPC solulinja) osoitti merkittävästi lisääntynyt antituumoriteholla DTX seuraavista coexposure on NFR ja CUR . Mekanistisesti tämä 3-lääkeyhdistelmä synergized tukahduttaa AKT ja aiheuttaa ATF4, CHOP ja TRIB3 tasolla. Sekä

in vitro

ja

in vivo

toteaa selvästi sekaantumaan potentiaali adjuvanttihoito fysiologisesti saavutettavissa pitoisuuksia NFR ja CUR lisäämään tehoa DTX CRPC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

C4-2B soluja, luun metastaattinen CRPC alilinja johdettu LNCaP, oli ystävällinen lahjoitus tri Leland Chung laboratoriossa (Emory University) [39] . Nämä solut kasvatettiin RPMI-1640-media (Cellgro, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä antibiootti liuosta (Cellgro). RWPE-1-soluissa, ei-tuumorigeeninen ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan kuolemattomiksi ihmisen papilloomaviruksen (HPV-18), saatiin American Type Culture Collection (ATCC, # CRL-11609). Nämä solut kasvatettiin keratinosyyttien seerumivapaassa (K-SFM), johon on epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja naudan aivolisäkeuutetta, kaikki Invitrogen-yhtiöstä hankitut (Carlsbad, CA). Primäärisistä ihmisen eturauhasen epiteelisolut (PrEC) saatiin ATCC: stä (# PCS-440-010) ja viljeltiin eturauhasen epiteelisolujen ruselatusaineeseen ja lisäykset (ATCC, # PCS-440-030 ja # PCS-440-040). Bone Marrow mesenkymaaliset kantasolut (BM-MSC: t) saatiin kantasolujen ydin laitokseen Tulanen yliopistossa (New Orleans, LA) ja viljeltiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 20% FBS: ää ja antibiootteja. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa, kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

Reagenssit

Nelfinaviirimesylaattia (NFR) jauhetta uutettiin ja puhdistettiin 250 mg: n tabletteja ( Agouron lääkkeet, San Diego, CA). Curcumin (CUR) saatiin yhtiöltä Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Doketakseli (DTX) ja Thapsigargin (Tg) saatiin Sigma (St. Louis, MO) ja AKT-inhibiittorin (Akti-IV, luettelonro. 124005) saatiin yhtiöstä Calbiochem (Billerica, MA). Sillä

in vitro

tutkimuksissa kaikki lääkkeet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Ensisijainen vasta-aineita koko-AKT ja fosfo-AKT yhteensä eIF2α ja fosfo-eIF2α, ja ihmisen BiP /Grp78, PARP ja CHOP, olivat kaikki ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Vasta-aineet ihmisen TRIB3 ja ATF4 oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), vasta-aine ihmisen β-aktiini Fisher Scientific (Waltham, MA) ja vastaan ​​Ki-67 oli Spring Biosciences (Pleasanton, CA). Kaikki toissijainen vasta, kuten vuohen anti-hiiri, vuohen anti-kani ja naudan anti-vuohi, ostettiin kaikki Santa-Cruz Biotechnology.

solunelinkykyisyysmääritys

MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] määritystä käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden altistumisen jälkeen testiyhdisteet [40]. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Halutut pitoisuudet yhdisteitä, yksin tai erilaisina yhdistelminä, lisättiin soluihin 3 jäljitellä kuoppiin. Jälkeen 24-72 tunnin inkuboinnin, MTT: tä (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan ja formatsaanikiteet havaittiin violetti väri. Eloonjäämisprosentteina laskettiin mittaamalla absorbanssi 540 nm: ssä käyttäen μQuant levylukijaa Bio-Tek (Seattle, WA).

DNA: n fragmentoituminen määrityksen

DNA pirstoutuminen määritys suoritettiin edellinen julkaistut tutkimukset [41]. Lyhyesti, solut 10 cm: n kudos–jelmämaljaa käsiteltiin halutut pitoisuudet DTX, NFR ja CUR, yksinään ja yhdistelmänä. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua solun lyysipuskuria {0,2% Triton-X 100, 10 mM Tris-CI (pH 7,4) ja 10 mM EDTA (pH 8,0)}, jota seuraa käsittely 100 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma ) ja 0,5 mg /ml proteinaasi-K: n (Sigma). Alhaisen molekyylipainon DNA uutettiin lisäämällä yhtä suuret tilavuudet fenolia, kloroformia ja isoamyyli- alkoholia (25:24:1) ja lisäksi kloroformilla ja isoamyylialkoholia (24:1). Uutettua DNA: ta saostettiin etanolilla (300 mM NaCl ja 100% jääkylmää etanolia), liuotettiin uudelleen 1 X TE (tris /EDTA) puskurilla ja elektroforeesi 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia (0,1 ug /ml). DNA pirstoutuminen visualisoitiin UV-valon avulla Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, Hercules, CA).

kaspaasi-3 määritys

EnzChek kaspaasi-3 määritys Kit (Molecular Probes; Eugene, OR) havaitsee apoptoosin mittaamalla proteolyyttisen amino-metyylikumariinin (AMC) johdettu fluoresoiva substraatti, Z-DEVD-AMC. Lyhyesti, solut 10 cm petrimaljoihin hoidettiin DTX, NFR ja CUR, yksin ja yhdessä. Solut kerättiin 24 tuntia, hajotettiin, ja kaspaasi-3-määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti protokollia. Mean fluoresenssivoimakkuudet mitattiin käyttämällä Flx800 mikrolevylukijaa (BioTek) heräte ja emissioaallonpituudet vahvistaa 360 ± 20 nm: n ja 460 ± 20 nm.

Western immunodetektioon

kokosolulysaateista kerättiin eri ajankohtina (30 min 9 tuntia) jälkeinen altistuminen DTX, NFR ja CUR hoitoja käyttäen 1X soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Proteiinit kvantitoitiin käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Thermo Scientific, Rockford, IL). Noin 30 ug proteiinia fraktioitiin päälle 10% SDS-PAGE-geeleillä Bio-Rad (Hercules, CA) ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla kalvoja, joissa on lohko-CH kemiluminesenssi esto (Millipore) ja hybridisoitiin haluttu primaaristen vasta-aineiden (1:1,000 laimennos) yli yön + 4 ° C: ssa ja sitten HRP-leimatun sekundaarisen vasta-aineita (1:5,000 laimennos) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssin (ECL) ja SuperSignal West Pico alustan (Thermo Scientific). Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttäen Image-J ohjelmisto (NIH) ja densitometristen arvo kullekin proteiinia normalisoitu vastaavaksi β-aktiini tasot kunkin näytteen.

pesäkkeitä muodostavien yksiköiden määritys

C4- 2B-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoihin 200 solua /malja. Drugs, yksin tai yhdistelmänä, lisättiin sen jälkeen 48 tunnin ja käsittelyt tehtiin 3 rinnakkaista kuoppiin. Sekä NFR ja CUR saivat täydennystä kahdesti viikossa ja DTX täydennettiin kerran viikossa yhdessä tuoretta kasvualustaa. Kolmen viikon kuluttua pesäkkeet kiinnitettiin 100% etanolilla ja värjättiin metyleenisinistä, ja pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) laskettiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

-tuumoriksenografti tutkimukset

Kaikki koemenettelyn joissa laboratorioeläinten tehtiin mukaisesti NIH ohjeiden ja hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Tulanen yliopistossa (IACUC; Protocol # 4295).

in vivo

antituumorivaikutuksen tehosta DTX, yksin tai yhdessä NFR ja CUR, määritettiin tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa nude-hiirissä (NCI, Frederick, MD). Kunkin hiiren (4 viikon ikäisiä), C4-2B-soluja (2 x 10

6) suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan seerumittomassa elatusaineessa ja injektoitiin ihonalaisesti (sc) yhdessä 100 ui Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 50-75 mm

3 (~ 2 viikkoa injektion jälkeen), eläimet satunnaistettiin hoitoon joko vehikkelillä, DTX (10 mg /kg), tai DTX (10 mg /kg) + NFR (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) intraperitoneaalisesti (ip) injektiolla. Ennen kutakin injektiota, lääkkeet juuri liuotetaan niiden ajoneuvojen [23], [43], [44]. DTX annettiin kerran viikossa, ja NFR ja CUR annettiin 5 päivää /viikko. Kasvaimen koot mitattiin kahdesti viikossa käyttäen mikrometrillä ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa, 0,5 x pituus x leveys

2 [45]. Paino kunkin hiiren mitattiin ja suhteet kasvaimen tilavuus koko painon laskettiin kunakin ajankohtana. Kasvaimet leikattiin lopussa hoidon aikana (4 viikkoa), parafinoidut ja leikattiin immunohistokemiallista (IHC) värjäys.

immunohistokemia

Kasvaimet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin 24 tuntia, minkä jälkeen 70% etanolilla ja sitten upotettiin parafiiniin. Osiot (-5 pm) leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Madison, WI), käytettiin määrittämään apoptoottisten solujen kasvaimen kohdissa, mukaan valmistajan protokollia. Tämä määritys mittaa biotinyloitua nukleotidin sisällyttäminen DNA, joka sitten visualisoidaan HRP-leimatulla streptavidiinilla ja DAB. Värjäys visualisoitiin Eclipse E-400 mikroskoopilla ja kuvat otettiin kiinni 4 eri alojen kunkin kasvaimen osassa.

Synergy määritys

CalcuSyn- ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, UK) käytettiin laskemiseen yhdistelmä indeksi (CI), joka perustuu Chou-Talalay menetelmä [46]. Tämä menetelmä perustuu mediaani-vaikutus yhtälö, joka sisältää Michaelis-Menton, Hill ja Henderson-Hasselbalch yhtälöitä ja antaa kvantitatiivisen mittauksen lisäaineen (CI = 1), synergistinen (CI 1) tai antagonistiset (CI 1) vaikutuksia.

tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin kanssa GraphPad Prism versio-4.00 Software (San Diego, CA, USA). Tulokset ilmaistaan ​​keskivirhe välineet (± SEM). Merkittävät muutokset valvonnan määritettiin kaksisuuntaista Studentin t-testiä ja p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Yhdistetty altistuminen Thapsigargin ja AKT-estäjä herkistää C4 2B solut DTX aiheuttama sytotoksisuuden

Vastatakseen meidän keskeinen hypoteesi, että samanaikainen kohdentaminen ER-stressi ja AKT väyliä johtaa Chemosensiti- of CRPC soluja, ensin tutki Tg ja Akti-IV coexposure voi herkistää C4 2B-soluja DTX-indusoidun sytotoksisuuden (Fig. 2A). Vaikutukset huumeiden lisääntyneen pitoisuudet ja aika vastuita ensin seurattiin MTT-määrityksissä. Klo 72 tunnin altistumisen jälkeen, IC

50-arvot DTX, Tg ja Akti-IV oli 35,8 nM, 80,8 nM ja 5,5 uM (taulukko S1 File S1). Mahdollisia synergiavaikutuksen lääkeyhdistelmän Sitten tutkittiin käyttämällä pitoisuuksia pienempi kuin niiden IC

50-arvot. Coexposure tutkimukset osoittivat selvästi, että yhdistelmä DTX (10 nM), Tg (25 nM) ja Akti-IV (2,5 uM) aiheutti merkittävän (p 0,0005) vähenee C4-2B solujen eloonjäämistä, verrattuna DTX yksin ( kuva 2B). Tulevaisuuden tutkimusta suoritettiin tutkia coexposure kahteen turvalliseen ja hyväksyttyjä aineita, ts NFR ja CUR, voidaan samalla lisätä DTX herkistymiseen C4-2B soluja.

(A). Samanaikainen induktio ER-stressin Thapsigargin (Tg) ja suppressio AKT jota Akt-estäjä (Akt-I) voi tehdä syöpäsolujen alttiita sytotoksinen vaikutus kemoterapiaa. (B). Sytotoksisia vaikutuksia DTX, yksin tai yhdessä Tg ja /tai Akt-I, on C4-2B solujen elinkykyä. Coexposure Tg (25 nM) ja Akt-I (2,5 uM) tehostettu DTX (10 nM) indusoi sytotoksisuutta 72 tunnin altistumisen jälkeen (n = 3). Virhe pylväät edustavat ± SEM arvoja ja merkittävät erot esitetään P-arvot (***, p 0,0005).

Coexposure fysiologisesti-saavutettavissa pitoisuudet NFR CUR herkistää C4-2B solujen DTX aiheuttama sytotoksisuuden

IC

50-arvot DTX, NFR tai CUR laskettiin altistumisen jälkeen yksittäisiä lääkkeitä 24, 48 ja 72 tunnin (taulukko S1 File S1 ). Keskittymä ja aikariippuvainen tukahduttaminen solujen eloonjäämisen (MTT-määritys) havaittiin. Myöhemmissä tutkimuksissa, osa-IC

50 lääkeaineiden pitoisuuksia käytettiin 2- tai 3 lääkkeen yhdistelmiä ja solujen eloonjäämistä tarkkailtiin eri solutyypeissä, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, ( C) BM-MSC: n ja (D) PrEC (Fig. 3). Vaikka 24 tunnin IC

50 DTX, NFR ja CUR yksinään osoitettiin olevan 590,5 nM, 30,3 uM ja 59 uM, vastaavasti kasvanut merkittävästi (p 0,0005) in C4-2B sytotoksisuutta havaittiin, kun DTX oli käytetään yhdessä NFR ja CUR. Mielenkiintoista on, että nopea sytotoksisuus havaittiin C4-2B-soluissa ei ollut ilmeistä, että ei-tuumorigeenisen RWPE-1-soluja tai primäärisiä soluja, eli BM-MSC: ja PrECs. Yhdistelmä-indeksi (CI) analyysi osoitti arvo 0,045 on C4-2B-soluissa, mikä viittaa siihen, voimakas synergistinen vaikutus 3-lääkeyhdistelmän. Kuitenkin, CI-arvot RWPE-1-soluja ja BM-MSC havaittiin olevan paljon suurempi, eli 0,527 ja 0,639, vastaavasti. Lisäksi CI arvo PrEC soluissa oli 2,074, mikä viittaa antagonistinen vaikutus. Samanlaisia ​​tutkimuksia toisessa aggressiivinen PCa solulinja, PC-3, osoitti myös merkittäviä (p 0,0005) lisäys DTX herkistyminen seuraavissa coexposure sekä NFR ja CUR (taulukko S1 File S1 ja Fig. S1A File S1). Mielenkiintoista kuitenkin, toisin kuin C4-2B soluissa, huumeiden synergistisyyttä PC-3-solujen todettiin vain 72 tuntia hoidon jälkeen. Yhdessä nämä tulokset osoittivat selvästi, että coexposure on NFR ja CUR voivat nopeasti ja synergistisesti lisätä DTX aiheuttamaa sytotoksisuutta että CRPC linjan C4-2B, mutta ei ei-tuumorigeenisen linja, RWPE-1. Siksi molekyylitason mekaaniset tutkimukset tehtiin rajaamiseksi ero toimia tämän 3-lääkeyhdistelmä molemmissa solulinjoissa.

sytotoksiset vaikutukset DTX (10 nM), yksin ja yhdessä NFR (5 uM) ja /tai CUR (5 uM), on esitetty seuraavissa neljässä solutyyppejä, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, (C) PrEC ja (D) BM-MSC: t. Solujen elinkelpoisuus määritykset tehtiin 24 tuntia altistuksen jälkeen ja prosentuaalinen muutos solun eloonjäämisen, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kontrolli), määritettiin. MTT-määrityksissä suoritettiin 3 rinnakkaisnäytettä kuoppiin ja kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme riippumatonta kertaa (n = 3). Virhe pylväät edustavat ± SEM ja merkittäviä eroja DTX-vain ja DTX + NFR + CUR ryhmä esitetään P-arvot (***, p 0,0005; **, p 0,005).

Differential vaikutukset NFR CUR yhdistelmä DTX aiheuttaman apoptoosin C4-2B ja RWPE-1-soluissa

valvotaan, onko ero sytotoksisuutta C4-2B

vs.

RWPE1 solujen käsittelyn jälkeen 3-lääkeyhdistelmä johtuu eroista apoptoosin (Fig. 4). Cellular apoptoosin arvioitiin useita tekniikoita, kuten DNA: n fragmentoituminen (Fig. 4A 4B), kaspaasi-3: lla indusoi AMC tuotanto (Fig. 4C 4D) ja PARP pilkkominen (Kuva. 4E 4F). DNA pirstoutuminen testi osoitti, että sellaisia ​​lääkkeitä ei indusoinut apoptoosia; kuitenkin, kasvu tikapuunmuodostuksen rakenteessa oli selvää, kun DTX yhdistettiin joko NFR tai CUR ja apoptoosi entisestään kanssa 3-lääkeyhdistelmä. Vaikka samankaltainen DNA: n fragmentoituminen kuvioita näkyivät RWPE-1-soluissa, AMC määritys selvästi osoittanut merkittävästi korkeamman kaspaasi-3 aktiivisuutta C4-2B soluissa verrattuna RWPE-1-soluissa. Kumpikaan NFR eikä CUR yksinään havaittiin lisäävän AMC tuotantoa; kuitenkin niiden yhteenlaskettu altistus suureni kaspaasi-3: n aktiivisuuden, ja tämä näkyi myös ilman DTX yhteiskäsittely. Lisäksi vaikka NFR tai CUR yksin voi lisätä kaspaasi-3 aktiivisuutta DTX altistetuissa soluissa, merkittävimmät nousua havaittiin, kun sekä NFR ja CUR käytettiin yhdessä DTX (vertaa raidat 5 ja 8). Tiedot PARP pilkkominen määrityksissä edelleen vahvisti ero vaikutusta lääkkeen yhdistelmä apoptoottisen solukuoleman. Vuonna C4-2B soluissa, 9-kertainen nousu havaittiin kuluessa 9-tunnin altistuksesta; kuitenkin vain 2,3 kertainen nousu nähtiin RWPE-1-soluissa. Näin ollen, altistuminen NFR ja CUR syvästi lisää DTX-indusoidun apoptoosin C4-2B soluja.

Apoptoosin indusointi C4-2B (A, C, D) ja RWPE-1 (B, E, F) solut käsittelyn jälkeen DTX (10 nM), yksin ja yhdessä NFR (5 uM) ja /tai CUR (5 uM) arvioitiin DNA-pirstoutuminen (A ja B), kaspaasi-3-määritys (C ja E ) ja PARP pilkkominen (D ja F). DNA-pirstoutuminen ja kaspaasi-3 määrityksissä esittävät apoptoosin 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Muutokset PARP pilkkominen mitattiin 9 tuntia altistuksesta. Laddering- kuvio fragmentoitunutta DNA: ta oli osoitus apoptoosin, mikä vahvistettiin edelleen lisääntynyt AMC vapautuu aktivoitu kaspaasi-3 (n = 3) (*, p 0,05). Expression sekä kokonais- ja halkaistut PARP määritettiin western blot määrityksiä. Nuolet osoittavat halkaistut PARP tasoilla. Kertamuutoksia PARP pilkkominen huumeiden altistetuissa soluissa (kaistat 2-8) verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kaista 1) on esitetty seuraavat normalisoinnin vastaavan β-aktiini tasot.

yhdistetyn hoidon DTX, NFR CUR kumotaan PI3K /AKT signalointia C4-2B soluissa

purkaa taustalla olevien mekanismien mukana Chemosensiti- jonka 3-lääkeyhdistelmä, western immuunidetektio tutkimuksia tehtiin seurattava sekä AKT aktivointia ja ilmaus useiden ER- vaurion merkkiaineiden (Fig. 5 ja Fig. S2 File S1). Alustavat tutkimukset tehtiin seurata aikaa ja annoksesta riippuva vaikutus DTX, yksin tai yhdessä NFR ja /tai CUR, että C4-2B soluissa (Kuva. S2 File S1). Määrittää niiden ajallisia vaikutuksia AKT-signalointireitin, C4-2B soluja valotettiin ensin lääkkeitä 30 min 6 tuntia ja sitten stimuloitiin insuliinin kaltainen kasvutekijä-1 (IGF1, 10 ng /ml) 15 minuuttia. Sekä yhteensä AKT (t-AKT) tasot ja AKT fosforyloituu seriini-473 (p-AKT) määritettiin. Verrattuna stimuloituihin soluihin, p-AKT kasvoi 3-4-kertaiseksi seuraavien IGF1 stimulaation (ei esitetty). Vuonna C4-2B soluissa, p-AKT tukahduttaminen näkyivät 30 min altistuksen, ja oli selvästi sisällä sisällä 3 tuntia. Mielenkiintoista, vaikka DTX yksinään lisäsi p-AKT tasoilla 30 min, kasvusta AKT selviytymisreittiin ei havaittu soluissa coexposed on NFR CUR. IGF-1 indusoi p-AKT tasot olivat lähes lakkautettiin 6 tunnin jälkeinen lääkealtistuksen (Fig. S2A File S1). Kumpikaan pitoisuus eikä aika lääkealtistuksen pystyi muuttamaan koko AKT (t-AKT) tasot joko solutyypissä.