Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme osoittaneet, että estämällä CXCR4 voi olla voimakas antimetastaattisia hoidon CXCR4 liittyviä suun syöpä. Koska CXCR4 antagonistit ovat nykyään kliinisessä käytössä aiheuttaa liikkeelle hematopoieettisten kantasolujen, jatkuvaa antamista estäjänä varten etäpesäke voi aiheuttaa pysyvää leukosytoosi. Tässä tutkimuksessa tutkimme uusien terapeuttisten myötävirtaan kohde (t) SDF-1 /CXCR4 järjestelmässä käytetään B88-SDF-1-solut, jotka ovat autokriini SDF-1 /CXCR4 järjestelmän ja näytteille etäinen metastaattinen potentiaali

vuonna vivo

. Microarray-analyysi paljasti, että 418 geenit yläreguloituja B88-SDF-1-soluissa. Olemme tunnistaneet geeni, joka on erittäin ylössäädelty B88-SDF-1-soluissa, metabotrooppisten glutamaattireseptorien 5 (mGluR5), joka oli vaimentua hoidon jälkeen 1,1 ’- [1,4-fenyleenibis (metyleeni)] bis-1,4 , 8,11-tetra octahydrochloride (AMD3100), joka on CXCR4-antagonisti. Säätely mGluR5 mRNA SDF-1 /CXCR4 järjestelmä pääasiassa säätelee Ras-ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 kautta. Lisäksi kasvu B88-SDF-1-soluissa ei ollut vaikutusta mGluR5-agonisti (S) -3,5-DHPG (DHPG) tai mGluR5-antagonistien 2-metyyli-6- (fenyylietynyyli) pyridiini (MPEP) ja 3- ((2-metyyli-1,3-tiatsol-4-yyli) etynyyli) pyridiini (Mtoe). Olemme kuitenkin havaittu, että DHPG edistänyt B88-SDF-1 solumigraatio, kun taas sekä MPEP ja Mtoe esti B88-SDF-1 solumigraation. Arvioida lääkkeen toksisuus, antagonisteja injektoitiin intraperitoneaalisesti immunokompetenteilla hiirillä ja 4 viikkoa. Hiiriä, joihin injektoitiin MPEP (5 mg /kg) ja Mtoe (5 mg /kg) ei esiintynyt mitään sivuvaikutuksia, kuten hematotoxicity, allergisia reaktioita tai laihtuminen. Annon antagonistit estivät merkittävästi etäpesäkkeiden B88-SDF-1-solujen keuhkoihin nude-hiirissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että estämällä mGluR5 antagonisteilla, kuten MPEP ja Mtoe voisi estää etäpesäkkeiden CXCR4 liittyvien suusyövän aiheuttamatta sivuvaikutuksia.

Citation: Kuribayashi N, Uchida K, Kinouchi M, Takamaru N, Tamatani T, Nagai H, et al. (2013) The Role of Metabotrooppiset glutamaattireseptori- 5 on stroomakasvaimet Cell-Derived Factor-1 /CXCR4 System Oral Cancer. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10,1371 /journal.pone.0080773

Editor A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 06 lokakuu 2013; Julkaistu 13 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Kuribayashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B, 24792225, https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aiemmin osoittaneet, että B88-solut, suun syöpäsolut ilmentävät kemokiinireseptoria CXCR4, erityisesti etäispesäkkeitä kaulan imusolmukkeet kautta stroomasolulinja eristetyn hyytymistekijä (SDF) -1 kaltevuus tuottama imusuonten strooman [1-3]. Pakko-ilmentyminen SDF-1 B88-soluissa (nimeltään B88-SDF-1-solut) Siirretään parannettu soluliikkuvuus ja keuhkojen etäpesäkkeet laskimonsisäisen rokotus [4]. Viime aikoina olemme myös osoittaneet, että CXCR4 lauseke myötävaikuttaa metastaattisen potentiaalin sylkirauhasten syövät [5]. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että esto CXCR4 1,1 ’- [1,4-fenyleenibis (metyleeni)] bis-1,4,8,11-tetra octahydrochloride (AMD3100), joka on CXCR4-antagonisti, voi olla voimakas anti -metastatic hoito CXCR4 liittyvän pään ja kaulan alueen syöpä [5,6].

SDF-1 /CXCR4 järjestelmä lähinnä toimii kemotaktinen tekijä syöpäsolujen päästä metastaasien. Kuitenkin jotta voidaan luoda etäpesäkkeitä, useita tärkeitä prosesseja, kuten invaasio, intravasation, ekstravasaatio ja kohdunulkoinen kasvupotentiaalia, ovat välttämättömiä. Näin ollen on tärkeää tutkia toimintaa alavirran kohde (s) vastaa perustamista etäpesäkkeiden SDF-1 /CXCR4 järjestelmä. Lisäksi viimeaikaiset kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että yksi anto AMD3100 tehokkaasti liikkeelle Veren kantasolut, vaikka AMD3100 eliminoituu nopeasti joiden arvioitu jakautumisen puoliintumisaika 0,3 tuntia ja terminaalinen puoliintumisaika 5,3 tuntia [7, 8]. Kuitenkin tehokas CXCR4 liittyviä antimetastaattisia hoitojen saattaa vaatia päivittäistä hallintoa AMD3100 jatkuvasti estämään migraation premetastatic solujen metastaasien, joka voi aiheuttaa kroonisen leukosytoosi. Jos alavirrassa oleva kohde-geeni (t) SDF-1 /CXCR4 järjestelmä nimenomaan ilmaistu syöpäsoluissa havaittiin, on odotettavissa, että anti-metastaattinen hoito saattaa suorittaa turvallisemmin ja tehokkaammin. Kuitenkin kohdegeenin (t) SDF-1 /CXCR4-järjestelmä ei täysin ymmärretä. Näin ollen tässä tutkimuksessa tutkimme uusien terapeuttisten myötävirtaan kohde (t) SDF-1 /CXCR4 järjestelmä B88-SDF-1-solut, jotka ovat autokriini SDF-1 /CXCR4 järjestelmän ja näytteille etäinen metastaattinen potentiaali in vivo, käyttäen cDNA mikrosirut [4].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Hiiret käsitellään suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden yliopiston Tokushima (Luvan numero: 10084). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

cDNA mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA cDNA mikrosiruanalyysi uutettiin seerumia B88-mock-solut ja B88-SDF-1-soluissa. Applied Biosystems Kemiluminesenssiin RT-IVT Labeling Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) käytettiin muuntamaan koko RNA digoksigeniinilla (DIG) -leimattuna cRNA. Yksi ug kokonais-RNA: ta käytettiin tuottamaan kaksijuosteisen cDNA: n. CDNA transkriptoidaan DIG-leimattuja nukleotideja (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi), hajanaista ja hybridisoitiin ihmisen genomin Survey Array (Life Technologies) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pesun jälkeen kunkin matriisin, signaali kehitettiin käyttämällä kemiluminesenssiosoitusta kit (Life Technologies). Jalostettu taulukot skannattiin 1700 kemiluminesenssi mikrosirulla analysaattori (Life Technologies). Nämä tulokset analysoitiin käyttämällä GeneSpring GX 12,5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA) ohjelmistoja. Toiminnallinen analyysi IPA tunnistettu biologisia toimintoja tai sairauksia, jotka olivat merkittävimmät tietojen joukko. Fischer tarkkaa testiä käytettiin laskemiseen p-arvo määrittää todennäköisyys, jokainen biologinen toiminta tai sairaus osoitettu, että datasarja johtui mahdollisuus yksin. Microarray raakadata on talletettu Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) mukaan vähintään tietoa microarray kokeilu (MIAME) ohjeet. Hakunumerolla on GSE50507.

Solut ja soluviljelmä

B88-solut perin perustettiin potilaalta, jolla kielen syöpä [1] ja katsotaan mykoplasmaa ja bakteerikontaminantteja. Soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä kostutetussa atmosfäärissä 95 % ilmaa ja 5% CO2, 37 ° C: ssa.

Glutamaatti määritys

yhteensä 5 x 10

6 solua ympättiin 100 mm astiat (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Medium korvattiin DMEM ilman L-glutamiinia ja FCS 24 tunnin kuluttua. Vielä 24 tunnin viljelyn jälkeen elatusaine kerättiin talteen, ja 100 ui analysoitiin kanssa Amplex® Red glutamiinihappo /glutamaattioksidaasin Assay Kit (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssi mitattiin Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 530 nm: n virityksellä ja 590 nm fluoresenssidetektiolla.

Hiiret ja in vivo

C3H /kana hiiret ja BALB /c-nude-hiiriä hankittiin CLEA Japan (Osaka, Japani) ja ylläpidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa. Kokeellisessa kemoterapiaa, C3H /HeN-hiiriä käytettiin kontrollina immunokompetenteilla hiirillä [9], ja käsiteltiin päivittäin joko ihon alle (sc) injektioilla AMD3100 (2,5 mg /kg; Sigma) [5,6] tai intraperitoneaalisesti (ip) injektiot 2-metyyli-6- (fenyylietynyyli) pyridiiniä (5 mg /kg; MPEP, Tocris Bioscience, Bristol, UK) [10], 3 – ((2-metyyli-1,3-tiatsol-4-yyli) etynyyli ) pyridiiniä (5 mg /kg; Mtoe; Calbiochem, San Diego, CA, USA) [10], tai sama tilavuus suolaliuosta. Hiiret käsiteltiin AMD3100 tapettiin päivänä 1, 14 ja 28, ja hiiret hoidettiin MPEP tai Mtoe tapettiin päivänä 1, 7, 14, 21, ja 28. Kaikki hiiret tapettiin exsanguination natrium- pentobarbitaalianestesiassa ja täydellinen veren laskea suoritettiin käyttäen ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Tokio, Japani) on Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japani). Sillä etäpesäkkeiden määritystä, 1 x 10

6 B88-SDF-1-solut ympättiin suonensisäisesti (i.v.) ennen hoitoa aineilla. Hiiret tapettiin 30 päivän kuluttua soluinokulaation, ja keuhkot extirpated ja jakaa kahtia. Puolet keuhkojen vahvistettiin histopatologista analyysiä ja värjättiin H-E ja toinen hajotettiin kvantitatiivista analyysiä käyttäen Alu-PCR. Alukkeet, joita käytettiin Alu-PCR oli halu-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, halu-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. Gene yleiskäyttöön mitattiin jatkuvasti ABI PRISM 7000 Sequence Detection System for 35 sykliä käyttämällä THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japani).

RT-PCR

Solut viljellään kuten yksikerroksia otettiin talteen subkonfluenssin. 24 tunnin kuluttua, RNA eristettiin TRIzol reagenssia (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-PCR mGluR5 ja glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) mRNA suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 94 ° C 2 min; sitten 30 sykliä 94 ° C 1 min, 60 ° C 1 min ja 72 ° C 1 min; ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 1 min. Alukesekvenssit ihmisen mGluR5 ja GAPDH olivat seuraavat: mGluR5-UP: 5′-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 ’, mGluR5-DN: 5′-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3′, GAPDH-UP: 5’-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ’, ja GAPDH- DN: 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 ’. Kvantitatiivista RT-PCR, tutkimme ilmaus mGluR5 ja GAPDH jonka

Δ

ACt menetelmällä. mGluR5 ja GAPDH mRNA ilmaistaan ​​samanaikaisesti Taqman

TM Gene Expression Analyysit (Life Technologies) mukaan valmistajan ohjeiden. Gene tiettyjä tuotteita jatkuvasti mitattiin ABI StepOnePlus Real-Time PCR System aikana 40 PCR-sykliä.

virtaussytometrianalyysin

logaritmisesti kasvavat solut trypsinoitiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi (V /V) jäillä 10 minuutin ajan. Solut pestiin ja niitä inkuboitiin anti-mGluR5-mAb (laimennus 1: 100; R TOCRIS) [12], 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe. 24 tunnin kuluttua solut värjättiin Alexa Fluor 488-konjugoitu phalloidin (Life Technologies), ja immunofluoresenssilla havaittiin epifluoresenssimikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani).

MTT-määritystä

yhteensä 5 x 10

3-soluja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppalevylle (Falcon, Becton Dickinson Labware) DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FCS: ää . 24 tunnin viljelyn jälkeen solut käsiteltiin joko 100 uM DHPG, 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe 48 tuntia. Solujen lukumäärä kvantitoitiin käyttäen MTT-määritystä [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, Sigma].

Haavan määrityksessä

jälkeen 24 tunnin viljelyn, lineaarinen haava syntyy kaapimalla konfluentteja monokerrokset solujen pipetillä kärjestä, kun läsnä oli joko 100 uM DHPG tai 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe. Irrallinen solut pestiin pois sekoittaen. Solut kuvattiin samaan verkkoon sijainti kuluttua 48 h. Kukin rivi maljattiin ja haavoittui kolmena kappaleena.

In vitro solun migraatiokokeessa

in vitro

kulkeutumista suun syöpäsolujen arvioitiin käyttämällä Transwell kammio (Corning, Corning, NY, USA). Solujen kalvon huokoset tai solut on kiinnitetty alapintaan kalvon laskettiin 10 näkökenttien suurella suurennuksella (x 400). Joissakin kokeissa, 100 uM DHPG, 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe lisättiin soluihin ympätään ylempään kammioon.

Tilastollinen

väliset tilastolliset erot keinot arvot eri hoitoryhmään arvioitiin StatView 4,5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) käyttäen yksisuuntaista ANOVA merkitykseen asetettu osoitteessa

p

0,05.

Tulokset

eristäminen kohdegeenin, metabotrooppisten glutamaattireseptorien 5, joka on indusoitu SDF-1 /CXCR4 järjestelmän

tutkitaan uusia terapeuttisia alavirrassa oleva kohde ( t) SDF-1 /CXCR4 järjestelmän avulla suullinen syöpäsolut, B88-SDF-1, joka on autokriini SDF-1 /CXCR4 järjestelmän ja näytteille etäinen metastaattinen potentiaali

in vivo

. Microarray-analyysi paljasti, että 418 geenit yläreguloituja B88-SDF-1-soluissa verrattuna mock soluihin, ja että ilmaisu metabotrooppisen glutamaattireseptori 5 (mGluR5) kasvoi 46-kertaiseksi (viides ylhäältä) in B88-SDF-1-soluissa, jossa korkeimmat pisteet, jotka vastaavat mGluR5-reitin, kuten on esitetty IPA (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi Park ja kollegat osoittivat, että vahva mGluR5 ilmentyminen liittyy potilaan selviytymisen ja että mGluR5-antagonistit estävät muuttoa suun syöpäsolujen

in vitro

[13]. Näin ollen, olemme analysoineet mGluR5 ehdokkaana liittyvän geenin SDF-1 /CXCR4-järjestelmä. Vahvista spesifisyyden mikrosiruanalyysi, mRNA ilmaus mGluR5 varmistettiin RT-PCR. Samanlainen mikrosirun tuloksia, mRNA: n ilmentyminen mGluR5 on yliaktiivista B88-SDF-1-soluissa, verrattuna vale-soluja (kuvio 1A) ja estää käsittelemällä AMD3100 (kuvio 1A). Olemme aiemmin osoittaneet, että SDF-1 /CXCR4 järjestelmä aktivoi sekä Ras-ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 ja fosfatidyyli 3 kinaasi (PI3K) -Akt väyliä [1]. Siksi seuraavaksi tutkitaan, joka edistää näiden reittejä säätely mGluR5. Ilmaisu mGluR5 oli täysin kumottu käsittelemällä U0126, joka on MEK: n estäjä ja osittain inhiboitu wortmanniinilla, PI3K-estäjä (kuvio 1 B). Saimme myös samankaltaisia ​​tuloksia määrällisen RT-PCR (kuvio 1 C). Lisäksi säätelyä mGluR5-proteiinin havaittiin myös virtaussytometrialla ja immunosytokemiassa tulokset (kuvio 1 D, E).

(A) ilmentyminen mGluR5 mRNA vahvistettiin B88-mock ja B88-SDF-1-soluissa sekä läsnä ollessa ja puuttuessa AMD3100 (1 ug /ml). Ihmisen istukasta käytettiin positiivisena kontrollina (PC). (B) Soluja käsiteltiin U0126 (10 nM) tai wortmanniini (50 nM) 48 tuntia ja mRNA: n ilmentymisen mGluR5 analysoitiin RT-PCR: llä. (C) ilmentyminen mGluR5 mRNA vahvistettiin real-time PCR. **;

p

0,01 verrattuna käsittelemättömään B88-SDF-1-soluissa yksisuuntainen ANOVA. ND; ei havaittavissa. (D) Proteiinin ilmentymistä mGluR5 arvioitiin B88-mock ja B88-SDF-1-soluissa käyttämällä virtaussytometria. Logaritmisesti kasvavia soluja inkuboitiin kanssa tai ilman anti-mGluR5-mAb ja värjättiin PE-leimatulla vuohen anti-hiiri-IgG. Valkoinen ja punainen vyöhykkeet osoittavat solut värjättiin isotyyppikontrollilla ja anti-mGluR5-mAb, vastaavasti. (E) Proteiinin ilmentymistä mGluR5 havaittiin immunosolukemiallisella. Tuma värjättiin DAPI (sininen).

ilmentyminen glutamaattireseptorien B88-SDF-1-soluissa

Glutamaatti reseptorit on jaettu kahteen ryhmään; mGluR: ien ja Ionotrooppiset GluRs (iGluR: t), jotka on lisäksi tunnusomaista, että joko N-metyyli-D-aspartaatin (NMDA), a-amino-3-hydroksi-5-metyyli-isoksatsoli-4-propionihappo (AMPA) ja kainaatti (KA) reseptorit [14,15]. Olemme validoitu ilmaus glutamaattireseptorien mukana SDF-1 /CXCR4-systeemiä käyttäen cDNA microarray. Ja 8 erilaista mGluR tutkitaan vain ilmentyminen mGluR5 oli merkittävästi yläreguloituja B88-SDF-1-soluissa (taulukko 1). Lisäksi 14 tyyppisiä iGluR: t tutkittiin, ilmaus GluR1, AMPA-reseptorin, nousi 6-kertaiseksi B88-SDF-1-soluja (taulukko 2).

Group

mGluR

Taita induction

*

ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. ilmentyminen mGluR cDNA mikrosiruanalyysi.

* Lisääntymisen merkkejä B88-SDF-1-solujen vs B88-mock-solut CSV Lataa CSV Ryhmä

iGluR: t

Taita induktio

*

AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. ilmentäminen iGluR: t cDNA mikrosiruanalyysi.

* Lisääntymisen merkkejä B88-SDF-1-solujen vs B88-mock-solut CSV Lataa CSV

tuotanto glutamaatin suun syöpäsoluissa

Seuraava tutkitaan tuotannon glutamaatin, mGluR5 ligandi, vuonna B88 ja sen transfektanteissa, B88-mock ja B88-SDF-1-soluissa. Glutamaatti tuotanto havaittiin elatusaine peräisin näistä soluista, jonka pitoisuus on noin 12 uM (taulukko 3). Kuitenkin, glutamaatti tuotanto ei ollut riippuvainen joko SDF-1 /CXCR4 järjestelmän tai ekspressiotaso mGluR5.

Solut

B88

B88-mock

B88-SDF-1

glutamaatti vapautumisen (uM) 12,23 ± 0.3012.17 ± 0.1712.21 ± 0.29Table 3. Tuotanto glutamaatin suusyövän soluja.

CSV Lataa CSV

rooli mGluR5 solun kasvuun

tutkittiin, mikä vaikutus mGluR5 solujen kasvuun käyttämällä tiettyä mGluR5-agonisti, DHPG, ja kaksi antagonistit, MPEP ja Mtoe. Agonistin ja antagonistien ei vaikuttanut kasvua joko B88-mock tai B88-SDF-1-soluja (kuvio 2).

yksisolukerroksena soluja käsiteltiin joko 100 uM DHPG, 20 uM MPEP (A) tai 20 uM Mtoe (B). Vaikutus mGluR5 solujen kasvuun arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Ei ollut merkittäviä eroja kolmen ryhmän yksisuuntaisella ANOVA.

Rooli mGluR5 on SDF-1 /CXCR4-riippuvaisen solumigraatio

vieressä tutkineet vaikutusta mGluR5 on SDF-1 /CXCR4-riippuvaisten solujen kulkeutumista. Haavan paranemista määritykset paljastivat, että parannettu motiliteettia B88-SDF-1-soluissa edelleen kiihdyttää DHPG hoitoon, mutta merkittävästi heikentynyt MPEP ja Mtoe hoitoa (kuvio 3A, B). Antagonistit mGluR5 esti myös muuttoa B88-SDF-1-soluissa, mikä näkyy Siirtotavan kammio määritys (kuvio 3C). Lisäksi DHPG parannettu F-aktiini polymerointi kärjessä, kun taas MPEP ja Mtoe esti F-aktiini polymerointi (kuva 3D-G). Havaitsimme myös esto matrigeeliä hyökkäyksen Mtoe hoitoa B88-SDF-1-soluissa (tietoja ei esitetty).

(A) B88-mock tai B88-SDF-1-soluja viljeltiin konfluenssiin. Haava paranemista määritys suoritettiin, kun läsnä oli joko 100 uM DHPG, 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe. (B) Kvantitatiivinen aineisto johdettu (A). *;

p

0,05 verrattuna DHPG-käsiteltyjen solujen yksisuuntaisella ANOVA. (C) motiliteettia B88-SDF-1-soluja, kun läsnä oli joko 100 uM DHPG, 20 uM MPEP tai 20 uM Mtoe tutkittiin käyttäen transwell migraatiokokeessa. *;

p

0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin tai DHPG-käsiteltyjen solujen yksisuuntaisella ANOVA. (D-G) F-aktiini polymerointi etureunan B88-SDF-1-soluissa tutkittiin että immunosytokemialla seuraavat (D) ei käsittelyä, (E) DHPG hoito, (F) MPEP käsittely ja (G) Mtoe hoitoon. Tuma värjättiin DAPI (sininen).

vaikutus mGluR5-antagonistien on immunokompetenteilla hiirillä

Koska mGluR5 saattaa olla uusi metastaattinen tavoite suusyövän, arvioimme sivuvaikutuksia mGluR5 antagonistien C3 /kana hiirillä. Ei laihtuminen tai makroskooppisia elimen poikkeavuuksia ei havaittu hiirillä, joita oli käsitelty mGluR5-antagonistien MPEP ja Mtoe (tietoja ei ole esitetty). Lisäksi nämä antagonistit eivät indusoi hematotoxicities kuten anemia ja leukosytoosi (kuvio 4A-C). Olemme myös arvioineet sivuvaikutuksia AMD3100 on C3H /kana hiirillä. Ei laihtuminen, makroskooppisia elimen poikkeavuuksia tai muutoksia punasolujen count havaittiin hiirillä annettiin AMD3100 (tuloksia ei esitetty); kuitenkin merkittäviä ja kroonisia leukosytoosi jälkeen havaittiin päivittäin s.c. antamisen AMD3100 (tuloksia ei ole esitetty).

C3H /HeN-hiiriä käsiteltiin i.p. jossa MPEP (5 mg /kg), Mtoe (5 mg /kg) tai saman määrän suolaliuosta päivittäin. Hiiret tapettiin päivänä 1, 7, 14, 21, ja 28 exsanguination ja WBC (

), punasolut (RBC, B) ja hemoglobiini (Hb; C) mitattiin. Ei ollut merkittäviä eroja kolmen ryhmän yksisuuntaisella ANOVA.

rooli mGluR5 SDF-1 /CXCR4-riippuvaisen solu- etäpesäke

Niinpä määritimme vaikutus mGluR5-antagonistien on keuhkoetäpesäkkeet of B88-SDF-1-soluissa. Lukuisia etäpesäkenystyröiden havaittiin hiirten keuhkoissa, jotka ympättiin B88-SDF-1-soluja (kuvio 5A, vasemmalla). Kuitenkin merkittävä väheneminen metastaattisen keuhkosyövän kyhmyt havaittiin hiirissä, joita hoidettiin MPEP (kuvio 5A, keskellä) ja Mtoe (kuvio 5A, oikealla), kuten on esitetty histopatologista analyysiä aikana 4 viikon tarkkailujakson aikana. Olemme myös vahvistaneet läsnäolon metastaattisen syöpäsolujen uutettu keuhkokudoksessa käyttämällä kvantitatiivista Alu-PCR. Näin ollen ilmentyminen ihmisen Alu-DNA: käsitellyillä hiirillä mGluR5-antagonistien oli merkittävästi alhaisempi kuin hiirissä, joita hoidettiin suolaliuoksella (kuvio 5B).

Solut inokuloitiin verisuonen nude-hiirten, jotka tapettiin päivänä 30. (A) edustaja H 0,01 verrattuna suolaliuokseen yksisuuntaisella ANOVA.

Keskustelu

Glutamaatti on ainutlaatuinen ligandi mGluR5, joka on metabotrooppisten glutamaattireseptoreiden perheeseen kuuluvat G-proteiiniin kytkeytyvien reseptorit [16,17], että kaikkialla läsnä löytyy aivokuori, hippokampus, häntätumakkeessa ja nucleus accumbens -alueen keskushermoston hermoston (CNS) [16,17]. On ehdotettu, että mGluR5 on osallisena keskushermoston häiriöt, joita indusoi liikaeritys glutamaatin, kuten epilepsia, neurogeeninen tai tulehduksellinen kipu, psykoosi, dyskinesia, päänsärkyä ja huumeriippuvuuden [16,17]. Solutasolla, mGluR5 säätelee kasvua ja muuttoliike gliasolujen [18], hermo prekursorikantasoluista [19], alkion kantasolujen [20] ja glioomasolulinjaa [21]. Vaikka rooli mGluR5 syövän etenemisessä on edelleen epäselvä, viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että mGluR5 toimii paksusuolessa [22], rintojen [22] ja syöpäsolujen [23]. Lisäksi Park ja kollegat osoittivat, että vahva mGluR5 ilmentyminen liittyy potilaan selviytymisen ja että mGluR5-antagonistit estävät muuttoa suun syöpäsolujen

in vitro

[13]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mGluR5 toimii onkogeenin kiinteät syövät, mukaan lukien suun syöpä. Toisaalta käsiä, äskettäiset tutkimukset ovat osoittaneet, että glutamaatti on mesenkymaalisten solujen tuottama, kuten osteoblastien ja osteoklastien, epiteelisolujen, kuten haiman saarekesolujen ja keratinosyytit, rinta- ja eturauhassyövän soluissa [24-27]. Lisäksi tuotanto glutamaatin glioomasoluihin on raportoitu liittyvän leviämisen ja invaasion [21,28,29]. Lisäksi, Bathe ja kollegat osoittivat merkittävästi kohonneet pitoisuudet glutamaatin potilaiden seerumeista haimasyöpä, mitattuna metabolomiikan analyysi [30]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että B88-solut, ja sen transfektoitiin johdannaiset, tuottavat glutamaattia niiden elatusaineessa, jonka pitoisuus on noin 12 uM. Nämä pitoisuudet olivat samanlaisia ​​havaintoja kuvanneet Seidlitz ja kollegoiden rintasyövän solulinjaa, MDA-MB-231 [29]. Nämä tulokset osoittavat, että glutamaatin ja sen reseptori liittyvät syövän etenemisessä. Ei kuitenkaan eroa glutamaatti tuotannon välillä havaittiin B88-mock ja B88-SDF-1-soluissa, vaikkakin ilmaisu mGluR5, reseptorin glutamaatin, on yliaktiivista B88-SDF-1-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus mGluR5 sijaan glutamaatti tuotanto, tarvitaan glutamatergisen järjestelmän olla mukana SDF-1 /CXCR4 signalointi.

Äskettäin, synteettisen mGluR5-antagonisteja on kehitetty mahdollisina lääkkeinä keskushermoston häiriöitä, joiden aiheuttama liikaeritys glutamaatin [11,31,32]. On raportoitu, että anto MPEP ja Mtoe on käytetty tehokkaasti kivun hoitoon oireiden, Parkinsonin tauti, kognition häiriö, masennus, ahdistus, ja skitsofrenian [16,17]. Vaikka me käytettiin aluksi MPEP kuin mGluR5 antagonisti tässä tutkimuksessa merkittävä epäspesifinen toimet MPEP, kuten estämällä AMPA tai NMDA-reseptorien, on ilmoitettu [10]. Lisäksi havaitsimme 6-kertaiseen kasvuun ilmaus GluR1, AMPA-reseptori osallistuu kasvun ja invaasion gliooma solujen in B88-SDF-1-soluissa [33,34]. Jos haluat jättää epäspesifinen vaikutus MPEP mGluR5, me arvioidaan uudelleen roolin mGluR5 on SDF-1 /CXCR4 järjestelmän avulla äskettäin kehitetty mGluR5-antagonisti Mtoe, mikä on enemmän erittäin selektiivinen mGluR5 ja on vähemmän off-tavoite vaikutukset kuin MPEP [10]. Kuitenkin sekä MPEP ja Mtoe oli samanlaisia ​​vaikutuksia siirtolaisuuden ja etäpesäkkeiden B88-SDF-1-soluissa, mikä osoittaa tiettyä vaikutusta mGluR5 on SDF-1 /CXCR4 järjestelmä.

Olemme havainneet lisäaine vaikutuksia mGluR5 agonistien DHPG in migraatiokokeessa huolimatta sisältää suuren määrän glutamaatin mediassa. Vaikka emme noudata suoraa aktivoitumista mGluR5, katsotaan, että DHPG luultavasti aktivoivat mGluR5 in B88-SDF-1-soluissa, koska DHPG ei tehostanut muuttoliikkeen mock-soluissa, jotka eivät ilmennä mGluR5 (tuloksia ei ole esitetty). Cleva ja Olive osoitettu, että mGluR5 on fyysisesti kytketty NMDA-reseptorien eri rakennustelineet proteiineja, ja biokemiallisesti kytketty NMDA-reseptorin toimintaa kautta PKC [35]. Lisäksi tämä mGluR5-NMDA-vuorovaikutus on havaittu lukuisissa aivoissa valmisteissa, jolloin aktivointi mGluR5-reseptorien kanssa DHPG voimistaa NMDA-vasteita eksogeenisesti käytetään glutamaattia tai NMDA [35]. Koska B88-SDF-1-solut ilmentävät NMDA-reseptorien meidän microarray-analyysi (taulukko 1), tämä lisäaine vaikutus DHPG voi johtua samanaikaisen aktivaation NMDA-reseptorin kautta.

Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, osallistuminen Ras-ERK1 /2 polku on säätelyä mGluR5 että SDF-1 /CXCR4-järjestelmä. Vaikka yhdistyksen välillä mGluR5 ja SDF-1 /CXCR4 järjestelmä ei ole raportoitu syöpäsoluissa, Luo ja kollegat ovat osoittaneet induktion mGluR5 on E14.5 hermo esiastesolujen stimuloimalla SDF-1. He ehdottivat myös, että mGluR5: n ilmentymisen SDF-1 /CXCR4 järjestelmä indusoi transkriptiotekijä, Ets, joka aktivoituu ERK1 /2-signalointireitin [36]. Koska

mGluR5

geeni on Ets sitoutumiskohtia niiden promoottorien [37], CXCR4 /ERK1 /2 /Ets polku saattaa olla mukana induktioon mGluR5 joka havaittiin meidän kokeessa.

Teimme samassa kokeessa käyttäen suun SCC solulinjan, HNT, jossa ilmaus CXCR4 on 7,5 kertaa pienempi kuin että B88-soluissa [1]. HNT-SDF-1-solujen teki näytteille vähäistä, mutta ei merkittävää, fenotyyppisiä muutoksia in vitro ja in vivo [4], ja mGluR5 induktio havaittiin vain marginaalinen tasolla, mikä todennäköisesti johtuu alennettu ilmaus CXCR4, verrattiin B88-solut. Siten CXCR4 ekspressiotaso ja vahva alavirran signalointia voi olla myös kriittinen aktivointia mGluR5 reitin.

Havaitsimme, että mGluR5-antagonistit esti merkittävästi SDF-1 /CXCR4-riippuvaisen muuttoliikettä ja etäpesäke. Vaikka SDF-1 /CXCR4 järjestelmä lähinnä toimii kemotaktinen tekijä syöpäsoluissa, on myös mukana useissa metastaattisen prosesseja, kuten uudissuonittuminen, soluadheesiota, invaasio, kasvu ja epiteelin jotta mesenkymaalitransitioon [38-43]. Esillä olevassa tutkimuksessa, mGluR5 säädellään solun maahanmuutto liittyy SDF-1 /CXCR4-järjestelmä; on kuitenkin epätodennäköistä, että mGluR5-antagonistit tukahduttaa SDF-1 /CXCR4-riippuvaisen etäpesäke vain kautta estyy solujen vaeltamiseen. Vaikka mGluR5 on todettu lisäävän tarttuvuutta ja hyökkäys suun syöpäsolujen [13] ja seuraus hermosoluja [44], vain vähän tietoa myöskään etäpesäke liittyviä toimintoja. mGluR aktivoida sekä MAPK ja Akt polkuja, jotka ovat kaksi tunnusmerkki signalointireittejä, jotka edistävät syövän kasvua ja etäpesäkkeiden [45,46]. Näin ollen, mGluR5 saattaa estää näiden kriittisten metastaattisen reittejä ja estää syövän etäpesäkkeitä.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa havaitsimme CXCR4 ilmaisun noin 60% ensisijaisen suusyöpä ja totesi, että CXCR4-positiivisia tapauksia oli merkittävästi huonompi ennuste kuin CXCR4-negatiivinen tapauksissa [3]. Vaikka emme ekspression tutkimiseksi mGluR5 suun syöpä kudoksiin, Park ja kollegat osoittivat, että 70% suusyöpä ilmaista mGluR5 ja että yli-ilmentyminen mGluR5 vähentää eloonjäämisaste potilaiden suun kautta syöpä [13]. Yhdessä yhdistyksen välillä CXCR4 ja mGluR5 on erittäin suositeltavaa edistää etenemistä suun syöpä.