Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus nykymaailmassa. Vaikka jotkut edistysaskeleet keuhkosyövän hoidossa on tehty, elossaololuku on vielä heikko. MikroRNA (miRNA) voivat toimia oncogenes tai kasvaimeen synnyssä ihmisen maligniteetti. MIR-34 Perheeseen kuuluu kasvaimeen ehkäisevästä miRNA, ja pelkistetyssä ilme on raportoitu erilaisten syöpien, kuten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-34a ja miR-34c kohde verihiutaleiden kasvutekijän reseptorin alfa- ja beeta (PDGFR-α ja PDGFR-β), solun pinnan tyrosiinikinaasireseptorit jotka aiheuttavat lisääntymisen, migraation ja invaasion syövässä. MiR-34a ja miR-34c oli vaimentua vuonna keuhkokasvaimia verrattuna normaaleihin kudoksiin. Lisäksi olemme tunnistaneet käänteinen korrelaatio PDGFR-α /β ja miR-34a /c-ilmentymisen keuhkojen kasvain näytteissä. Lopuksi miR-34a /c yliekspressio tai alisäätely PDGFR-α /β jonka siRNA: t, voimakkaasti täydennetty vaste TNF liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) ja vähentää muuttavien ja invasiivisia kapasiteettia NSCLC-solujen.

Citation : Garofalo M, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. (2013) MiR-34a /c-Dependent PDGFR-α /β alassäätely Estää kasvaimen kehittymisen ja parantaa TRAIL-indusoitu apoptoosi Lung Cancer. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10,1371 /journal.pone.0067581

Editor: Noriko Gotoh, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan

vastaanotettu: 10 marraskuu 2012; Hyväksytty: 23 toukokuu 2013; Julkaistu: 21 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Garofalo ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health CA152758. Kirjoittajat ovat kiitollisia tutkimukseen tukea Ohio State University kohdennetut investoinnit palkinto. MG on vastaanottaja Kimmel Scholar Award 2011. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: GJN on työntekijä Phylogeny , Inc. ei ole patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta vuoden tutkimus-, ennuste potilaille, joilla on keuhkosyöpä on edelleen synkkä. Yleisin tyyppi, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) (85%), on esitetty yleisesti Viiden vuoden elossaololuku 15%. Isomuotoja verihiutaleiden kasvutekijän reseptorin (PDGFR) ja sen ligandi, PDGF, muodostavat perheen reseptoreita ja ligandeja mukaan proliferatiivisia ja prosurvival signalointi solujen sisällä. PDGFR /PDGF- järjestelmä sisältää kahden reseptorin (PDGFR-α ja PDGFR-β) ja neljä ligandien (PDGFA, PDGFB, PDGFC, ja PDGFD). Ligandin sitoutumisen indusoi reseptorin dimerisoitumisen, jolloin autofosforylaatiota spesifisten tyrosiiniryhmien ja sen jälkeen rekrytointi erilaisia ​​signaalitransduktion molekyylejä. PDGFR säätelee normaali solujen kasvua ja erilaistumista [2], ja ilmentyminen aktivoituu PDGFR edistää syövän syntyyn [3]. Lukuisat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset osoittivat, että esto PDGFR-α signalointi häiritsee syöpäsolun eloonjäämisen osajoukko ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) kanssa aktivoivan PDGFR-α mutaatioita [4, 5]. Tuoreessa tutkimuksessa 150 NSCLC potilaiden näytteistä, aktivoitu PDGFR-α havaittiin 13%: ssa tapauksista [6], mikä viittaa siihen, että joissakin näistä potilaista saattaa hyötyä hoitoja suunnattu PDGFR-α. Lisäksi PDGFR-α yliekspressio on havaittu metastaattisessa versus nonmetastatic medulloblastoma potilaan näytteitä ja häiritsevät PDGFR-α-toiminto esti metastaattisen potentiaalin medulloblastoma solujen kasvua in vitro [7]. Koska sen progrowth rooli solujen signalointi, PDGFR-α on tullut houkutteleva terapeuttinen kohde monissa ihmisen syöpäsairauksia. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, sytoplasminen PDGFR-α ilmentymisen kasvain on negatiivinen prognostinen indikaattori [8], joka vahvistaa, että PDGF-akseli voi olla biologisesti merkityksellinen. Kaikki jäsenet PDGF perheen näytön tehokas angiogeeninen aktiivisuus

in vivo

, ja tästä näkökulmasta, PDGF-B /PDGFRβ akseli oli laajin arvioidaan. Vuonna null hiirillä on osoitettu, että PDGF-B ja PDGFRβ ovat kriittisesti mukana verisuonten kehitystä. Rooli PDGF /PDGFR verisuonten kehitys tukee poistokokeita [9,10]. MikroRNA (miRNA), luokka ~ 22 nt endogeenisen RNA: t, ovat tärkeitä säätelijöitä geenien ilmentymistä ja ovat sekaantuneet säätelyyn kriittisiä prosesseja, jotka vapautettiin syöpäsoluissa, kuten leviämisen [11] eriyttäminen [12] ja apoptoosin [13 ]. Muutoksia miRNA ilmentyminen syövässä on dokumentoitu lukuisissa tutkimuksissa ja ehdottaa, että miRNA kriittisesti edistävät syöpäsolu fenotyyppi [14,15]. Lisäksi jotkin miRNA-koodaavat geenit on luokiteltu onkogeenisia tai tuumoria tukahduttavan geenejä mukaan niiden toimintaa solutransformaatioon ja muuttunut ilmentyminen kasvaimissa.

Vuonna 2007 raportteja useista laboratorioista osoitti, että jäsenet miR-34 perhe ovat suoria p53 tavoitteita, ja että niiden säätelyä aiheuttaman apoptoosin ja solusyklin pidätyksen [16,17]. Nisäkkäissä, MIR-34 perheen käsittää kolme käsitellään miRNA, joita koodaa kaksi eri geeniä: miR-34a on koodattu omalla transkriptio, kun taas miR-34b ja miR-34c on yhteinen ensisijainen transkriptin. Lisäksi promoottorialueen miR-34a, miR-34b ja miR-34c sisältää CpG-saarekkeiden ja poikkeava CpG metylaatio vähentää miR-34 perheen ilmentymisen monissa syöpätyypeissä [18,19,20].

tässä tutkimuksessa, osoitamme, että miR-34a ja miR-34c, vahvasti vaimentua NSCLC soluissa ja keuhkojen kasvaimet, vaikka ne ovat erittäin ilmentyy normaaleissa keuhkojen kudoksia. Lisäksi miR-34a ja miR-34c, kohdistamalla PDGFR-α ja PDGFR-β, lisäämään TRAIL: n indusoiman apoptoosin ja vähentää invasiivisuus keuhko- syöpäsoluja. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, ensimmäistä kertaa, että kombinatoorista hoito TRAIL ja PDGFR-inhibiittorit voivat olla tehokkaita anti-NSCLC terapia.

Tulokset

MiR-34a ja miR-34c tavoite PDGFR -α ja PDGFR-β 3 ’UTR

joukossa miRNA, miR-34 perheenjäsenten on tärkeä kasvain tukahduttava rooleja, koska ne ovat suoraan säätelee p53 ja säveltää p53-verkon [16,17]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että miR-34 metylaatio esiintyi NSCLC ja merkittävästi liittyvät epäedulliseen kliiniseen tulokseen [20]. Ensin analysoidaan Real Time PCR (qRT-PCR) miR-34a, -34b ja -34c ilmaisun 5 eri NSCLC solulinjoissa p53 WT, mutantti tai nolla (kuva S1a File S1). MiR-34a, -34b ja -34c oli vähän tai ei ollenkaan ilmentymistä kaikissa viidessä solulinjoissa (kuvio S1B File S1). Tunnistaa miR-34a, -34b, ja -34c tavoitteet, teimme bioinformatiikan haku (Targetscan, Pictar) luulotellun mRNA tavoitteita. Niistä Ehdokaskohteiden, 3 ’UTR ihmisen PDGFR-α ja PDGFR-β sisälsi alueet (PDGFR-α nukleotidit 2670-2676, 2699-2705, PDGFR-β nukleotidit 1535-1541), joka vastasi siemenet sekvenssit HSA-asennuspalveli- 34a, -34b ja -34c (kuva 1a). PDGFR-α ja PDGFR-β on raportoitu olevan yli-ilmentyneen ja huonosta lopputuloksesta keuhkosyövän [21]. Voit tarkistaa, onko PDGFR-α ja PDGFR-β olivat kohdistu suoraa miR-34a, -34b ja -34c, PDGFR-α 3 ’UTR, joka sisältää kaksi miR-34a, -34b ja -34c sitoutumiskohdat ja PDGFR-β 3’ UTR, joka sisältää yhden miR-34a, -34b ja -34c sitoutumiskohdan (kuva 1a, b), kloonattiin alavirtaan lusiferaasin avoin lukukehys. Mielenkiintoista, lisääntyneen ekspression miR-34a ja miR-34c, eikä miR-34b, kun transfektio, vahvistettiin qRT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty), laski merkittävästi lusiferaasin aktiivisuuden, mikä osoittaa, välillä on suora vuorovaikutus miRNA ja PDGFRα ja PDGFRβ 3 ”UTR (kuva 1c, d). Kohdegeenin tukahduttaminen pelastettiin mutaatiot täydentävän siemen sivustoja (kuva 1b, c, d). Yhdessä tulokset osoittavat, että miR-34a ja miR-34c ja ei miR-34b kohdistaa suoraan PDGFR-α ja PDGFR-β.

(a) PDGFR-α ja PDGFR-β 3 ’UTR: t sisältävät, vastaavasti , kaksi ja yksi ennustettu miR-34a, -34b ja -34c sitoutumiskohdista. Kuvassa linjaus siemenen alueiden miR-34a /c PDGFR-α ja PDGFR-β 3 ’UTR näkyy. Sivustoja tavoite mutageneesin on merkitty punaisella. _deleted nukleotidia. (B) PGL3 valvonta-PDGFR-α, jotka sisälsivät kaksi PDGFR-α sitoutumiskohtia (punaisella). Poistetaan toinen PDGFR-α sivustoja käytettiin tuottamaan mutantti-lusiferaasi palsmids. (C-d) PDGFR-α ja PDGFR-β 3 ’UTR ovat kohdistu suoraa miR-34a ja miR-34c. pGL3-PDGFR-α ja pGL3-PDGFR-β lusiferaasi konstrukteja, jotka sisältävät villin tyypin (vasemmalla puolella histogrammit) tai mutatoituja (oikealla puolella histogrammien) PDGFR-α ja PDGFR-β 3 ’UTR: t, transfektoitiin Calu -6-soluja. Suhteellinen tukahduttaminen tulikärpäsen lusiferaasin ilmentymistä standardoitu transfektiosysteemillä valvontaa. Reportteri määritykset suoritettiin kolmeen kertaan oleellisesti identtiset tulokset. * P 0,0001, ** P 0,05 kahdella pyrstö Studentin t-testillä.

MiR-34a ja miR-34c ovat kääntäen verrannollinen PDGFR-α /β ilmaisun

in vitro

ja

in vivo

Seuraavaksi analysoimme seuraukset kohdunulkoinen ilmentymisen miR-34a ja -34c in Calu-6 ja H1703 soluja. Valitsimme nämä kaksi solulinjaa, koska suuri ekspressiotasot PDGFR-α (H1703 ja Calu-6) ja PDGFR-β (Calu-6) (tuloksia ei ole esitetty). Lisääntynyt ilmentyminen miR-34a ja miR-34c, kun transfektio varmistettiin qRT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty), ja sitten vaikutukset PDGFR-α ja PDGFR-β-mRNA: n ja proteiinin tasot analysoitiin qRT-PCR: llä ja western blot. MiR-34a ja -34c (ei miR-34b) yli-ilmentymisen merkittävästi vähentää PDGFR-α ja PDGFR-β-mRNA: t (kuva 2a) ja endogeenisen proteiinin tasoja, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu ennalta miR (kuvio 2b). Ilmentymistasojen neljän PDGF ligandit (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) jälkeen miR-34a ja miR-34c täytäntöön ilmentyminen arvioitiin myös sekä Calu-6 ja H1703-soluissa. PDGFD oli tuskin ilmaistu molemmissa solulinjoissa; emme löytäneet vaihtelu ilmentymisen PDGFA, PDGFB ja PDGFC (tietoja ei ole esitetty). Yhteenvetona, nämä tulokset tukevat bioinformatiikan ennusteet osoittaa PDGFR-α ja PDGFR-β 3 ’UTR: t kohteina miR-34a ja -34c.

(a) qRT-PCR osoittaa PDGFR-α ja PDGFR-β mRNA: iden downregulation in Calu-6 ja H1703-soluissa sen jälkeen, kun miR-34 ja miR-34c, mutta ei miR-34b täytäntöön ilmentymistä (b) miR-34a ja miR-34c täytäntöön ilmentyminen vähentää endogeenisten tasojen PDGFR-α /β-proteiinin tasot H1703 ja Calu-6 NSCLC. Solut transfektoitiin joko salattu, miR-34a tai miR-34c varten 72h. PDGFR-α ja PDGFR-β ilmentyminen arvioitiin western blot. Kuormituksen valvonta saatiin käyttämällä GAPDH vasta-ainetta. * P 0,05, ** P 0,001 kahdella pyrstö Studentin t-testillä.

Voit tarkistaa downregulation miR-34a ja -34c myös

in vivo

, 9 keuhkokasvaimia (joukossa adenokarsinooma ja okasolusyöpä) ja viereisen histologisesti normaalin keuhkojen kudoksia analysoitiin miR-34a ja -34c ilme. Kuten on esitetty kuviossa 3a ja b, miR-34a ja miR-34c ilmentyminen oli alempi kasvaimen verrattuna normaaleissa näytteissä (kuvio 3a, b).

(a-b) qRT-PCR: llä 18 keuhkojen kasvain ja normaaleissa kudoksissa. MiR-34a ja miR-34c on vaimentua kasvaimissa verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin. (C) Rasiakuvaajat osoittaa miR-34a ja miR-34c ilmentyminen 48 keuhkosyövän normaaleissa ja syövän kudoksissa. (D) XY sirontakuvaajiin osoittaa käänteinen korrelaatio miR-34a /c ja PDGFR-α /β. Kaksisuuntainen Studentin t-testiä käytettiin tarkistaa merkitystä. P 0,05.

Lisäksi olemme analysoineet miR-34a, 34c ja PDGFR-α /β-mRNA: n ekspressio 24 primaarisista ihmisen keuhkosyövän yksilöt verrattuna 24 normaaleissa kudoksissa. MiR-34a ja -34c olivat lähes havaitsematon kasvain ja ilmentyy suuresti normaalin keuhkokudoksen testatut näytteet (kuvio 3c). Merkillistä, käänteinen korrelaatio miR-34a /c ja PDGFR-α ja PDGFR-β havaittiin (kuvio 3d). Edelleen vahvistaa nämä havainnot, in situ -hybridisaatio (ISH) analyysi suoritettiin käyttäen 5′-dig-leimattua LNA-koettimien keuhkojen kasvaimet ja normaaleissa kudoksissa, ja sen jälkeen immunohistokemia (IHC) ja PDGFR-α ja PDGFRβ. Useimmat keuhkosyöpään solut osoittivat heikkoa ilmentymistä Mir-34a ja korkea ilmentyminen PDGFR-α /β, kun taas viereisen ei-pahanlaatuisen keuhko ilmaistu PDGFR-α harvoin ja runsaasti ilmaista miR-34a. MiR-34a ja PDGFR-α /β ilmaisun suurin osa 107 eri kasvaimissa analysoitu oli periaatteessa toisiaan poissulkevia (kuvio 4a, b ja kuvassa S2 File S1).

(a-b) Immunohistokemia ja situ 107 keuhkosyöpään kudosnäytteistä. MiR-34a (sininen) ja PDGFR-α /β (ruskea /punainen, vastaavasti RGB ja kukin fluoresoiva punaisen Nuance muuntaa kuva) ilmentyminen kääntäen verrannollinen vuonna keuhkosyövässä ja viereisen normaalin keuhkojen kudoksia. Nämä leikesarjojen analysoitiin miR-34a ilmentymisen in situ -hybridisaatiolla, minkä jälkeen immunohistokemiaa PDGFR-α /β. (A) edustaja esimerkki: Co-ilmentymisen analyysi miR-34a ja PDGFR-α. Huomautus puute ilmaisun yhdistetyn kuvan (paneeli b) (loisteputki keltainen = co-lauseke). (B) edustaja esimerkki: miR-34a = sininen (paneeli a), PDGFR-β = red (paneeli b), koekspressoimalla = keltainen (paneeli c). RGB = tavallisessa Vihreä Sininen kuva ISH /LHC esitetty reaktio ruudut a-c. Mittakaava osoittaa 50 pm. Suurennus on sama kaikille paneeleja.

MiR-34a ja miR-34c voittaa TRAIL vastustus NSCLC-solujen kautta PDGFR-α ja PDGFR-β downregulation

TNF-liittyvä apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) on jäsen tuumorinekroositekijäperheenjäsen, tiedetään indusoivan apoptoosia erilaisia ​​kasvaintyypeissä. TRAIL pystyy erityisesti indusoivat solukuolemaa syöpäsoluissa säästäen normaalit solut ja testataan parhaillaan lupaavana syöpälääkkeen kliinisissä kokeissa [22]. Kuitenkin monet kasvaimet mukaan lukien NSCLC ovat vastustuskykyisiä Trail mikä rajoittaa sen terapeuttista soveltamista. Koska PDGFR-α ja PDGFR-β säännellä PI3K /Akt ja ERK1 /2 polkuja [23,24,25], tutkimme seuraavaksi, immunovärjäyksellä, ilmentymisen ja /tai aktivointi joidenkin proteiinien mukana näiden reittien seuraavissa miR -34a ja miR-34c täytäntöön ilmentymisen tai PDGFR-α /β hiljentämiseltä siRNA. Kuten on esitetty kuviossa 5a, fosforylaation tasoja ERK: t laskivat jälkeen miR-34a ja miR-34c täytäntöön ilmentymisen verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus miR. PDGFR-α hiljentäminen vähensi aktivointi sekä Akt ja ERK1 /2 (kuvio 5b). Olemme aiemmin osoittaneet, että PI3K /AKT-reitin avainasemassa in TRAIL: n indusoiman apoptoosin [26], joten vaikutukset miR-34a ja miR-34c ilmentymisen vaikutus solujen eloonjäämistä ja TRAIL vastus NSCLC tutkittiin. Ensin suoritetaan proliferaatiomääritys on Calu-6 ja H1703 TRAIL semi-resistenttien solujen jälkeen täytäntöön ilmentyminen miR-34a ja miR-34c. 48 tuntia transfektion jälkeen solut altistettiin TRAIL 24 h, ja sitten solujen lisääntyminen määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Calu-6 ja H1703-solut yli-ilmentävät miR-34a ja -34c oli merkitsevästi vähemmän lisääntymisnopeus kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio S3a File S1). Lisäksi kaspaasi 3/7 määritys paljasti, kasvusta TRAIL herkkyyden jälkeen miR-34a ja -34c täytäntöön ilmentymistä tai PDGFR-α /β vaiennettu, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu miR tai siRNA (kuvio 5c, d).

(a) Western blot in Calu-6 solua jälkeen miR-34a, -34b ja -34c pakko ilme. MiR-34a tai miR-34c ja ei miR-34b pakko ilmentyminen vähenee PDGFRβ ekspressiotasot ja vähentää aktivoinnin ERK1 /2. (B) Western blot, joka osoittaa, että se inaktivoi Akt ja ERK: t reitit jälkeen PDGFR-α hiljentäminen. (C) kaspaasi 3/7 määrityksessä. MiR-34a ja -34c täytäntöön ilmaisun Calu-6 ja H1703 semi-resistentit solut, kasvattaa vaste TRAIL: n indusoiman apoptoosin. (D) kaspaasi 3/7 määritys osoittaa, että PDGFR-α tai PDGFR-β hiljentäminen lisää vastetta TRAIL-indusoitua apoptoosia. (E) PDGFR-α tai PDGFR-β yliekspressio H460 TRAIL-herkkien solujen vähentää vastaus huumetta. (F) Yhdistetty hoito PDGFR-inhibiittorin (20 uM), ja eri TRAIL pitoisuudet (0-100-150 ng /ml) 24 h herkistää NSCLC-solujen TRAIL-indusoidun apoptoosin. * P 0,001, ** P 0,05.

Lisäksi, yliekspressio PDGFR-α ja PDGFR-β H460 TRAIL-herkkien solujen, lisäsi resistenssin lääkkeelle (kuvio 5e ja kuvio S3C File S1). Sitä vastoin hoito Calu-6 solut PDGFR estäjä lisäsi merkittävästi herkkyyttä TRAIL: n indusoiman apoptoosin (kuvio 5f ja Kuva S3D File S1). Kiinnostavaa, yliekspressio PDGFR-α tai PDGFR-β (käyttäen kaksi plasmidia, jotka sisältävät ainoastaan ​​koodittavat sekvenssit eikä 3 ’UTR: t ja PDGFR-α /β) yhdessä miR-34a tai miR-34c, vähentynyt herkkyys TRAIL-indusoitua apoptoosin, joka arvioidaan sekä MTT: n ja kaspaasi 3/7 määritys (kuva S4 File S1). Tulokset viittaavat siihen, että PDGFR-α ja PDGFR-β tärkeä rooli TRAIL: n indusoiman apoptoosin ja PDGFR-estäjä voi herkistää NSCLC soluja varrella tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia.

PDGFR-α /β downregulation by asennuspalveli- 34a ja miR-34c estää muuttoliike ja invasiivisuus NSCLC-solujen

Koska PDGFR-α /β säätelemään PI3K /AKT-reitin, etenkin maahanmuuttopolitiikasta ja hyökkäys eri kasvaimissa [27,28], tutkimme jos miR -34a /c voivat vaikuttaa NSCLC muuttoliikkeen ja hyökkäyksen kautta PDGFR-α ja PDGFR-β downregulation. Suoraan testata toiminnallista roolia miR-34a /c-kasvainten synnyssä, me yli-ilmentynyt nämä kaksi miRNA tai vaiennettu PDGFR-α /β in Calu-6 tai H1703-soluissa. Kiehtovan, havaitsimme merkittävää lasku muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia Calu-6 ja H1703 solujen jälkeen miR-34a tai miR-34c yli-ilmentymisen (kuva 6a) sekä jälkeen PDGFR-α ja PDGFR-β downregulation (kuva 6b), vahvistettiin myös scratch-haavan määritys (kuva 6c). Edelleen varmistaa, että PDGFR-α ja PDGFR-β oli kasvaimien syntyyn liittyvien NSCLC-solujen, miR-34a ja -34c transfektoitiin Calu-6-solut yksinään tai yhdessä plasmidin kanssa, joka yli-ilmentää vain koodaavan sekvenssin eikä 3 ’UTR of PDGFR-α ja PDGFR-β. MiR-34a /c täytäntöön ilmaisun vähensi muuttoliikettä ja hyökkäys Calu-6 solua mutta yli-ilmentymisen PDGFR-α tai PDGFR-β, yhdessä kahden MikroRNA, palautti osittain muuttoliikkeen ja invaasio ominaisuudet, mikä viittaa siihen, että miR-34a /c säädellä NSCLC tumorigeneesin, ainakin osittain, kautta PDGFR-α /β (kuva 6 d, e).

(a) MiR-34a ja -34c täytäntöön ilmaisun vähentää vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia H1703 soluja. (B) PDGFR-α ja PDGFR-β hiljentäminen vähentää vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia Calu-6 solua. RFU = Suhteellinen fluoresenssi Units. (C) edustaja valokuvia naarmuuntunut alueilla yksisolukerroksena Calu-6-solut transfektoitu miR-34a /c tai ohjaus miRNA (miR-Ctr) at 0h, 12h ja 24h jälkeen haavoittaen pipetillä kärjestä. Mittakaava, 100 pm. Suurennus on sama kaikille paneelit. (D-e) PDGFR-α ja PDGFR-β yliekspressio osittain pelastaa vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia Calu-6 solua. * P 0,05.

Keskustelu

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan sekä miehillä että naisilla maailmanlaajuisesti

1. American Cancer Society arvioi 156940 johtuvia kuolemia keuhkosyöpään Yhdysvalloissa 2011 yksin [29]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus suurimman osan kaikista keuhkosyöpää ja on johtava syy syövän kuolleisuus [30].

korkea kuolleisuus liittyy keuhkosyöpä on aiheuttanut lukuisia tyhjentävä pyrkimyksiä tunnistaa uusia terapeuttisia tavoitteita ja hoitomuotoja tätä tappavaa tautia. Verihiutaleiden-kasvutekijän reseptoreita (PDGFRs) ja niiden ligandit, verihiutaleista peräisin kasvutekijät (PDGF) kriittisiä rooleja mesenkymaalisten solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä. Poikkeavuuksia PDGFR /PDGF arvellaan edistää useita ihmisen sairauksien ja erityisesti pahanlaatuisen [31].

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavaa RNA: ita, jotka osoittavat sääntelyn purkamiseen useimmat syövät. On yhä enemmän todisteita siitä, että niillä on merkittävä rooli patogeneesissä ja ennusteen ihmisen maligniteettien ja kestävyys kemoterapeuttisten [32,33]. Tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) laukaisee apoptoosin kasvainsoluissa, mutta kun sitä käytetään yksin, se on tehoton hoidettaessa TRAIL-resistenttejä kasvaimia. Tämä vastus on haastava TRAIL-pohjainen syöpähoitojen. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-34a ja miR-34c voimakkaasti downmodulated sekä NSCLC-soluihin ja keuhkojen kasvaimet verrattuna normaaleihin kudoksiin. Pakotettu ilmentymä miR-34a ja miR-34c vaimentua PDGFR-α ja PDGFR-β-mRNA ja proteiini tasoilla. Lusiferaasi ja western blot kokeet osoittivat, että PDGFR-α ja PDGFR-β ovat kohdistu suoraa miR-34a ja miR-34c muttei miR-34b. Vastus monien syöpätyyppien tavanomaisen kemoterapian on merkittävä tekijä heikentää onnistunut syövän hoitoon. AKT aktivointi vaikuttaa myös kasvaimen kehittymisen ja kasvaimen etäpesäke, ja kuten on esitetty viimeksi vastustuskyky kemoterapia [26,34]. Tämän seurauksena molemmat

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa yhdistyvät pienmolekyylisalpaajilla PI3K /Akt-reitin tavanomaisen kemoterapian ovat osoittautuneet toimiviksi lieventävät kemoterapeuttisten vastarintaa. Erityisesti estämään AKT toiminta voi olla pätevä lähestymistapa syövän hoitoon ja tehokkuuden lisäämiseksi kemoterapiaa.

Proteiinikinaasit ovat merkittäviä säätelijöitä useimpien solun signalointireittien. Niistä reseptori (RTK: t), kuten PDGFR, pelata keskeisiä rooleja edistämisessä solujen kasvun ja lisääntymisen transdusoimalla solunulkoinen ärsykkeitä solunsisäinen signalointi piirejä [35]. Merkittävä osa solunsisäisen signaloinnin koneisto on PI3K /Akt (PKB) /nisäkkään rapamysiinin kohde (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) reitin [36,37]. Poikkeava aktivaatio tämän reitin mutaation tahansa useiden geenien tiedetään esiintyvän useimmissa ihmisen syövissä eri mekanismien kautta [38,39]. Aikaisemmassa työssä [26], osoitimme, että MET, aktivoitumisen kautta PI3K /AKT-reitin, aiheuttama kasvaimen kehittymisen ja TRAIL vastustusta NSCLC. Siksi me arveltu, että PDGFR-α /β kautta aktivointi AKT koulutusjakson olisi oltava mukana TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Todellakin, yli-ilmentyminen miR-34a ja miR-34c tai alisäätely PDGFR-α /β jonka siRNA: t, erittäin lisääntynyt vaste Semiresistenttien NSCLC solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Tärkeää on, yhdistetty hoitoon PDGFR estäjän TRAIL, lisääntynyt apoptoosi ja vähentää solujen lisääntymistä, joka arvioidaan kaspaasi 3/7 määritys ja MTT määrityksissä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito TRAILin kanssa PDGFR estäjät voivat herkistää osajoukko keuhkotuumoreiden, jotka ilmentävät PDGF-reseptoreita, huumeiden. Lisäksi on tunnettua, että PI3K /AKT, kuten hyvin ERK1 /2 reitit säätelevät solujen muuttoliike ja hyökkäys eri syöpiä [40,41]. Täällä on raportoitu, että miR-34a ja miR-34c yli-ilmentymisen tai PDGFR-α /β hiljentäminen esti migraation ja invaasion kapasiteetti Calu-6 ja H1703-soluissa, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu miR tai siRNA-ohjaus. Pakotettu ilmentymä PDGFR-α tai PDGFR-β osittain palautettu NSCLC maahanmuutto- ja invaasion tukevat että ekspression säätelyn näiden reseptorien miR-34a /c on tärkeä rooli NSCLC kasvainten synnyssä. Olemme kuitenkin tunnustaa, että muut miR-34a /c tavoitteita, mukaan lukien c-Met [16] ja AXL [42] voisivat osallistua työhön. Vaikka tämä käsikirjoitus oli valmisteilla Silber et al. kertoi, että miR-34a ilmentyminen oli matalampi Proneuraaliset gliooma verrattuna muihin kasvain alatyyppeihin ja tunnistettu PDGFR-α välittömänä kohteena miR-34a [43]. Täällä me raportoimme, että ei vain miR-34a mutta miR-34c myös downregulates PDGFR-α in NSCLC soluissa. Lisäksi osoitamme, että PDGFR-β on miR-34a /c suora kohde, kun emme nähneet mitään merkittävää vaikutusta ilmaus PDGFR-α ja PDGFR-β jälkeen miR-34b täytäntöön ilme. Merkillistä, meidän tutkimus osoittaa, että estoa tai alisäätely PDGFR-α ja PDGFR-β by miR-34a /c antagonisoi tuumorigeenisyyteen ja lisää herkkyyttä TRAIL-solukuolema tärkeitä terapeuttista käyttöä tulevaisuuden kasvainhoitojen keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Keuhkosyöpä solulinjojen ja kudosnäytteiden

Ihmisen H460, A549, H1299, H1703 solulinjoja kasvatettiin RPMI, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 2 mM L-glutamiinia ja 100Uml-1 penisilliini-streptomysiiniä. Calu-6-solut kasvatettiin MEM, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia ja 100Uml-1 penisilliini-streptomysiiniä. 9 keuhkokasvaimia (mukaan lukien adenokarsinooma ja okasolusyöpä) ja niiden normaalit kollegansa olivat ystävällisesti Dr. S. P. Nana-Sinkam, Pulmonary, Allergy, Critical Care ja Sleep Medicine, Ohio State University Kattava Cancer Center, Columbus, OH. 48 keuhkojen normaali ja kasvain kudosnäytteitä hankittiin patologian osaston, Ohio State University. Kaikki ihmisen kudokset saatiin protokollan mukaisesti hyväksymän Ohio State Institutional Review Board.

lusiferaasianalyysissä

3 ’UTR ihmisen PDGFRA ja PDGFRB geenit, amplifioitiin PCR-menetelmällä käyttäen seuraavia alukkeita:

PDGFR-α FW 5 ’TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3’

PDGFR-α RW 5 ’TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 ”

PDGFR-β FW 5′ TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3 ’

PDGFR-β RW 5 ’TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3’

ja kloonattiin alavirtaan Renilla lusiferaasin lopetuskodoni pGL3 kontrollivektorille (Promega). Näitä rakenteita käytetään tuottamaan, käänteisellä PCR: p3′-UTRs- mutantti-plasmideja käyttäen seuraavia alukkeita:

PDGFR-α Mut1 FW 5 ’ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3’

PDGFR-α Mut1 RW 5 ’CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT

PDGFR-αmut2 FW: 5′ ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3 ’

PDGFR-αmut2 RW: 5′ AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3 ’

PDGFR-β Mut FW 5′ -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 ’

PDGFR-β Mut RW 5′- GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3′

Calu-6-solut kotransfektoitiin 1 ug p3’UTR-PDGFR-α, p3 ’UTR-PDGFR-β tai p3’UTRmut-PDGFR-α ja p3’UTRmut-PDGFR-β, 1 ug Renillan lusiferaasin ilmentymistä rakentaa PRL-TK (Promega) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Solut otettiin talteen 24 h transfektion jälkeen ja niistä määritettiin Dual Luciferase Assay (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiinien NSCLC uutettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskurissa (0,15 mM NaCl, 0,05 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% Triton, 0,1% SDS: ää, 0,1% natriumdeoksikolaattia ja 1% Nonidet P40). Näyte uutetta (50 ug) erotettiin 7,5-12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä (PAGE) käyttäen mini-geelin laite (Bio-Rad Laboratories), ja siirrettiin Hybond-C extra nitroselluloosa. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,05% Tween 20: tä, niitä inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen, pestiin ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen, ja visualisoitiin kemiluminesenssin. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-PDGFR-α, anti-PDGFR-β, anti-ERK1 /2, anti-p-ERK: t, anti-Pakt, anti-yhteensä AKT, anti-GAPDH vasta-aineita (Cell Signaling). Toissijainen anti-kani tai anti-hiiri-immunoglobuliini G (IgG) vasta-aine peroksidaasikonjugaatti (Chemicon) käytettiin.

Reaaliaikainen PCR

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen standardia TaqMan PCR kitin Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). 10 ui PCR-reaktiota sisältyy 0,67 ui RT tuote, 1 ui TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 mM-TaqMan-koettimella, 1,5 mM aluketta ja 0,7 mM reverse-aluke. Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppalevyllä 95

° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C

° C: ssa 15 s, ja 60

° C: ssa 1 min. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Kynnyssyklinä (CT) on määritelty murto-syklin, jossa fluoresenssi kulkee kiinteän kynnysarvon. Vertailevan CT menetelmä suhteellisen kvantisoinnin geenin ilmentymisen (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään miRNA ekspressiotasot. Y-akseli edustaa 2 (-ΔCT), tai suhteellinen ekspressio eri Mirs. MIRS ekspressio laskettiin suhteessa U44 ja U48 rRNA. Kokeita tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin aineiston pisteelle, ja data-analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa (Bio Rad).

solukuoleman ja solujen lisääntymistä kvantifiointiin

havaitsemiseksi kaspaasi 3/7 aktiivisuus, soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä kolmena kappaleena, käsiteltiin TRAIL (100-150ng /ml) ja analysoitiin käyttäen kaspaasi-Glo 3/7 Assay kit (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jatkuvien muuttujien ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta (S.D.). Solujen elinkelpoisuus tutkittiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-dipheniltetrazolium bromidia (MTT)-solujen tiitteri 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega), mukaisesti valmistajan protokollaa. Metabolisesti aktiivisia soluja havaittiin lisäämällä 20 ui MTT kuhunkin kuoppaan. Kun oli kulunut 1 h inkuboinnin jälkeen levyt analysoitiin Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories).

Anti-PDGFR-α ja anti-PDGFR-β siRNA: t transfektion

Soluja viljeltiin 50% konfluenssiin ja transfektoitiin ohimenevästi 72h käyttäen Lipofectamine 2000 100 nM anti-PDGFR-α ja /tai 100 nM anti-PDGFR-β SMARTpool siRNA tai ohjaus siRNA (Dharmacon), uima-allas neljä kohdespesifisen 20-25 nt siRNA: t on suunniteltu kaataa geeniekspressiota.

Mirna lukittu nukleiinihapon in situ -hybridisaatio formaliinia, parafiiniin upotettujen kudosleikkeiden

in situ -hybridisaatio (ISH) suoritettiin parafiini ihmisen keuhkojen kudoksia käyttäen aikaisemmin julkaistu protokollaa [44], joka sisältää ruoansulatusta pepsiini (1,3 mg /ml) 30 minuuttia. Sekvenssin koettimen, joka sisältää dispergoidun lukittu nukleiinihappo (LNA) modifioituja emäksiä digoksigeniinillä konjugoitu 5′-päässä oli: 5 ’ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3’. Koetin cocktail ja kudosten miRNA oli co-denaturoitiin 60

° C: ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen hybridisaatio 37

° C: ssa yön ja tiukka pesu 0,2x SSC ja 2% naudan seerumialbumiinia 4

° C: ssa 10 minuuttia. 0,05.