Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kasvainperäinen liukoisen tekijät, kuten liukoinen HLA-molekyylit, voidaan edistää syövän immuuni paeta ja siksi vaikutus kliiniseen kulkuun pahanlaatuisia sairauksia. Olemme aiemmin raportoitu, että melanooma solut tuottavat,

in vitro

, liukoiset muodot ei-klassisen luokan I MHC-molekyylin HLA-E (sHLA-E). Tutkiakseen sHLA-E tuotannon eri kasvaimet ja käsitellään sen mahdollisesti arvoa kasvaimeen liittyvän markkeri, kehitimme erityistä ELISA kvantifiointiin sHLA-E biologisissa nesteissä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Olemme kehittäneet sHLA-E spesifisiä ja herkkiä ELISA ja osoitimme, että seerumin sHLA-E tasot olivat merkitsevästi koholla (P 0,01) melanoomapotilaissa (n = 127), verrattuna terveisiin luovuttajien (n = 94 ). sHLA-E havaittiin myös viljelmän supernatantit erilaisia ​​kasvainsolulinjoja (n = 98), mukaan lukien melanoomat, munuaisen, paksusuolen ja peräsuolen ja rintasyöpiä. Sytokiinit sääntely sHLA-E tuotantoa tuumorisoluissa suoritettiin myös. IFN-γ: n, IFN-α: n ja TNF-α havaittiin upregulate sHLA-E tuotantoa tuumorisoluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Koska laaja kasvainkudoksen vapautumista HLA-E ja sen ylössäätöä inflammatoristen sytokiinien, sHLA-E olisi tutkittu sen osallisuudesta immuunivastetta kasvaimia vastaan. Mielenkiintoista on, että tuloksemme osoittivat, välistä positiivista seerumia että sen läsnäollessa sHLA-E ja melanooma. Näin ollen määritys sHLA-E tasolle käyttäen ELISA lähestymistapaa voidaan tutkitaan kliinisen markkeri syöpäpotilailla.

Citation: Allard M, Oger R, Vignard V, Percier JM, Fregni G, Périer , et ai. (2011) Serum Liukoinen HLA-E Melanooma: uusi Mahdolliset immuuni-Related Marker in Cancer. PLoS ONE 6 (6): e21118. doi: 10,1371 /journal.pone.0021118

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen de la Santé (CRP-Santé), Luxemburg

vastaanotettu: toukokuu 10, 2011; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2011; Julkaistu: 21 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Allard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia myöntämiä ”Ligue Nationale contre le Cancer” (labellisation 2007). Rahoittaja ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Evidences kertynyt osoittaa kykynsä immuunijärjestelmän tunnistamaan ja tuhoamaan pahanlaatuisia soluja, jotta estetään kasvaimen kehitykseen. Tätä prosessia kutsutaan syöpä immuunitutkimusohjelmasta, perustuu liittyi toiminnan efektorien synnynnäisen (NK, NKT-solujen, γδ T-solut, dendriittisolut) ja adaptiivisen (antigeenispesifisten T-ja B-solut) immuniteetti tunnistaa ja poistaa syntymässä transformoitujen solut. Kuitenkin, huolimatta hyvin määritelty immunogeenisen kasvaimen antigeenejä, ja jopa, kun läsnä on kasvaimen antigeeni-spesifisten sytotoksisten T-solujen, immuunijärjestelmä ei näytä olevan täysin tehokas hävittämään kasvaimet [1].

useita mekanismeja ovat sekaantuneet kasvain immuuni paeta, kuten rakenteellisia ja toiminnallisia korjauksilla HLA (HLA), jotka edustavat usein tapahtumia syövissä. Tämä kuuluu klassinen HLA luokan I (HLA-A, -B, -C) menetys tai alisäätely ja poikkeava ilmentyminen kuin klassisen HLA luokan I antigeenejä (HLA-E, -G), joka tarjoaa mekanismit johtavat lasku tunnustus ja kasvainsolujen tuhoutumiseen immuunijärjestelmän sytotoksisten efektorien (pääasiassa CTL ja NK-solut) [2]. Kiinnostus ei-klassisen HLA-molekyylejä on kannustanut sen osoittaminen, että ne voivat vaikuttaa NK ja T-solujen kasvainsolujen paeta kautta vuorovaikutuksessa NK estävä reseptoreihin [3] – [6]. Lisäksi tuotetaan ei-soluihin sitoutunut liukoinen HLA (sHLA) molekyylejä, on myös kuvattu, ja se voi olla vaihtoehtoinen strategia syövän immuunivasteen paeta [7], [8]. Tueksi Tämän hypoteesin sHLA molekyylien on osoitettu aiheuttavan

in vitro

inhibitio ja /tai apoptoosin CTL ja NK [9], [10]. Lisäksi lisääntynyt seerumin klassisen ja ei-klassisen sHLA on kuvattu useissa pahanlaatuisia sairauksia, ja niiden ennustetekijöitä merkitystä on ehdottanut tilastollisesti merkittävää yhteyttä korkea vaiheessa sairaus tai erityistä kliinistä kurssi oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [11].

aiemmin havaittu, yhteistyössä patologia, usein HLA-E mukaan ihosyövän ja paksusuolikarsinoomat [12]. Tutkimukset ryhmämme ym tuetaan immunosuppressiivinen mahdollisuuksia tämän ilmaisun kautta sitoutuminen CD94 /NKG2A estävä NKR on sytotoksisia soluja (NK ja CD8 TIL) kasvaimen solukalvon HLA-E [13] – [16]. Meillä on myös raportoitu, että melanoomasolulinjoissa voi tuottaa liukoisia muotoja HLA-E (sHLA-E)

in vitro

, jonka proteaasi riippuvainen irtoaminen pinnan molekyylejä, ja että tämä tuotanto lisääntyi IFN-γ [12] .

tavoitteena läsnä oli kehittää ELISA-määritystä havaitsemiseksi ja kvantifiointia sHLA-E biologisissa nesteissä, vahvistaa sen erityispiirteet ja, jos riittävä, käsitellä kliinistä merkitystä sHLA- E veressä melanooman potilaista.

tulokset

kehittäminen HLA-E erityinen ELISA

havaitsemiseen ja kvantifioimiseen sHLA-E biologisista näytteistä, kehitämme sandwich-ELISA käyttämällä noncompeting kiinteitä talteenoton ja biotinyloitua havaitsemiseen anti-HLA-E monoklonaalisia vasta MEM-E /08 ja MEM-E /07 vastaavasti. Ensimmäinen konsentraatioalueella puhdistettua liukoista yhdistelmä-HLA-E (rsHLA-E) testattiin. Esitetyssä A kuviossa 1A, rsHLA-E havaittiin vähintään pitoisuutena 5 pg /ml. Koska raportoitu ristireaktiivisuus sekä anti-HLA-E Abs neljällä HLA luokan Ia alleelimuotoja: HLA-A23, -B7, -B8 ja -B27, me sitten tarkistetaan niiden havaitseminen käyttämällä suunniteltu ELISA-määritystä. Niistä liukoista yhdistelmä-HLA-A23, -B7, -B8 ja -B27 sekä rsHLA-A2 käytettiin negatiivisena kontrollina, vain heikko signaali saatiin rsHLA-B7 maksimiannos 20 ng /ml (Fig. 1 B).

A /havaitseminen sHLA-E käyttäen sarjalaimennoksia yhdistelmä-HLA-E monomeeriä. Harmaa alue ilmaisee erilaisia ​​mitattavissa sHLA-E tasolle. B /määrittäminen HLA-E sitovan spesifisyyden. Laimennussarjoja HLA-A2, -A23, -B7, -B8 ja -B27 liukoista yhdistelmä monomeerejä on testattu verrattuna yhdistelmä-HLA-E monomeeriä.

Nämä tulokset johtivat päätelmään, että sandwich-ELISA on kuvattu tässä on erittäin spesifinen ja herkkä HLA-E, ja sitä voitaisiin käyttää seulontamenetelmä havaitsemiseksi sHLA-E biologisista näytteistä.

Lisääntynyt liukoisen HLA-E seerumeissa melanoomapotilailla

seulotaan seerumeista 94 terveiltä luovuttajilta ja 127 melanoomapotilaita ilman nykyinen hoito läsnäolo sHLA-E (taulukko 1). Olemme havainneet sHLA-E seeruminäytteistä sekä terveiden ja potilaan luovuttajien laimennus-riippuvaisella tavalla (kuvio. 2A), mikä osoittaa, että tämä ELISA voidaan käyttää määrittämään sHLA-E seeruminäytteet. Ottaen huomioon mahdolliset ilmaantuvuus iän ja sukupuolen, ei ole merkittäviä eroja sHLA-E tasot havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Yksittäiset arvot seerumin sHLA-E on esitetty piste-juoni käyttäen log asteikko (Fig. 2B) ja välineet, mediaanit ja vaihteluvälit merkitty taulukossa 2.

A /antava havaitsemiseen sHLA-E käyttäen sarjalaimennoksia kaksi seeruminäytteistä ELISA: lla. B /jakelu liukoisen HLA-E pitoisuudet seerumissa terveillä verrokeilla ja melanooma potilaiden. P-arvo osoittaa eron näiden kahden ryhmän välillä. C /Prosenttiosuudet positiivinen sHLA-E-seerumeiden (sHLA-E≥5 pg /ml) terveillä luovuttajien ja melanooma potilaiden. D /jakelu liukoisen HLA-E pitoisuudet seerumissa melanooman potilaiden osalta kasvaimen vaiheissa.

melanooma potilaiden seerumin sHLA-E (mediaani [alue] ) lisääntyivät merkitsevästi verrattuna terveisiin kontrolleihin (9 pg /ml [0-2544] vs 0 pg /ml [0-1224], vastaavasti, p 0,001). Kvantifioimiseksi taajuutta sHLA-E-positiivinen seerumi, otamme raja-arvo on 5 pg /ml. Tämä analyysi paljasti, että ryhmässä 94 terveiden luovuttajien, sHLA-E voitiin havaita 30 seerumista (31,9% kokonaismäärästä). Sen sijaan, melanoomapotilailla, 68 ulos 127 seerumista (53,5% kokonaismäärästä) sisälsi sHLA-E (Fig. 2C). Siten prosenttiosuudet positiivinen seerumi olivat merkittävästi korkeammat melanoomaa potilailla verrattuna terveisiin luovuttajien (p 0,001). Alaryhmäanalyysissä harkitsee AJCC vaiheissa (American sekakomitean Cancer, https://www.cancerstaging.org/) suoritettiin sitten. Ei suhdetta seerumin sHLA-E tasojen havaittiin suhteessa kasvaimen luokittelu (Fig. 2D). Kuitenkin, kuten on esitetty taulukossa 1, sHLA-E tasot olivat lisääntyneet huomattavasti vaiheessa III melanooma potilailla verrattuna terveiden luovuttajien (p 0,0001).

Yhdessä nämä tulokset validoitu ELISA määrittämiseksi sHLA-E ihmisen seerumia ja osoittivat, että sHLA-E on merkittävästi kasvanut seerumeissa melanoomapotilailla.

liukoisen HLA-E, jonka erilaiset paneelin ihmisen kasvaimen solulinjojen

Analysoimme tuotannon liukoisen HLA-E 98 eri perustettu ihmisen tuumorisolulinjoja, jotka edustavat kiinteitä kasvaimia, kuten melanoomat (n = 30), karsinoomien (keuhko- (n = 5), colo-peräsuoli (n = 12), munuaisen (n = 10 ), munasarja (n = 3), rinta (n = 11) ja eturauhasen (3)), kilpirauhasen syöpä (n = 1), kohdunkaulan syöpä (n = 1), sarkoomat (osteosarkoomat, n = 3), gliooma (n = 2) ja neste kasvaimet (mesotelioomatapausten (n = 7), myeloomat (n = 7) ja leukemiat (n = 3)). Kuten on esitetty kuvioissa 3A ja 3B (valkoinen), sHLA-E havaittiin supernatanteista kasvainsolulinjoissa, jotka ovat peräisin eri alkuperää testattu, lukuun ottamatta supernatantissa munasarjojen kasvainten, myelooma, leukemiat ja glioomasolulinjoja (Fig. 3 ja dataa ei esitetty). Meidän viljelyolosuhteet (500 000 solua, 3 ml, 48 tuntia), tasot sHLA-E luonnollisesti tuotettu kasvaimen solulinjat vaihtelevat 5-400 pg /ml. Korkein tuotannot havaittiin keskuudessa melanooma, peräsuolen ja munuaisten tuumorisolulinjoja. Taajuus analyysi kasvaimen solulinjojen pystyy tuottamaan sHLA-E (ottaen cut-off-arvo on 5 pg /ml) paljasti, että noin kolmasosa kasvaimen solulinjat tuottivat sHLA-E (24,5%, 24: 98) osuus on suurempi saatu melanooman (40%, 12 ulos 30) ja munuaissolukarsinooma (40%, 4 10) (Fig. 3C).

analyysi liukoisen HLA-E pitoisuudet supernatanteissa kasvainsolulinjoja käsitelty tai ei ole IFN-γ osalta kasvaimen alkuperän: jakelu yksittäiset pitoisuudet (A), keskimääräinen tasot (B) ja prosenttiosuudet positiivisen supernatantteja (sHLA-E≥5 pg /ml) (C).

valikoiva sääntely sHLA-E tuotantoa sytokiinien

Olemme aiemmin osoittaneet, että IFN-γ lisäsi pinnan HLA-E ja leviämistä liukoisen HLA-E mukaan melanoomasoluja. Tämän vahvistaa tulos ja laajentaa paneeli testattiin sytokiinit, vaikutus IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, IFN-a2a: n, IFN-γ: n, TNF-α: n ja GM-CSF, kun tuumorisolulinjoja sHLA-E tuotantoa testattiin. Kuten odotettua, sHLA-E vapautuminen indusoitiin tai merkittävästi lisääntynyt kasvaimen solusupernatanttien jälkeen IFN-γ aktivointi (p 0,0001). Taajuus analyysi kasvaimen solulinjojen pystyy tuottamaan sHLA-E jälkeen IFN-γ hoidon kaksinkertaistui (24,5%: sta 49%, 48: 98) (Fig. 3C). Vähemmässä määrin, altistuminen IFN-α: n ja TNF-α huomattavasti tuotantoa sHLA-E by kasvainsolulinjoja (p 0,001 ja p 0,05 vastaavasti). Nämä tulokset on esitetty kuviossa 4A käyttäen kahta melanoomasolulinjoja (M88 ja M102) ja yksi paksusuolen adenokarsinooman solulinja (HT29). Muut testattu sytokiinien ei ole vaikutusta tähän tuotantoon. Kineettinen analyysi ja annos-vaste-kokeet suoritettiin IFN-γ: n, IFN-α: n ja TNF-α. Kuten on esitetty kuviossa 4B, sHLA-E tuotanto lisääntyi merkitsevästi annoksesta riippuvaisella tavalla maksimaalinen vaikutus havaittiin 10 ng /ml kolmen sytokiineja. Tämä tuotanto oli havaittavissa jo 1. päivänä sytokiinien hoidon tuumorisolujen ja oli maksimaalinen 48 tunnin kuluttua (Fig. 4C).

A /sHLA-E havaitseminen supernatanteista kolmesta tuumorisolulinjoja: kaksi melanoomasolujen linjat (M88 ja M102) ja yksi colocarcinoma solulinja (HT29), käsiteltiin tai ei IFN-α: n, IFN-γ: n tai TNF-α (10 ng /ml, 48 h). Merkittävät erot ohjaus ja hoito-arvot osoitetaan (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). B /sHLA-E havaitsemiseksi viljelysupernatanteista M102 käsiteltiin sarjanumero pitoisuuksilla IFN-α: n, IFN-γ: n ja TNF-α: ssa 48 tuntia. C /aikakäyrä sHLA-E tuotannon supernatantista M102 hoidettiin enintään 6 päivän ajan 10 ng /ml IFN-γ.

Keskustelu

Tämä tutkimus antaa näyttöä, että seerumin sHLA-E lisääntyy merkittävästi potilailla, jotka kärsivät melanooma verrattuna normaaliin yksilöitä, riippumatta iästä ja sukupuolesta. Teimme tämän analyysin avulla, käyttäen spesifinen ja herkkä ELISA, että olemme kehittäneet ja validoitu määrittämiseksi sHLA-E tasot biologisissa nesteissä. Tässä suuressa tutkimuksessa, mukaan lukien 221 yksilöitä, havaitsimme kohonneita seerumin sHLA-E, samoin kuin korkeamman taajuuden sHLA-E-positiivisia seerumeita potilailla, joilla on ihosyövän verrattuna terveiden luovuttajien. Ottaen huomioon kasvain luokittelua, kun taas sHLA-E tasot näyttivät nousta kehittyneitä sairauden vaiheisiin asti vaiheessa III, emme löytäneet merkitsevästi yhteydessä seerumin sHLA-E tasoilla ja melanooma vaihe, mikä voi johtua epäoikeudenmukainen jakautuminen potilaiden alaryhmä. Kuitenkin, jos verrataan terveiden luovuttajien, potilailla, joilla on vaiheen III melanooma näytteillä erittäin korkeissa sHLA-E seerumin tason kannalta sekä keskittyminen ja tiheys positiivinen seerumi. Toisaalta potilaita, joilla on vaiheen IV tauti esillä alhaisempi sHLA-E, joka on sopusoinnussa heikko spontaani HLA-E, jonka metastaattinen kasvain kohdat, jotka olemme aikaisemmin raportoineet immunohistokemiallisesti [12].

Nämä tiedot korosti kiinnostus liukoisten, ei-klassiset HLA-I molekyylien pahanlaatuisia sairauksia. Toinen ei-klassiset HLA-I molekyylin, HLA-G, on tunnistettu erilaisia ​​maligniteetteja kuten syöpien ja on saanut paljon huomiota viime julkaisuissa. Kliinisissä tutkimuksissa on osoitettu, että sHLA-G tasot olivat merkittävästi koholla potilaiden seerumeista pahanlaatuisten ihosyövän, gliooma, rinta- ja munasarjasyövät, ei-pienisoluinen-keuhkosyövässä (NSCLC), krooninen lymfosyyttinen leukemiat, B-solujen ja T-solujen Non-Hodgkin- lymfoomat [17] – [21]. Lisäksi, Zhu et ai. osoittivat, että seerumin sHLA-G tasoilla voisi olla hyödyllinen indikaattori erottavien kolorektaalisyövissä hyvänlaatuisesta peräsuolen sairauksia [22]. Lopuksi sHLA-G taso oli myös merkittävästi korkeampi maligni askites munasarjojen ja rintakarsinoomista kuin hyvänlaatuinen tarkastuksia [23]. Vastaavasti, kohonneet stressi-indusoituva MHC-luokan I ketjuun liittyvä pinnan glykoproteiineja, MICA ja MICB, on todettu korreloivan syövän vaiheissa ja etäpesäkkeiden useissa karsinoomissa [24] – [26]. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset yhteneväisesti paljasti suurempia määriä kuin klassisen HLA-I molekyylien biologiset nesteet (veri ja askites) kärsivien potilaiden erilaisia ​​syöpiä.

Koska me ja muut ovat aikaisemmin havainneet sHLA-E supernatantit melanooman ja peräsuolen solulinjojen Western blot -analyysillä, tutkimme, käyttämällä suunniteltu ELISA, tuotannon sHLA-E kasvaimen johdetut solulinjat suurta kasvain luokkaan, mukaan lukien kiinteät kasvaimet, kuten melanooma, rinta-, paksusuolen ja munuais- ja neste kasvainten mesotelioomatapausten ja myeloomat [12], [27]. Osoitimme, että sHLA-E spontaanisti tuotetaan 25% testatuista solulinjoista (24 ulos 98), jotka ovat peräisin useita erilaisia ​​ihmisen kasvaimista, erityisesti melanooma, peräsuolen ja munuaisten syövät. Joten, on mielenkiintoista käsitellä mahdollisia ennakoivaa ja ennusteen arvioinnissa on sHLA-E veressä potilaiden kärsivät näistä syövistä.

Olemme myös tutkineet vaikutus erilaisten sytokiinien HLA-E tuotannon kasvainsolulinjoja. Mukaan edellisessä tuloksia melanoomasolulinjoja [12], osoitimme, että IFN-γ: n indusoimien tai lisääntynyt sHLA-E, mikä puolestaan ​​johtaa tuotannon sHLA-E 50% tuumorin testatuista solulinjoista (48: 98) . Lisäksi vapautuminen sHLA-E myös ohjaavat IFN-α ja TNF-α vähemmässä määrin. Ottaen huomioon, että IFN-γ ja IFN-α ovat korkeat indusoijia HLA-I molekyylien ilmentyminen, niiden vaikutus sHLA-E tuotanto todennäköisesti heijastavat kasvua HLA-E ilmentyminen kasvainsoluissa. Koska sHLA-E vapautumisen melanoomasoluja on pääasiassa matriksimetalloproteinaasi-riippuvainen, TNF-α vaikutus HLA-E tuotanto voisi johtua kyky TNF-α edistää matriksimetalloproteinaasi ilmaisun [12], [28]. Nämä tulokset ovat samansuuntaisia ​​kuin Coupel

et al.

Esittää sHLA-E tuotantoa endoteelisolujen käsittelyn jälkeen IFN-γ ja TNF-α [29]. Silti oppositiossa tutkimuksessaan, emme noudata mitään vaikutusta IL-1β kohtelu sHLA-E tuotantoa tuumorisoluissa, johtunee alhainen IL-1-reseptorin (IL-1R1) kasvaimen solulinjojen testattu tutkimuksessamme. Kuitenkin, kuten on raportoitu, että kasvaimen solulinjojen, mukaan lukien melanooma solulinjat, voidaan ilmaista IL-1R1, voimme olettaa, että IL-1β, jonka tiedetään edistää matriksimetalloproteinaasi ilmaisun voisi lisätä tuotantoa sHLA-E IL -1R1 ilmentäviä tuumorisoluja [30], [31].

koska sen vaikutus kasvainsolujen proliferaatiota, angiogeneesiä ja sen immunomodulatorisia kapasiteettia, IFN-α käytetään immunoterapiassa hoidettaessa erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia , kuten melanooman ja munuaisen karsinooma [32]. Sen vuoksi, kuten olemme osoittaa sen kyky upregulaatioon sHLA-E tuotantoa tuumorisolulinjoja, systeeminen hoito IFN-α voi lisätä sHLA-E tuotannon melanoomapotilailla. Tässä tuki, IFN-α hoito liittyy kohonnut sHLA-G seerumin melanoomapotilailla [33]. Lisäksi on raportoitu, että γ-säteilytys downregulates pinnan HLA-G1 melanoomasoluissa, tehostamalla proteolyyttisen tämän molekyylin [34]. Joten, on mielenkiintoista selvittää, onko tämä mekanismi on myös havaittu HLA-E, joka sitten vapautuu kasvaimeen microenvironment ja täten vaikuttaa paikallisen immunologinen tila.

Riippumatta mahdollisista mekanismi sHLA- E tuotanto on tärkeää korostaa sitä, kuinka sukupolvi sHLA-E kasvainsolujen voisivat osaltaan varten immuunitutkimusohjelmasta paeta. Koska vuorovaikutus kalvoon sitoutuneen HLA-E, jossa inhiboivaa reseptoreihin CD94 /NKG2-A indusoiman inhibition NK ja T-solujen vastausten immunosuppressori aktiivisuus sHLA-E on tutkittava. Tueksi mahdollisen immunoregulatorisia fonction, Coupel

et al.

Raportoitu että sHLA-E suojaavat endoteelisolujen NK-solujen hajoamiseen [29]. Lisäksi sHLA-G ja sMICA on osoitettu vähentävän immuunijärjestelmän tunnustamista ja kasvainsolujen tuhoutumiseen. sHLA-G, kautta vuorovaikutus estäjä reseptoreiden ILT-2 ja ITL-4, on osoitettu estävän lyyttisen aktiivisuuden NK-solujen, apoptoosin CD8

+ CTL, vaikuttaa CD4

+ alloproliferation ja heikentää NK /DC ylikuulumisen [35] – [38]. Lisäksi kasvain- liukoinen MICA indusoi endosytoosin ja hajoamisen sukulais activatory reseptorin NKG2-D kasvainten tunkeutuvia lymfosyyttejä, heikentäen niiden aktivaation [29], [39]. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot korosti kasvain- liukoinen NKR ligandeja tuottamalla kasvaimeen mikroympäris- suosii immuuni paeta. Lisäksi on raportoitu, että sHLA-G on valmistettu

in vitro

monomeeriset ja multimeeriset muodot ja että sHLA-G dimerisaatio täydentää ILT-2-välitteinen inhibitio T-solun alloresponse [40]. Niin, että on olemassa sHLA-E multimeerien olisi myös tutkittava.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimus tarjoaa ensimmäistä kertaa todisteita kohonnut sHLA-E seerumeista melanoomapotilailla, joka osoittaa, että HLA-E ehkä toimii kliininen markkeri ennustetta tai ennustaminen kliinisiin tuloksiin näiden syöpien erityisesti yhteydessä immunoterapian. Koska herkkä sHLA-E-ELISA on käytännön etuja laajamittaisen seulonnan, se voitaisiin hyväksyä rutiinikäyttöön immunologisessa seurantaan ihosyövän ja muiden ihmisen syövissä. Vaikka toiminta kasvain- liukoisen HLA-E on määriteltävä, voimme olettaa, että nämä molekyylit voivat vahvistaa isännän immunosuppressiota estämällä toimintoja NK ja T-solujen, ja siten suosivat selviytymisen syöpäsoluja. Kliinisesti merkittävistä tehtävä näiden sHLA-E molekyylejä on analysoitava huolellisesti, jotta voitaisiin kehittää asianmukaisia ​​immunoterapeuttisia strategioita.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

MEM-E /07 ja MEM-E /08 mAb: itä (Exbio, Tsekin tasavalta), joka sitoo natiivi HLA-E proteiineja käytettiin ELISA.

peptiditekijät Rekombinantti liukoinen HLA

peptidit hankittiin Eurogentec (Angers , Ranska). Puhtaus ( 85%) kontrolloitiin käänteisfaasi-korkean suorituskyvyn nestekromatografialla. Monipuolinen HLA ja β2-mikroglobuliinin rekombinanttiproteiineja uudelleenlaskostettiin kanssa seurasi osoitetuista synteettisiä peptidejä. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201 signaalipeptidi) ja HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-A

27-35) monomeerit tuotettiin rekombinanttiproteiinin laitos (IFR 26, Nantes). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL ja HLA-B * 2705 /HRCQAIRKK monomeerit toimitti tetrameeri tuotantolaitoksen (Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne, Sveitsi) .

potilaat ja näytteet

Sera kerättiin Melanoomapotilaiden (n = 127), joissa kaikissa on virallista suostumusta. Seerumit terveiltä luovuttajilta (n = 94) toimittivat Etablissement Français du Sang (EFS) (Nantes, Ranska) ja käytettiin kontrolleina.

Ethics lausunto

kirjalliset suostumukset saatiin kaikilta potilaiden ja terveillä luovuttajilla. Kaikki nämä tutkimukset hyväksynyt paikallisten eettisten commmitees ”Comité de Protection des personnes Ouest IV-Nantes” ja ”Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé”.

Solulinjat kulttuuri

melanoomasolulinjojen perustettiin GMP yksikkö Cellular Therapy ja laboratoriossamme (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Ranska) ja kuuluvat Biocollection PC-U892-NL (CHU Nantesin). Kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat ostettiin ATCC tai perustettu laboratoriossamme UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU Nantesin). Munuaisten sinoomasolulinjoja perustettiin INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, Pariisi, Ranska) [41]. Rintasyöpä solulinjoja ostettiin ATCC tai perustettu laboratoriossamme UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU Nantesin). Keuhkosyöpä solulinjojen ja mesoteliooma solulinjat ostettiin ATCC tai lahjoja M. Grégoire (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, France, Biocollection PC-U892-MG, CHU Nantesin). Myeloomasolut linjat olivat lahjoja C. Pellat (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, France, Biocollection PC-U892-MA, CHU Nantesin). Munasarjasyöpänäytteissä, gliooman, leukemia, kilpirauhasen, kohdunkaula ja eturauhassyövän solulinjat ostettiin ATCC ja ystävällisesti C. SAI, F. Vallette ja F. Pariisi (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Ranska). Luusarkoomasoluissa linjat hankittiin ATCC ja lahjoja M. Padrines (EA3822, INSERM U957, Nantes, Ranska). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI tai DMEM, jossa on 10% naudan sikiön seerumia (FCS, PAA, Itävalta).

Kasvain supernatantit tuotanto

sHLA-E tuotannon seulontaan, 500 000 kasvainsoluja viljeltiin 6-kuoppaisille levyille 3 ml: ssa 10% FCS-RPMI, täydennetty tai IFN-γ (20 ng /ml). 48 tunnin kuluttua kasvaimen supernatantit kerättiin, sentrifugoitiin 5 min nopeudella 2500 g ja säilytetään pakastettuina ennen testattavaksi ELISA.

vaikutus muiden sytokiinien alle sHLA-E tuotantoa, on alun perin testattiin 20 ng /ml, kun 48 tuntia kahdella ihosyövän solulinjojen (M88 ja M102) ja yksi peräsuolen adenokarsinoomasolulinja (HT29). Annos-vaste ja kinetiikan arviointi IFN-γ: n, IFN-a2a: n ja TNF-α oli toissijaisesti suoritettiin kuten on kuvattu (pitoisuutena, joka vaihtelee 40 0,02 ng /ml aikana 1-6 päivää), jossa näiden kolmen kasvaimia solulinjoissa.

Detection of sHLA-E ELISA

Nunc-Immuno MaxiSorp Mikrotiitterilevyt päällystettiin (50 ul /kuoppa) MEM-E /08 mAb 1 ug /ml karbonaatti /bikarbonaatti-puskurissa (CO

3HNa 35 mM, CO

3Na

2 15 mM, pH 9,5) yön yli 4 ° C: ssa. Neljän pesun jälkeen PBS-0,05% Tween 20: tä (200 ui /kuoppa), levyt kyllästettiin PBS: llä, joka sisälsi 10% FCS: ssa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (200 ul /kuoppa). Neljän pesun jälkeen, biologisten näytteiden (50 ul /kuoppa, joka on mahdollisesti laimennettu kyllästyspuskuriin) lisättiin (kolmena kappaleena) ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Viljelysupernatantit analysoitiin laimentamaton ja kuusi kaksoislaimennuksessa seerumeista käytettiin. Havaitsemisvälineet biotinyloitu MEM-E /07 mAb laimennettiin 1 ug /ml kyllästys- puskuriin, lisättiin sen jälkeen, kun neljä pesua (50 ul /kuoppa) ja inkuboitiin uudelleen 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Levyt pestiin neljä kertaa ja inkuboitiin strepta-HRP-reagenssia (BD Pharmingen), joka oli laimennettu 1/1000 kyllästys- puskuriin, 1 h huoneen lämpötilassa. Lopuksi levyt pestiin neljä kertaa ja inkuboitiin substraatin (3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidiiniä neste, Sigma, ST Qentin Fallavier, Ranska) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä (100 ul /kuoppa). Reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 ul /kuoppa 1 M H

3PO

4. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä Thermo Scientific Multiskan EX. Analyysi standardikäyrän ja interpolointi näytteiden pitoisuudet tehtiin käyttämällä Prism 5 Software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Tilastollinen

Sera syöpäpotilaiden verrattiin sera terveiden luovuttajien. Mukaan ei-parametriset jakelu sHLA-E seerumin tiedot esitettiin avulla, mediaanit, vaihtelee ja prosenttiosuudet positiivinen sHLA-E seerumit. Yleiseen vertailu kahteen ryhmään, tilastollinen analyysi suoritettiin Mann-Whitney U -testillä. Jakelu pitoisuuksien poikki vaiheessa arvioitiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä. Vertaamaan taajuutta positiivisen sHLA-E seerumit, Fisherin testiä käytettiin. Tilastollinen analyysi modu vaikutus sytokiinien on sHLA-E tuotantoa kasvainsolulinjoissa suoritettiin yksisuuntainen ANOVA ja sen jälkeen postitse hoc Bonferronin testi. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Prism 5 Software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Kiitokset

Kiitämme Pr Marie-Françoise Avril (APHP, Hôpital Cochin, Service de Dermatologie, Pariisi, Ranska) tarjoamiseksi melanooman verinäytteitä. Kirjoittajat myös kiittää Philippe Guillaume päässä tetrameeri tuotantolaitos Ludwig Institute for Cancer Research (Lausanne, Sveitsi) tuotantoa varten HLA monomeerien.