Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fosfory- molekyylejä ovat biomarkkerit syövän patofysiologian ja kestävyys terapian, mutta koska fosfoproteiinituote analyytit ovat usein labiileja, huonosti hallinnassa kliinisen laboratorion käytännöt voitaisiin estää käännös tutkimustuloksia tällä alalla alkaen penkki sängyn. Siksi verrattuna useita biomarkkereiden ja fosfoproteiini immunohistokemia (IHC) johtaa 23 kliinisessä kolorektaalikarsinoomasta näytteistä jälkeen joko uusi, nopea kudoksen kiinnittäminen protokollaa tai standardia kudoksen kiinnittäminen käyttämästä protokollasta kliinisissä laboratorioissa, ja tutkimme myös vaikutusta määritellyn postoperatiivisen ”kylmä” iskemia ajan seuraavilla IHC tuloksiin. Olemme havainneet, että yhden tunnin kylmäiskemia välein, sallitaan ASCO /CAP ohjeet tiettyjen syöpäsolujen biomarkkerina määrityksissä, on erittäin haitallista tiettyjä fosfoproteiini analyyttien, erityisesti fosforyloitu epidermaalisen kasvutekijän reseptori (pEGFR), mutta lyhyempi iskeeminen välein (alle 17 minuuttia) helpottaa säilyttämistä fosfopro-. Toiseksi, huomasimme, että nopea 4 tunnin, kaksi lämpötila, formaliinilla kiinnittäminen tuotti ylivoimainen värjäytymisen useissa tapauksissa valitse markkereita (pEGFR, pBAD, Pakt) verrattuna standardi yön yli huoneenlämmössä kiinnittäminen protokollaa, vaikka ottaen vähemmän aikaa. Nämä havainnot osoittavat, että tulevan tutkimuksen ja kliinisen apuohjelmia fosfoproteiini- IHC arvioimiseksi kolorektaalikarsinooman patofysiologia ehdottoman riippuvaisia ​​huomiota preanalytical tekijöitä ja tiukasti kontrolloitua kudoksen kiinnittäminen protokollia.

Citation: Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) immunohistokemia paksusuolisyövän biomarkkereiden fosforylaatiomääritys edellyttää hallittua Tissue Fixation. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10,1371 /journal.pone.0113608

Editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 28 lokakuu 2014; Julkaistu: 19 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Theiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus osarahoitteinen tutkimus avustuksen GSB Ventana Medical Systems, Inc. ei ole lupanumeroon liittyvät tähän sopimukseen tutkimus myöntää. Tutkimus oli kehittäneet yhteistyössä GSB: n toimielimen ja Ventana, ja siten Ventana työntekijää oli mukana kaikissa vaiheissa tutkimus (tutkimuksen suunnittelu, tietojen kerääminen, analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoitus). Loput osa tästä työstä rahoittivat sisäinen University of Washington varoista.

Kilpailevat edut: Geoffrey Baird on lukenut lehden politiikka ja laatijat käsikirjoitus on seuraavat kilpailevia intressejä: Ilmoitetut laatijat ovat työntekijöitä Ventana Medical Systems, Inc. Tämä ei muuta mitään tekijän sitoutuminen tahansa PLoS One politiikkaa.

Johdanto

täsmähoitoihin paksusuolen syövän, on ollut viime aikoina huomiota saatettu tunnistamisen tärkeyttä aktivointi valtiot solusignalointimolekyylien ennustamiseen vastauksia hoidon. Hyvä esimerkki on EGFR-välitteinen aktivoituminen MAPK signalointia, joka edistää epäherkkyys BRAF-mutantin peräsuolen karsinoomat RAF inhibitioastetta Vemurafenib [1]. Tärkeämpää tämä pEGFR uudelleenaktivointia tapahtuma edellyttää mukauttamisen EGFR: n estäjien, ja yhdistetty polyterapiassa BRAF ja EGFR: n estäjien voittaa tämän resistenssin, jossa hyödyllinen vaste

in vitro

ja eläinmalleissa

in vivo

.

laajentaminen näiden ennen laboratoriolöydöksistä klinikalle, ja kykymme vaikuttaa vaihtoehtoisia hoitoja, on täysin riippuvainen kyvystämme tarkasti säilyttää ja tunnistaa aktivoinnin valtioiden osalta. Pyrkiessään määrittää optimaalisen säilymisen (kudoksen sitomiseen) edellytykset tukea kohdennettuja terapiassa, kirjallisuudessa on johtanut meidät kyseenalaistamaan, onko normaali käytäntö anatominen patologian laboratorio riittää kattamaan kaikkia mahdollisia sudenkuoppia, jotka voivat vaikuttaa biomarkkereiden /aktivaatiotilaa säilyttäminen. Esimerkiksi omassa kliinisen laboratorion kokemus, kudosnäytteet voi jätetään huoneenlämpöön ennen upottamista fiksatiivissa pitkiä aikoja, ja todellinen aika kiinnitysnesteeseen, ja lämpötila, jotka fiksatiivi, joskus huonosti hallinnassa. Nykyinen Yhdysvaltain ammattilainen asiaa koskevat suuntaviivat [2] – [4] käsitellä vain rajallinen määrä kliinisestä näytteestä tyyppejä ja loppupään biologisten merkkiaineiden analyysit, tai ovat edelleen melko laaja määritellä, mitä pidetään hyväksyttävänä suhteen kiinnityksen ajan (2-kertainen vaihtelu suurimpaan kiinnitys ajan, 16-32 tuntia, suositellaan CLSI ohjeita, ja 12-kertainen valikoima kiinnittäminen kesto, 6-72 tuntia, pidetään hyväksyttävänä ASCO /CAP rintasyövän merkki suuntaviivat). Ennalta fiksaatio ”kylmäiskemia” aika enintään yhden tunnin katsotaan myös hyväksyttävää jossakin näiden suuntaviivojen [3], joka on alueella, mitä olemme havainneet kliinisesti omassa toimielimissä. Edellinen syöpä biomarkkereiden Immunohistokemiatutkimukset ovat todellakin löytäneet ~ 1 tunti iskemian kertaa hyväksyttäviä, vaikka nämä tutkimukset ovat keskittyneet lähinnä perustettu biomarkkerit kuten estrogeenireseptorin ja HER2 [5], [6]. Kuitenkin suuntaviivojen jotka ovat olemassa, kukaan tarkoituksena on ratkaista säilyttämiseen biomarkkereiden aktivoinnin valtiot kuten fosforylaatio todetaan ollenkaan. Tämä on erityisen ongelmallista, koska fosforylaatio valtiot ovat olleet tunnettuja jo jonkin aikaa olevan erittäin herkkiä preanalytical ehtoja [7] – [9], kuten lämmin iskeeminen kertaa [10] (joita ei tutkittu tässä).

tätä varten olemme kehittäneet uuden, nopean kahden lämpötilan formaliini kiinnitys strategia, löysimme säilyttää tärkeimmät ominaisuudet kudoksen kuten morfologia, sekä proteiinien ilmentyminen arvioituna immunohistokemiallisesti [11]. Siinä työssä, löysimme merkittävä Pakt säilyttäminen on Calu3 hiiren ksenograftimallia, arvioituna IHC, käyttäen kahta lämpötilan kiinnitys protokollaa, ja huomasimme, että tämä värjäytyminen oli lähes kokonaan kadonnut tavallisilla huoneenlämmössä kiinnitys. Eteenpäin tästä tutkimuksesta, laajensimme tutkimusta kolorektaalikarsinooma näytteitä, analysoimalla ylimääräisiä phosphoepitopes. Tässä nykyisessä kattava tutkimus, kysyimme, onko kahden lämpötilan teknologian lisäksi auttaneet säilyttämään aktivaatiotilaa biomarkkereiden merkitystä peräsuolen syövän hoidossa, sekä onko ohjaamiseksi ennalta kiinnitys kylmä iskeeminen väliajoin oli tärkeää, että nämä biomarkkereita. Käyttäen 23 kolorektaalisyöpää kirurgiset näytteet kerätään määritelty kylmän iskeemisen väliajoin ja formaliini kiinnittäminen protokollia, tutkimme fosforyloitumisaste lukuisten PI3-kinaasin koulutusjakson tavoitteista sekä BRAF V600E mutaatio ja muiden merkkiaineiden avulla immunohistokemia [12], [13]. Raportoimme tässä sekä merkityksestä kylmän iskeemisen ajan muuttujana fosfoproteiini analyysiin sekä kokonaisvaikutusta meidän nopean kahden lämpötilan formaliini kiinnitys protokollaa.

Materiaalit ja menetelmät

Sample keräys- ja Fixation

Ihmisen paksusuolen syöpä näytteet saatiin Indivumed GmbH (Hampuri, Saksa), kuten parafiiniin upotettu lohkojen. Näytteitä kerättiin Indivumed koska Ventana ei ole lääketieteen laitoksen ja näin ollen ole pääsyä kirurgisten näytteiden ja myös siksi Indivumed tiedettiin pystyä tarjoamaan kudosnäytteiden dokumentoitua lyhyt (alle 17 minuuttia) jälkeisen leikkaaminen iskeemisen välein. Indivumed tutkijat suoritetaan kudosta kokoelmia hyväksyntänumerolla paikallisesta Institutional Review Board, ja saatu kirjallinen suostumus potilaan mukana.

Kaikissa kokeissa kiinnittäminen protokollia suoritettiin Indivumed tutkijat, ja koostui upottamalla 10% neutraalissa puskuroituun formaliiniin (10% kyllästettyä vesipitoista formaldehydiä Fisher Scientific, Houston, TX, puskuroitu pH-arvoon 6,8-7,2, jossa 100 mM fosfaattipuskuri) vaihtelevia aikoja lämpötila-alueella 4-45 ° C. Huoneenlämpötila vaihteli 20-25 ° C. Kudosnäytteitä kerätään kliiniset tapaukset jaettiin kolmasosaa ja kukin kiinteä eri tavalla. Yksiosainen oli kääritty suolaliuoksella kostutetulla sideharsolla ja pidettiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan ( ”1 tunti kylmäiskemia”) ennen 24 tunnin kiinnitys huoneenlämpötilassa. Tämä oli testata vaikutusta enää ohjeellinen määrätty kylmäiskemia välein yhden tunnin ajan. Loput kaksi kappaletta oli testata vaikutusta lyhyempi (alle 17 minuuttia) kylmäiskemialle välein. Yksiosainen asetettiin suoraan huoneenlämmössä formaliinilla 24 tunnin ajan ( ”24 hr”). Kolmas kappale asetettiin suoraan 4 ° C formaliinilla 2 tuntia sen jälkeen 2 tuntia 45 ° C formaliinia ( ”2 + 2”) [11]. Jälkimmäinen oli testata, jos prosessi voitaisiin nopeuttanut lisätä työn tehokkuutta sairaalassa. Fiksaatio suoritettiin 100-500 ml katettu dekantterilaseja jääkaapissa 4 ° C hoitoa, tai tavanomaisen kemiallisen vetokaappiin korkeampia lämpötiloja. Kylmäiskemia ajat ”24” ja ”2 + 2” näytteen keskimäärin 10 +/- 3 minuuttia (vaihteluväli 6-17 min). Loppupään kudosten käsittely suoritettiin, kuten on kuvattu [11], jossa kaikki liuotin prosessori vaiheet pidettiin 45 ° C: ssa ympäristön paineessa, ja parafiini vaihe pidettiin 60 ° C: ssa vakuumissa. Kaikki näytteet upotettiin parafiiniin ja leikattiin lasilevyille kuten 4-mikronin leikkeitä IHC tai histomorphology.

Automatisoitu immunohistokemia

Immunohistokemia määritykset suoritettiin Ventana Discovery XT automatisoitu värjäys mukainen instrumentti valmistajan ohjeita. Objektilasit de-paraffinized käyttäen EZprep liuosta (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) 30 minuutin ajan 75 ° C: ssa. Epitooppi haku suoritettiin automaattiseen värjäyslaitteesta kanssa CC1 liuoksen (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) 64 minuuttia 95 ° C: ssa. Vasta-aineet on saatu Cell Signalling Technologies tai Epitomics ensin titrattiin yli konsentraatioalueella tarjota optimaalisen suhteen spesifistä värjäytymistä tausta värjäystä. Kun tiitterit asetettu, vasta-aineet siirtyvät laimentimen käyttäjän täytettäviksi automaatit käytettäväksi automaattisia värjäyslaitteesta. Lasit kehitettiin käyttäen Opti

View of DAB havaitseminen kit (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Lyhyesti, vaiheet mukana estäjä 8 minuuttia, linkkeri 8 minuuttia, multimeeri 12 minuuttia, DAB /peroksidi 8 minuuttia ja kuparin 4 minuuttia. Objektilasit Sitten vasta- värjättiin hematoksyliinillä II 8 minuuttia (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Vasta-aineita, kloonit, ja tiitterit on esitetty taulukossa 1. Vasta-ainetiitterit määritettiin jokaiselle vasta-aineen käyttämällä positiivista ja negatiivista kontrolli kudosten seuraten valmistajan ohjeita.

immunohistokemia Analysis

immunohistokemiallinen analyysit olivat tekee kaksi riippumatonta patologia, kukin sokaissut kiinnitykseen menetelmän jokaisen dian, käyttämällä H-pisteet semiquantitation värjäystä suhteessa ja intensiteetti [14]. Tapauksissa, joissa molemmissa

in situ

ja invasiivisia neoplasia, vain invasiivisia kasvain pois marginaalit kudosnäytteen pisteytettiin. Korkea intensiteetti värjäys, joka oli selvästi taka absoluuttinen kudokseen marginaalit (toisin sanoen, mitä yleisesti kutsutaan kliinisissä immunohistokemia kuin ”reuna vaikutus” [15]) ohitettiin. Pistemäärät avoimessa kolmannen osapuolen, ja kaikki H pisteiden kustakin patologi piirrettiin toisiaan vastaan ​​kunkin markkerin. Tulospalvelu joka ilmestyi subjektiivisesti poikkeavia, eli ne, jotka merkittävästi poikennut samanlaisen viivan arvioimana silmämääräisesti, käytiin läpi yhdessä usean otsikkona mikroskoopilla ja päättämään pisteytyksestä syntyi.

Tilastollinen analyysi

Kaikki analyysi suoritettiin käyttäen R tilastoja paketti. Kullekin tapauksessa H tulokset kahdesta arvioijat laskettiin keskiarvo. Tilastolliset erot kiinnittäminen ryhmien (24 hr vs 2 + 2, 24 h vs kylmäiskemia) käyttäen kaksipuolinen pariksi Wilcoxonin testi. Koska useita ehtoja arvioitiin samanaikaisesti, p-arvot näiden vertailujen muunnettiin vääriä löytö korko-korjattu q-arvot [16], [17]. Boxplots kuvassa 1 kertyi kanssa paketin ggplot2. Mustat palkit mediaaniarvot ja laatikoita ulottuvat 25

th 75

th persentiilit. Whiskers ulottuvat 1,5 × neljännespisteiden välinen etäisyys.

H tulokset värjäystä intensiteetin kaikissa tutkituissa biomarkkerit, käsittelemällä kunnossa. ”2 + 2” on nopea kiinnitys kunnossa ”, 24 hr.” On tavallinen 24-tunnin huoneenlämmössä tilassa ilman ennalta kiinnittäminen kylmäiskemia, ja ”Iskemia” tarkoittaa 1 tunnin kylmä iskeemisen jakson ennen 24 tuntia huoneen lämpötila kiinnitys. Mediaanit edustaa vaakaviivoja, laatikot tontteja vastaavat 25

th ja 75 prosenttipisteet kunkin jakelun, viikset ulottuvat äärimmäisissä arvo, joka on 1,5 kertaa etäisyys ensimmäisen ja kolmannen kvartiileihin, ja data pidemmälle viikset esitetään pisteinä.

tulokset

H-pisteet kaikki merkit on esitetty graafisesti boxplots kuvio 1, ja vertailun tulokset testaus on esitetty taulukossa 2 .

Hyvin harvat tapaukset osoittavat havaittavaa värjäytymistä kolmelle markkereita (BRAF V600E, pMEK1 /2, ja Pakt), mutta kahdessa tapauksessa oli yksiselitteisesti positiivisia BRAF V600E mutaatio, toteamus vahvistettiin molekyylitason analyysi (tietoja ei esitetty). Kaiken kaikkiaan 2 + 2 protokolla tuotti yhtä paljon tai enemmän IHC signaali kuin 24 tunnin hoito, jossa edustava värjäys tulokset esitetään kuviossa 2. Vaikka useat tapauskohtaisesti erot korostuvat kuvassa 2, ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja havaittu useita pariksi vertailujen tekeminen 24 tapauksessa (taulukko 2). Taulukko 2 osoittaa, että kahden merkin näytti olevan hieman suurempi värjäytymisen 24 tunnin hoito (EGFR ja Perk), mutta jälleen kerran, nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä, eikä myöskään patologien teki näytteiden löytää aina kun discrepant värjäyksen välillä 2 + 2 ja 24 tunnin olosuhteet johtaisivat muutokseen patofysiologisia tulkita näitä kahta markkereita.

edustaja tulokset IHC analyysin kaksi koolonkarsinooman näytettä alistettiin joko nopean kiinnityksen ehto ( ”2 + 2”) tai standardin 24 tunnin huoneenlämmössä kunnossa ilman ennalta fiksaatio kylmäiskemia ( ”24 hr”). Perk, pMTOR, pMEK1 /2 ja pPRAS40 näkyvät yhdessä tapauksessa ja pBAD ja Pakt näkyvät toisesta tapaus. Kaksi erilaista tapausta Tässä näytetään, koska kaikki tapaukset osoittavat, värjäystä kaikille markkereita. Kaikki micrographs otetaan 200 × vastaavia vastuita.

IHC signaalia huomattavasti haitallisesti vaikuttaa enää 1 tunnin kylmäiskemia ajan ennen kiinnittämistä verrattuna lyhyempi iskeeminen intervalli protokollia, joissa ainoana poikkeuksena EGFR. Nämä suuntaukset olivat tilastollisesti erittäin merkittäviä pEGFR ja pMSK1, ja väheneminen lisäansiot värjäystä lähestyi tilastollista merkittävyyttä. Kahdessa tapauksessa tietyissä, joka on esitetty kuvioissa 3 ja 4, karsinoomat kätkeminen BRAF V600E mutaatio havaittiin olevan selvästi positiivinen pEGFR sekä lyhyemmän iskeemisen aikaväli olosuhteissa, mutta värjäystä oli lähes kokonaan poissa, kun näyte altistettiin pidempään 1 tunti kylmäiskemialle kunnossa.

kuvat ovat yhden koolonkarsinooman tapaus värjätään vasta BRAF V600E, pEGFR, EGFR, ja pMSK1, osoittaa merkittävää menetystä pEGFR värjäytymistä iskemian kunnossa. Kaikki micrographs otetaan 200 × vastaavia vastuita.

edustaja toisen koolonkarsinooman tapauksessa värjätään vasta BRAF V600E, pEGFR, PTEN, ja pMSK1, osoittaa merkittävää menetystä pEGFR värjäytymistä iskemia kunto. Kaikki micrographs otetaan 200 × vastaavia vastuita.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat selvästi, että huomattava leikkauksen jälkeiset, pre-kiinnitys kylmä iskeeminen välein (yksi tunti ) confounds pyrkimys tunnistaa fosforylaation tiloja keskeinen PI3 kinaasireittiä elementti formaliinikiinnitetyt kudosta. Tämä havainto on yhdenmukainen aikaisempien raporttien että ilmoitetaan merkitsevä preanalytical herkkyys fosfoproteiini- määritykset [7], [18]. Jos huolellinen näyte käsittelyä käytetään minimoimaan kylmän iskeemisen väli (alle 17 minuuttia), kuitenkin sekä 24 tuntia huoneenlämmössä formaliinia kiinnitys ja meidän nopea kahden lämpötilan fiksaatio protokolla säilyttää fosforylaatio signaaleja keskimäärin oleellisesti kaikki markkereita tutkittu. Miksi jotkut merkkiaineet vaikuttavat enemmän kylmäiskemia on epäselvää; tasapaino esteettömän kinaasi ja fosfataasiaktiivisuus kylminä iskeeminen välein ei todennäköisesti pelata ulos identtisesti kullekin fosforylaation kohde, kuitenkin niin tunnistamalla ne tavoitteet liioiteltuja herkkyys kylmäiskemialle tutkimusten kuten tämä on erittäin tärkeä, koska alan phosphoprotein immunohistokemia edistysaskeleet.

Kun prefixation kylmäiskemia aika ulottuu tunti katsotaan hyväksyttävän välin nykyisessä ASCO /CAP suuntaviivat ER testaus [3], huomasimme, että signaali valitun fosfopro- vähenee merkittävästi. Erityisesti kahdessa yksilöitä löytyi satamaan BRAF V600E mutaatio (kuviot 3 ja 4), 1 tunnin kylmä iskeeminen aikaväli näytti peittää ilmaus pEGFR, virhe, joka voisi johtaa epäonnistumiseen tunnistaa nämä potilaat ehdokkaiksi ylimääräisiä hoito [12], [13], [19]. Näissä kahdessa tapauksessa, nopea kahden lämpötilan fiksaatio protokolla tuotti selvästi enemmän pEGFR värjäystä kuin 24 tunnin tallennuksesta protokollaa, mikä osoittaa, että nopea protokolla voi olla vakaampi arviointimenetelmän tämän kliinisesti merkittäviä biomarkkereiden aktivaatiotilaa. Samanlainen suuntaus on havaittavissa joitakin muita markkereita (esim. PBAD, Pakt) valitussa tapauksissa kuvassa 2. Tämä havainto selvästi korostaa mahdollisia vaikutuksia preanalytical näytteen käsittelyn aikakaudella henkilökohtaisen lääketieteen, koska säilyttäminen biomarkkereiden aktivoinnin valtioiden näyttää olevan suhteellisen vakio, keskimäärin välillä kiinnitys protokollien joillekin biomarkkereita, mutta eroaa merkittävästi erityistapauksissa.

Useat tutkimukset ovat nyt havainneet, että MAPK-reitin uudelleenaktivointi muodostaa puitteet hoidon resistenssin BRAF V600E mutatoitunut peräsuolen karsinoomat jotka on käsitelty Vemurafenib [1], [20], [21].

In vitro

ja ksenograftimalleja mukaan tämä kestävä tila voidaan korjata kaksoishoito kuten EGFR: n estäjien suunnattu pEGFR, mutta tämä lähestymistapa perustuu siihen kykyä taudinmäärittäjä tunnistaa pEGFR yli-ilmentymisen kliinisessä kudosnäytteestä. Vaikka nykyinen kirjallisuuden mukaan kaksoishoito omistaa paljon mahdollista hyötyä potilaille, joilla näitä erityisiä kasvain fenotyyppejä, meidän tulokset osoittavat, että tämä kaikki mahdollinen hyöty on vaarassa, jos hallitsematon kudoksen säilyttämisen ja fiksaatioprosessi työskentelee. Kaksi potilasta, joiden karsinoomat kanna BRAF V600E mutaatioita, esimerkiksi ei voida tunnistaa ehdokkaiksi EGFR-terapiasta oli heidän näytteitä kerätty pidemmän tunti kylmässä iskeemisen aikaväli, joka ei ole nähnyt vain kliinisen patologian aloilla, mutta on myös katsotaan hyväksyttävää nykyisessä syövän biomarkkereiden analyysiin ohjetta. Näiden kliinisten näkökohtien perusteella on myös syytä harkita äärimmäisen kustannukset uusia hoitomuotoja kehitettäessä, niin että misidentifying potilaat ehdokkaiksi hoitoja voisi olla paitsi henkilökohtaisesti haitallisia vaan myös taloudellisesti tuhlausta.

Lisäksi BRAFV600E /pEGFR esimerkki on myös huomattava, että Perk ilmentyminen on vähentynyt 1 tunnin kylmäiskemia (katso taulukko 2). Koska Perk on käytetty seurata hoidon tehoa, tämä vaikutus, jos läsnä kliinisessä kokeessa, voisi mahdollisesti heikentää hoidon seurantaa. Myös valikoiduissa tapauksissa (kuvio 2), näennäinen pBAD ekspressiota voidaan vähentää prefixation iskemia, sekoittavat pystymme arvioimaan ilmentymistä tekijä, jonka tiedetään olevan merkitystä paksusuolen syövän synnyssä [19].

Yksi mahdollinen heikkous tämän tutkimuksen että suhteellisen harvat näytteet tutkittiin. Vaikka kaikki näytteet analysoitiin kaikki merkit, korkeat kustannukset ja vaikea hankkia näytteiden tarkkaan määritelty preanalytical hoitoja kaupallisia myyjä estivät tutkimuksessa enemmän näytteitä. On selvää, lisäksi suurempia tutkimuksia olisi hyödyllistä vahvistaa nämä havainnot. Työ ksenograftimalleja voidaan myös olettaa olevan hyötyä tällä alalla, ja se on todellakin ollut niin meidän edeltävästä työstä tämän aiheen [11], koska hieno valvoa preanalytical edellytyksin tämä on mahdollista näissä järjestelmissä. Kuitenkin päätimme työskennellä kliinisissä näytteissä täällä, koska ne ovat aikaisempaa osuvampia nykyisiin ongelmiin translaatiotutkimuksessa syöpätutkimuksessa. On syytä huomata, että 10 minuutin keskiarvoina kylmäiskemia kertaa näytteiden perusteella kerättyjä tutkimuspöytäkirja ei yleensä havaita nykyisessä anatominen patologian käytäntöjä, eikä voi tällaisen nopeasti kylmäiskemia kertaa saavutettavissa nykyisen prosessit kliinisissä laboratorioissa. Vaikka se voi olla haaste sisällyttää havaintomme standardikontteihin kliinistä työnkulkuja, koska monet nykyiset lääketieteelliset laitteet eivät pysty vähentämään iskemia-aika merkittävästi, uskomme tiedot osoittavat, että standardointi ja optimointi preanalytical olosuhteet on ainakin arvokas tavoite.

Toinen mahdollinen heikkous on se, että fosfoproteiinia signaali tulokset poikki hoitoon edellytykset eivät verrattiin käyttämällä kliinisesti validoitu pisteet kynnysarvot, yksinkertaisesti siksi tällaisia ​​kynnysarvoja varten markkereita tässä tutkituista. Mitä me havaittu meidän semikvantitatiivinen lähestymistapa kuitenkin oli, että signaaleja usein jyrkästi vuonna näytteissä on pitkä prefixation iskeeminen välein, ja että näissä kahdessa erityistapauksissa keskustelimme pitkän prefixation iskeeminen väli näytti ablate kaikki asiaankuuluvat signaali kriittinen biomarkkereiden. Näissä tapauksissa valvotun fiksaatio protokollat ​​selvitettiin säilynyt signaaleja, jotka todennäköisesti tulkitaan, että lääketieteellisen arvioinnin kahden harjoitellaan patologeja, kuten patofysiologisesti merkitystä mahdollisten hoidon.

Lopuksi, vaikka olemme tulkinneet tappiot fosfoproteiini- IHC signaaleja viitteitä vahingollisia preanalytical vaikutuksia, se voisi olla, että kasvaa värjäys olivat tosi esineitä ja että pieneni värjäytyminen oli lähempänä todellisen tilan

in situ

. Toiset ovat osoittaneet, että monet phosphomarkers, kuten Pakt, ovat selvästi vähentyneet yhteydessä muutetut kiinnittäminen ehtoja tai kylmäiskemia [22], [23], joten meidän tulkinta ei ole vailla. Vaikka tämä kysymys ei voi koskaan ratkaista ilman tulevaisuudessa

in vivo

tutkimuksissa, mikä on ehdottoman selvää, tämä työ on, että muutokset näennäinen aktivointi valtioiden monien merkityksellisten syövän biomarkkerit näyttävät olevan herkkiä yhteisiä preanalytical muuttujia. Näistä muuttujista, iskeeminen väli on ehkä yksi tärkeimmistä, ja siksi uskomme, että lisätutkimukset ja kliiniset tutkimukset on sisällytettävä tarkastuksia, joissa käsitellään tämän tekijän.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Raaka H-pisteet tiedot kaikista tutkituista tapauksista tässä tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0113608.s001

(XLSX) B