Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on kaikkein vaarallisin kaikista gynekologisten syöpien, ja sisältää erilliset histologisia alatyyppejä, joilla on erityisiä geneettisiä ja kudosten alkuperämaan eroja. Munasarjojen kirkas cell carcinoma (OCCC) osuus on noin 10% tapauksista ja on kutsutaan stressiä reagoiva syöpä. OCCC on ominaista lisääntynyt ilmentyminen oksidatiivisen stressin ja glykolyysiin liittyvien geenien. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme arveltu, että bioenergetic profilointi voisi yksilöllisesti erottaa OCCC muista EOC histologisia alatyyppejä. Käyttämällä solunulkoinen flux analysaattori, OCCC linjat (ES-2, TOV-21-G) on osoitettu olevan erittäin metabolisesti aktiivinen, korkean hapenkulutuksen (OCR) ja korkea solunulkoinen happamoitumista rate (ECAR), ilmaisevan parantunutta mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation ja glykolyyttiset korko vastaavasti. Korkean bioenergetiikan profiilin liittyi solulinjat kykyä muodostaa ankkurointi riippumattomia pallosia. Kun otetaan huomioon niiden korkea glykolyyttiset ja mitokondrioiden toimintaa, OCCC soluilla voimakas herkkyys 2-deoksi-D-glukoosin ja rotenoni kasvun estäminen, vaikka tämä kemosensitiivisyys profiili ei ole erityisiä vain OCCC soluihin. Bioenergetic profilointi määriteltiin myös ei-OCCC solulinjassa, OVCA420, pitänyt vakavasti vaarantua mitokondrioiden toimintaa, joka perustuu alhaisen OCR ja stimulaation puutteesta maksimaalisen hengityksen seuraavan soveltamisen uncoupler FCCP. Tähän liittyi mitokondrioiden morfologian muutoksia, jotka viittaavat tehostetun fissio, lisääntynyt ilmentyminen mitokondrion fissio proteiini Drp1, menetys mitokondrion kalvon potentiaalia ja riippuvuutta glykolyysin. Tärkeää on, että tämä mitokondrion toiminnan mukana on kyvyttömyys OVCA420 solujen selviytymään hypoksinen stressiä, ja heikentynyt kyky stabiloida HIF-1α vasteena 1% O

2 hypoksian. Tämä tieto voi olla välttämätöntä tutkijoiden aikoo käyttää tätä solulinjaa lisätutkimuksiin aineenvaihdunnan ja hypoksia, ja ehdottaa, että muuttunut mitokondrioiden fissio dynamiikka edustaa fenotyyppiä alapopulaation EOCs.

Citation: Dier U, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel N (2014) bioenergetic analyysi munasarjasyövän Cell Lines: profilointi histologinen alatyyppi ja identifiointi Mitochondria-Viallinen Cell Line. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10,1371 /journal.pone.0098479

Editor: Jianhua Zhang, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 tammikuu 2014; Hyväksytty: 02 toukokuu 2014; Julkaistu: toukokuu 23, 2014

Copyright: © 2014 Dier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) myöntää R00CA143229 National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on edelleen yksi tappavimmista naisten syöpätapausta, joilla on vain vähän parannusta kokonaiselossaoloaikaa raportoitu kolmen viime vuosikymmenen aikana. On käynyt ilmi, että munasarjasyöpä on laaja termi, jota käytetään useita eri sairauksia, jotka jakavat saman anatominen sijainti sisällä intraperitoneaalisen (IP) ontelon. Viisi alatyyppejä epiteelin munasarjasyöpä (EOC) eroavat merkittävästi niiden kudoksen alkuperän, genomista markkereita ja riippuvuus eri pro-tuumorigeenisia cell signalointipolkujen [1] – [3]. Korkeatasoinen vakavien munasarjasyöpä (SOC) on yleisin histologinen alatyyppi ja ominaista korkea taajuus TP53 mutaatioita, genomista epävakautta ja oleviksi munanjohtimen alkuperästä [3], [4]. Munasarjojen selkeä solukarsinoomat (OCCC) muodostavat noin 10% EOC tapauksista Länsi populaatioiden (jopa 25% aasialaisilla) [5]. OCCCs näyttävät koostuvan heterogeenisen alapopulaatioiden näyttämään eriasteista genomisen poikkeavuuksien [6]. Yleisimmät liittyvät AT-rikas vuorovaikutuksessa domeenin, joka sisältää proteiinia 1A (ARID1A mutaatio -50%) [7], [8] ja PI3K koulutusjakso (PTEN menetys -40% [9], PIK3CA mutaatio [10]; AKT2 vahvistus [5]). ARID1A mutaatiot ovat mahdollistaneet tutkijat yhdistää aikaisin OCCC vaurioita endomet- kudosten ja endometrioosin kystat [8], [11].

Vaikka on olemassa merkittäviä eroja genomisessa poikkeamia yksittäisten OCCC yksilö, Yamaguchi ja kollegat ovat viime aikoina raportoineet geeniekspressiota allekirjoitus, joka liittyy yksilöllisesti OCCC [12]. Erityisesti tämä tutkimus vahvisti muut raportit, jotka OCCC luonnehditaan stressi reagoiva syöpä [12] – [14]. Korkea ekspressio antioksidantti entsyymejä ja geenejä, jotka liittyvät glukoosin aineenvaihduntaa ovat myös yleisiä [12], [15]. Tämä ilmaus profiili on ajateltu edustamaan mukautuksia OCCC vastaan ​​stressitekijöitä kasvaimen microenvironment, kuten ilmainen-rauta aiheuttamaa redox stressiä ja tulehdusta [16]. Jotkut näistä ilmaisun muutoksia tutkittiin samalla tavalla endometriumin kystat, vielä viittaa siihen, että tämä edustaa edeltäjä kudoksen OCCC [12].

Vaikka alkuvaiheen OCCC potilailla on yleensä parempi eloonjäämisaste kuin alkuvaiheessa SOC potilasta, vaiheessa III ja IV OCCC on yhteydessä huonoon säilymiseen. Lisäksi alle 10% toistuvien OCCC reagoivat terapiaan, ja tämä histologinen alatyyppi on yhdistetty korkean sisplatiini-resistenssi [5]. Ottaen huomioon, että on merkittäviä eroja OCCC genomin ja ilmaisun profiilia kuin SOC, on tarpeen edelleen ymmärtää molekyylitason mekanismeja, jotka ohjaavat OCCC kasvaimen kehittymisen ja etenemisen räätälöidä terapeuttisia tässä histologista alatyypin. Koska OCCCs on luonteenomaista korkea ilmentyminen välittäjäaineiden glykolyyttisellä reitin, tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää, jos OCCC solulinjoja myös merkittävästi eroavat bioenergetiikan profiilin verrattuna muihin EOC viljelmässä. Käyttämällä elävien solujen mittaukset hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumista, pystyimme osoittamaan, että OCCC solulinjat ovat erittäin aineenvaihdunnan. Lisäksi tämä analyysi paljasti SOC solulinja viallinen mitokondrioiden toimintaa, joka ilmenee menetystä hypoksinen vasteen näissä soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 ja NOSE007 solut jalomielinen lahjoitus tri Susan K. Murphy (Duke University) ja niitä viljeltiin RPMI1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13-solut eristettiin alun perin munasarjasyöpä potilaan askites [17], [18]. NIHOVCAR3 soluja (kutsutaan täällä OVCAR3) ja munasarjojen selvä solu- sinoomasolulinjoja ES-2 ja TOV-21-G hankittiin ATCC. ES-2-soluja viljeltiin Modified McCoyn 5a Medium, jossa oli 10% FBS: ää. TOV-21-G-soluja viljeltiin 01:01 sekoitus MCDB 105, joka sisälsi 1,5 g /l natriumbikarbonaattia ja Medium 199, jossa 2,2 g /l natriumbikarbonaattia, 15% naudan sikiön seerumia. OVCAR3 soluja pidettiin RPMI1640, joka sisälsi 0,01 mg /ml naudan insuliinia ja 20% FBS: ää. Glutamiini ja glukoosin poisto suoritettiin käyttäen MP Biomedicalsin RPMI 1640 Medium, 1X Liq., W /o L-glutamiinia ja glukoosi.

bioenergetic Analyysi hapenkulutuksen (OCR) ja Solunulkoisilla happamoituminen Rate (ECAR)

Seahorse XF24

3 Solunulkoisilla Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) käytettiin arvioimaan bioenergetic fenotyypit munasarjasyövän solulinjoissa. Solunulkoisen Flux Analyzer mahdollistaa samanaikaisen elävien solujen mittaamisen hapenkulutuksen (OCR), indikaattori mitokondrion hengitystä, ja solun happamoitumista rate (ECAR), indikaattori netto protonin menetys glykolyysin aikana. Ennen kokeen aloittamista, solut tasaisesti siirrostettiin (40000 solua /kuoppa; seuraavat optimointi solun kylvö numero) osaksi XF24 soluviljelylevy ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Soluviljelyalustoja korvattiin XF media (Seahorse Bioscience), puuttuu natriumbikarbonaattia ja FBS, etukäteen pesty XF media. Solut pantiin ei-CO

2 37 ° C inkubaattoriin 1 tunnin ajan, ennen alkua kokeilun. OCR ja ECAR mitattiin yli 3 minuutin aikana, jonka jälkeen 3 minuuttia sekoittaen ja uudelleen hapetus media. Kolme basaali mittaukset tehtiin ennen injektiota farmakologinen käsittelylaitteet mitokondrioiden Hengitysketjun proteiineja, joka tunnetaan myös mitokondrio stressitestin. Useita bioenergetiikan parametrit voidaan päätellä seuraamalla OCR vastauksena näiden yhdisteiden [19]. Sen jälkeen perustetaan pohjapinta OCR lukema, Oligomysiini A käyttää estämään protoni (H +) virtaavat ATP nopaliinisyntaasin olennaisesti estää kaikki ATP-sidottu hapenkulutusta. Maksimaalinen hengitystä voidaan aloittaa altistamalla solut karbonyyli syanidi-ptrifluoromethoxyphenyl hydratsoni (FCCP), joka on ionofori, joka kuljettaa H + poikki mitokondrion kalvon johtava romahtaa kalvon potentiaalia ja nopea kulutuksen O

2. Antimysiini- estää mitokondrion hengitystä estämällä kompleksi III (Ubikinoni: Sytokromi b-c kompleksi). ATP-syntaasi estyi injektoimalla 1 uM Oligomysiini A (Sigma), minkä jälkeen injektio 750 nM FCCP (Sigma) mittaamiseksi maksimaalisen OCR. Tämän jälkeen lisättiin 1 uM Antimysiini A (Sigma), joka sulkee kaikki mitokondrion hengitystä. Kolme mittaukset OCR /ECAR saatiin injektion jälkeen kunkin lääkkeen ja lääkeainepitoisuudet optimoitu Solulinjoihin ennen kokeita. OCR ja ECAR lukemat normalisoituivat kokonaisproteiinin tasossa (BCA proteiinin määritys, Pierce) kussakin kuopassa. Kukin solulinja oli edustettuna 5 kaivoihin koetta kohti ja jäljitellä kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa. Basal hengitystä johdettiin vähentämällä kolmas OCR käsittelyn jälkeen antimysiiniherkkien Lisäksi kolmannesta pohjapinta OCR käsittelyssä. Hengitysteiden State ilmeistä, osoitus mitokondrioiden hengityselinten tila, laskettiin käyttäen: 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) [20]. Ennen aloittamista näissä kokeissa vastekäyrät (100 nM-3 uM) tehtiin perustaa pitoisuuden FCCP saavuttamiseksi tarvitaan maksimaalisen OCR. Kaikki solulinjat vastasivat saavuttamalla tasannevaiheen maksimaalisen OCR 750 nM FCCP, jossa esto OCR havaittiin 3 uM joissakin solulinjoissa (OVCA429, Ovca433, Ovcar3, ES-2). OVCA420 solut eivät reagoineet FCCP milloin tahansa testatulla pitoisuudella.

Reaaliaikainen semi kvantitatiivinen RT-PCR

jälkeen RNA: n eristys (RNeasy Mini Kit, Qiagen) ja käänteistranskriptio käyttäen iScript cDNA Synthesis (BioRad), reaaliaikainen semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR cycler käyttäen iTaq Universal SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad). Seuraavia alukepareja käytettiin semi-kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR-analyysi: HNF-1β sense: 5′-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 ’; HNF-1β antisense, 5’-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 ’[21]. GLUT-1 sense 5’-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 ’; GLUT-1-antisense 5’-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 ’[22]. Tiedot analysoitiin käyttäen vertailevaa CT menetelmällä arvojen normalisoitu p-Actin tasoilla ja ilmaistu suhteessa tasoilla NOSE007 soluissa.

Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys

Munasarjasyöpä solulinjoja istutettiin (1000 solua /kuoppa) 96-kuoppaisille pyöreäpohjaiseen ultra-low kiinnitys (ULA) levyt (Corning) ja seurattiin sferoidiviljelmiä aggregaatin muodostumista jopa Päivä 9 normaaleissa viljelyolosuhteissa (täydet media, 37 ° C, 21% O

2, 5 % CO

2).

solujen elinkelpoisuus määritykset

Yhtä suuret määrät soluja ympättiin 96-kuoppalevyille ja solujen elinkelpoisuus vasteena kemoterapeuttisten aineiden mitataan seuraavan 72 tunnin lääkeaineen hoidon osoitettu annoksia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kristalliviolettia otto. Lyhyesti, solut värjättiin kristallivioletilla 10 minuutin ajan, jota seurasi pesu PBS: ssä ja H

2O. Kristalliviolettia väriaineen vapautettiin soluista käyttäen 30% etikkahappoa ja absorbanssi mitataan 590 nm: ssä, käyttäen SpectraMax Paradigm Molecular Devices -mikrolevylukijalla. Solujen elinkelpoisuus ilmaistaan ​​prosenttiosuutena elinkelpoisuus suhteessa ei-käsiteltyjen solujen. Sisplatiini (cis-Diamineplatinum (II) dikloridia), paklitakseli ja 2-deoksi-D-glukoosi (2-PO) hankittiin Sigmalta. Rotenonin saatiin Seahorse Biosciences.

Mitotracker värjäys

Soluja viljeltiin peitinlaseilla inkuboitiin 250 nM Mitotracker Red CMX ROS (Life Technologies), 15 minuutin ajan, jota seurasi pesu PBS: ssä ja kiinnityksen 4% paraformaldehydillä. Näytteet asennetaan dioja Prolong Gold /DAPI (Life Technologies), ja kuvattavan käyttäen eVOSfl AMG LED-pohjaisen fluoresenssimikroskoopilla (100x immersioöljyobjektiivilinssillä).

mtdna /nDNA suhde reaaliaikainen RT-PCR-

määrällisesti mitokondrioiden DNA (mtDNA) ja tuman DNA: n (nDNA) kokonais-DNA: munasarjojen syöpäsolujen uutettiin käyttäen AllPrep DNA /RNA /proteiini Mini Kit (Qiagen), joka oli laimennettu lopulliseen pitoisuuteen 10 ng /ul. Määrällisesti suhteellisen mtdna: nDNA suhde seuraavia alukkeita; 16S rRNA-geenin mitokondrion (mt) DNA (sense: 5′-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 ’; antisense: 5′-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3′); 18S rRNA ydinvoiman (n) DNA: ta (sense: 5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 ’, antisense: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’) [23], [24]. CT-arvot mt16S ja n18S saatiin seuraavat Reaaliaikainen PCR 50 ng kokonais-DNA: sta käyttäen iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), on hehkutus lämpötilassa 59 ° C.

mitokondrion kalvon potentiaalia

Mitokondrioiden kalvojännite mitattiin käyttäen JC-1 väriaine (5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi, Life Technologies), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja inkuboitiin 10 ug /ml JC-1 väriaine 15 minuutin ajan ja fluoresenssin otetut kuvat käyttäen 20x tavoite. Suhde punaisen fluoresenssin JC-1-aggregaattien ja vihreä JC-1 monomeerien mitattiin käyttämällä kuva J, seuraavat kuvan taustan korjauksen.

kyky muodostaa klooneja

Solut (100 solua /kuoppa) siirretään 6 kuoppalevylle ja viljeltiin 10 päivää normaaleissa viljelyolosuhteissa (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2, Biospherix hypoksinen kammio). Kyky muodostaa klooneja arvioitiin värjäämällä pesäkkeitä kidevioletilla ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin käyttäen Image J ja data ilmaistiin solujen hengissäsäilymisosuus.

Immunoblottausmääritys

Solulinjat viljeltiin 10 cm ruokia subkonfluens- ja hajotettiin RIPA-puskurissa (+ proteaasi-inhibiittorit), jota seurasi elektroforeesi 4-12% SDS-PAGE-geeleissä (Bio-Rad). Sen jälkeen western siirto, kalvot koetettiin ensisijainen Anti-Drp1-vasta-aine (Millipore) tai GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) yön yli 5% rasvatonta maitoa /TBS, 0,1% Tween 20: tä. Sen jälkeen sekundaarinen vasta-inkubaation blotit tehtiin näkyviksi käyttämällä Femto tai Pico kemiluminesenssin alustalle (Thermo Scientific). Sillä HIF-1α-analyysi, soluja viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2) kahden tunnin ajan. Solut heti hajotettiin 2 x SDS-näytepuskuriin ja saman verran ladattiin SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad), jota seurasi western siirto ja immunoblottauksen varten HIF-1α ja β-aktiini latauskontrollina. Anti-HIF-1α-vasta-aine hankittiin BD Transduction Laboratories ja β-aktiini-vasta Applied Biosystems-Life Technologies.

Data ja Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään edustavat vähintään kolmeen rinnakkaiseen kokeissa. Kuva J käytettiin määrällisesti suhteellisen fluoresenssi ja mitataan sferoidiviljelmiä alueen kokoa. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Tilastotietoja (ANOVA kanssa Tukeyn kokeen, tai T-testi) suoritettiin käyttäen GraphPad Prism Software (v6), ja tiedot pidetään merkitsevä p 0,05.

Tulokset

Hengityksen Profile munasarjojen Cancer Cell Lines

luonnehtivat bioenergetiikan profiilia munasarjasyövän solulinjoissa käytimme ekstrasellulaarisen vuon analysaattori määrittää elävien solujen hapenkulutuksen (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista korko (ECAR; Seahorse Bioscience). Kaksi OCCC solulinjat, ES-2 ja TOV-21-G: tä verrattuna ei-OCCC EOC solulinjoissa (OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13, OVCAR3) ja normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja (NOSE007).

Kuvio 1A esittää OCR solulinjojen vasteena käytettyjen yhdisteiden mitokondrion rasituskoe ajan. Basal ja ATP-riippuva OCR lukemat osoittivat, että suurin osa syövän testatuista solulinjoista, lukuun ottamatta OVCA420 soluja, oli merkittävästi korkeammat OCR verrattuna normaaliin munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja (NOSE007, kuviot 1B 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 tilastollisesti merkitsevä verrattuna NOSE007; # p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001 tilastollisesti merkitsevä verrattuna OVCA420). OCCC solulinjoja korostettu mustalla ja normaali epiteelisolujen linja valkoinen. G. keskiarvo Hengitysteiden State

Näennäinen laskettiin 3-4 Replikoitumattoman kokeiden avulla: 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR).

Vaikka kaikki syöpäsolut oli selvästi korkea mitokondriaalisen hengityksen verrattuna NOSE007 soluihin emme havaita merkittävää eroa hengitysparametrejä välillä OCCC solujen ja muiden munasarjasyövän solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että mitokondrioiden hapenkulutusta profiili ei eroa munasarjasyövän histologisten alatyyppejä. Kuitenkin käyttämällä tätä lähestymistapaa pystyimme tunnistamaan OVCA420 soluihin olevan viallisia mitokondrioiden toimintaa, osoittaa alhainen pohjapinta OCR ja puute vastaus FCCP.

OCCC soluissa on korkea solunulkoinen happamoituminen nopeudella

samanaikainen mittaamiseen OCR, solunulkoinen flux analyysi voidaan arvioida, solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) kulttuurin media. Tätä pidetään epäsuoraa analyysiä glykolyyttisen määrä soluja [19]. OCCC solulinjoja ES-2 ja TOV-21-G näkyy suuri pohjapinta ECAR, kun taas muut solulinja oli pienempi ECAR, samanlainen NOSE007 (kuvio 2A). Oligomysiini A käytetään edistää maksimaalista ECAR, joka sulkee ATP-riippuvaiset OCR, tehokkaasti siirtymässä aineenvaihduntaa oksidatiivinen fosforylaatio glykolyysistä (kuvio 2B). Ero maksimaalinen ja pohjapinta ECAR pidetään glykolyyttisen varakapasiteetin soluja (kuvio 2C). OVCA420 soluja, mikä näkyy viallinen mitokondrion hengitystä (kuvio 1), oli myös pieni glykolyyttisissä varakapasiteettia, joka osoittaa nämä solut toimivat lähellä niiden maksimaalinen glykolyyttisissä korko korvauksena menetyksestä OCR. Tämä viittaa siihen, riippuvuus Glykolyysivaiheen mukaan OVCA420 soluja. Normaali epiteelisolulinja NOSE007 näytetään alimman glykolyyttisen varauksesta, mikä viittaa siihen, että niiden kyky glykolyysiin on pienempi kuin muiden syöpäsolulinjoja.

. Pohjapinta ECAR mitattiin käyttämällä solunulkoista flux analysaattori (Seahorse Bioscience). B. Maksimaalinen ECAR stimuloitiin lisäämällä 1 uM Oligomysiini A. C. glykolyyttisissä varakapasiteetti laskettiin erotus maksimaalinen ja pohjapinta OCR. Tulokset yhdestä Replikoitumattoman kokeessa näytetään (n = 5, ANOVA, Tukeyn kokeen * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 tilastollisesti merkitsevä verrattuna NOSE007; # p 0,01, ### p 0,001 tilastollisesti merkitsevä verrattuna OVCA420).

Bioenergetics profiilia

jotta saataisiin parempi kokonaiskuva bioenergetiikan profiilia munasarjasyöpä solulinjoissa tutkittu me piirretään pohjapinta ECAR vastaan ​​mitokondrion OCR (kuvio 3A). Tämä osoitti selvästi, kuinka eri solulinjojen jakautuvat useisiin bioenergetiikan luokkiin. Löysimme 3 erillistä ryhmää solujen bioenergetiikan profiileja. OCCC solut TOV-21-G ja ES-2 muodostavat selvästi erittäin energinen soluja korkea hengitystä ja glykolyysin. OVCAR3 solut samalla näkyvissä tämän kuvion. OVCA433, OVCA429 ja DOV-13 oli enemmän aerobinen fenotyypin, kun taas NOSE007 ja OVCA420 solut olivat vähiten energinen solut, sekä alhainen OCR ja ECAR. On huomattava, että toisin kuin OCR, The ECAR mittaukset olivat vaihtelevan kokeellisen päivää, mikä oli erityisen ilmeistä OVCAR3 ja DOV-13 solulinjoissa (kuvio 3A). Mielenkiintoista on, sitä enemmän aerobisia soluja OVCA433, OVCA429 ja DOV-13 oli suhteellisen korkea glykolyyttistä varanto, mikä viittaa siihen, että nämä solut kykenevät ylösajo heidän glykolyyttisissä aktiivisuus tarvittaessa, kuten voi olla tapauksessa hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 3B). ES-2-solut näkyvät alimman varakapasiteettia, mikä osoittaa, että tämä solulinja voidaan pyrkii toimimaan lähellä maksimaalista hengitys- ja glykolyyttisissä kapasiteetti normaaleissa viljelyolosuhteissa (kuvio 3B). Kun otetaan huomioon sekä OCR ja ECAR parametrit, meidän tiedot viittaavat siihen, että OCCC solut ovat erittäin energisiä, vedoten sekä oksidatiivisen fosforylaation ja glykolyysistä täyttämään energiantarvetta. Kuitenkin, hengitys- ja glykolyyttiset profiilit eivät ehkä ole riittäviä erottamaan OCCC solut muista histologinen alatyyppi, kuten OVCAR3 solut samanlaiset bioenergetiikan ominaisuudet.

. Piirtämistä Basal ECAR ja OCR tasoilla tarjoaa snap-laukaus bioenergetiikan profiilit munasarjasyövän solulinjoissa tutkittu. OCCC solulinjoja ES-2 ja TOV-21-G sekä OVCAR3 solut osoittavat korkeaa Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen fosforylaation ja ovat siten luokiteltu erittäin energinen solut. B. piirtäminen glykolyyttisissä Reserve vastaan ​​Respiratory varauksesta, jotkin solut näyttävät toimivan lähellä niiden maksiminopeus, kuten ES-2-solut, kun taas toiset ovat korkeat hengitysvajaus (NOSE007) tai korkea glykolyyttisiä Reserve (DOV-13, OVCA429). OCCC solulinjoja leimataan musta kolmiot, muut EOC solulinjat harmaina ympyrät (OVCA420 kuten ympyrä, X), ja normaali epiteelisolujen linjojen NOSE007 valkoisena neliö. Data A ja C edustaa keskiarvoa keskiarvon OCR ja ECAR lukemat 3-4 kokeellinen jäljittelee C. Sferoidiviljelmiä muodostuminen korreloi bioenergetic allekirjoitus munasarjasyöpäsoluja. Solut ympättiin ULA levyille ja koko (ala sferoidiviljelmiä aggregaatin pikseleinä) piirrettiin (n = 6).

Kyky selviytyä kiinnittymisestä riippumaton sferoidiviljelmiä aggregaatti on suuri rooli siinä transcoelomic reitillä munasarjasyövän etäpesäkkeiden kautta IP ontelon. Siksi arvioitava korkean bioenergetiikan profiili tarjoaa etu sferoidiviljelmiä muodostumiseen ja säilymiseen. Mielenkiintoista on, että erittäin energinen solut, ES-2, TOV-21-G ja OVCAR3 pystyivät muodostamaan ja ylläpitämään suuria pallomainen aggregaatteja, kun ympättiin ultra-low kiinnityspinnat (kuvio 3C). Vaikka OCCC sferoidia jatkui koko kasvaa, OVCAR3 aggregaatit alkoi erotella päivänä 9. Solut entistä aerobinen fenotyyppi oli joko kykene muodostamaan sferoideja (DOV-13) tai ylläpitämään aggregaattien alle ankkurista riippumaton kasvu riippumattomista päivänä 4 (OVCA429 OVCA433). NOSE007 ja OVCA420 pystyivät helposti muodostaa pieniä pallomainen aggregaatteja, joita ei koko kasvaa ja alkoi hajota jälkeen päivä 4 ja päivä 9, tässä järjestyksessä. Nämä tiedot osoittavat, että suuri bioenergetiikan allekirjoituksen (korkea OCR ja ECAR) voi liittyä kyky muodostaa sferoideja, mahdollisesti auttamalla anoikis kestävyys ja kiinnittymisestä riippumaton solujen lisääntymistä.

suhde Bioenergetics jotta Kemosensitiivisyys profiilit

kun tiedetään eri bioenergetics allekirjoituksia meidän joukko munasarjasyövän solulinjoissa, halusimme tutkia onko tämä ennustava solulinjan vastaus kemoterapeuttisia. Sisplatiinin ja paklitakselin käytetään yleisesti aineina hoidettaessa munasarjasyövän. Resistenssin kehittyminen on Sisplatiini on yhteinen piirre munasarjasyövän ja OCCC on luonnehdittu erittäin sisplatiini kestävä histologiset alatyypin. Siksi oli yllättävää nähdä vahvan vähentää solujen elinkelpoisuuden ES-2 ja TOV-21-G-solujen vastauksena tätä yhdistettä (kuvio 4A). OVCA429 ja OVCA433 solut oli suurin vaste Paklitakseli, jota seuraa ES-2 ja TOV-21G-soluissa (kuvio 4B). Kuitenkaan ollut selkeää kuvio liittyy Sisplatiini ja paklitakselin herkkyys ja bioenergetiikan fenotyypin.

Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksia 72A. Sisplatiini, B. Paclitaxel, C. 2-deoksiglukoosi (2-PO), D. resveratrolin, E. metformiinin, F. rotenoni, ja G. Yhdistelmähoito pieniannoksista rotenoni (R; 0,1 uM) ja 2-PO (2 mM). Tulokset yhdestä Replikoitumattoman kokeessa näytetään (n = 5-6, A-F: ANOVA, Tukeyn kokeen * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 huomattavasti vähemmän solujen elinkelpoisuus verrattuna NOSE007 samaan hoitoon pitoisuus; G: Studentin T-testiä, tilastollisesti merkitsevä verrattuna kunkin solulinjan hoidon rotenone yksin [* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, *** * p 0,0001], tai 2-DG yksin [# p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001]). Tähdellä korosta OVCA420 soluja, joilla on viallinen mitokondrion hengitystä. H. Expression of GLUT-1 ja HNF-1β viestin munasarjasyöpäsoluja, arvioituna puolikvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR. Expression korreloi tasoille NOSE007 soluissa (n = 3; ND = ei mitattavissa signaalia havaita).

Koska korkean ECAR havaittiin OCCC soluissa, ei ollut yllättävää, että ES-2 ja TOV-21-G-solut osoittivat korkeinta vastauksena glykolyyttisen estäjä 2-deoksi-D-glukoosi (2-PO; kuvio 4C). OVCAR3 solut olivat resistenttejä 2-DG, joka voidaan tukea niiden laatu vaihteli ECAR lukemat (kuvio 3A). OVCAR3 soluissa oli myös hieman korkeampi hengitysvajaus kuin OCCC solulinjat (kuvio 1 i), joka voi osoittaa, että nämä solut kykenevät ylösajo heidän oksidatiivisen fosforylaation vastauksena glykolyysistä alasajojen tehokkaammin. Vaihtoehtoiset käsittelylaitteet Glykolyysivaiheen, kuten resveratrolin ja metformiinin johti vastaavien solujen elinkelpoisuuden profiilit saadaan 2-DG (kuvio 4D & E). NOSE007, DOV-13 ja OVCAR3 solut olivat yleensä vastustuskykyisempiä näitä yhdisteitä. Kuten odotettua, OVCA420 solut olivat herkkiä glykolyysin inhibition 2-PO, resveratrolin ja metformiinin, mutta tämä ei ollut selvästi erilainen OVCA429 tai OVCA433 soluja.

verrattuna NOSE007 soluihin, OVCA429, OVCA433, ja OCCC solun linjat ES-2 ja TOV-21-G soluilla oli merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuuden vastauksena mitokondrioiden estäjän rotenoni (kuvio 4F). Tämä saattaa liittyä niiden korkea riippuvuus mitokondrion hengitystä, mikä näkyy erityisesti OVCA429 ja OVCA433 soluja. NOSE007 ja DOV13 soluja, jotka oli alhaisemmat OCR profiili olivat vähemmän herkkiä mitokondrioiden inhibitiolle rotenoni annoksella 1 uM. Kiinnostavaa kyllä, tämä malli rotenoni herkkyys vastaavuuksia että paklitakselia (kuva 4B), mikä viittaa siihen, että paklitakseli saattaa olla voimakkaampi aktiivisuus solujen parannettu mitokondriaalisen hengityksen. Lisäksi välittäjänä mikrotubulia riippuvia vaikutuksia, Paklitakselin on osoitettu saavan aikaan sen apoptoottinen vaikutus

kautta

mitokondrioiden [25] – [27]. Tarve toiminnallisten mitokondrioiden herättämisessä Paklitakselia myrkyllisyys korostettiin myös puute OVCA420 vastauksena tätä yhdistettä. Solujen lisääntynyt herkkyys 2-DG, olivat paremmin kohdennettuja yhdistelmähoidolla pieniannoksista 2-DG (2 mM) ja rotenoni (100 nM), jolla on korkein tappaminen havaittu in OVCA420, OVCA429, OVCA433 ja kaksi OCCC solulinjoista ES-2 ja TOV-21-G (kuvio 4G).