Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Beclin 1 ja Beclin 2 ovat autophagy liittyviä proteiineja, jotka osoittavat samankaltaisia ​​aminohapposekvenssejä ja domeenirakenteet. Beclin 1 perustettiin ensimmäinen yhteys autophagy ja syöpä. Kuitenkin rooli Beclin 2 syöpä on epäselvä. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli analysoida Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja suusyövän kudoksissa ja solulinjoissa, ja arvioida niiden mahdollisia rooleja syövän etenemisessä.

Methods

Tutkimme Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja immunohistokemia 195 tapauksissa suun syöpä. Prognostisia roolit Beclin 1 ja Beclin 2 analysoitiin tilastollisesti.

In vitro

, yliekspressio ja knockdovvn Beclin proteiinien tehtiin suullinen tasyöpäsolulinja, SAS. Immunofluoresenssitutkimukset ja autophagy flux määrityksiä vahvistaneet Beclin proteiinit olivat mukana autophagy. Vaikutukset Beclin 1 ja Beclin 2 autophagy ja kasvaimen kasvua arvioitiin muuttamalla LC3-I LC3-II ja klonogeeniset määrityksissä, vastaavasti.

Tulokset

Suun syöpä kudoksiin näytteillä poikkeava ilmauksia Beclin 1 ja Beclin 2. sytoplasminen Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisut eivät liittyneet suun syöpä kudoksiin. Eloonjäämisessä analyysit, korkea sytoplasmista Beclin 1 ilmentyminen oli yhteydessä alhaiseen tautikohtaisten selviytymisen, ja negatiivinen ydin- Beclin 1 ilmentyminen liittyi korkea toistuvien vapaa elinaika. Potilaat, joilla on joko korkea tai matala sytoplasmista Beclin 2 ilme oli huomattavasti pienempi eloonjäämiseen ja tautien eloonjäämisaste tietyissä kuin ne, joilla on kohtalainen ilme. Suun syöpäsoluja yli-ilmentyminen joko Beclin 1 tai Beclin 2 johtaneet autophagy aktivointi ja lisääntynyt klonogeeniset selviytymisen; knockdovvn Beclin 2 heikentynyt autophagy ja lisääntynyt klonogeeniset selviytymistä.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittivat, että erillisiä malleja Beclin 1 ja Beclin 2 liittyi aggressiivisen kliinisiä tuloksia. Beclin 1 yliekspressio sekä Beclin 2 yli-ilmentymisen ja ehtyminen, osaltaan kasvaimen kasvua. Nämä havainnot viittaavat siihen Beclin proteiinit tuumorigeneesiin liittyvistä.

Citation: Liu J-L, Chen F-F, Chang S-F, Chen C-N, Lung J, Lo C-H, et al. (2015) Expression of Beclin proteiinit liittyy syövän etenemisen Oral Cancer. PLoS ONE 10 (10): e0141308. doi: 10,1371 /journal.pone.0141308

Editor: Spencer B. Gibson, Manitoban yliopiston, CANADA

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 07 lokakuu 2015; Julkaistu: 27 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia tiede ja teknologia Taiwan (MOST 103-2320-B-182A-018, NMRPG6D0071) (MOST 104-2320-B -182A-012-, NMRPG6E0041), Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (CMRPG6E0071), ja Chang Gung Medical Research Center (CMRPD6C0013). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä ja kasvava maailmanlaajuinen ongelma. Korkea ilmaantuvuusluvut esiintyy Etelä- ja Kaakkois-Aasiassa, osissa Eurooppaa osaa Latinalaisen Amerikan ja Tyynenmeren alueella [1]. Äskettäin ilmaantuvuus suullisen syöpä on lisääntynyt, etenkin taloudellisesti kehittyneissä maissa [2]. Valtaosa suusyövästä okasolusyöpä, joka syntyy levyepiteeliä limakalvon suun pinnan. Huolimatta samankaltaisia ​​histologisen fenotyyppi, molekyylitasolla suusyövän on erittäin monimutkainen, jossa esiintyy useita geneettisiä ja epigeneettiset mutaatioita [3, 4]. Tunnistaminen uusia biomarkkereita suun syöpä voidaan soveltaa uusien hoitotoimenpiteiden.

Autophagy on evoluutiossa konservoitunutta catabolic prosessi, johon hajoaminen tarpeeton solunsisäisten metaboliittien ja vahingoittuneet soluelimiin mukaan lysosomaalisten entsyymien. Prosessissa muodostumista autophagosomes, joka tuhoaa toivottuja soluliman sisällön ja sitten toimittaa ne lysosomeihin. Ensisijainen tehtävä autophagy on ylläpitää solun homeostaasin, erityisesti ravinteiden riistää olosuhteissa. Niistä autophagy liittyviä geenejä,

beclin 1

perustettiin ensimmäinen yhteys autophagy ja syövän [5], ja pitää haploinsufficient kasvainsuppressorigeenin [6, 7]. Beclin 1 osallistuu autophagosome nukleaatioon varhaisessa vaiheessa autophagy. Lisäksi Beclin 1 vuorovaikutuksessa monia myönteisiä ja kielteisiä säätimiä, jotka vaikuttavat autophagic aktiivisuus ja kasvaimen kehittymisen [8-12]. Se toimii ratkaiseva välittäjänä autophagy sääntelyä.

Beclin 2

, kerran kutsutaan

BECN1P1

, alunperin pidetty pseudogeeniä. Vuonna 2013, He et ai alttiina, että geeni koodaa proteiinia, joka osoittaa korkean yhtäläisyyksiä Beclin 1 aminohapposekvenssissä ja verkkotunnuksen rakenteita, ja he nimesivät uuden proteiinin Beclin 2 [13]. Tämä uusi tunnistettu proteiini havaittiin toiminut autophagy, endolysosomal hajoamista, ja aineenvaihduntaa. Se myös vuorovaikutuksessa useiden sidoskumppanien Beclin 1, kuten ATG14, AMBRA1, VPS34, ja Bcl-2. Nämä tiedot viittasivat sen säätelijänä autophagy [13].

yhdistys Beclin 2 ja syöpä ei ole käsitelty, ja suhde Beclin 2 ja Beclin 1 ilmaisun ja tuloksia syöpäpotilaiden ei ole koskaan tutkittu . Tässä tutkimuksessa tutkimme ilmauksia Beclin 1 ja Beclin 2 suun syöpä kudoksiin, ja tutki yhdistysten kesken ilmauksia Beclin 1 ja Beclin 2, viittaavia tekijöitä, ja eloonjäämisaste. Olemme myös tarkastetaan vaikutukset muuttamisen Beclin proteiineja autophagy ja syöpäsolujen lisääntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteiden

Tämä Potilasaineisto hyväksyi Institutional Review Board of St. Martin De Porres Hospital (Chiayi City, Taiwan) ja Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (Chiayi County, Taiwan). Potilaan tiedot nimettömiksi ja de-tunnistettu ennen analyysiä. Formaliinifiksoidusta, parafinoidut kudosnäytteitä suullinen saavilla syöpäpotilailla kirurginen resektio saatiin arkistoista St. Martin De Porres Hospital tammi 2003 ja joulukuussa 2008. Kaikki tapaukset olivat ensimmäistä kertaa todettiin, histologisesti varmennettu okasolusyöpä. Potilailla, jotka saivat ennen leikkausta neoadjuvant hoitoon tai ollut kasvain koko on alle 5 mm, jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Kliiniset tiedot, mukaan lukien potilaiden ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, imusolmuke tila, etäpesäke, ja seurantatietoja, saatiin potilastietoja. Kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) vaihe määriteltiin seitsemännen painoksen amerikkalaisen sekakomitean Cancer pysähdyspaikan järjestelmä [14]. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin välistä aikaa leikkauksen ja kuoleman kaikista syistä. Tautikohtaisten selviytyminen (DSS) määriteltiin välistä aikaa leikkauksen ja kuoleman aiheuttamia suusyöpä. Toistumisen elinaika (RFS) määriteltiin välinen aika leikkauksen ja ensimmäisen paikallisen tai systeemisen uusiutumisen.

yhteensä 198 tapausta suusyövän alunperin mukana. Kolme tapausta näyttämällä vähän tai ei lainkaan kudoksen osioista kudossiruina suljettiin pois. Tutkimus lopulta muodostui 195 tapausta immunohistokemiallista tahrat ja tilastollinen analyysi.

Patologinen tutkimus

hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen dioja kunkin tapauksen arvioitiin uudelleen patologi vahvistamiseksi histologinen tyyppi , laatu, tila kuolion ja lymphovascular hyökkäystä. Histologinen arvosana luokiteltiin luokan 1 (hyvin eriytetty), luokka 2 (kohtuullisesti erilaistunut), ja 3. asteen (huonosti eriytetty). Tapaukset nekroottista alueet muodostavat yli 10% kasvaimen alueita pidettiin ”laaja kuolion” ja muissa tapauksissa kirjattiin ”vähän tai ei lainkaan kuolion.” Lymphovascular invaasio määriteltiin läsnäoloa syöpäsolujen sisällä lymphovascular kanavia.

Tissue mikrosirujen rakentamiseen

Tissue mikrosirujen rakentaminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, patologi analysoi hematoksyliinillä ja eosiinilla-värjätään dioja, ja sitten merkitty edustajan alueita näytteitä dioja ja vastaavan kudosblokeista. Näyte ydin valinta kudosblokeista kuului kaksi 1,5 mm: n läpimittaiset sydämiä varten kussakin tapauksessa syövän kudosten, ja yksi 1,5 mm: n läpimittaiset core kussakin tapauksessa normaalin suun mucosas. Valitun ytimet irrotettiin ja siirrettiin parafiini-vastaanottaja lohkoja. Peräkkäiset 4-pm paksun osat tuotettiin, ja hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys suoritettiin kunkin vastaanottajan lohkon vahvistaa läsnäoloa valitun vyöhykkeillä.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen tahroja tehtiin 4 -μm-paksummat kohdat päässä kudossiruina joita Leica Bond-Max Autostaineriin (Leica Microsystems, Bondbiotech, Taichung, Taiwan) mukaan valmistajan ohjeiden vähäisin muutoksin. Leikkeet poistettiin parafiini Bond vahan Solution (Leica) ja hydrata uudestaan ​​arvostellaan alkoholia. Lämmön aiheuttama antigeeni haku saavutettiin Bond Epitooppi Retrieval Liuos 1 (Leica) 20 minuutin ajan 100 ° C: ssa. Levyjä inkuboitiin vetyperoksidin 5 minuuttia vähentää endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Objektilaseja inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa hiiren monoklonaalisia vasta-aineita Beclin 1 (1: 400, kanin polyklonaalinen, Abcam, Cambridge, UK) ja Beclin 2 (1: 400, kanin polyklonaalinen, Novus biologisten, Littleton, CO, USA). Jälkeinen ensisijainen IgG linkkeri reagenssia käytettiin 8 minuuttia, ja levyt inkuboitiin polymeerisen piparjuuriperoksidaasi IgG reagenssi 8 minuuttia paikallistaa primaarisen vasta-aineen. Diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB) käytettiin substraattina havaitsemaan antigeenin vasta-aineen sitoutumisen. Lopuksi, hematoksyliinillä levitettiin 5 minuuttia vastavärjäämiseksi ytimiä.

arviointi Immunohistokemian

intensiteetti, prosentteina, ja solunosasijaintia n immunohistokemiallisella värjäyksellä kussakin tapauksessa kirjattiin. Normaali nielurisakudoksessa käytettiin positiivisena kontrollina. Värjäys jättämällä primaarinen vasta-aine tehtiin, koska negatiivisen kontrollin. Soluliman ja ydin- ilmaisuja arvioitiin erikseen. Intensiteetti ja prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen kussakin ytimessä skannattiin alhaisen tehon kenttä (100 X) ja sitten arvioidaan HPF (400 X). Värjäytymisen intensiteetti kirjattiin 0, 1, 2, ja 3 viitaten negatiivinen, heikko, kohtalainen, ja vahva värjäytyminen, vastaavasti. Niiden positiivisten solujen kirjattiin 0%: sta 100%. Tulokset värjäytyminen pisteytettiin käyttäen nopeaa (Q) pisteet, joka saadaan kertomalla positiivisten solujen prosenttiosuuden (P), jonka intensiteetti (I) (Q = P × I maksimi = 300) [16]. Kaksi patologit arvioitu riippumattomasti tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä tietämättä ennusteeseen viittaavia tietoja. Ristiriitaisia ​​tuloksia ratkaistiin jonka multihead mikroskoopilla.

Cutoff pisteen valinta immunohistokemiaan

sytoplasmista ilmauksia Beclin 1 ja Beclin 2, optimaalinen sulku olevia Q tulokset määritettiin X-Tile ohjelmisto 3.6.1, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Ohjelma laskettu khiin neliö arvot kaikilla mahdollisilla osastojen perustuu log-rank testi Kaplan-Meier. Sytoplasmista ekspressiota Beclin 1, yksi optimaalinen piste, jolla on korkein arvo oli päättänyt. Cutoff pisteen Q tulokset korkeimmalla chi-neliö-arvot olivat 55, 110 ja 25 OS, DSS, ja RFS, vastaavasti. Valitsimme 63 rajasäädöksi Q sijoituksen Beclin 1 sytoplasmisen ilme. Sytoplasmista ekspressiota Beclin 2, chi-neliö-arvot määritetään 2 optimaalinen sulku kohdat olivat suuremmat kuin määritetty 1 optimaalinen piste. Niinpä valitsimme 2 sulku pistettä luokitella sen lausekkeen 3 ryhmään: matala, kohtalainen, ja korkea. Cutoff olevia Q pisteet korkein chi-neliö-arvot olivat (35, 125), (35, 145), ja (25, 85) OS, DSS, ja RFS, vastaavasti. Valitsimme (32, 118) kuin sulku Q pistemäärät Beclin 2 sytoplasmista ilme.

Vain pieni osa tapauksista osoitti ydin- ilmentymistä Beclin 1 tai Beclin 2. Näin tapauksissa yli 10% alueilla tumavärjäystä luokiteltiin positiivisiksi; muut luokiteltiin negatiiviseksi.

Soluviljelmät ja reagenssit

Ihmisen suun okasolusyöpä solulinja SAS, perustetaan huonosti eriytetty levyepiteelisyövän kielen, viljeltiin 10% FBS DMEM. Ilmentävien plasmidien lippu-merkitty Beclin 1 ja Beclin 2 saatiin Addgene ja lahjana Levine laboratoriosta, vastaavasti. Voit luoda lentivirusvektorilla ilmentävät Beclin 2, PCR-fragmentti lippu-tagged

beclin 2

kloonattiin pLX301 lentivirusvektorilla (Addgene). Lentiviruksiin kertyi rinnakkaistransfektoimalla HEK293 plasmideilla pLX301-Beclin 2, pCMVDR8.2 ja pMD.G Lipofectamine 2000 lentiviruksien vapautuu elatusaineeseen kerättiin 48 tuntia ja 72 tuntia transfektion jälkeen. SAS solut stabiilisti yli-ilmentävät Beclin 2 perustettiin infektoimalla lentivirukselle ilmaisemalla Beclin

2

ja puromysiiniselektion. Bafilomysiini, joka on autophagy estäjä estää fuusion välillä autophagosomes ja lysosomeihin, oli ostettavissa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

siRNA Knockdown

Double-stranded Sirna (siRNA) vastaan ​​

Atg5

ja

beclin 2

oli ostoksen Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) ja Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), tässä järjestyksessä. SAS-solut ympättiin 6-kuoppalevyille, ja transfektoitiin 100 pmol siRNA mukaan RNAiMax (Invitrogen) on seuraavana päivänä.

immunoblot-analyysi

Solut hajotettiin PBS: ssä, joka sisälsi 1% Triton X -100 ja proteaasiestäjäseostabletit (Sigma-Aldrich). Lysaatit sentrifugoitiin 12,000x g 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Proteiinit lysaatin erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraanille kalvo ja havaittiin immunoblottauksella. Anti-Flag ja Anti-Atg

5

ostettiin Sigma-Aldrich. Anti-LC3 saatiin Nanotool (Teningen, Saksa). Anti-Beclin 1 ja anti-Beclin 2 ostettiin Santa Cruz Biotechnology ja Novus Biologicals, vastaavasti. Anti-P62 ostettiin Abcam.

immunofluoresenssi

Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, ja käsitellään immunofluoresenssivärjäyksen primaarista vasta-ainetta anti-Flag (M2) ja inkubointi fluorescence- leimattua sekundääristä vasta-ainetta (Invitrogen). Lopuksi solut havaittiin ja kuvat otettiin kiinni alla Leica SP5 fluoresenssimikroskoopilla.

klonogeeninen määritys

SAS-solut, jotka on transfektoitu plasmideilla tai siRNA maljattiin noin 200 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 10 päivää. Solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 1% kristallivioletilla metanolissa 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen ulos väriaine, pesäkkeet laskettiin.

Tilastollinen

Khin neliö testejä käytettiin arvioimaan yhdistyksen ilmentymisen Beclin proteiinien ja viittaavia tekijöitä. Korrelaatiot Q tulokset arvioitiin Spearmanin testejä ja Spearmanin rho kertoimia havainnollistettiin lämpönä kartalla. Käyrät OS, DSS, ja RFS piirrettiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot eloonjäämisluvuissa verrattiin log-rank testejä. Yksiulotteista ja monimuuttuja Coxin osuus regressiomalleja käytettiin arvioida riskisuhteita ja 95%: n luottamusväli potilaiden tuloksia. Kaikki

P

arvot olivat 2-puolinen.

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Siirtomaa numerot klonogeeniset määrityksissä olivat edustettuina suhteet ohjaus +/- keskivirhe. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 19.0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Armonk, NY, USA) ja Excel 2013 (Microsoft Excel, Microsoft, Redmond, WA, USA) for Windows.

Tulokset

Poikkeava Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja suusyövän kudoksissa

arvioidaan Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja ja niiden solunosasijaintia teimme immunohistokemia 195 tapausta suusyövän kudosten ja normaali suullinen mucosas. Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja olivat sijaitsevat pääasiassa solulimassa, ja satunnaisesti ytimet. Normaali suullinen mucosas osoittivat heikkoa tai kohtalaista sytoplasmista ilmaisun ja polttoväli ydin- ilmaus Beclin 1 ja Beclin 2 (kuvio 1 A ja 1 E). Suullinen syöpä kudoksiin näytteillä vaihteleva soluliman ilmauksia Beclin 1 ja Beclin 2, vaihdellen kokonaistappiot hajanainen vahva ilmaisu (kuvio 1 B-1D ja 1F-1H). Keskimääräinen Q tulokset soluliman Beclin 1 ja Beclin 2 oli 67,46 ± 55,19 ja 75,26 ± 62,16, vastaavasti. Cutoff pistettä Beclin 1 ja Beclin 2 kuvattiin materiaalit ja menetelmät. Sytoplasmista Beclin 1 111 tapausta (56,92%) luokiteltiin heikkoa ilmentymistä, ja 84 tapausta (43.08%) luokiteltiin voimakkaaseen ilmentymiseen. Sytoplasmista Beclin 2, 65 potilasta (33,33%) luokiteltiin heikkoa ilmentymistä; 83 potilasta (42.56%) luokiteltiin kohtalainen ilmaisu; 47 potilasta (24,10%) luokiteltiin voimakkaaseen ilmentymiseen. Vain pieni joukko suusyövän kudosten ilmaisee tumavärjäystä of Beclin 1 (33/195, 16,92%) ja Beclin 2 (29/195, 14.87%) (kuvio 1 C, 1D ja 1I).

(A ) Heikko tai kohtalainen sytoplasmista ja ydinvoiman ilmentymistä Beclin 1 normaalissa suun squamous limakalvo. (B) Alhainen sytoplasmista ekspressiota Beclin 1 suullisen syöpäkudoksessa. (C) Korkea soluliman ja positiivinen ydin- ilmentymistä Beclin 1 suullisen syöpäkudoksessa. (D) Alhainen soluliman ja positiivinen ydin- ilmentymistä Beclin 1 suullisen syöpäkudoksessa. (E) heikko tai kohtalainen sytoplasmista ekspressiota Beclin 2 normaalissa suun squamous limakalvo. (F) Alhainen sytoplasmista ekspressiota Beclin 2 suullisesti syöpäkudoksessa. (G) Kohtalainen sytoplasmista ekspressiota Beclin 2 suullisesti syöpäkudoksessa. (H) Korkea sytoplasmista ekspressiota Beclin 2 suullisesti syöpäkudoksessa. (I) Kohtalainen soluliman ja positiivinen ydin- ilmentymistä Beclin 2 suullisesti syöpäkudoksessa.

yhdistysten Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ja autophagosomal markkeri suusyövän kudoksissa

Vertasimme Beclin 1 ja Beclin 2 ilmaisuja iän, sukupuolen, kasvaimen koon, imusolmuke tila, etäpesäke, vaihe, laatu, lymphovascular invaasio, ja kuolion (taulukko 1). Beclin 1 ilme oli liity viittaavia tekijöitä. Alhainen sytoplasminen ilmentyminen Beclin 2 liittyi korkeampi histologinen (huono ennustetekijä) verrattuna kohtalainen ja korkea ilmaisuja. Positiivinen ydin- ilmentyminen Beclin 2 oli liitetty huono ennustetekijät, kuten imusolmuke etäpesäke ja lymphovascular invaasio.

ydin- ja sytoplasman ilmauksia Beclin 1 osoittivat heikkoa korrelaatiota (Spearmanin rho = 0,287,

P

0,001). Ydin- ja sytoplasman ilmauksia Beclin 2 myös korreloivat heikosti (Spearmanin rho = 0,212,

P

= 0,003). Sytoplasmisen ilmaus Beclin 1 ja Beclin 2 on riippumaton (Spearmanin rho = -0,072,

P

= 0,318). Välisiin suhteisiin Beclin proteiinien ja autophagosomal merkki, LC3B, arvioitiin myös. Autophagosomes edustaa LC3B punctae arvioitiin edellisessä tutkimuksessa [18]. Vain sytoplasminen Beclin 1 korreloi tasolle LC3B punctae (Spearmanin rho = 0,305,

P

0,001) (kuvio 2).

väri mittakaavassa Spearmanin kerroin rho annetaan alemmalla oikea, vihreillä edustaa negatiivinen korrelaatio ja punainen positiivinen. *

P

0.05.

Erilliset ekspressiomalleja Beclin proteiinien yhteydessä huonoon ennusteeseen

Kaplan-Meier käyrät kumulatiivinen OS, DSS, ja RFS todennäköisyyksiä Beclin 1 ja Beclin 2 esitetään kuvassa 3. Potilaat, joilla on korkea sytoplasmisen Beclin 1 ilme oli pieni DSS (

P

= 0,008), ja ne, joilla negatiivinen ydin- Beclin 1 ilme näytti korkea RFS (

P

= 0,036). Potilaat, joilla on joko korkea tai matala sytoplasmista Beclin 2 ilme oli huomattavasti pienempi OS ja DSS hinnat verrattuna potilaisiin, joilla on kohtalainen sytoplasmisen Beclin 2 ilme. Selviytymisen todennäköisyydet potilaiden välillä matala ja korkea sytoplasman ilmaisut eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Ydin- Beclin 2 ilmentyminen oli unassociated kanssa selviämistila.

tulokset yhden ja usean selviytymisen analysoi Coxin suhteellista vaaraa regressiomenetelmiä esitetään taulukoissa 2, 3 ja 4 Korkea soluliman Beclin 1 ja negatiivinen ydinaseiden Beclin 1 liittyi huono DSS ja RFS alle yhden ja usean analyysit, vastaavasti. Lisäksi sytoplasmisen Beclin 2 ilmaisu oli itsenäinen ennustetekijä OS ja DSS. Matala ja korkea sytoplasman Beclin 2 ilmaisuja liittyi aggressiivisen kliinisiä tuloksia.

Joko Beclin 1 tai Beclin 2 yliekspressio indusoi autophagy ja edistää suun syöpäsolujen kasvua

tutkia vaikutuksia Beclin 1 ja Beclin 2 yli-ilmentymisen suusyövän, käytimme SAS transfektoitujen solujen ekspressoivan plasmidin flag-merkitty Beclin 1 ja Beclin 2, vastaavasti. Yli-ilmentyminen Beclin 1 tai Beclin 2 johti lisätä muuntamisen LC3-I LC3-II normaaliolosuhteissa. Kuitenkin tämä ilmiö inevident alle nälkään tilassa (kuvio 4A). Suhde LC3-II /LC3-I ja p62 tason molemmat lisääntynyt soluissa yli-ilmentävät Beclin 1 tai Beclin 2 verrattuna kontrolliin jälkeen bafilomysiini hoidon nälkään (S1 Kuva). Nämä havainnot vahvistavat rooli Beclin 2 autophagy kautta.

(A) SAS-solut transfektoitiin kontrolli-plasmidi, ilmentävien plasmidien flag-merkitty Beclin 1 (B1) tai Beclin 2 (B2). 24 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin Earlen tasapainotettua suolaliuosta (EBSS) 1 h nälkään. Lysaatti valmistettiin ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla. Intensiteetti LC3-I ja LC3-II mitattiin käyttäen ImageJ ja suhde LC3-II /LC3-I on esitetty alla. (B) HEK293 stabiilisti ilmentävät GFP-LC3 transfektoitiin plasmidilla ilmentävien lippu-merkitty Beclin 1 tai Beclin 2 ja viljeltiin joko normaali viljelyalustaan ​​(DMEM) tai nälkään ehto (EBSS), kuten. Solut kiinnitettiin 48 h transfektion jälkeen. Epäsuoralla immunofluoresenssilla värjäys suoritettiin käyttäen anti-Flag M2. 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäys paljasti ytimen. Laatikko alue suurennetaan (a). (C) SAS transfektoitiin kontrolli tai lippu-merkitty Beclin 1 ja Beclin 2 24 tuntia. Transfektoidut solut maljattiin uudelleen 200 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle. Jälkeen 14 päivää, pesäkkeet visualisoitiin käyttäen 1% kristalliviolettia metanolia. Kokeet suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti.

arvioimiseksi solunosasijaintia Beclin proteiinien, HEK293-solut transfektoitiin plasmidilla ilmentävät flag-merkitty Beclin 1 ja Beclin 2, vastaavasti. Normaaliolosuhteissa määrä GFP-LC3 puncta oli alhainen, ja Beclin 1 ja Beclin 2 käytti enimmäkseen lokalisoitu sytoplasmassa (kuvio 4B, vasen paneeli). Sen jälkeen autophagy induktion ravinteiden nälkään ja bafilomysiini Altistuksen jälkeen solut osoittivat lisääntynyttä LC3 punctae; Beclin 1 ja Beclin 2 osoitti osittaista rinnakkaispaikantumisen kanssa LC3 punctae (kuvio 4B, oikea paneeli). Lisäksi havaitsimme, että LC3 punctae suurennettiin vuonna Beclin 2 yli-ilmentävät solut verrattuna kontrolliin ja Beclin 1 yliekspressoivia soluja. Lisäksi solut joko Beclin 1 tai Beclin 2 yliekspressio lisäsi klonogeeniset selviytymisen kyky verrata hallita transfektoiduissa soluissa (kuvio 4C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen Beclin 1 tai Beclin 2 aktivoi autophagy ja edistää syöpäsolujen kasvua, ja vaikutukset yliekspressio Beclin 1 ja Beclin 2 olivat toisistaan ​​riippumattomia.

Beclin 2 väheneminen heikentää autophagy ja edistää suun syöpäsolujen kasvua

tarkastaa vaikutuksen beclin 2 ehtymisen ja sen suhteesta autophagy suun syöpä, transfektoimme siRNA kohdistaminen joko

beclin 2

tai

Atg5

SAS soluissa . Koska endogeeninen Beclin 2 taso oli alhainen SAS soluissa, tehokkuus

beclin 2

pudotus siRNA ensin määritettiin soluissa stabiilisti ilmaistu lippu-merkinnällä Beclin 2. Solut ekspressoivat stabiilisti Beclin 2 osoitti korkeampi suhde LC3- II /LC3-I (kuvio 5A, vasen paneeli). Jälkeen transfektoidaan siRNA kohdistaminen

beclin 2

tai

Atg5

, ilmentyminen Beclin 2 tai Atg5 väheni merkittävästi, ja suhteet LC3-II /LC3-I laski samanaikaisesti (kuvio 5A, oikealle paneeli). Vaikka endogeeninen Beclin 2 pystynyt havaitsemaan jälkeen transfektoimalla siRNA kohdistaminen

beclin 2

, The Beclin 1 ja Atg5 tasot pysyivät muuttumattomina, ja suhde LC3-II /LC3-I oli vähentynyt (kuvio 5B). Nämä tiedot merkitsevät sitä, että Beclin 2 ehtyminen aiheuttaa autophagy vajaatoiminta. Solut joko Beclin 2 tai Atg5 ehtyminen näytti klonogeeniset selviytymisen kyky verrata käsiteltyjen solujen ohjaus siRNA (kuvio 5C). Nämä havainnot viittaavat siihen Beclin 2 ehtyminen heikentää osa autophagy toimintaa, ja edistää syöpäsolujen kasvua.

(A) SAS solut tai stabiilisti ilmentävät flag-merkitty Beclin 2 tai (B) SAS transfektoitujen solujen ohjaus siRNA ( scr), Atg5 siRNA (siAtg5) tai Berlin 2 siRNA (siB2). Solulysaattia valmistettiin 48 tunnin kuluttua transfektion ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (C) SAS-solut transfektoitiin ohjaus siRNA (SCR), Atg5 siRNA (siAtg5) tai Berlin 2 siRNA (siB2) 24 tuntia. Transfektoidut solut maljattiin uudelleen 200 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle. Jälkeen 14 päivää, pesäkkeet visualisoitiin käyttäen 1% kristalliviolettia metanolia. Kokeet tehtiin kolme kertaa itsenäisesti.

Keskustelu

Beclin perhe on 2 tunnistettu jäsentä, Beclin 1 ja Beclin 2. ennustetekijöiden rooli Beclin 1 on tutkittu laajasti eri tyyppisiä ihmisen syövissä, ja potilaiden tulokset määräytyy sytoplasmisen Beclin 1 ilmentyminen voi olla spesifinen syöpätyypin. Esimerkiksi alhainen ilmentyminen Beclin 1 yhteydessä huonoon ennusteeseen rintasyövän [19, 20], munasarjasyöpä [21], keuhkosyöpä [22], maksasyövän [23], kolangiokarsinooma [24], haimasyöpä [25], hypopharyngeal syöpä [26], kurkunpään syöpä [27], ruokatorven syöpä [28], pohjukaissuolisyöpä [29], mahasyöpä [30], lymfoomat [31-33], jne korkea ilmentyminen Beclin 1 yhdistetty kasvaimen aggressiivisuus nenänielun kohdunkaulan [34], kohdun limakalvon syöpä [35], ja peräsuolen syöpä [36]. Tutkimukset on Beclin 1 suun syöpä kudoksiin osoitti, että korkea ilmentyminen huonosta ennustetekijöiden ja /tai aggressiivinen kliinisiä tuloksia [37, 38]. Tutkimuksemme oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten ja me kertoo vielä, että yliekspressio Beclin 1 SAS aiheuttama kasvaimen kasvua klonogeeniset määrityksessä, mikä osoittaa sen rooli syövän etenemisen suusyöpää.

Tässä tutkimuksessa ensin arvioinut ilmaisun ja prognostiset roolia Beclin 2 ihmisen syövässä. Me paljastaa, että suullinen syöpäpotilaat joko korkea tai matala ilmentymisen Beclin 2 osoittivat huonompi ennuste kuin ne, joilla on kohtalainen ilme. Ilmaus Beclin 2 oli riippumaton syövän vaiheessa (taulukko 1). Joko korkea tai matala Beclin 2 ilmentymisen syövän kudoksissa ehdotti toimintahäiriöitä autophagy ja aineenvaihduntaa. Beclin 2 toiminnalliset analyysit osoittivat lisäksi joko sen kulutukseen tai yliekspressio edistää kasvaimen kasvua SAS suun syöpäsoluja. Nämä havainnot merkitsevät Beclin 2 liittyy tuumorigeneesiä suusyöpä. Manipulointi geenin ilmentymisen

beclin 1

ei vaikuta Beclin 2-proteiinin, ja päinvastoin. Sytoplasmisen lausekkeet 2 proteiinit olivat myös etuyhteydettömille suun syöpä kudoksiin (kuvio 2). Tulokset viittaavat siihen, molekyylitason mekanismi, joka osallistuu suun tumorgenesis näiden 2-proteiinien on riippumaton.

Autophagy on liitetty sekä kasvaimen suppression ja kasvaimen etenemisen. Autophagy estää pahanlaatuisiin normaalien solujen ylläpitämällä solun homeostaasin, normaalia aineenvaihduntaa, ja genomin vakauteen [39]. Vakiintuneisiin kasvaimiin, autophagy usein edistää kasvainsolujen kasvua ylläpitämällä aineenvaihduntaa stressaavaa kunnossa [40, 41]. Kuitenkin todellinen vaikutus autophagy on tumorigeneesin voi olla kontekstisidonnaisia. Autophagy voi säädellä solujen kasvua eri tavalla kudostyyppejä ja geneettisen asetukset [42, 43]. Liitot välinen autophagy ja Beclin proteiinit on hyvin dokumentoitu. Beclin proteiinit vuorovaikutuksessa komponenttien luokkaan III fosfoinositidi 3-kinaasi monimutkainen, joka vaaditaan aloittamiseen autophagy [13, 44]. Beclin 1 on mukana muodostumiseen phagophore (esiaste autophagosome) alussa vaiheen autophagy, ja on colocalized kanssa LC3 punctae [45, 46]. Tuloksemme ensimmäinen osoittaneet rinnakkaispaikantumisen on Beclin 2 ja LC3, vahvistavat, että Beclin 2 osallistuu autophagy. Vaikka olemme havainneet, että manipulointia Beclin 1 tai Beclin 2 tasolla johtivat muutoksiin autophagy niiden vaikutukset kasvaimen kasvuun ei saa kokonaan suoraan takia autophagy. Beclin 1 oli alun perin määrä todettiin kasvaimia estävä toiminta [5]. Paradoksaalisesti korkea ilmentyminen Beclin 1 liittyi syövän etenemisen joidenkin syöpien, kuten edellinen kuvattu [34-38]. Allelic menetys

beclin 1

esti kasvainten muodostumista tietyn genotyypin hiirien [47, 48]. Beclin 1 paitsi vuorovaikutuksessa positiivisia ja negatiivisia säätelijöitä autophagy, vaan osallistuu myös useita ei-autophagic prosesseissa [49]. Vaikutukset Beclin 1 taudin etenemiseen voi olla ainakin osittain riippumaton autophagy. Lisäksi tutkimuksemme määritti ensin yhteyden Beclin 2 ja syövän etenemiseen. Suhteita Beclin 2 ja kasvaimen kehittymisen voi olla monimutkaisempi. Kasvain eteneminen aiheuttama Beclin 2 yli-ilmentymisen ja vähenemistä voi johtua eri mekanismeja. Meidän data ja aiemmat kirjallisuudessa todettu, että pudotus on Beclin 2 heikentynyt, mutta ei täysin poistanut autophagy [13]. Kasvain kasvu aiheuttamat Beclin 2 ehtyminen voidaan herättämän autophagy ja /tai autophagy-riippumattomien mekanismien. Beclin 2 osakkeiden useita vuorovaikutuksessa kumppanien Beclin 1, ja lisäksi tarvitaan hajoamisen GASP1-säänneltyjen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) [13]. Monet GPCR: t ovat yli-ilmennetään syöpien ja edistää syöpäsolujen lisääntymistä [50].