Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä varsi kaltainen puolella väestöstä (SP) soluja on tunnistettu monia kiinteitä kasvaimia; mutta useimmat näistä tutkimuksista suoritetaan käyttäen vakiintuneita syöpäsolulinjoilla. Syöpäsolut tuumorikudoksessa, joka sisältää fibroblastien ja monia muita solutyyppejä ovat paljon monimutkaisempia kuin syöpä-solulinjasta. Vaikka SP solut tunnistettiin kurkunpään okasolusyöpä (LSCC) solulinja Hep-2 in Pilottitutkimuksemme, ei tiedetä, onko LSCC kudos sisältää SP-soluissa. Tässä tutkimuksessa LSCC soluja (LSCCs) olivat ensisijainen viljeltiin ja puhdistettiin kirurgisesti resektoitiin LSCC näyte, joka on peräisin hyvin erilaistunut Kurkunkannen kasvain kiinalainen mies. Tätä seurasi tarkastaminen epiteelin ominaispiirteet, kuten ultrastruktuuri ja biomarkkereita. Selvä SP alaryhmässä (4,45 ± 1,07%) eristettiin Hoechst 33342 ulosvirtausta analyysi viljellystä LSCCs käyttämällä virtaussytometrillä. Cancer kantasolujen (CSC) -associated määritykset, kuten ilmaus itseuudistumisen ja CSC markkerigeeni, proliferaatiota, erilaistumista, pallomainen muodostumista, kemoterapia vastus, ja tuumorigeenisyystesti sitten toteutettiin vuosina SP ja ei-SP (NSP) LSCCs.

In vitro

ja

in vivo

määrityksissä osoitti, että SP-soluissa ilmenee etuoikeutettu ilmaisu itseuudistumisen ja CSC markkerigeeni, suurempi kapasiteetti lisääntymistä, erilaistumista ja pallomainen muodostuminen; parannettu kestävyys kemoterapiaa; ja suurempi ksenograftin tuumorigeenisyystesti immuunivajaissa hiirissä verrattuna NSP soluihin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ensisijainen viljellyt ja puhdistettu LSCCs sisältävät syöpää varsi kaltaisia ​​SP soluja, joita voidaan käyttää arvokkaana mallina CSC tutkimuksen LSCC.

Citation: Wu CP, Zhou L, Xie M, Du HD Tian J, Sun S, et ai. (2013) Identification of Cancer Stem-Like Side Population solut Puhdistettu Ensisijainen viljellyissä ihmisen kurkunpään Okasolusyöpä epiteelin. PLoS ONE 8 (6): e65750. doi: 10,1371 /journal.pone.0065750

Editor: Jian Cao, Stony Brook University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 marraskuu 2012; Hyväksytty: 29 huhtikuu 2013; Julkaistu: 11 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain tuettu National Natural Science Foundation of China (30872855) ja Shanghai Science and Technology Foundation of China (12JC1402101). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer varsi kaltainen puolella väestöstä (SP) solut on onnistuneesti tunnistettu laaja valikoima kiinteiden kasvainten, mukaan lukien rintasyövän [1], [2], maksasyövän [3] – [7], keuhkojen syöpä [8], [9], maha-suolikanavan syöpä [10] – [12], eturauhassyöpä [13], sappirakon syöpä [14], munasarjasyöpä [15], kohdun limakalvon syöpä [16], haimasyöpä [17], [ ,,,0],18], urologiset syöpä [19], [20], glioblastooma [21], melanooma [22], osteosarkooma [23], [24], mesenkymaaliset kasvaimet [25], nenänielun syöpä [26], suusyövästä [27], [28], ja muut pään ja kaulan alueen syövät [29], [30]. Kuitenkin, suurin osa näistä tutkimuksista on suoritettu käyttäen vakiintuneita syöpäsolulinjoilla. Vaikka perustettu syöpäsolun linjat ovat käyttökelpoisia välineitä perus- ja prekliinisen syöpätutkimuksessa, ne ovat yksinkertaistettuja jäljittelee monimutkaisia, heterogeeninen, kiinteä syöpäkudokset. Syöpäsoluja primaarikasvaimen sisältävän kudoksen fibroblastien, stroomasoluilla, lymfosyyttejä, ja muita soluja, ovat paljon monimutkaisempia kuin solujen syöpä solulinjassa. Siksi ensisijainen viljellyt ja puhdistettu syöpäsolujen johtuvat syöpäkudokset voi olla parempi esitys alkuperäisestä kasvaimesta.

Kurkunpään levyepiteelisyöpä (LSCC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten pään ja kaulan alueella. Viime vuosina LSCC potilaat pitkälle ovat silti yleensä periksi Paikallista uusiutuminen ja etäinen etäpesäke. Syöpä varsi kaltaiset SP soluilla on keskeinen rooli kasvaimen aloittamista, huolto, eteneminen, ja uusiutumisen [31] – [33]. Siksi jatkuva tutkimus SP-soluissa kehittää uusia aineita, jotka kohdistuvat syövän kantasolut (CSCS) tarvitaan kiireellisesti.

pilottitutkimus tunnistettu syöpää varsi kaltaisia ​​SP solujen LSCC solulinjassa Hep-2 [30] . On kuitenkin tiedetä, onko LSCC kiinteä kasvain sisältää SP-soluissa. Tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa käytimme Hoechst 33342 ulosvirtaus analyysi tunnistaa SP soluja suoraan puhdistetusta, ensisijainen viljellyt, hyvin erilaistunut LSCC soluja (LSCCs) johdettu kiinalainen mies potilaasta laryngektomian varten Kurkunkannen syöpä. Huomasimme, että ensisijainen viljellyt LSCCs sisälsi myös selvä SP alapopulaatio, jonka osuus 4,45 ± 1,07% koko syöpäsoluja. Lisäksi mukaan

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä, olemme dokumentoitu, että SP-soluissa tunsivat enemmän syöpää varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia verrattuna ei-SP-soluissa (NSP).

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tuumorinäytesylinterin saatiin suostumuksella eettisen komitean silmä, korva, nenä ja kurkkutautien sairaala, Fudanin yliopiston, Shanghai, Kiina. Allekirjoitettu suostumus saatiin potilaasta. Protokolla hyväksyttiin Shanghai Medical Experimental Animal Care komitea. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Potilastiedot

Potilas oli käsittelemätön 68-vuotias kiinalainen mies, joka tehtiin laryngektomian varten levyepiteeliperäinen syöpä johtuvat kurkunkantta, Stage IV, T4aN2M0, joka perustuu 6. painos unionin International Cancer valvonta (UICC) TNM luokitusjärjestelmä. Erityisesti hän ei ole suvussa pään ja kaulan alueen syöpä, mutta on 40-vuotisen historian tupakoinnin ja 30-vuotisen historian alkoholin käytön.

Ensisijainen kulttuuri ja puhdistus LSCCs

kirurgisesti resektoitiin tuumorinäytesylinterin upotettiin kylmään kolmen antibiootti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 1% penisilliini /streptomysiiniä ja amfoterisiini B: tä (10 ug /ml) (Invitrogen, Buffalo, NY, USA), ja scissored pieniksi paloiksi, jotka sitten hajotettiin entsymaattisesti RPMI 1640 väliaineessa, joka sisältää tyypin IV kollagenaasia (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 200 U /ml vähintään 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut ja jäljellä olevat fragmentit huuhdottiin sitten ja suspendoitiin BEGM ™ (keuhkoputken epiteelisolujen kasvualustaan) (Catalog CC-3170, Lonza, Walkersville, MD, USA), johon oli lisätty 1% penisilliini /streptomysiiniä. Suspensio ympätään sitten 60-mm: n petrimaljoille kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Jälkeen 3-4 päivää inkuboinnin, joidenkin fragmenttien ja solujen kiinnitetty lautasen; ne, jotka eivät noudata pestiin pois ennen aineen uusittiin. Fibroblastit poistettiin lyhyellä altistuksella 0,25% trypsiini-EDTA: ta (Invitrogen, Buffalo). Syöpäsolut lähellä yhtymäkohta irrotettiin 0,25% trypsiini-EDTA, ja niitä siirrostetaan. Soluja varastoitiin nestemäisessä typessä kanavasta 1.

Morfologiset tutkiminen ja Immunosytokemia

Viljellyt LSCCs tutkittiin alla faasikontrastimikroskoopissa varten morfologisia ominaisuuksia. Validoida epiteelin alkuperä, LSCCs kasvaa 24 h lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) ja 10 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) /10% normaalia vuohen seerumia /0,3% Triton X- 100 (Boster, Wuhan, Kiina) huoneenlämpötilassa 40 minuutin ajan estämään epäspesifisten vuorovaikutusten ja läpäiseviksi soluja. Monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen sytokeratiini (CK) (pan) (01:50, klooni AE1 /AE3; Maixin Biotech, Fuzhou, Kiina), sytokeratiini 5 (CK5) (01:50, luettelo C0246, Abou, San Francisco, CA, USA ), ja vimentiinin (1:50, klooni SP20, Maixin Biotech) lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin sekundaarisen vasta-aineen ja inkubointia pimeässä 1 tunnin ajan 37 ° C.The tumat värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Boster, Wuhan, Kiina). Sekundäärinen vasta-aine oli Cy3-konjugoitu vuohen anti-hiiri /kani immunoglobuliini (Ig) G raskaiden ja kevyiden ketjujen (H + L) (1:100; Jackson, Lancaster, PA, USA).

transmissioelektronimikroskopialla

pelletti saatu korjattua LSCCs at passage 2 kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä ja kiinnitettiin jälkikäteen 1% osmiumtetroksidilla. Näyte dehydratoitiin läpi porrastettu alkoholin sarja ja upotettu hartsiin. Ultrathin leikkeet leikattiin, värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja sitä tarkasteltiin Philips CM120 siirto (TEM).

Flow Cytometer puhtaudesta Primary Viljellyt LSCCs

Viljellyt LSCCs olivat trypsinoitiin, pestiin PBS: ssä, fiksoitiin 4% PFA: ssa 10 minuutin ajan, ja inkuboitiin 1% BSA /10% normaalia vuohen seerumia /0,3% Triton X-100 (Boster) huoneenlämpötilassa 40 minuutin ajan solujen permeabiliteetin aikaan saamiseksi ja estää epäspesifisen vuorovaikutusta. Tätä seurasi inkubointi PBS: ssä, joka sisälsi CK (pan) -fluorescein isotiosyanaatti-vasta-ainetta (1:500, klooni C-11, Sigma) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä ja analysoitiin käyttäen syaani ADP virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Solut käsiteltiin PBS sijasta CK (pan) toimi kontrollina.

havaitseminen ja eristäminen SP ja NSP soluja käyttämällä virtaussytometria

Viljellyt LSCCs Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa huuhdottiin PBS, trypsinoitiin, ja keskeytettiin pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml kylmään BEGM väliaineessa. Hoechst 33342 (Sigma) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 5 ug /ml läsnä tai poissa ollessa verapamiilin (Sigma) 50 umol /l, esi-inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Tätä seurasi 90 minuutin inkuboinnin pimeässä 37 ° C: ssa välein ravistellen. Pesun jälkeen 1 ug /ml propidiumjodidia (Sigma) lisättiin jättää kuolleita soluja, ja näytteet analysoitiin EPICS ALTRA virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

solunelinkykyisyysmääritys

vasta järjestetty SP ja NSP LSCCs ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa 0,2 ml: ssa BEGM keskipitkän ja seerumivapaassa väliaineessa (SFM, on kuvattu seuraavissa sferoidi muodostumisen määritys). Kukin ryhmä toistettiin 6 kuoppiin, ja elatusainetta ilman solut toimivat kontrollina. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani), seuraten valmistajan ohjeita. Inkuboinnin kesti 3 tuntia, ja määritys suoritettiin kolmena kappaleena. UV-absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) lukulaite.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) käytetään erottamaan kokonais-RNA eristetty SP ja NSP-soluihin käyttäen. Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen PrimeScript® RT reagenssikittiä kanssa gDNA pyyhekumi (Takara, Dalian, Kiina). Reaaliaikainen PCR tehtiin kanssa SYBR® Esisekoite Ex TaqTM (Takara) on Lightcycler 480 väline (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveitsi). Lämpökäsittelyyn sisältyi alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Beeta-aktiini (ACTB) käytettiin endogeenista ohjaus. Kaavan 2

-ΔΔCT käytettiin lasketaan suhteellinen mRNA: n ilmentymisen SP versus NSP-soluja. Käytetyt alukkeet monistusta on lueteltu taulukossa 1.

Western Blot CSC Markers

noin 30 ug proteiinia näytteistä solulysaateista Lajiteltujen SP ja NSP-solut analysoitiin käyttämällä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (Beyotime, Shanghai, Kiina), sähköllä polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA), ja tutkittiin yön yli primaarisen vasta-aineen (Epitomics, Burlingame, CA, USA) ja CD44 (1:1,000 , 1998-1), CD24 (1:500, T3445), CD133 (1:1,000, 3621-1), ABCG2 (1:1,000, 3765-1), BMI1 (1:10,000, 5590-1), Oct4 ( 1:1,000, 2876-1), Sox2 (1:1,000, 2683-1), ja Nanog (1:1,000, 3369-1). Vuohen anti-kani-IgG (H + L) (1:5,000, Jackson) levitettiin sitten, jonka jälkeen signaali havaitseminen käyttämällä BeyoECL Plus (Beyotime, Shanghai, Kiina). ACTB vasta-ainetta (1:5,000, R1207-1; Hua Biotech, Hangzhou, Kiina) käytettiin normalisoimaan määrä näyte ladattiin.

proliferaatiotestillä

Lajiteltu SP ja NSP LSCCs ympättiin, kuten edellä on kuvattu. Päivinä 1, 3, 5, ja 7 lajittelun jälkeen, solujen kasvu määritettiin käyttäen CCK-8, seuraten valmistajan ohjeita. Inkuboinnin kesti 3 tuntia, ja määritys suoritettiin kolmena kappaleena. UV-absorbanssi mitattiin 450

Differentiation Pitoisuus

yksittäisiä SP ja NSP soluja viljeltiin BEGM alustassa 18 päivää, jonka aikana näytteet restained Hoechst 33342 päivänä 6, 12, ja 18 määrittää prosenttiosuus SP-soluja kussakin ryhmässä. Käytimme virtaussytometrillä analysointia varten.

sferoidi muodostumisen määritys

Lajiteltu SP ja NSP-soluja (5000 solua /ml) viljeltiin käyttämällä StemPro_ NSC SFM kit (A10509-01; Invitrogen, Carlsbad), jossa SFM sisältävät Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) /F12, 20 ng /ml fibroblastikasvutekijää, ja 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää. Lisäksi, 1% 200 mmol /l L-glutamiinia (25030; Invitrogen, Grand Island, NY, USA) lisättiin. Jälkeen siemennystä pallomainen muodostumista kyky kahden osajoukon havaittiin ajan.

Drug Sensitivity Pitoisuus

Lajiteltu SP ja NSP LSCCs ympättiin 5 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja viljeltiin BEGM alustassa, joka sisälsi sisplatiinia (Pharmaceutical Factory, Nanjing, Kiina) pitoisuutena gradientilla (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 ug /ml). Kukin konsentraatio toistettiin 6 kuoppiin. Muut 6 rinnakkain kuoppiin esi-inkuboitiin 50 umol /l verapamiilia kuin chemosensitizer sisplatiinia 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Keskittymä on 0 ug /ml toimi kontrollina. Lisäksi 6 kuoppiin, jotka sisältävät ainoastaan ​​alustassa toimi nollakoe. Soluja, viljeltiin 48 tuntia, arvioitiin inkuboimalla CCK-8: ssa 3 tuntia. Inhibitionopeudesta (IR) arvioitiin käyttäen kaavaa IR = 100% -survival rate (SR), ja SR mitattiin käyttäen kaavaa SR = (keskimääräinen absorbanssi koemaljoihin /absorbanssien keskiarvoa kontrollikuoppiin) x 100% .

Vieraslajisiirteen tuumorigeenisyystesti Pitoisuus

in vivo

Mies ei liikalihava diabeettinen (NOD) /sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä, iältään 6-8 viikkoa (SLAC Laboratory Animal Company , Shanghai, Kiina), syötettiin laminaaristi kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Lajiteltu SP, NSP soluja, ja vanhempien LSCCs ilman lajittelua suspendoitiin 0,2 ml: aan PBS: ää ja injektoitiin kainalon kunkin hiiren. Hiiriä tunnustellaan kahdesti viikoittain kasvainten muodostumista ja tapettiin 6 viikkoa myöhemmin. Kaikki kasvain kyhmyt valokuvattiin, punnittiin, ja vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. P-arvot laskettiin painot SP kasvainten suhteessa kuin NSP kasvaimia.

Tilastollinen analyysi

Data esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD), joka on vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Studentin t-tai

Mann-Whitney

testiä käytettiin GraphPad Prism-ohjelmiston versio 5.00 Windowsille (GraphPad Software, San Diego CA, USA) tutkimaan eroja. Arvot P 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

morfologiset, immunosytokemi-, ja Ultrastructural ominaisuudet

Viljelty LSCCs kasvoi yksikerroksinen on mukulakivi kuvio, joka osoittaa niiden epiteelin alkuperä. Lisäksi ne osoittivat tyypillisiä ominaisuuksia pahanlaatuinen muutos (Fig. 1A-C). Positiivinen värjäys CK (pan) ja CK5 ja negatiiviset värjäys vimentiinista vahvistaneet epiteelin sukuperää (Kuva. 1 D-F). Lähetys elektronimikroskoopilla paljasti tyypillisen epiteelin ominaisuudet LSCCs, kuten monet mitokondrioita, karkeita endoplasmic Reticuli, ribosomeja, suuri epäsäännöllinen ytimet kanssa tumakalvoa osoittavat syvää sisennystä ja mikrovillus ulokkeiden solun pinnalla. Nippua tonofilaments sytoplasmassa ja lukuisia desmosomeihin solujen väliset yhteydet havaittiin usein (Fig. 1G-I).

(A) Kurkunpään okasolusyöpä soluja (LSCCs) kasvoi suoraan eksplantaatin 48 h ymppäyksen jälkeen ympäröimänä fibroblastit (nuoli). (B) passage 1, LSCCs kasvoi rinnakkain fibroblasteja (nuoli). (C) Tällä passage 4, LSCCs kasvoi voimakkaasti ilman fibroblasteja ja näytteillä ominaispiirteiden pahanlaatuisia muutoksia, kuten lukuisat mitoosi lukuja, iso ydinvoiman sytoplasman suhde, näkyvä useita nucleoli, satunnainen monitumaiset jättisolut, sytoplasmista vacuoles, pyöreä ja luminescent soluja, ja ydinaseiden poikkeavuus. Positiivinen värjäys sytokeratiini (CK) (pan) (D) ja CK5 (E), ja negatiivinen värjäys vimentiinista (F). Mikroskooppitutkimus ominaisuudet (nuolet) ja LSCCs osoittaa desmosomeihin solujen väliset yhteydet (G), tonofilaments sytoplasmassa (H), ja sisennetty tumakalvoa (I).

Puhtaus ja lajittelu SP Solut Puhdistettu ensisijainen viljellyt LSCCs

puhtaus ensisijainen viljellyistä LSCCs määritettiin virtaussytometrialla oli 98,32 ± 0,93% (Fig. 2A, B). Solujen lajittelu suoritettiin jälkeen ilman kuolleita soluja ja solujen roskia perustuvat hajottaa signaaleja ja propidiumjodidin fluoresenssi. R2 portti osoitti SP soluja, jotka olivat Hoechst 33342 negatiivisia /himmeä, ja R4 portti määritellyt NSP soluja, jotka olivat Hoechst 33342 positiivisia. SP-soluissa käytössä joissakin 4,45 ± 1,07% koko soluja. Kun esi-inkuboitiin verapamiilin kanssa 30 min, prosenttiosuus SP-solujen laski 0,14 ± 0,13% solujen kokonaismäärästä (Fig. 2C, D). SP ja NSP solut kerättiin seuraavissa kokeissa. Puhtaus juuri lajitellaan SP ja ei-SP-soluissa oli 99,25 ± 0,23% ja 98,98 ± 0,22%: lla (Fig. 2E, F).

(A) Puhtaus viljeltyjen LSCCs määritettiin virtaussytometrillä käyttämällä sytokeratiinia (CK) (pan) (98,32 ± 0,93%) ja (B) kontrolli. (C) lajittelu LSCCs käyttämällä Hoechst 33342. R2 portti edustaa puolella väestöstä (SP) soluja (4,45 ± 1,07% kaikista soluista) ja R4 portti on ei-SP (NSP) soluja. (D) SP osuus jälkeen verapamiili hoito oli 0,14 ± 0,13%. Puhtaus juuri järjestetty SP (99,25 ± 0,23%) (E) ja NSP soluja (98,98 ± 0,22%) (F).

elinkykyyn lajittelun jälkeen

Ei merkittävää eroja solujen elinkelpoisuuden välillä havaittiin juuri järjestetty SP ja NSP LSCCs ylläpidetään sekä BEGM ja SFM-alustassa (P 0,05) (Fig. 3A), mikä osoittaa, että Hoechst konsentraatio (5 ug /ml), käytettiin tässä tutkimuksessa ei mahdollisesti muuttavat solujen elinkelpoisuutta NSP LSCCs.

. (A) Solujen elävyys lajittelun jälkeen. Ei ole merkittävää eroa solujen elinkyky havaittiin välillä puolella väestöstä (SP) ja ei-SP (NSP) solujen keuhkoputken epiteelisolujen kasvualustaan ​​(BEGM) ja seerumitonta alustaa (SFM). Suhteellinen (B) mRNA ja (C) proteiini tasoilla itseuudistumisen ja CSC markkerigeeni SP ja NSP soluja. (D) Cell kasvuvauhti SP ja NSP solujen sekä BEGM ja SFM määräytyy Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (*** P 0,01, ** P 0,05, * P 0,05).

Expression of Self-uusiminen ja CSC Marker Geenit mRNA Level

suhteellinen mRNA ilmauksia ABCG2, BMI1, Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24 ja CD133 vuonna lajitellun SP ja NSP solut määritettiin qRT-PCR. Tulokset osoittivat, että SP solut osoittivat korkeampia mRNA: n ekspression ABCG2, BMI1, Oct4, Nanog, Sox2, ja CD44 verrattuna NSP soluihin. Ei kuitenkaan ole merkittäviä ero CD24 ja CD133 mRNA: n ilmentymisen havaittiin välillä SP ja NSP-solut (Fig. 3B).

Protein tasot CSC Markers

SP solujen havaittiin kasvaneen proteiinin tasot CD44, ABCG2, BMI1, Oct4, Sox2, ja Nanog verrattuna NSP soluihin. Mitään merkittäviä eroja CD24 ja CD133-proteiinia tasot välillä havaittiin SP ja NSP-soluissa (kuvio. 3C).

Cell Growth Rate

päivinä 1, 3, 5, ja 7 lajittelun jälkeen, absorbanssi SP ja NSP soluihin mitattiin käyttäen CCK-8 määrittää kasvuvauhtia. Vuonna BEGM keskipitkällä, sekä SP ja NSP solut lisääntyivät ajan myötä. SP solut saavuttivat eksponentiaalinen kasvuvaihe 3 vuorokauden kuluttua kylvö ja päivällä 7 he olivat tasaantumassa. Sen sijaan, NSP solut jatkettiin kasvaa hitaasti, kunnes päivä 7 ennen muuttoa päivityksen vaihe (P 0,001). Vuonna SFM, SP solut lisääntyivät vakaasti, joiden nopeus on pienempi kuin että BEGM. Sen sijaan, NSP solut tuskin levittävät (Fig. 3d).

eriyttäminen Analysis

päivinä 6, 12, ja 18 ymppäyksen jälkeen viljelty SP ja NSP solut restained Hoechstin 33342 kohteeseen mitata eroja niiden erilaistumista kyky. Tiedot osoittivat, että prosenttiosuus SP solujen väheni kulttuuri ajan, klo 17.67 ± 1,45% 6. päivänä, 9,08 ± 0,61% päivänä 12, ja 4,45 ± 0,63% päivänä 18 (Fig. 4A-F). Päivänä 18, prosenttiosuus Hoechst 33342-himmeä /negatiiviset solut viljellyissä SP-soluissa oli samanlainen kuin lajittelemattoman LSCCs, kun taas viljeltyjä NSP-solut sisälsivät vain 0,07 ± 0,03% SP-soluissa (kuvio. 4G-H), joka on voinut syntyä jäännöstoimintojen SP soluja viime lajittelusta.

prosenttiosuus puolen väestöstä (SP) soluja havaittiin viljellyissä SP-soluissa väheni ajan myötä. Prosenttiosuus SP solujen oli 17,67 ± 1,45% päivänä 6 (A, B), 9,08 ± 0,61% päivänä 12 (C, D), ja 4,45 ± 0,63% päivänä 18 (E, F). Sen sijaan, prosenttiosuus SP solujen viljeltiin ei-SP (NSP) solut oli 0,07 ± 0,03% (G, H).

Sphere Formation

yksittäisiä SP solut lisääntyivät stabiilisti varteen soluviljelyalustaan. Floating aloilla suspensiossa syntyy yhdestä SP solu LSCCs kasvanut koko ajan (Kuva. 5A-C). Sen sijaan jotkut NSP solut kuolivat ja muut levittävät hyvin hitaasti ja voi muodostaa visuaalisen palloja (Fig. 5D).

3. päivänä (A, x 100), päivä 5 (B, x 100), ja päivä 7 (C, x 400), kelluva pallomainen klustereita puolella väestöstä (SP) solujen laajentunut vaiheittain tavalla ajan mittaan. Sitä vastoin ei-SP (NSP) solut eivät voi muodostaa pallomaisia ​​klustereita oltuaan viljeltiin 7 päivää (D, x 100). (E) herkkyys vasta lajitellaan SP ja NSP sisplatiiniin. Inhibitionopeudesta (IR) ja SP-solut osoittivat merkittävää eroa NSP-soluja kussakin pitoisuudessa (P 0,001), lukuun ottamatta 11 ug /ml (P 0,05). SP solut olivat resistenttejä sisplatiinia kuin NSP soluja; tämä voitaisiin kumota Verapamiilin esikäsittelyä.

Drug Herkkyys Erot SP ja NSP Cells

Eri sisplatiinin arviointiin käytettiin erojen huumeiden herkkyyden välillä SP ja NSP solujen läsnäolo tai puuttuminen verapamiilin, salpaaja solun pinnan ABCG2 kuljettaja vastaa kemoterapeuttisten vastus. Kun sisplatiinia yksin, SP-solut osoittivat voimakasta vastustusta, kunnes pitoisuus sisplatiinin saavutti 9 ug /ml, ja IR-SP-soluja ei esiintynyt merkittävää eroa NSP pitoisuutena 11 ug /ml (P 0,05). Verrattuna SP soluja, IR NSP solut osoittivat merkittävää eroa kussakin pitoisuudessa (P 0,001) lukuun ottamatta 11 ug /ml. IR SP solujen esikäsitelty verapamiilin lisätä ilman merkittävää eroa verrattuna NSP soluihin (P 0,05), mutta merkittävä ero verrattuna SP soluja ilman verapamiili esikäsittelyä (P 0,001). Ei merkittäviä muutoksia havaittiin IR NSP-solujen läsnä tai poissa ollessa verapamiilin (P 0,05) (Fig. 5E).

Higher Kasvaimia synnyttävä kapasiteetti SP Solut NOD /SCID-hiiret

Käytimme lajittelemattoman LSCCs varten alustavassa kokeessa ja valitsi 4 x 10

5 korkeimpana rokotus solujen määrä SP ja NSP soluja. Alin inokulaation solujen lukumäärä (2 x 10

4), SP-solut muodostivat kaksi kasvaimia (n = 4); sen sijaan, alin injektio solujen määrä NSP solujen muodostamiseksi kahden kasvaimia oli 2 x 10

5 (n = 4). Merkittäviä eroja ei havaittu välinen painoero SP kasvaimet ja NSP kasvaimia. Patologinen Tulokset vahvistivat, että molemmat kasvaimet muodostettu SP ja NSP-solut olivat hyvin eriytetty LSCCs, samanlainen kuin alkuperäinen kasvain (Fig. 6, taulukko 2).

(A) Pistopaikat on liikalihava diabeettinen (NOD) /sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä. Hematoksyliinillä ja eosiinilla kasvainten, jotka johtuvat potilaan (B), hiiret (C, kasvaimen muodostettu puolella väestöstä (SP), D, kasvain on muodostettu ei-SP (NSP) solut). Sekä alkuperäinen ksenosiirrettyjä kasvaimet olivat tyypillisiä, hyvin erilaistunut, okasolusyöpä keratiini helmiä havaittu usein (nuolet). (E) kanssa 2 x 10

5 solut ruiskutetaan, SP solut muodostivat neljä suurempaa kasvaimia (4/4), kun taas NSP solut muodostivat kaksi paljon pienempiä kasvaimia (2/4). (F) tilastollinen analyysi SP ja NSP kasvaimen painot eri pistetään cell määriä (*** P 0,01, ** P 0,05).

Keskustelu

tässä tutkimuksessa kuvataan onnistunut eristäminen ja tunnistaminen syövän kantasolujen kaltaisia ​​SP soluja suoraan kirurgisesti resektoitiin LSCC näyte on peräisin hyvin erilaistunut Kurkunkannen kasvaimen kiinalainen miespotilas. Vaikka ensisijainen LSCCs vaikeasti kulttuuri

in vitro

, ennen eristämistä yritimme primääriviljelmässä 40 LSCC yksilöitä ja onnistui yhdessä tapauksessa. Sitten puhdistettu viljellystä LSCCs toistuvasti ero trypsinoimalla poistamiseksi rinnakkain fibroblasteissa.

Yksikerroksisista ja mukulakivi kuvio LSCCs tunnistetaan faasikontrastimikroskopiaan, positiivinen värjäytyminen CK (pan) ja CK5, negatiivinen värjäys vimentiinista, ja epiteelin ultrarakenteen (mukaan lukien tonofilaments ja desmosomit) paljasti transmissioelektronimikroskoopilla vahvisti epiteelin linjaa viljeltiin LSCCs (Fig. 1).

Koska pahanlaatuiset okasolujen ovat fenotyyppisesti määritetään sytokeratiini, käytimme virtaus sytometrillä CK (pan) vasta-aine arvioida puhtauden viljeltyjen LSCCs. Vaikka tulokset tulisi olla 100%, puhtaus oli 98,32 ± 0,93%, mikä saattaa olla seurausta epätäydellinen tehoa vasta-aineen (Fig. 2A, B). Sitten osoitti, että puhdistettu ensisijainen viljellyt LSCCs sisälsi erillisen SP alaryhmässä (4,45 ± 1,07%), joka perustuu niiden kykyyn jättää Hoescht 33342 väriaine, ja tämä kapasiteetti voitaisiin estää verapamiilin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että Hoechst 33342 syrjäytymistä verapamiili herkkä (Fig. 2C-F).

Koska DNA-sitovan väriaine Hoechst on myrkyllinen soluille, erityisesti suurina pitoisuuksina. Jotta voidaan poistaa huolen, että NSP solut valikoivasti säilyttää sytotoksinen Hoechst 33342, joka voisi muuttaa leviämisen kapasiteetti, joka on solunelinkykyisyysmäärityksen suoritettiin lajittelun jälkeen. Tulokset eivät paljastaneet merkittäviä eroja solujen elinkelpoisuuden välillä tuoreeltaan lajitellaan SP ja NSP solujen (P 0,05) (Fig. 3A), mikä osoittaa, että solujen elinkelpoisuus NSP LSCCs ei mahdollisesti vaikuttaa 5 ug /ml Hoechst, jonka pitoisuus laajalti käytetty SP solujen tutkimuksessa [34].

verrattuna NSP soluihin, SP solut ovat kasvaneet geenien ilmentymistä, kuten Oct4, Nanog, BMI 1, ABCG2, ja Sox2 [31], osallistuvat asetuksessa kantasolujen itseuudistumisen. Mielenkiintoista on, että nämä viisi geeniä toimivat myös CSC merkkiaineiden kiinteitä kasvaimia [35], [36]. Lisäksi, CD44, CD24, ja CD133 ovat tunnettuja CSC merkkiaineiden kiinteitä kasvaimia [37]. Olemme tutkineet ilmentymisen kahdeksan geenien sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien SP solujen havaittiin olevan merkittävästi voimistunut ilmentyminen Oct4, Nanog, BMI 1, ABCG2, Sox2, ja CD44 sekä mRNA ja proteiini tasoilla verrattuna NSP soluihin. Huomattavaa on, että NSP solut oli myös ilmaisua CD44-proteiinin, joka on aiemmin ilmoittanut, että CD44 ilmentyy lähes kaikissa syöpäsoluissa; tämä heijastaa epäselvyyden CD44 CSC ylläpitoon [38]. SP-soluissa havaittiin myös olla samanlaisia ​​ilmentymisen CD24 ja CD133 sekä mRNA ja proteiini tasoilla verrattuna NSP soluihin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että CSC fenotyyppejä kiinteisiin kasvaimiin ei välttämättä ole yhdenmukainen eri syöpätyyppejä tai jopa kasvaimia saman histologisten alatyyppi (Fig. 3B, C) [37].

Self-uudistaminen ja eriyttäminen ovat keskeisiä ominaisuuksia kantasolujen joiden avulla ne voivat aiheuttaa jälkeläisistä, kuten CSCS, mikä satama rajoittamaton proliferaatiopotentiaali, ja fenotyypiltään erilaisia ​​soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen. Vuonna lisääntymisen määritys, SP solut kasvoivat huomattavasti nopeammin kuin NSP solut sekä BEGM ja SFM-alustassa (Fig. 3d), mikä vahvistaa rajoittamaton proliferaatiopotentiaali SP soluja. Epäsymmetria on tietyn tyyppinen solunjakautumisen houkutteleva mekanismi CSC koska se vaatii vain yhden jako sekä itseuudistumiseen ja erilaistuminen [39]. Erilaistumiseen määrityksessä, prosenttiosuus SP soluja viljeltiin SP-solujen vähentynyt viljelmässä ajan mittaan asteittainen suureneminen prosenttiosuus NSP soluja. Jopa päivänä 18, viljellyt NSP-solut sisälsivät vain 0,07 ± 0,03% SP-solut (Fig. 4), ja nämä voivat ovat syntyneet jäljellä SP soluja viime lajittelua. Tämä viittaa siihen, että SP solut voivat läpikäydä epäsymmetriset solunjakautumisen itse uudistaa ja tuottaa heterogeeninen fenotyypit matalan tuumorigeenisiä solujen, myös NSP solut; kuitenkin, NSP solut eivät voi käänteisesti erilaistua SP soluihin.

Neural kantasoluilla on kyky kasvaa SFM ja muodostavat neuropallo. Nämä ominaisuudet on hyödynnetty valinta kantasolujen kaltaisia ​​soluja ihmisen syövissä, ovat ensi sijassa rintasyöpä. Tutkimuksessamme kyky SP-solujen tuottamaan pallomaisia ​​pesäkkeitä oli merkittävästi korkeampi kuin NSP-solujen, sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten (Fig. 5A-D) [8], [30].

lääke herkkyys määrityksessä, mittasimme huumeiden herkkyys eroja SP ja NSP soluja. Mekanismi säätelevä ulosvirtausta Hoechstin väriaine siirretään osittain ilmaisun kautta ATP: n sitoutuminen kasetin proteiini (ABC) kuljettajat, pääasiassa ABCG2, mukana ulosvirtausta kemoterapeuttisten aineiden [40], [41]. Siksi käytimme verapamiili estää kalvon ABCG2 kuljettaja ja havaittu myrkyllisyyttä muutokset sisplatiinin. Olemme havainneet, että SP solut olivat paljon vastustuskykyisempiä sisplatiinia kuin NSP solut kussakin pitoisuudessa (P 0,001) lukuun ottamatta 11 ug /ml (P 0,05) Tämä tilanne voisi olla päinvastainen esikäsittelemällä verapamiilin, mikä osoittaa, että ABCG2 kuljettaja voi pelata tärkeä rooli lääkeresistenssin (Fig. 5E). On kuitenkin syytä huomata, että Mdr1a /b /Bcrp1 kolminkertainen hiirten ovat elinkelpoisia ja silti säilyttää joitakin SP-soluja luuytimessä [42], mikä viittaa siihen, että mekanismi, jolla SP fenotyyppi määritetään ei ainoastaan ​​sille läpi ilmaus ABC transporter proteiineja. Siksi tarkka mekanismi Hoechst eksluusio vielä täysin selvitetty.

Data riippumattomien laboratorioiden, pääasiassa perustuu tutkimukseen syöpäsolulinjojen, ovat osoittaneet, että verrattuna NSP väestöstä, syövän kantasoluja, kuten