Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Poistettu in maksasyövän 1 (DLC1), jäsen RhoGTPase aktivoiva proteiini (GAP) perhe, tiedetään olevan suppressiivinen toimintaa aiheuttavan kasvaimia ja syövän etäpesäkkeiden. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismeja miten DLC1 estää solun liikkuvuus ei ole täysin selvitetty. Rho-kinaasin (ROCK) on välittömästi alavirtaan efektori RhoA välittämisessä solujen solun tukirangan tapahtumia ja solun liikkuvuus. Esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan vaikutuksia DLC1 Rho /ROCK signalointireitille maksasolukarsinoomassa (HCC).

Menetelmät /Principal Havainnot

osoittaneet, että DLC1 säätelee negatiivisesti Rock- riippuvainen actomyosin kontraktiliteettiin. Vuodesta immumofluorescence tutkimus, huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen DLC1 kumosi Rho /ROCK-välitteisen solun tukirangan uudelleenjärjestely, mukaan lukien muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista. Se myös vaimentua aivokuoren fosforylaatiota myosiinikevytketjua 2 (MLC2). Nämä estävä tapahtumia DLC1 olivat RhoGAP-riippuvaisia, kuten RhoGAP-puutteellinen mutantti DLC1 (DLC1 K714E) poistetaan näiden estävä tapahtumia. Lisäksi Länsi-tutkimus, DLC1 esti ROCK liittyviä myosiinikevytketjua fosfataasiin kohdistaminen yksikkö 1 (MYPT1) fosforylaation Treoniini 853. Tarkastelemalla solumorfologia mikroskoopilla, huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen hallitseva-aktiivisten ROCK vapautuu soluista DLC1 aiheuttamaa cytoskeletal romahdus ja solun kutistuminen.

Johtopäätös

Tuloksemme viittaavat siihen, että DLC1 säätelee negatiivisesti Rho /ROCK /MLC2. Tämä syytöksiä ROCK-välitteisen reitin of DLC1 tukahduttamaan etäpesäke HCC-solujen ja rikastuttaa ymmärrystä molekyylitason mekanismeja etenemistä maksasolusyövän.

Citation: Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, Chan LK, Ching YP, Yin JW-P, et ai. (2008) Poistettu Liver Cancer 1 (DLC1) säätelee negatiivisesti Rho /ROCK /MLC Pathway maksasolukarsinoomassa. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10,1371 /journal.pone.0002779

Editor: Neil Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 20 huhtikuu 2008; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2008; Julkaistu: 23 heinäkuu 2008

Copyright: © 2008 Wong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat Hong Kong Research Grants neuvosto (HKU 7436 /04M), RGC Collaborative Reseaarch Fund (HKU 1 /06C), Michael ja Betty Kadoorie Cancer Genetics Research Program 2004. IOL Ng on Loke Yew professori Pathology.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cell muuttoliike sisältää sykliä vaiheita, jotka alkavat päässä muodostuminen solun ulokkeen eturintamassa. Tällä sivustoja ulokkeen, paikallisessa tarttumisessa muodostetaan liittää solun tukirangan, lähinnä aktiini ja myosiinin, solunulkoiseen matriisiin. Solun tukirangan luo jännitystä, joka johtaa actomyosin kontraktiliteettiin sen translokoituvat solun kehon. Lopuksi jännitys vapauttaa kiinnikkeistä peräisin solun takareunan [1]. Sääntelyn missä tahansa vaiheista, jotka liittyvät solujen vaeltamiseen voi aiheuttaa poikkeavan solun liikkuvuus, ja syöpäsolut, etäpesäkkeiden [2]. Maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti. Intrahepaattinen etäpesäke on johtava kuolinsyy potilailla, joilla on tämä syöpä. Siksi uskomme ymmärtää paremmin molekulaarisia mekanismeja säätelevät HCC solu muutto voi valaista kehittämään uusia kohdennettuja terapeuttisesta.

Poistettu in maksasyövän 1 (DLC1), kasvainsuppressorigeenin, ensimmäiseksi tunnistettiin perus HCC kuin rotta p122RhoGAP homologia [3]. HCC, DLC1 on havaittu olevan tuumoria tukahduttavan kyvyt [4] – [6], ja se on ali-ilmentynyt pääasiassa geenin deleetion ja DNA: n metylaatio [7] – [9]. Ali DLC1 on myös osallisena muissa syövissä, kuten rinta-, keuhko-, ja eturauhasen [9] – [14]. DLC1 osoitettiin myös vaimentua metastaattisessa soluissa verrattuna ei-metastasoituneen solujen rinta- ja HCC mallit [15], [16]. Ektooppinen ilmentyminen DLC1 havaittiin tukahduttaa solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen HCC, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä, munasarjasyöpä solulinja mallit [4], [15], [17] – [21], ja yliekspressio DLC1 metastaattisessa rintasyövässä solulinja voisi lieventää koon ja ilmaantuvuuden keuhkometastaasien [15]. Kuitenkin molekyylimekanismeja taustalla tukahduttamista solun liikkumista ja syövän etäpesäkkeiden jäävät epäselviksi.

DLC1 on jäsenenä RhoGTPase aktivoiva proteiini (RhoGAP) perheen ja hänellä RhoGAP toiminnan spesifistä RhoA [8]. DLC1 säätelee negatiivisesti aktiivisuuden RhoA lisäämällä luontaista GTP hydrolyyttistä aktiivisuutta RhoA, mikä katalysoi RhoA sen GTP-sitoutunut aktiivisesta tilasta GDP-sitoutunut ei-aktiivisessa tilassa [22]. Rho-kinaasin (ROCK) on tunnetuin alavirtavaikuttajainhibiittorit RhoA [23], [24]. Sitovat RhoA vapauttaa ROCK sen autoinhibitorinen rakenteesta ja aktivoi ROCK-välitteisen solu- tapahtumat [23], [25] – [27]. ROCK tiedetään säädellä solujen liittyviä tapahtumia solun liikkuvuus. Esimerkiksi ROCK osoitettiin hallitsemaan soluun napaisuus säätelemällä PTEN /Akt-signalointireitin Neutrofiiliarvojen [28] ja ohjata häntä takaisinveto monosyyttien ja eturauhassyövän solut [29] – [31]. ROCK myös parannettu actomyosin contractility, pääasiallinen vaihe solumigraation kuten edellä on kuvattu [32]. Tärkeää on, ROCK on kinaasi, joka fosforyloi ja aktivoi monia loppupään pinnoille kuten LIMK ja myosiinikevytketjua 2 (MLC2). Fosforylaatiota Näiden substraattien on tärkeää säännellä solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä ja solumigraatio [33], [34]. Hyperactivation että Rho /ROCK polku tiedetään liittyvän aggressiivisempia kasvaimen ominaisuuksia, kuten etäpesäkkeiden ja invaasio [35] – [41]. Vapauttaminen Rho /ROCK reitti voi olla consequentially liittyvät sen poikkeavasta ylävirran sääntelyn kautta. Olemme aiemmin osoittaneet, että DLC1 on RhoGAP proteiini ja siksi on loogista spekuloida, että DLC1 tukahduttaa syöpäsolumetastaasi kautta negatiivisesti säätelevä ROCK välittämän tukirangan uudelleenjärjestelyn. Tämä hypoteesi ei ole koskaan testattu kokeellisesti ja mekanistinen perusteella, miten DLC1 tukahduttaa syöpäsolumetastaasi ei ole rajattu. Siksi on strateginen tutkia mahdollisia toiminnallisia yhteyksiä DLC1 ja ROCK polku ja niiden vaikutuksia HCC.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että DLC1 esti ROCK välittämää solun tukirangan tapahtumien, kuten muodostuminen stressisäikeiden ja polttoväli yhteystiedot verkko ja fosforylaatiota MLC2 solussa aivokuori. Merkittävää on, nämä estovaikutus DLC1 riippui sen RhoGAP toimintaa. Lisäksi olemme osoittaneet, että DLC1 toimi negatiivisena säätelijänä ROCK säätelyssä solujen morfologia. Kaiken kaikkiaan olemme osoittaneet, että DLC1 säätelee negatiivisesti ROCK tukahduttamaan solujen liikkumisen HCC.

Tulokset

DLC1 lakkautetaan muodostumista ROCK-välitteisen stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion verkon

Ensimmäinen, me kysyi jos muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista HCC-soluissa oli ROCK riippuvainen. Huomasimme, että stressi kuitu niputtaminen paneelit (värjättiin phalloidin tahra) ja paikallisia tarttumista (paksilliini), erityisesti keskiosassa, jotka liittyivät korostaa kuituja, jotka poistetaan heti ROCK-estäjää (kuviot 1A). Tämä havainto osoittaa, että muodostumista stressiä kuitujen ja paikallisia tarttumista HCC-soluissa on ROCK-riippuvainen.

(A) ROCK estäjä tukahdutetaan stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumista HCC-soluissa. SMMC-7721-solut ympättiin cover-slip päivää ennen käsittelyä. Stressi kuidut värjättiin phalloidin tahra (punainen) ja paikallisia tarttumista kanssa paksilliini tahra (vihreä). Stressi kuituja voitiin selvästi havaita nippujen ulottuvalla solut ja paikallisia tarttumista oli liitetty stressisäikeiden niputtamista taulukot SMMC-7721 mock käsitelty kontrolli. Hoito ROCK estäjän Y27632 10 uM 60 minuuttia tukahdutti muodostumista stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion verkon SMMC-7721. (B) ja (C) DLC1 tukahdutetaan ROCK välittämää stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumista HCC-soluissa. SMMC-7721-soluissa (i) ja BEL7402 (ii) transfektoitiin myc-merkityn ekspressioplasmideja, pCS2 + MT, pCS2 + MT /DLC1, ja pCS2 + MT /DLC1 K714E, ja tunnustettu anti-myc-vasta-aineita (9E10). Stressi kuidut ja paikallisia tarttumista värjättiin phalloidin-TRITC ja anti-paksilliini-vasta vastaavasti. Villityypin DLC1, mutta ei RhoGAP-puutteellinen mutantti (DLC1 K714E), tukahdutti stressiä kuitujen muodostumista ja vähensi rasitukseen liittyviä säikeitä sidottu paikallisessa tarttumisessa muodostettu SMMC-7721-soluja. Prosenttiosuus eri DLC1 konstruktien transfektoituja soluja, joilla stressiä kuituja tai paikallisia tarttumista esiteltiin pylväsdiagrammi vastaavasti. Kunkin konstruktin, yhteensä 67-170 transfektoidut solut laskettiin mikroskoopin alla. Virhepylväät edustavat keskihajonta (SD) saatujen tietojen kahdessa riippumattomassa kokeessa.

tutkimiseksi säätelytoimintaa DLC1 on ROCK välittämän stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumista HCC, me ohimenevästi yli-ilmentynyt DLC1 vuonna DLC1 puutteesta SMMC-7721 ja BEL7402 HCC-soluissa ja sen vaikutukset verkon stressiä kuitujen ja paikallisia tarttumista tutkittiin. Yli-ilmentymisen villityypin DLC1 merkittävästi tukahdutti muodostumista rasitukseen liittyviä säikeitä ja paikallisia tarttumista näissä soluissa, kuten on osoitettu phalloidin (kuvio 1 B) ja paksilliinin tahrat (kuvio 1 C-i ja 1C-ii), vastaavasti. Analogisesti ROCK eston (kuvio 1A), DLC1 poisti lähinnä stressi kuitu sidottu paikallisessa tarttumisessa sijaitsee keskeisellä alueella solujen (kuvio S1A). Menetys paikallisessa tarttumisessa pahensi ektooppiseen ilmentymisen SAM domain-poistetaan mutantti DLC1 (ΔSAM) (kuvio S1B), joka on DLC1 katkaistu rakenteen, joka aiheutti ankarampaa solun kutistuminen ja häviäminen rasitukseen liittyviä säikeitä [4]. Sitä vastoin RhoGAP-puutteellinen mutantti (DLC1 K714E) ei kyennyt estämään sekä stressin kuitua ja fokaalisen adheesion muodostumista (kuviot 1B ja 1C). Nämä havainnot osoittivat, että DLC1 esti ROCK riippuvainen stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumisen kautta RhoGAP aktiivisuutta.

DLC1 lakkautetaan ROCK välittämää aivokuoren myosiinikevytketjua 2 fosforylaation

Aktiivinen ROCK nimenomaan fosforyloi myosiinikevytketjua 2 (MLC2) Ser 19; Näin ollen, tämä ROCK-spesifinen fosforylaatio on laajalti käytetty korvikemarkkerina ROCK toimintaa [36], [42] – [45]. Fosforylaatio MLC2 on Ser19 on tärkeää toiminnan myosiinin joka vastaa actomyosin supistumiskykyä ja siten solujen vaeltaminen [46]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että fosfo-MLC2 värjäys BEL7402 HCC-solujen oli erityisen merkittävä solussa aivokuori. Kuitenkin, kun ROCK aktiivisuus estettiin joko Y27632 (kuvio 2A) tai ektooppinen ekspressio määräävän-negatiivinen ROCK mutantti (kuvio 2B), tämän reuna-fosforylaatiota MLC2 oli täysin poistettu, ja fosforylaatiota MLC2 tuli pääasiassa sytoplasmista kuvio. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen hallitseva-aktiivisten ROCK huipentui huomattavaan kasvattamiseen MLC2 fosforylaation aktiini nippua (kuvio 2B). Nämä havainnot osoittavat, että tämä erottuva fosforylaatio mallia MLC2 solussa aivokuori tiukasti ja säätää positiivisesti ROCK aktiivisuutta.

(A) BEL4702 HCC-solulinja käsiteltiin mock-ohjaus tai ROCK estäjä (Y27632) seulottiin hiiren monoklonaalisella vasta-ainetta vastaan, fosfo-MLC2 (Ser 19). Fosfo-MLC2 (vihreä) on pääasiassa havaittu solun aivokuoren BEL7402 soluja (kuten on osoitettu nuolilla), ja tämä aivokuoren värjäyskuvio poistettiin käsittelemällä ROCK estäjä Y27632. (B) BEL7402 solut transfektoitiin myc-merkitty dominantti negatiivinen ROCK tai määräävän aktiivinen ROCK-rakenteet ja havaitaan kanin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan, myc-epitooppi (A14) (punainen). Hallitseva aktiivinen (DA) ROCK aiheutti voimakkaan fosforylaatioon MLC2 (Ser 19) klo aktiini nippua (PRECENTAGE solujen näytteille ilmiön: 94,0% DA ROCK-transfektoiduissa soluissa verrattuna 0% vektorin transfektoitujen solujen). Nuolet piste aktiini nippua hallitseva aktiivisen ROCK transfektoitu soluun, jossa fosforylaatio MLC2 (Ser 19) tehostettiin. Dominantti negatiivinen (DN) ROCK tukahdutti aivokuoren fosforylaatiota MLC2 (Ser 19) (prosenttiosuus soluja, joilla tämä ilmiö: 87,5%: n DN ROCK-transfektoiduissa soluissa verrattuna 7,3%: n vektorin transfektoitujen solujen). Nuolet osoittavat solun cortex vallitsevan negatiivisen ROCK transfektoitu soluun, jossa fosforylaatio MLC2 (Ser 19) oli menetetty. Kuten on esitetty, tiukka sääntely ja optimaalinen ROCK aktiivisuutta tarvitaan ylläpitämään aivokuoren fosforylaatioon MLC2 (Ser 19) sisään BEL7402 soluissa.

tutkimme seuraavaksi DLC1 voisi poistaa tämän ROCK-specific MLC2 fosforyloitumismallia HCC-soluissa. Ensin arvioidaan, onko aivokuoren fosfo-MLC2 värjäyskuvio liittyi endogeenisen ilmentymisen tasojen DLC1 eri solulinjoissa. Havaitsimme näkyvään fosfo-MLC2 värjäytymistä solussa cortex in SMMC-7721, BEL7402, ja WRL HCC-solulinjat (kuvio 3C), ja HeLa kohdunkaulan syövän solulinja (kuvio 3C), mikä ei ollut ilmentymistä DLC1 (kuvio 3A). Toisaalta, HepG2 ja Hep3B, kaksi HCC-solulinjoissa DLC1 ilmentymistä (kuvio 3A), näytetään diffuusi sytoplasman fosfo-MLC2 värjäys ilman erillistä aivokuoren fosforylaation MLC2 solussa kehälle (kuvio 3B).

(A) DLC1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen HCC solulinjoissa. (B) ja (C) DLC1 ilmentyminen liittyy fosfo-MLC2 värjäyskuvio. Edustavia kuvia DLC1-positiivisia ja DLC1-negatiiviset solut, vastaavasti. DLC1-positiivisia Hep3B ja HepG2, näytetään hajanainen fosforylaatiota MLC2, kun taas DLC1 ei-ilmentävien BEL7402 ja HeLa, näytetä lausutaan aivokuoren fosforylaatiota MLC2 solussa aivokuori.

Jos haluat varmistaa, että esto aivokuoren fosfo-MLC2 liittyi suoraan DLC1, me sitten ekspressoida ohimenevästi villityypin DLC1 ja DLC1 RhoGAP-puutteellinen mutantti (K714E), vastaavasti, DLC1-null BEL7402 soluja. Villityypin DLC1 vähentää huomattavasti solujen määrä, joilla on fosfo-MLC2 aivokuoren värjäytymistä (kuviot 4A 4B), merkitsee suppressiivinen rooli DLC1 on ROCK toimintaa. Toisaalta, DLC1 RhoGAP-puutteellinen mutantti (K714E), ei pystynyt poistamaan fosfo-MLC2 aivokuoren värjäytymistä (kuviot 4A 4B). Havaintomme vuoksi ehdotetaan DLC1 esti ROCK-specific MLC-2 fosforylaatiota HCC-soluissa, kautta RhoGAP aktiivisuutta.

(A) pCS2 + MT vektori yksin, pCS2 + MT DLC1, ja pCS2 + MT DLC1 K714E, vastaavasti , transfektoitiin BEL7402 soluihin. Tunnustamista transfektoitujen solujen suoritettiin tutkimalla soluja c-myc (A14) kanin vasta-ainetta, mitä seurasi värjäys anti-kani-vasta-aine, joka on konjugoitu Texas Red. Solut, jotka on transfektoitu pCS2 + MT pelkällä vektorilla näkyy selvä aivokuoren fosforylaation MLC2, kuten on osoitettu nuolilla. Solut, jotka on transfektoitu DLC1 näytetään menetys aivokuoren fosforylaation MLC2. Transfektoitujen solujen DLC1 K714E, The RhoGAP-puutteellinen mutantti, edelleen näkyy selvä aivokuoren fosforylaation MLC2, kuten on osoitettu nuolilla. (B) Prosenttia eri DLC1 konstruktien näytteille aivokuoren fosforylaatiota MLC2 Ser 19 on laskettu ja esitetty pylväskaavio. Kunkin konstruktin, 80-100 transfektoidut solut laskettiin ja aivokuoren MLC2 fosforylaatio on tallennettu. Virhepylväät edustavat keskihajonta (SD) saatujen tietojen kolmen erillisen kokeen.

DLC1 heikennettyjä myosiinifosfataasin toimintaa vähentämällä fosforylaatio myosiinifosfataasin kohde alayksikköä 1 (MYPT1) at Thr 853

lisäksi fosforylaatioon myosiinin, ROCK myös lisää myosiinin fosforylaatio fosforyloimalla myosiinifosfataasin kohde alayksikköä 1 (MYPT1) at Thr 696 ja Thr 853 ja siten inaktivoimaan sitä. Vaikka Thr 696 MYPT1 voidaan fosforyloituu muiden proteiinikinaasien, Thr 853 fosforylaatio, toisaalta, on selektiivisesti säätelee ROCK [32]. Lisäksi MYPT1 Thr 853 fosforylaation on osoitettu olevan lupaava sijaismarkkeri että käänteisesti korreloi myosiinifosfataasin toimintaa [36], [42] – [45]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että, kun Y27632 käsittely, fosforylaatio tasot MYPT1 (Thr 853) vähenivät kaikissa HCC testatuissa solulinjoissa (kuvio 5A), kun koko MYPT1 pysyivät ennallaan. Samoin, yliekspressio DLC1 heikennetty fosforylaation MYPT1 on Thr853, osoittaa menetys ROCK aktiivisuuden (kuvio 5B). Inaktivointi myosiinifosfataasin (kuten heijastuu kasvaneena MYPT1 fosforylaatio) ja aktivointi MLC2 yhdistetään vaikutukset ROCK, ja nämä vaikutukset voitaisiin tukahduttaa DLC1, mikä johtaa yhteensä laskua myosiinin fosforylaation ja vähenemiseen solun contractility.

(A) ROCK estäjä Y27632 tukahdutetaan MYPT fosforylaation Thr 853 kaikissa HCC solulinjoissa. (B) DLC1 tukahdutetaan MYPT fosforylaation Thr 853 293 T-soluissa. Band intensiteetti analysoitiin AlphaEaseFC ™ ja prosenttiosuus laskettiin vertaamalla sen mukaan valvontaa.

ROCK estäjä tukahdutetaan HCC soluliikkuvuus

ektooppinen ilmentyminen DLC1 HCC solulinjassa, me aiemmin osoitti DLC1 merkittävästi tukahdutettu HCC solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus [4]. Tukeakseen meidän hypoteesia, että DLC1 tukahdutetaan solujen vaeltamiseen kautta negatiivisesti säännellään ROCK toimintaa, tutkimme vaikutus ROCK estäjän HCC solujen vaeltamiseen kanssa Transvvell- määrityksessä. Havaitsimme, että ROCK estäjä Y27632 tukahdutti migraation HCC-solujen, SMMC-7721 (kuvio 6A vasen paneeli) ja BEL7402 (kuvio 6B vasen paneeli), mistä on osoituksena määrän väheneminen siirtynyt solujen Transvvell- määrityksessä. Tämä havainto osoittaa, että ROCK toiminto on ratkaisevan tärkeä HCC solujen vaeltamiseen. Poistaa väärinkäsitysten takia solukuoleman aiheuttama toksisuus, suoritimme soluproleferaatiomäärityksessä on HCC-soluissa. Soluproleferaatiomäärityksessä osoittaneet Y27632 ei vaikuttanut solujen kasvuun, joka vahvisti, että esto ROCK vaikuta vain HCC solujen vaeltamiseen (kuvio 6A ja 6B oikea paneeli).

ROCK estäjä Y27632 tukahdutetaan HCC solujen vaeltamiseen. Y27632 väheneminen siirretty (A) SMMC-7721-soluissa (

P

0,0001,

t

-testi) ja (B) BEL7402 solujen (P 0,0001,

t

-testi). Virhepylväät edustavat keskihajonta (SD) saatujen tietojen kolmesta mikroskooppikentäs-. Kokeet on toistettu kolme kertaa. Soluproleferaatiomäärityksessä näytettiin oikealla verrata kasvuvauhti mock valvonnan solujen ja Y27632 käsitellyt solut.

ROCK käänteinen solun morfologiset muuttaminen DLC1

aiemmin osoitettu, että DLC1 oli pystyy aiheuttamaan solun elimellisen muutoksen pienemmällä stressisäikeiden muodostumista HCC-soluissa ja fibroblasteissa [4]. Koska ROCK on tärkein modulaattorin solun tukirangan signalointi ja cytoskeletal organisaatio on keskeinen tekijä solujen morfologia, me arveltu, että solun morfologiset muutokset aiheuttamien DLC1 olivat kautta ROCK. Tätä varten me havaittu solun morfologian DLC1 ja ROCK ko-transfektoitiin soluihin immunofluoresenssin. Myös laskettiin solujen määrän, joka osoitti solun romahtaa tai kutistuminen aiheuttama romahduksen solun tukirangan verkon (kuvio 7C), kuten on kuvattu muualla [4], [47] – [49]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että yliekspressio DLC1 COS7-soluissa indusoi solun tukirangan romahtaa tai solun kutistuminen (kuva 7A-i), samanlainen kuin meidän edelliset havainnot [4]. Solujen kutistuminen tehostettiin ektooppinen ilmentyminen SAM domain-poistettu mutantin DLC1 (ΔSAM) (kuvio 7B-i). Kotransfektion tyhjien pEGFP vektori ei pelastaa DLC1 aiheuttama solujen morfologisia muutoksia, mutta solujen määräävän aktiivisen ROCK voisi voittaa inhiboiva sääntely DLC1 (kuvio 7A-ii) ja jopa DLC1ΔSAM (kuvio 7B-ii) ja vapautetaan solujen DLC1 n aiheuttamaa solujen kutistuminen. Tämä koe osoitti, että ROCK on yksi alavirran efektoreina DLC1 koordinoinnissa morfologisia muutoksia HCC-soluissa.

COS7-solut kotransfektoitiin (A) DLC1 ja ROCK tai (B) DLC1ΔSAM ja ROCK, vastaavasti . Solut transfektoidaan pCS2MT DLC1 tai pCS2MT DLC1ΔSAM ilmestyi punainen, kun taas solut transfektoitu pEGFP tai pEGFP ROCK ilmestyi vihreä. DLC1 aiheuttama solun tukirangan romahtaa tai solun kutistuminen (A-i), joka oli entisestään ja selvästi osoittaa SAM-poistettu konstruktio, pCS2 + MT DLC1ΔSAM (B-i). ROCK pystyi palauttamaan soluja DLC1 aiheuttama solun kutistuminen (A-ii) ja jopa DLC1ΔSAM aiheuttama voimakas solun kutistuminen (B-ii). (C) Co-transfektoidut solut laskettiin ja niiden morfologioita kirjataan. Määrä kotransfektoitiin soluilla havaittava solun kutistuminen (solu romahdus) jaettiin kokonaismäärä kotransfektoitiin solut lasketaan, laskea solujen prosenttiosuus näyttämiseen kutistuminen osoittamalla tavalla pylväskaavio. Kutakin kolonnia kohden, 150-200 kotransfektoitiin solut laskettiin. Virhepylväät edustavat keskihajonta (SD) saatujen tietojen kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

Yksi tärkeimmistä rooleista DLC1 on sen kyky tukahduttaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. Tässä tutkimuksessa valottaa taustalla olevien mekanismien sääntelyn HCC solumigraation ja hyökkäystä DLC1, olemme osoittaneet, että DLC1 tukahdutti HCC solujen vaeltamiseen kautta säätelevät solun tukirangan ja actomyosin supistuminen. Lisäksi olemme osoittaneet, että DLC1 toimi negatiivisena säätelijänä ROCK säätelyssä solumorfologian.

DLC1 sääteli negatiivisesti ROCK välittämä actomyosin contractility

supistumisomi- liike syöpäsolujen syntyy peräkkäisen supistukset actomyosin nippua koostuu aktiini ja myosiinin nimeltään actomyosin. Nämä actomyosin nippuja, visualisoida stressi kuituja, venyttää poikki solun elin ja luoda jännitteitä tuottaa solun supistuminen ajaa soluun liikkeen liittämällä polttoväli adheesiomolekyylien [50]. Edellisen perusteella tutkimuksen estävää vaikutusta DLC1 stressiä kuituihin, tässä me vielä havaittu, että muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista verkon riippui DLC1 RhoGAP ja ROCK aktiivisuutta HCC-soluissa. Tämä havainto lisäksi valottaa että stressi kuidut ja paikallisia tarttumista työtä käsi kädessä kuvatulla Hallin A. [51], ja niiden muodostuminen on toisistaan ​​riippuvaisia ​​ja tiiviisti säännelty RhoGAP of DLC1 ja ROCK toimintaa. Lisäksi DLC1 vähentynyt ROCK-välitteisen fosforylaation MYPT1 (Thr853) ja fosforylaatio MLC2 (Ser19) ja mistä aiheutuisi laskua yhteensä myosiinin fosforylaation ja aiheuttaa väheneminen stressisäikeiden kontraktiliteettia [46]. Kaikki nämä linjat todisteiden lähentyneet selittää, että DLC1 ohjataan yksi keskeinen muuttavien mekanismien actomyosin supistuminen, samanlainen kuin toinen jäsen RhoGAP perhe, p190-RhoGAP [52].

DLC1 lakkautetaan fokaalisen adheesion muodostumista ja myös lokalisoitu fokaalisen adheesion monimutkaisia ​​

kiehtova kysymys tämän löydöksen noin estävää vaikutusta muihin RhoGAP kohdistaminen keskeisille adheesiomolekyylien on syntynyt. DLC1 ja useat jäsenet RhoGAP proteiinien, mukaan lukien P122-RhoGAP ja RC-GAP72 havaittiin paikallistaa paikallisiin tarttumisiin [47], [49]. Itse asiassa, toiset ja olemme aiemmin raportoitu, että DLC1 myös lokalisoitu paikallisia tarttumista ja vuorovaikutuksessa jäsenten tensin perheen [18], [53], [54]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että DLC1 tukahdutettu stressi kuitu-sidottu fokaalisen adheesion muodostumista sen RhoGAP aktiivisuutta. Vuodesta immunofluoresenssilla tutkimuksessa havaitsimme, että osa DLC1 transfektoitujen solujen, DLC1 osoitti fokaalisen adheesion lokalisaatio (kuva S1A); kun taas joissakin muissa DLC1 transfektoituja soluja, etenkin näyttämällä laaja solun kutistuminen, intensiivinen menetys stressisäikeiden sidoksissa paikallisia tarttumista havaittiin (Fig. 1 C). DLC1 lokalisointi paikallisessa tarttumisessa ja sen estävä vaikutus paikallisessa tarttumisessa eivät ole toisiaan poissulkevia. Me spekuloida, että annos vaikutus saattaa olla yksi tekijöistä. Kun solu transfektoitiin suuren annoksen DLC1, DLC1 voisi sammuttaa kaikki stressi kuidut ja stressi kuitu sidottu paikallisessa tarttumisessa ja aiheuttaa laajaa solun romahtaa (Fig. 1 C). Toisaalta, kun solu transfektoitiin pienemmällä annoksella DLC1, DLC1 olisi sammuttaa useimmat stressiä kuitujen ja stressi kuitu-sidottu paikallisessa tarttumisessa mutta säästää jonkin verran paikallisia tarttumista ei liity korostaa kuituja ja johtaa mietojen solussa romahtaa ( Kuva S1A). Toinen spekulointia oli samanlainen RC-GAP72 [47], DLC1 voisi paikallistaa ja polttovälin tarttuvuus hajota polttopiste kiinnitysalueisiin.

cytoskeletal romahduksen aiheuttama solun kutistuminen ja vaikutus DLC1 on solun tukirangan romahtaa

Focal kiinnikkeistä ja actomyosin stressi kuidut toimivat aina toisistaan ​​riippuvaisia ​​tavalla ja ne yhdessä rakentaa tukirakenteen tukemaan ehjää solun morfologian [47]. Häiriöt edellä mainittuun verkkoon aiheuttamien DLC1 johtanut intensiiviseen solun tukirangan romahdus johtaa solun kutistuminen. Tämä havainto oli samankaltainen Barberis D

et al.

N tutkimuksen p190RhoGAP häviäminen paikallisessa tarttumisessa aiheuttamien p190RhoGAP edeltää solun kutistuminen [48]. Havaitsimme, että menetys paikallisessa tarttumisessa ja stressi kuituja pidettiin tunnin kuluttua ROCK inhibitiota Y27632, mutta solut eivät romahtaa heti (kuva 1A), kunnes pitkäaikainen hoito Y27632 jopa 24 tuntia (kuvio S2). Tämän havainnon olemme arveluihin, että solu romahdus aiheuttama Y27632 Hoito oli aiheutunut menetyksestä fokaalisen adheesion ja stressi kuituverkon. Kun inhibitio ROCK jonka Y27632, tukirankaproteiinin verkkoja ei voitu muodostaa, ja solut eivät enää kyenneet kestämään menetys solun tukirangan verkon ja lopulta käyvät läpi solu- romahtaa, jota havaitaan solun kutistuminen (kuvio 8). Tämä tutkimus osoitti, että tukirankaproteiinin romahdus aiheuttama DLC1, eli RhoGAP joka sen downregulation liittyy HCC etenemiseen, voi osittain päinvastaiseksi aktiivinen ROCK, lisäksi ymmärtää, että DLC1 säätelee negatiivisesti ROCK säätelyssä actomyosin contractility, solun morfologia, ja solumigraatio peräkkäin . Aikaisemmat tutkimus kertoo, että DLC1 paitsi tukahdutetaan solujen vaeltamiseen, vaan myös soluinvaasiota jotka osallistuvat soluväliaineen este. Sahai E

et al.

Raportoitu, että syöpä solulinjat saattavat hallussaan eri liikennemuotojen soluliikkuvuus ja pyöristetty morfologia syövän solulinjat olivat herkempiä ROCK estäjä 3-ulotteinen matriisi [55]. Se, onko tämä malli on sovellettavissa HCC soluihin ja onko muita solunulkoinen proteolyyttinen väyliä coorperate kanssa DLC1 /Rho /ROCK /MLC-reitin ovat vielä tuntemattomia ja odotettu puututtava.

(A) Stressi kuituja liitetty paikallisessa tarttumisessa muodostavat verkoston. Stressi kuidut venytetty koko solu käyttää, antamaan solujen ehjän morfologia. (B) DLC1 RhoGAP tai menetystä ROCK aktiivisuuden aiheuttama menetys stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista. Muutama paikallisia tarttumista ja nippujen stressin kuituja jäi. (C) pitkittynyt tai vaikea menetyksen stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion verkon aiheuttamia DLC1 RhoGAP tai poistaminen ROCK toiminta johtaisi intensiivinen solun tukirangan romahtaa. Kaikki stressi kuidut ja paikallisia tarttumista poistettiin.

Tutkimus osoitti, että ROCK estäjä, Y27632, ei vaikuttanut HCC solujakautumisessa tehokas annos, joka vaimentaa HCC solujen vaeltamiseen. ROCK-inhibiittorit ovat laajalti käytetty eläinmalleissa, kuten rotan ja hiiriä malleja, aiheuttamatta merkittäviä myrkyllisyys eläimille tehokkaat annokset [35], [56]. Takamura et ai. osoittaneet, että Y27632 voi estää intrahepaattinen etäpesäke HCC [35] ja viime aikoina, toinen ROCK estäjä, fasudil, on onnistuneesti sovellettu kliinisessä tutkimuksessa potilailla, joilla sydän- ja verisuonitaudit [57]. Nämä tutkimukset osoittavat, että toksisuus ROCK estäjien soluihin on rajoitettu [35]. Kertyvät tietämys osoittaa, että ROCK on tärkeä rooli syövän etäpesäkkeitä, ja tässä tutkimuksessa on rikastuttanut tietämystä ROCK signalointireitille HCC. ROCK-inhibiittorit kuten Y27632 saattavat olla hyödyllisiä kemoterapeuttisen intervention tukahduttamisessa maksansisäisten etäpesäke, merkittävä kuolinsyy HCC potilailla, aiheuttamatta paljon haitallisia vaikutuksia potilaille. Edelleen luonnehdinta tehokkuudet ROCK estäjien ja anti-ROCK hoitoja hoidossa HCC odotetaan vielä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja plasmideja

SMMC-7721 ja BEL7402 olivat lahjoja Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia; 293T, COS7, HepG2 ja Hep3B saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293T, BEL7402, SMMC-7721, ja COS7 viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), suuri glukoosipitoisuus, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia; Hep3B ja HepG2-soluja viljeltiin vähintään essential medium (MEM), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Myc-merkittyjen ekspressiorakenteiksi (pCAG) kuljettaa ihmisen villityypin ROCK, hallitseva aktiivinen ROCK (1-725 aa), ja hallitseva negatiivinen ROCK mutantti (K105A, I1009A) oli ystävällisesti toimittanut S. Narumiya (lääketieteellinen tiedekunta, Kyoto University) [27]. Ihmisen ROCK kinaasidomeenissa (ROCK 76-338 aminohapot) monistettiin PCR: llä ja kloonattiin pEGFPC3 vektoriin käyttäen Kpnl ja Xhol ruoansulatusta sivustoja ja sitä käytettiin hallitseva aktiivista muotoa ROCK. Villityypin DLC1 ja RhoGAP-mutantteja kloonattiin, kuten on kuvattu aiemmin [4].

lääkehoito ja transfektio

ROCK-spesifinen estäjä Y27632 Calbiochem (Darmstadt, Saksa). Hoitoon,-soluja lisättiin Y27632 10 uM, ja niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Transfektiota, 1 x 10

5-soluja ympättiin peitinlaseil- 35 mm: n maljoille päivä ennen transfektiota. Indikoitu transfektoitiin soluihin FuGene 6-reagenssia (Roche, Basel, Sveitsi) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Immunofluoresenssimikroskopia

Hiiren monoklonaalinen vasta-aine fosfo-myosiinin kevytketju 2 (Ser 19) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine paksilliini saatiin Upstate (Lake Placid, NY). Hiiren monoklonaalinen (9E10) ja kanin polyklonaalista (A14) vasta-aineita c-myc saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Red väriaine-konjugoitu AffiniPure vuohen anti-hiiri-IgG ja fluoreseiini (FITC) konjugoidulla AffiniPure vuohen anti-kani-IgG hankittiin valmistajalta Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Immunofluoresenssivärjäystä, solut kiinnitettiin paraformaldehydillä, läpäiseviksi Triton, salvattiin naudan seerumialbumiinia ja sitten inkuboitiin osoitetun ensimmäisen ja toisen vasta-aineita.