Krooninen sairaus

tiivistelmä

aktivoituminen PI3K /AKT signaalireitin on tunnettu liikkeellepaneva voima eteneminen kastraatio-toistuvia eturauhassyöpää (CR-cap), joka muodostaa suurimman tappavan fenotyyppi korkki. Täällä, me tunnistaa käyttäen genomista shRNA näyttö PI3K /AKT-inaktivoivan loppupään tavoite, FOXO4, mahdollisena CaP etäpesäke vaimennin. FOXO4 proteiini tasot korreloivat käänteisesti invasiivista potentiaalia paneelin ihmisen CaP solulinjoissa, joissa vähentynyt mRNA-tasot korreloivat lisääntynyt ilmaantuvuus kliinisten etäpesäke. Taintumisen (KD) on FOXO4 ihmisen LNCaP aiheuttaa kasvavia invaasio

in vitro

ja imusolmukkeesta (LN) etäpesäke

in vivo

vaikuttamatta indeksien leviämisen tai apoptoosin. Lisääntynyt Matrigel invasiivisuus löysi KD FOXO1 muttei FOXO3. Vertailu eri tavoin ilmaistuna geenejä vaikuttaa FOXO4-KD LNCaP viljelmässä, perusasteen kasvaimissa ja LN etäpesäkkeitä tunnistetaan paneelin ilmen- tymisen lisääntymisen geenien, kuten PIP, CAMK2N1, PLA2G16 ja PGC, joka, jos tippuu alas siRNA voivat heikentää lisääntynyt invasiivisuus liittyy FOXO4 puutos. Vaikka vain joitakin näistä geeneistä koodaavat FOXO promoottorin sitoutumiskohdat, ne ovat kaikki RUNX2 indusoitavissa, ja RUNX2 sitoutuminen PIP-promoottori on lisääntynyt FOXO4-KD-soluja. Todellakin, pakko ilmaus FOXO4 päinvastaiseksi lisääntynyt invasiivisuus LNCaP /shFOXO4 soluja; pakko ilmaus FOXO4 ei muuttanut RUNX2 proteiinin tasot, mutta se laski RUNX2 sitoutumisen PIP promoottori, jolloin PIP downregulation. Lopuksi oli korrelaatiota FOXO4, mutta ei FOXO1 tai FOXO3, alisäätely ja laski etäpesäke elinaika ihmisen CaP potilailla. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että lisääntynyt PI3K /AKT-välitteinen metastaattinen invasiivisuus korkki liittyy FOXO4 menetys, ja että mekanismit aiheuttavan FOXO4 uudelleen ilmentyminen saattaisi tukahduttaa CaP metastaattinen aggressiivisuus.

Citation: Su B, Gao L, Baranowski C, Gillard B, Wang J, Ransom R, et ai. (2014) genomi-Wide RNAi Screen Tunnistaa FOXO4 kuin Etäpesäke-vaimennin kautta torjumista PI3K /AKT signaalireitin eturauhassyövässä. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10,1371 /journal.pone.0101411

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2014; Julkaistu: 01 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray tiedot on talletettu Gene Expression Omnibus hakunumerolla GSE58403.

Rahoitus: IHG tukivat Department of Defense, (www.army.mil) myöntää PC040256 ja PC061246, National Cancer Institute (www.cancer gov) myöntää CA94108 (IHG), ja National Cancer Center Support Grant 2P30 CA016056. BS tukivat National Natural Science Foundation of China nro 81272380. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on edelleen kaikkein diagnosoitu ei-kutaaninen syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa miesten [1]. Alkuvaiheessa CaP säätelevät androgen siten androgeenideprivaatio hoito on ollut tukipilari hoidon progressiivisen eturauhassyövän. Useimmat potilaat väistämättä epäonnistuvat tämän terapian, etenee kastraatio-toistuvia eturauhassyöpää (CR-cap) tyypillisesti esittämällä luun tai imusolmukemetastaaseja joiden kasvu riippuu jatkuvia androgeenireseptorin (AR) signalointi [2]. Todellakin, kohdentamista CR-CAP tarkempia antiandrogeenit tai AR-antagonistien on tarjonnut merkittäviä, mutta ohimenevä, kliininen teho ja kestävyys edelleen käsittää AR riippuvuutta, joskin mukana AR mutantteja tai yliekspressio [3] – [5].

aktivointi fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /AKT-reitti on merkittävä tekijä Cap etenemistä [6], [7], että 42% ensisijaisen CaP vaurioiden ja 100% etäispesäkekasval- näytteille muutoksia (mutaatioita /poistot, kopioluvun vaihtelua, ero geenien ilmentyminen) yhdessä tai useammassa osia [8]. Tämä on johtanut useisiin kliinisiin tutkimuksiin kohdistaminen PI3K, AKT tai TORC1 yhdessä standardin chemotherapies (taksaanit, Platins) tai antagonisteina androgeenireseptorin akselin tai AR [6]. Todellakin, eturauhasen-erityinen menetys PI3K /AKT antagonisti, PTEN, hiiren siirtogeenisiä malleja on riittävä indusoimaan intraepiteliaalisten neoplasia [9], [10].

FOXO perheenjäsenet, FOXO1, FOXO3a ja FOXO4 , ovat kaikkialla läsnä-ilmaistaan ​​transkriptiotekijöiden, jotka toimivat kasvaimia estävä proteiinien kautta niiden kykyä tukahduttaa geenien koodaavat proliferatiivisen, selviytyminen tai anti-erilaistumista toimintoihin [11], [12]. Roolit FOXO jäsenille tukahduttamaan eturauhassyövän etenemistä on kuvattu. Esimerkiksi FOXO1 deleetio 13q14 liittyy androgeeni- ja AR-riippumaton leviämisen [13]. AKT, joiden aktiivisuus kasvaa Cap etenemisen [7], suoraan fosforyloi FOXO perheenjäseniä, mikä antagonisoivaa niiden toiminta edistämällä yhdessä 14-3-3 proteiinien ja estää niiden tumaansiirtymiseen [14], mikä johtaa niiden ubiquitylation välittämää proteasomin hajoaminen [ ,,,0],15]. Menetys FOXO3a edistää syövän muodostumisen TRAMP eturauhassyövän hiirimallissa [16], kun taas säätely tai aktivoitumista FOXO proteiinien johtaa kasvuun pidätys ja apoptoosin [17] – [19]. Tekemässä tutkimuksessa Zhang et al. [20] osoittaa, että FOXO1 estää CaP soluliikkuvuus ja invasiivisuus estämällä RUNX2 sitoutumasta ja transkriptionaalisesti aktivoimalla etenemistä geenejä, kuten

OP, IL8, VEGF

ja

MMP-13

. Vaikka jotkut tarpeeton rooleja FOXO proteiinien hiljaista havainto, että spontaani kateenkorvan lymfoomat ja systeemisiä hemangiomas indusoi vasta kun yhdistetyn poistamista FOXO1, FOXO3 ja FOXO4 [21], on saatu näyttöä siitä kromatiinin immunosaostus-sekvensointi (chip kohdat) tutkimukset on FOXO1 ja FOXO3a sekä yhteisiä ja ei-päällekkäisiä geenikohteet [22], [23]. Eturauhassyövän etenemistä, yhteinen tai erilliset roolit FOXO proteiineja ovat edelleen epäselviä.

Jotta voitaisiin tunnistaa geenejä, jotka antagonisoivat CaP etäpesäke, ihmisen LNCaP-solut, jotka ilmentävät heikko invasiivisuus, tartutettiin lentiviruksesta-koodattu genomista shRNA kirjasto ja sitten valitaan erittäin invasiivisia soluja Matrigel päällystettyä Boyden kammion määrityksessä. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että FOXO4 estää metastaattinen invasiivisuus estämällä RUNX2 aktivoimasta ryhmä pro-metastaattisen geenejä, mukaan lukien

PIP, PGC, CAMK2N1

ja

PLA2G16

. Havainto, että FOXO4 downregulation korreloi alkaa aikaisemmin etäpesäkkeitä Cap potilailla viittaa vahvasti siihen, että CaP etäpesäke voisi antagonisoida aktivoimalla FOXO4 ilmaisu tai estämällä RUNX2 toiminto.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

seuraavat ensisijaiset vasta-aineet (Ab) käytettiin: kanin polyklonaalisten vasta-aineiden spesifinen FOXO1, FOXO3, FOXO4, lohkaista kaspaasi-3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); Hiiren monoklonaalisia (mAb) sisältävät HA, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Applied Biological Materials, Richmond, BC, Kanada), ja Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).

Soluviljely

LNCaP (ATCC CRL-1740) ja CWR22Rv1 (ATCC CRL 2505) viljeltiin RPMI1640-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. DU145 (ATCC HTB-81) ja HEK293T (ATCC CRL-3216) soluja viljeltiin DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. LNCaP tartutettiin alikvootit DECODE (OpenBiosystems) yhdistettiin pGIPZ lentivirukselle kirjasto, joka koodaa ihmisen genomista shRNAs (13650 geenit kohdennetaan 7 altaissa 9750 shRNA kloonien /pool) moninkertaisuudessa-of-infektio 1 (RPCI shRNA Core, Irwin Gelman, Director), ja sitten valitaan puromysiiniä (2: g /ml) resistanssi. Puromysiiniresistenttejä soluja infektoitiin tyhjä pGIPZ pelkästään toimi negatiivisena kontrollina.

siRNA transfektion

Synteettinen ON-TARGETplus SMARTpool siRNA spesifinen FOXO4, FOXO1 ja FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), ja DHarmaFECT-1 transfektioreagenssi ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO). LNCaP-solut maljattiin yhtä suuri tiheydet 6-kuoppalevyille (5 x 10

4 kuoppaa kohden) yön yli. Solut transfektoitiin 50 nM NS-siRNA tai FOXO-spesifinen siRNA: ssa 24 tuntia käyttäen DharmaFECT1 seuraten valmistajan protokollaa.

MTS solukasvumäärityksessä

leviämisen LNCaP-solujen pysyvästi infektoitu pGIPZ -FOXO4 shRNA tai pGIPZ-NS-shRNA tai lyhytaikaisesti transfektoitu FOXO4- tai NS-siRNA arvioitiin käyttäen MTS-määritystä (Promega, Madison, WI) valmistajan protokollaa. MTS-määritys mittaa palauttaminen 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) ja formatsaaniksi metabolisesti aktiiviset solut.

Immunoblot (IB) analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 8% glyserolia, 1% Triton X-100, 0,1 % SDS: ää, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 10 mM Na

3VO4, 1 mM NaF, Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa)). 40 ug kokonaisproteiinia /näyte erotettiin SDS-PAGE: lla, blotattiin polyvinylideenifluoridia kalvoja, jotka blokattiin 30 min ajan 5% naudan seerumialbumiinia (Sigma) 1 x TBS /T (0,1% Tween-20: Tris-puskuroitu suolaliuos ), ja sitten testattiin kuten on esitetty. Digitaalisen kuvankäsittelyn ja signaalin kvantifiointi suoritettiin kemi-Genius

2 Bio-Imager (Syngene-, Frederick, MD) käyttäen GeneTools ohjelmistoa.

Ohimenevä transfektio

pFOXO4-GFP tai pFOXO4- TM-GFP, Ala substituutioita kaikissa kolmessa AKT fosforylaatiokohdat (ystävällisesti Stefanie Dimmeler, University Frankfurt, Saksa) transfektoitiin transientisti CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 plasmidi (ystävällisesti Zhiping Liu, UT Southwestern Medical Center) kotransfektoitiin ohimenevästi kanssa pEGFP DNA (Clontech /Takara, Mountainview, CA) osaksi CWR22Rv1 soluihin käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan suosituksia, ja sitten inkuboitiin 40h. GFP-positiiviset solut pisteytettiin hyökkäyksen ja

in situ

zymografia. Siru-qPCR analyysi, HEK293T-solut transfektoitiin ohimenevästi HA-RUNX2 (ystävällisesti Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), HA-RUNX2 plus Myc-FOXO4, tai tyhjän vektorin.

Invasion määritys ja valinta invasiivisia kloonien

Modified Boyden kammion määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [24] lähtien 5 x 10

4 solua /5-kuoppainen formaatti. Arvot siirtolaisuuden saatiin laskemalla vähintään 10 solua 6 kenttää per kalvo (x20 tavoite) ja keskiarvot kolmen erillisen kokeen. Solut lisääntynyt matrigeelin invasiivisuus eristettiin seuraavat neljä kierrosta peräkkäisen hyökkäyksen määrityksiä. Erityisesti, tunkeutuvat solut (kiinni pohjaan transwell kalvot) poistettiin trypsinoimalla, yhdistettiin perustuu shRNA moduulit, maljataan 6-kuopan astioihin, ja sen jälkeen laajenee uudelleen altistetaan hyökkäystä määrityksissä. Kolmen kierroksen jälkeen, solut maljattiin harvaan osaksi 10 cm ruokia, ja sen jälkeen lisääntymistä ja pesäkkeiden eristäminen, viivakoodit olivat Sanger sekvensoitu (RPCI Genomics Shared Resource Core, Irwin Gelman-Director) eristetyistä DNA: sta käyttämällä reunustavia PCR paria, F: 5 ’ – ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 ’ja R: 5′-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3′ tai käyttämällä suoraa sekvensointia aluke, 5’-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ’. LNCaP [vektori] tai LNCaP [shFOXO4] soluja transfektoitiin ohimenevästi 1: g kutakin pGIPZ lentivirukselle shRNA klooneja (GFP-proteiinia ekspressoivien) spesifinen PIP (liittymistä # NM_002652.2, klooneja V2LHS170040 ja V2LHS170041), CAMK2N1 (liittymisen # NM_018584.5 kloonit V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (liittymisen # NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), PGC (liittymisen # NM_002630.3, klooni V2LHS169912) tai RUNX2 (liittymisen # NM_004348, kloonit V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224628), tai tyhjä pGIPZ vektorisäätö (OpenBiosystems) arvioitiin invasiivisia mahdollisia.

In situ

zymografian

lasipeitinlevyille päällystettiin 0,2 mg /ml Oregon Green 488-konjugoidun gelatiini, ristisilloitettu 0,5% glutaraldehydi 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja inkuboitiin 5 mg /ml NaBH

4 3 min. Peitinlasit sitten desinfioidaan 70% EtOH: ssa 15 minuutin ajan ja pestiin seerumittomassa alustassa 1 h ajan 37 ° C: ssa. Solut maljattiin päällystetyt peitinlasit, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h, kiinnitettiin 10 min jääkylmällä 60% asetoni /3,7% paraformaldehydillä PBS: ssä, blokattiin 3% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Myc-FOXO4 värjättiin hiiren anti-myc (1:500), ja tumat värjättiin DAPI (Invitrogen, 1:500), jota seurasi FITC-konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG (1:500, Chemicon, Temecula, CA ). Fluoresenssikuvia otettiin käyttäen Nikon TE2000-E -käänteismikroskoopissa varustettu Roper CoolSnap HQ CCD-kamera. Invasiivisuus kvantifioitiin mittaamalla keskimääräinen tappio FITC-liivate alue kolmena kappaleena dioja.

Orthotopic etäpesäke malli

Orthotopic eturauhasen ruiskeita selkäpuolen lohkoa 10

6 solua 50: l PBS in male nude-hiirissä upotettu niiden kupeet testosteroni pellettejä suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. 10 viikon jälkeen hiiret uhrattiin ja tarkistettiin GFP fluoresenssin (Lightools Research, Encinitas, CA) on ensisijainen kasvaimia ja perifeerisissä elimissä. Kaikki eläinkokeet tehtiin valvonnassa Institutional Animal Care ja käyttö komitean Roswell Park Cancer Institute alle hyväksytyn tutkimussuunnitelman 1177M. Anestesia hengitettynä halotaania sen vaikutusta. Eutanasia suoritettiin CO2 tukehduttamalla seurasi niskanmurrolla.

immunohistokemia (IHC) B

Kudokset kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin 24 tuntia ennen käsittelyä. Kiinteä kudokset upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5: m. Objektilasit de-parafinized ksyleenissä ja sitten niihin lisätään arvostellaan alkoholeja seurasi DDH

2O. Laseja inkuboitiin 1 x pH 6 sitraattipuskurilla (Invitrogen Cat # 00-5000) 20 minuutin ajan ja sitten 3% H

2O

2 15 min. Objektilasit blokattiin 10% normaalia vuohen seerumia 30 min, mitä seurasi avidiini /biotiini lohko (Vector Labs Cat # SP-2001). Ensisijainen Abs ja Ki67 (1:500), GFP (1:50) tai kaspaasi 3 (1:200) laimennettiin 1% BSA-liuosta ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa (RT), jonka jälkeen inkuboitiin biotinyloidulla vuohen anti -rabbit toissijainen Ab (Cell Signaling Cat # 9661) 15 min. Saat signaalin laatua, ABC-reagenssia (Vector Labs Cat #PK 6100) levitettiin 30 min, jonka jälkeen inkuboitiin DAB alustaan ​​(Dako Cat # K3467) 5 min ja counterstaining muunneltujen Harris hematoksyliinillä (Richard-Allan Scientific Cat # 72704) 20 sekuntia. Objektilasit pestiin perusteellisesti PBS sinetöity peitinlaseista ja skannataan käytettäessä Aperio ScanScope CS käyttäen ImageScope ohjelmistoa (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

Geenien ilmentyminen array

Yhteensä-RNA valmistettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti kuusi näytettä: LNCaP [shFOXO4] solulinja, LNCaP [pGIPZ ohjaus] solulinja, LNCaP [shFOXO4] primaarikasvaimen, LNCaP [pGIPZ ohjaus] primaarikasvaimen, LNCaP [shFOXO4] imusolmuke etäpesäke ja LNCaP [pGIPZ ohjaus] imusolmuke etäpesäke. RNA-näytteet kvantifioitiin käyttäen ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific /NanoDrop) ja arvioitiin hajoamista käyttäen 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Näytteet, joissa RNA Integrity Value (RIN) 7 käsiteltiin geenien ilmentymisen erilaisia ​​analyysi käyttäen ihmisen HT-12 koko-genomin geenien ilmentymisen BeadChip array (v4) (Illumina, San Diego, CA). 500 ng kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi, jonka jälkeen

in vitro

transkriptio tuottaa biotiinilla leimatun cRNA käyttäen Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY), kuten valmistajan ohjeiden. 750 ng leimattujen koettimien sekoitettiin sitten hybridisaatio reagenssien ja hybridisoitiin yön yli 58 ° C: HT-12v4 BeadChips. Sen jälkeen pesu ja värjäys Cy3-streptavidiinikonjugaattia, The BeadChips oli kuvattu käyttäen Illumina Iscan Reader mitata fluoresenssi-intensiteetin jokaisen anturi. Intensiteetti signaali vastaa määrää vastaavan mRNA: n alkuperäisessä näytteessä. BeadChip tiedostoja analysoitiin GenomeStudio (v2011.1; Illumina) geenien ilmentyminen moduuli (v1.9.0) raportoimaan sekä un-normalisoitu ja kvantiili normalisoitu, tausta-korjattu geeniekspressiota signaalitasot. Geeniekspressiota signaalitasot analysoitiin sitten käyttämällä Bioconductor paketit Lumi ja Limma ohjelmat (https://www.bioconductor.org). Geenejä 2-kertainen ekspression muutoksia havaittiin.

Kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA (1 ug /reaktio) eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia saatettiin käänteistranskriptiolle reaktioita satunnaisella heksameerialukkeita käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies /Applied Biosystems). qRT-PCR suoritettiin 7900HT Sequence Detection järjestelmän (Life Technologies /Applied Biosystems) käyttäen Fast Start Universal SYBR Green Master kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukesekvenssit (taulukko S2) suunniteltiin käyttäen Primer -BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH käytettiin housekeeping geeni qRT-PCR-reaktioissa. Jokainen testi tehtiin kolminkertainen lisääntymään ja 2

-ΔΔCt menetelmä [26] avulla laskettiin geenien.

Co-immunosaostus (Co-IP) on FOXO4 ja RUNX2

HEK293T-solut kotransfektoitiin Myc-FOXO4 plus HA-RUNX2, HA-RUNX2 yksinään tai tyhjän vektorin yksin. 48 tunnin kuluttua solut lyysattiin RIPA-puskurilla ja IP suoritettiin käyttäen HA-Ab, minkä jälkeen IB, jossa on esitetty Ab, tai IP suoritettiin käyttäen Myc Ab, minkä jälkeen IB.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) – qPCR

ChIP-kokeet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (9) pienin muutoksin. Lyhyesti, LNCaP ja HEK93T soluja kasvatettiin 10-cm: n maljoihin (80-90% konfluenssiin) silloitettiin lisäämällä 10%: ista formaldehydiä ja elatusaineet 6-7 minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen lisättiin glysiiniä 125 mM. Kromatiinin sonikoitiin, jolloin saatiin 100-300 bp fragmentit SDS lyysipuskuria (0,1% SDS: ää, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 2% NP-40, 0,5% deoksikolaattia, pH 8,1), joka sisälsi 1 mM fenyylimetaanisulfonyyli fluoria ja proteaasinestäjä seosta. (Roche Applied Science) jälkeen pre-clearing proteiini A /G-magneettiset helmet (Millipore), kromatiinin inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 5 ug: lla seuraavia Ab kuten: HA, RUNX2, tai normaali hiiri-IgG. Immunokompleksit vedettiin alas proteiini A /G magneettisia helmiä. Siltoja sekä ChIP ja tulo DNA päinvastainen 65 ° C: ssa 5 h ja proteiinit pilkottiin proteinaasi K, ja DNA otettiin talteen fenoli /kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella, jossa on 20 ug glykogeenin operaattorin, kuten on kuvattu [27]. Saostetaan fragmentit kvantitoitiin qPCR, ja prosenttiosuus syöttää arvoja korjattiin negatiivisen kontrollin alueita toisin mainita. Alukkeet PCR-monistukseen PIP kuten edellinen kuvattu [28].

Tilastolliset analyysit

Statistical merkitykset ryhmien välillä määritettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testi, jossa virhe baareja merkitsee S.E.M. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Genomi laajuinen shRNA seulomaan ehdokas etäpesäkkeiden synnyssä

Jotta ymmärtää geneettiset tekijät tarpeen etäpesäke, käytimme korkean suorituskyvyn shRNA seulontaan niiden geenien tunnistamiseksi, jotka kykenevät tukahduttamaan Matrigel invasiivisuus, parametri metastaattisen kaskadin [29]. LNCaP-solut, joilla on alhainen invasiivisia potentiaalia [30], infektoitiin moduulien pGIPZ (GFP-proteiinia ekspressoivien) inhibiittoreita, joka koodaa moduulit ihmisen genomista shRNAs MOI = 0,7 (minimoida transdusoitujen solujen useita shRNAs), ja valinnan jälkeen puromy- vastus, solut altistettiin kolminkertaisiin Matrigel Boyden kammion hyökkäystä määrityksissä. Tunkeutuvat soluihin (kiinni pohjaan siirtoaltaat kalvot) poistettiin trypsinoimalla, yhdistettiin välillä kolmena rinnakkaisena, lisätään viljelmässä ja sitten suoritettiin kaksi kierrosta samanlaisia ​​hyökkäystä määrityksiä. LNCaP tartunnan tyhjä pGIPZ (LNCaP [vektori] soluja) ajettiin rinnakkain arvioimaan mitään valintaa spontaani lisääntyminen invasiivisuus (Fig. 1A). Oletimme, että solut yhä invasiivisuus johtuva menetys vaimentimen toiminta olisi rikastettu peräkkäisillä määrityksessä kierrosta. Kolmen syklin valinta, pesäkkeet eristettiin moduulien 2, 3, 6, ja 7, jotka osoittivat yhä invasiivisuuden suhteessa kierroksen 3 tasoa LNCaP [vektorin] kontrolleihin (Fig. 1 B). Sekvenssianalyysi (viivakoodi ja shRNA sekvenssi) ja BLAST tietopankin haku (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) tunnistettu useita klooneja forkhead laatikko O4 (

FOXO4

), kinesiiniin perheenjäsen 3B (

KIF3B

), signaalin siirtävää Jatkemolekyylin (SH3 domain ja ITAM motiivi) 1 (

STAM

), ja Homo sapiens liuenneen aineen kantaja perheen 17 (

SLC17A4

) (taulukko S1), jotka yhdessä edustavat 94% kaikista klooneista sekvensoitiin. Koska kasvava ymmärtää rooleja FOXO proteiinien alipaineensäätöventtiileillä syövän etenemisen [31], [32], ja äskettäisessä tutkimuksessa osoittaa, että säätely ylöspäin ANXA8 jonka FOXO4 estää solun muuttavien ja metastaattisen ominaisuudet kolangiokarsinooma solujen [33], keskityimme mahdollisesta roolista FOXO4 mahdollisena etäpesäke vaimennin.

. Kaavamainen yhteenveto näytön. Korkean suoritustehon shRNA seulontaan käytettiin tunnistamaan geenejä, joiden Knockdown aiheuttama kasvain invaasio, prosessi olennaista etäpesäke. Erittäin invasiivisia variantteja LNCaP valittiin käyttäen Matrigel päällystettyjä Boyden kammion hyökkäystä määrityksiä. B. Lisääntynyt invasiivisuus aiheuttama altaat shRNA kloonien yli 3 kierrosta valinta.

Ylähavas

: edustavat kuvat invasiivisen GFP-proteiinia ekspressoivien solujen ohjaus (pGIPZ vektori) tai shRNA (näyte # 2) kolmen valintakierroksen.

Alahavas

: invasiivisia mahdollisuudet yhdistetään solujen kussakin 7 infektion moduulien kolmen valintakierroksilla verrattuna LNCaP [vektori] soluja.

Down-regulation FOXO4 ihmisen metastaattisen CaP solulinjojen ja metastasoituneen kudoksissa

Voit testata, onko FOXO4 geenin ilmentyminen korreloi korkki solun invasiivisuus, ensin verrataan FOXO4 proteiinin ilmentymistä paneelia CaP solulinjojen kanssa erilaisia ​​invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin. Oli käänteinen korrelaatio matrigeelin invasiivisuus ja FOXO4 proteiinin tasot (Fig. 2A), varsinkin kun verrataan LNCaP kahteen metastaattisen variantteja, LN3 ja C4-2. Haku on Oncomine tietokannan (https://www.oncomine.org) paljasti, että FOXO4 oli merkitsevästi alassäädetty metastasoitunutta CaP verrattuna ensisijainen päällä syöpä ja /tai normaali näytteet kahdesta yksittäisten tutkimusten (kuvio 2B). Lisäksi analyysi metastaattisen CaP tapausta tutkimuksen Taylor et al. [8]

cbio

verkkosivuilla (https://www.cbioportal.org/public-portal/) osoittivat, että ne, joilla on FOXO4 downregulation korreloi nopeammin ulkonäkö etäpesäkkeitä verrattuna, jossa ei ole muuttunut FOXO4 ilmaisu (Fig. 2C). Ei ollut todisteita korreloivat FOXO4 downregulation rintasyövässä etäpesäkkeiden vaikka oli pieni downregulation paksusuolen syövän etäpesäkkeiden (Fig. S1), mikä viittaa siihen, että otaksuttu etäpesäke vaimennin toiminto FOXO4 olisi kudostyypin erityinen. FOXO1 tasot myös vaimentua Cap etäpesäkkeitä (Fig. S2A), mutta emme voineet selvittää FOXO1 menetys korreloi kasvoi etäpesäke Cap potilailla (Fig. S2B) takia underpowering alhaisen potilaalle numeroita. Sen sijaan, FOXO3 ekspressiotasot ei osoittanut korrelaatiota CaP etäpesäkkeitä (kuviot. S2C 0,01. B. ektooppinen ekspressoituminen WT tai konstitutiivisesti aktiivinen (TM) FOXO4 pienenee CWR22Rv1 invasiivisuus. Kohdunulkoinen FOXO4 arvioitiin IB (

yläpaneeli

) ja sen vaikutus Matrigelillä invasiivisuus kvantifioitiin (

alempi paneeli

). Virhepalkkien, S. E. kolminkertaisten kokeissa. *, P 0,01. C. Paikallinen invasiivisuus LNCaP [vektorin] (

ylärivissä

) vs. LNCaP [shFOXO4] (

alarivi

) arvioitiin soluille ympättiin Oregon Green 488-leimattua gelatiinia, jossa solut leimattiin DAPI. D. Sama analyysi kuin C paitsi vertaamalla CWR22Rv1 ilmentävät stabiilisti vektorilla tai Myc-FOXO4. E. Lung, maksan, munuaisten ja LN yksittäisiltä hiiristä tumored kanssa LNCaP [vektori] (kontrolli) tai LNCaP [shFOXO4] oli kuvattu käyttäen näkyvää valoa (

yläpaneeli

) tai fluoresoiva valo (

alemman levyn

). Nuolet, LN ja munuaisten etäpesäkkeitä. F. Metastasoitunut LN vaurioita peräisin LNCaP [shFOXO4] tumored hiiri värjättiin H B). Mielenkiintoista on, että pudotus on FOXO1, mutta ei FOXO3, LNCaP-soluista, jotka indusoitiin suurempi invasiivisuus (Fig. S4C), mutta pakko ilmentymistä joko FOXO1 tai FOXO3 ole vähentää invasiivisuuden CWR22Rv1 soluissa (kuvio. S4d). Näin ollen vaikka FOXO1 voi olla mukana LNCaP invasiivisuus, FOXO4 on sekä mukana ja riittävä valvonta invasiivisuus.

Sitten testataan onko FOXO4 Knockdown voisi edistää spontaaneja etäpesäkkeiden

in vivo

. Nude-hiirissä upotettu aika-julkaisu testosteronia pelletit injektoitiin niiden selkä lohkoihin LNCaP [vektori] tai LNCaP [shFOXO4] soluja, ja kymmenen viikon kuluttua hiiret tapettiin ja analysoitiin GFP fluoresenssin markkerina pGIPZ. Vaikka LNCaP [shFOXO4] ensisijainen-kasvainten olivat hieman pienempiä kuin indusoi LNCaP [vektori] soluja, tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. S3B). Mikä tärkeintä, ei ollut eroa niiden suhteellinen GFP: n ilmentymisen (Fig. S3C), tai niiden leviäminen tai apoptoosin hinnat

in vivo

perustuu Ki67 tai lohkaista kaspaasi-3 IHC värjäytymistä (kuviot. S3D 27% (3/11) ja 9,1% (1/11) kun shFOXO4 ryhmässä oli munuais- ja keuhkoetäpesäkkeet vastaavasti taas etäpesäkkeitä todettiin none (0/16) kontrolliryhmässä. Lisäksi olemme vahvistaneet, että LN vauriot ilmaisi GFP-proteiinia käyttämällä GFP-erityisiä IHC (Fig. 3F).

Analyysi FOXO4-säänneltyjen pro-etäpesäke geenien

Koska FOXO proteiinit toimivat transkriptiorepresso- tutkimme, lisääntynyt invasiivisuus jälkeen FOXO4 menetys voi johtua kasvusta pro-etäpesäkkeitä geeniekspressiota. Siten genominlaajuisten geenin ilmentymisen analyysi suoritettiin LNCaP [vektori] vs. LNCaP [shFOXO4] viljeltyjen solujen ensisijainen-kasvainten ja LN etäpesäkkeitä. Knockdovvn FOXO4 kussakin näistä näytteen sarjaa vahvistettiin IB (Fig. S5a). Tämä analyysi tunnistettu 535 geenejä, joiden ilmentyminen muuttunut ≥1.5-kertaiseksi (kuvio. S5B). Näistä 54 muutokset olivat yhteisiä kaikille kolmelle näytteelle sarjaa (Fig. 4A, Fig. S5c), ja näistä 19-geenien (15 voimistunut, 4 vaimentua) liittyi FOXO4 pudotus (Fig. 4B). Jotta keskittää analyysin, me analysoitiin Ingenuity IPA ohjelmisto, joka on 19-geenin allekirjoitus oli mukana etäpesäke liittyviä prosesseja, kuten solun liikkuvuus, invasiivisuus kemotaksista tai solujen selviytymistä. Kahdeksan geenejä säädellään ylöspäin shFOXO4 liittyvän LN etäpesäkkeitä (

PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP

, ja

PGC

) on havaittu mahdollisesti mukana etäpesäke (kuvio . 4C,

top).