Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mincle, makrofagi-indusoituva C-tyypin lektiinin , on jäsen C-tyypin lektiinin reseptoreihin. Se on tärkeä rooli mykobakteerilääkkeillä ja anti-sieni immuniteetti. Lisäksi se havaitsee kuolleet solut kautta sen ensisijainen ligandi SAP130.

Materiaalit ja Havainnot

Tutkimme kymmenen urothelial kasvaimia virtsarakon karjan. Kahdeksan heistä ilmaistuna E5 cDNA naudan papilloomavirusten tyypin 2 (BPV-2) ja 13 (BPV-13), jotka kuuluvat Deltapapillomavirus sukuun. Kaksi niistä ei tutkittu havaitsemiseksi E5 cDNA. Mincle ilmaus näyttäisi esiintyvän urothelial neoplastisten solujen vain. Ei mincle ekspressiota havaittiin urothelial solujen terve karja. Mincle ilmentyminen oli ominaista kalvo kuvio papillaarisen urothelial syövät; eristetyt ja /tai aihekokonaisuuksien urothelial solujen vahvassa sytoplasmisen immunoreaktiivisuus oli pääasiassa nähty invasiivisia urothelial syövissä.

Johtopäätös

Tämä on ensimmäinen tutkimus siitä ilmentymistä mincle eläinlääkinnässä onkologian ja ensimmäinen raportti joka kuvaa ilmaisua toiminnallisten mincle reseptorin neoplastisten solujen lääketieteellisessä kirjallisuudessa. Kuten on osoitettu, että Uroteelisyöpäsolujen on kyky toimia antigeeniä esittelevät solut (APC: t), on mahdollista, että mincle ilmentyminen on osallisena esittäminen syöpäsolujen antigeenien soluihin immuunijärjestelmää. Lisäksi koska ilmaus mincle edistää valvontaan

Mycobacterium bovis

BCG-infektio, tämä tutkimus on jännittävä kliininen merkitys vertailevassa lääketieteessä pitäen mielessä, että Bacillus Calmette-Guerin (BCG) immunoterapia on tällä hetkellä tehokkain hoito non-lihas invasiivisia virtsarakon syöpä ihmisellä. Mincle ilmentyminen urothelial kasvainsoluissa optio jatkotutkimuksia ymmärtämään paremmin roolin, jos lainkaan, tämän reseptorin virtsarakon syöpään. Jatkotutkimuksissa antaa oivalluksia roolissa mincle reseptorin Uroteelisyöpäsolujen tuumorin vastaisessa immunoterapiassa.

Citation: Roperto S, Russo V, Esposito I Ceccarelli DM, Paciello O, Avallone L, et al. (2015) Mincle, synnynnäinen immuuni Receptor, ilmaistaan ​​Uroteelisyöpäsolujen papilloomaviruksen-Associated urothelial kasvaimet Nauta. PLoS ONE 10 (10): e0141624. doi: 10,1371 /journal.pone.0141624

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: toukokuu 22, 2015; Hyväksytty: 28 syyskuu 2015; Julkaistu: 29 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Roperto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

C-tyypin lektiinin reseptorit (CLRs) käsittävät suuren superperheen proteiinien ilmentyvät ensisijaisesti myelooinen soluihin, joissa ne toimivat tehokkaasti hahmontunnistus reseptorit (PRRS) [1]. CRLs sisältää yli tuhat tunnistettu jäseniä useista eläinlajeista [2], ja niiden uskotaan olevan neljännen perheen kuvio tunnustamisesta reseptorit [3]. CLRs tunnistaa monipuolisia ligandeja ”nonself” (taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuviot-PAMPs), ’vahingoittuneet itse ”(vahinko liittyvä molekyyli kuviot-vaimentaa) tai” muuttunut itse ”(kasvaimeen liittyvien molekyylien kaavoja-TAMPs) [1 ].

Mincle, makrofagi-indusoituva C-tyypin lektiinin (kutsutaan myös CLEC4E), on jäsen CLRs. Se tunnistettiin alun perin transkription kohteena NF-interleukiini-6 (IL-6) pääasiassa ilmennetään antigeeniä esittelevien solujen (APC: t), kuten makrofagit, dendriittisolut (DC: t), B-solujen ja neutrofiilien [4]. Ilmaisu taso mincle in vakaan tilan kunto on erittäin alhainen; kuitenkin, se on erittäin ylössäädelty altistuksen jälkeen eri tulehduksellisten signaalien [5]. Mincle näyttää selektiivisesti liittyy Fc-gamma-reseptorin (FcyR) ja aktivoi makrofageja tuottamaan tulehdusta edistävien sytokiinien ja kemokiinien [6]. Mincle on keskeinen reseptori mykobakteeri johto tekijä trehaloosidimykolaatista (TDM) siten on tärkeä säätelijä antimikrobisen immuniteetti [7,8]. Mincle on keskeinen rooli antifungaalisen immuniteetin koska siinä tunnustetaan joidenkin sienten kuten

Candida albicans

,

Malassezia

lajien ja

Fonsecaea pedrosoi

, taudin aiheuttaja kromoblastomykoosi [9 -11]. Lisäksi mincle aistii kuolleita soluja kautta ensisijainen ligandi SAP130 (silmukointiyksikkövälitteiseen liittyvä proteiini 130), pieni ribonukleoproteiini- vapautuu nekroottisten solujen vain [6]. Viime aikoina on osoitettu, että luonnollinen tuote brartemicin, estäjä syöpäsoluinvaasiota, on korkean affiniteetin ligandin hiilihydraattia (CRD) ja mincle reseptorin [12].

Mincle on äskettäin löydetty voidaan ilmaista ei-immuunisolujen, kuten neuronien ja endoteelisolujen aivoinfarktin jälkeen sekä hiirillä että ihmisillä; Näin ollen, on ehdotettu, että mincle ja sen ligandi SAP130 osallistua synnyssä aivoiskemian, jonka tulehduksen käynnistämisestä [13, 14].

virtsarakon kasvaimet ovat hyvin harvinaisia ​​karjan osuus 0,01% kaikista naudan maligniteettien [15]. Päinvastoin, rakon kasvaimet ovat yleisiä aikuisten nautojen, jotka ovat laidunnettu pasturelands runsaasti saniainen saniainen (

Pteridium

spp.) [16-19]. Ptaquiloside, joka on sananjalka sesquiterpenoid, ja tarttuva aineiden uskotaan olevan vastuussa virtsarakon solutransformaatio. Vaikka monet bakteerit on todettu virtsassa mikrobiston nautojen vaikuttaa rakkokasvaimista [20], naudan papillomaviruksien (BPVs) Deltan suvun näyttävät olevan tärkein tartunnanaiheuttajien mukana etio-patogeneettisiä mekanismit virtsarakon syövän synnyn. Erityisesti naudan papilloomaviruksen tyypin 2 (BPV-2) ja tyyppi 13 (BPV-13) näyttävät olevan kaikkein vallitseva viruksen virtsarakkokasvain naudoilla [17, 21-26].

Tavoitteena Tässä asiakirjassa on raportoida ilmaus mincle reseptorin Uroteelisyöpäsolujen luonnollisesti esiintyviä papilloomaviruksen liittyvää urothelial kasvaimia karjaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tässä tutkimuksessa ei tehty mitään eläinkokeita. Keräsimme näytteitä suoraan yksityisen ja julkisen teurastamoissa eläimet teurastettiin seuraavan pakollisen kliininen ante mortem -tutkimuksen edellyttämällä tavalla Euroopan unionin (EU) lainsäädäntö.

kasvainnäytteestä

Ten naudan urothelial kasvain näytteet ja viisi virtsarakon näytteet ilmeisesti terveet lehmät olivat kerätty luvalla lääketieteen viranomaisten teurastamoissa nimeltä ”Barbara Rocco sas” of Simbario (Calabrian alue), ”Macello Comunale” Muro Lucano (Basilicatan alue), ”Cestari Carni srl” Montesano sulla Marcellana (Campanian alueen), ”Frigo Sud srl” Nocera Superiore (Campanian alueen), ”Real Beef srl” of Flumeri (Campanian alueen).

Voit estää mahdolliset rajat tartuntoja, sekä neoplastisia ja normaalissa virtsarakossa näytteet heti jaettu useisiin osiin . Jotkut osat jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää molekyylibiologian analyysi. Loput osat fiksattiin 10% puskuroituun formaliiniin mikroskooppista tutkimuksiin.

histopatologia

Kudokset kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin rutiininomaisesti upotettu parafiinivahaan. Histologinen diagnoosi arvioitiin 5-pm paksu hematoksyliinillä-eosiinilla (HE) -stained kohdat käyttäen morfologisten kriteerien ehdotettiin selvityksen uudesta histologinen luokitus urothelial kasvainten virtsarakon nautojen [19].

RNA

Yhteensä RNA uutettiin virtsarakot lehmien käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italia), mukaan valmistajan ohjeiden. Määrä ja laatu RNA arvioitiin käyttäen NanoVue Plus ja elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä. Genominen DNA poistettiin RNA valmisteita käyttämällä RNaasittomalla DNaasi I Fermentakselta Life Sciences (Dasit, Milano, Italia).

käänteistranskriptio (RT) -PCR BPV-2, BPV-13 E5, Mincle, FcyR ja CXCL2

Kokonais-RNA transkriptoitiin käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia), ja reaktiota inkuboitiin 25 ° C: ssa 5 min, 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 85 ° C 5 min, ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa 5 min. Syntetisoitu cDNA analysoitiin PCR: llä spesifisiä alukkeita BPV-2 E5 ORF (eteenpäin, 5′-CACTGCCATTTGTTTTTTTC-3 ’; taaksepäin, 5′-GGAGCACTCAAAATGATCCC-3’), että BPV-13 E5 ORF (eteenpäin, 5 ”- CACTGCCATTTGGTGTTCTT-3 ’; taaksepäin 5’AGCAGTCAAAATGATCCCAA-3′), ja Mincle (forward-aluke, 5’-GACTGAGGGTCAGTGGCAAT -3 ’; käänteinen aluke, 5′-GTCCCTTATGGTGGCACAGT-3’), ja FcyR (eteenpäin, 5 ’ – TTTGGTTGAACAAGCAGCGG-3 ’; taaksepäin 5’TGCAACTTGAGTCGGCAGTA -3’) ja CXCL2 (eteenpäin, 5’GCCGCTCCCATGGTTAAGAA-3 ’; taaksepäin 5’TCTGTAGGGGCAGGGTCTAC -3′). Arvioidaan riittävyyden cDNA näytteiden kontrollina PCR naudan β-aktiini-sekvenssi suoritettiin käyttäen alukesarjaa suunnitellut Primer BLAST ohjelmisto (eteenpäin, 5’-GAGCGTGGCTACAGCTTCAC-3 ’, käänteinen, 5′-CATTGCCGATGGTGATGA-3’ ). RT-PCR suoritettiin 25 ul reaktioseosta, joka sisälsi 2,5 ui 10 x puskuria, 2 mM MgCI

2, 2,5 U AmpliTaq-Gold DNA Polymerase (Life Technologies, Monza, Italia), 480 nM kutakin aluketta ja 200 mM kutakin dNTP: tä ja 50 ng DNA-uutetta. PCR-ohjelma oli 95 ° C: ssa 3 min, jota seurasi 35 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 s ja pidennys 72 ° C: ssa 1 min. Lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa 7 min suoritettiin kunkin PCR-määrityksessä. Geelielektroforeesi 20 ui monistettua DNA osoitti tuotteen odotettua kokoa. Kussakin kokeessa tyhjä näyte, joka koostuu reaktioseoksesta ilman DNA: ta oli mukana. Sikäli kuin BPV E5 cDNA analyysi positiivinen näyte koostuu kloonattujen BPV-2 (ystävällinen lahja Dr. A. Venuti) ja BPV-13 positiivisesta näytteestä (ystävällinen lahja Dr. A. A. Alfieri) käytettiin. Monistettu DNA puhdistettiin silikageelillä kalvoja käyttämällä QIAquick PCR määrän mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Qiagen, Milano, Italia). RT-PCR-tuotteiden erottamisen jälkeen geelielektroforeesilla, sekvensoitiin käyttäen Sanger menetelmää-pohjainen automaattinen sekvensseri (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies, Monza, Italia). Lisäksi monistettu Mincle DNA terveen ja sairaan rakot kloonattiin pGEM-T -vektoriin käyttäen pGEM-T Easy Vector System (Promega, Milano, Italia) ja sekvensoitiin automatisoitu laite (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi (qRT-PCR) varten Mincle

qRT-PCR-analyysi, 500 ng RNA: ta käänteistranskriptoituneet käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano , Italia) ja reaktiota inkuboitiin 25 ° C: ssa 5 min, 42 ° C: ssa 30 minuuttia, 85 ° C: ssa 5 min, ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa 5 min. Real Time suoritettiin käyttäen SsoFast EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Havaitsemiseksi Mincle spesifisiä alukkeita (kuten edellä on kuvattu), käytettiin. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja β-aktiini käytettiin sisäisenä standardina (forward-aluke 5′-TAGCACAGGCCTCTCGCCTTCG-3 ’; taaksepäin suuntautuvaa aluketta 5’GCACATGCCGGAGCCGTTGT-3’).

Western blot analyysi virtsarakkonäytteet ja mincle proteiinin

terveet ja sairaat rakkojen liuotettiin 2 tuntia 4 ° C: ssa lyysipuskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100. Välittömästi ennen käyttöä, seuraavat reagenssit lisättiin: 1 mM DTT, 2 mM PMSF: ää, 1,7 mg /ml aprotiniini, 25 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4 (Sigma-Aldrich, Milano, Italia).

Lysaatit selvitetty 15000 rpm 30 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Western blotting, 100 ug lysaattia proteiineja, kuumennettiin 100 ° C: ssa 4X esisekoittaa Laemmli-näytepuskuria (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Proteiinit tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuhteissa.

Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosalle suodatinmembraanit (GE Healthcare Life Sciences, Chalfont St Giles, UK) 1 h 10 V 192 mM glysiini /25 mM Tris-HCI (pH 7,5) /10% metanolia käyttäen Trans-Blot SD Semi Kuivaparistot (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia) mukaan valmistajan ohjeiden. Membraanit blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS, pH 7,5) 1 h huoneen lämpötilassa, pestiin TBS-0,1% Tween. Sitten suodattimet koetettiin anti-Mincle (CLEC4E (P-15): sc-161486, (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) laimennettuna 1: 1000 5% BSA inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Kolmen pesun jälkeen Tris-puskuroitu suolaliuos, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-vuohi-IgG: tä (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. sen jälkeen kun asianmukaiset pesuvaiheet, sitoutunut vasta-aine visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi-järjestelmä (Western blotting Luminol Reagent, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). kuvat otettiin Image Lab Software 2.0.1 (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia).

immunohistokemia

Kaikki patologinen näytteet immunovärjättiin ja osa tavanomaisen naudan virtsarakon limakalvon testattiin rinnakkain kontrollina käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin (ABC) menetelmän kanssa, Vectastain ABC -kittiä (Vector Laboratories, Inc., CA, USA). Lyhyesti, parafiinileikkeet parafiinista, ja blokattiin endogeenisen peroksidaasin 0,3% H

2O

2 metanolissa 20 min ajan. Antigeeni parannus suoritettiin esikäsittelemällä mikroaaltouuni lämmitys (kahdesti 5 min kukin 750 W) sitraattipuskurissa pH 6,0. Levyjä pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4, 0,01 M), sitten inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, joilla oli normaali kanin seerumi (Vector Laboratories Inc., CA, USA) laimennettiin 20%. Polyklonaalisella vuohen anti-CLEC 4E, anti-Fc-ε RIγ, anti-Card9 ja hiiren monoklonaalinen anti-Syk (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) primaaristen vasta-aineiden laimennettuna 1 200, 1 400, 1 300 ja 1 50, vastaavasti, fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), levitettiin yön yli huoneen lämpötilassa kosteassa kammiossa. Levyjä pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin sitten 30 min asianmukaiset biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen anti-vuohi (Vector Laboratories Inc., CA, USA), joka oli laimennettu 1: 200 PBS: ssä. Leikkeet pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin sitten Vectastain ABC-reagenssia (Vector Laboratories Inc., CA, USA) kosteassa kammiossa huoneenlämmössä. Väri kehitys saatiin käsittelemällä 3, 3′-diaminobentsidiinillä (Vector Laboratories Inc., CA, USA) 2-10 min. Osiot vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä. Ensisijainen vasta-aine jätettiin pois ja korvattiin vasta-laimennusainetta negatiivisista kontrolleista, joissa ei taustavärjäyksen havaittu.

Tulokset

Koska epäonnistuneen infektioiden BPV-2 ja BPV-13 ovat yleensä liittyneet urothelial kasvaimia virtsarakon karjan ensinnäkin tutkimme onko selostukset E5-proteiinin, viruksen suuret onkoproteiinia, olivat läsnä kasvaimia. RT-PCR osoitti, sekä BPV-2 ja BPV-13 E5 transkriptien vain kasvainsoluissa; no E5 transkriptit havaittiin terveillä virtsarakkonäytteet. Kun läsnä on BPV-2 ja BPV-13 E5 RNA varmistettiin sekvensoimalla amplikonien mukaisesti BPV-2: n sekvenssin M20219.1 ja BPV-13-sekvenssin JQ798171.1 (kuviot 1 ja 2). Mikroskooppinen malleja urothelial syöpien ja havaitseminen papilloomaviruksen E5 transkriptien on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

arviointi BPV-2 E5 cDNA RT-PCR (RT-PCR). M: 50 bp molekulaarinen merkkiaine (HyperLadder II Bioline); 2-3: terveet virtsarakon näytteitä; 4-6: virtsarakon kasvain näytteet; 7: positiivinen kontrolli (kloonattu BPV-2 DNA); 8: negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta lisätty). Nuoli osoittaa asemaa 154 bp BPV-2 E5 PCR-tuotteen.

arviointi BPV-13 E5 cDNA RT-PCR (RT-PCR). M: 50 bp molekulaarinen merkkiaine (HyperLadder II Bioline); 2-3: terveet virtsarakon näytteitä; 4-6: virtsarakon kasvain näytteet; 7: positiivinen kontrolli (BPV-13 DNA); 8: negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta lisätty). Nuoli osoittaa aseman 153 emäsparin BPV-13 E5 PCR-tuotteen.

Mincle proteiini paljastui sekä terveen ja sairaan näytteiden western blot tutkimus; proteiini näytti olevan yli-ilmentynyt tuumorinäytteissä verrattuna terveiden näytteiden (kuvio 3). RT-PCR paljasti mincle transkriptien sekä normaali- että syövän näytteitä. Sen jälkeen kloonaus ja sekvensointi, mincle selostukset osoitti 98% ja 99% identiteetti, lla, Bos taurus mincle geeni talletettu GenBank hakunumerolla XM_010827920.1 (kuvio 4). qRT-PCR havaitsi tilastollisesti merkittävää lisäystä mincle mRNA-tasojen patologisissa näytteissä (kuvio 5).

(x) Western blot -analyysi, joka esittää tilastollisesti merkittävää yliekspressio Mincle proteiinin kasvaimen rakot. Kaistat 1-3: virtsarakko terveistä eläimistä. Kaistat 4-6: kasvainkudoksessa edustavien kolmen eläimiä papilloomaviruksen liittyvän kasvainten virtsarakon. Aktiini-proteiinin tasot havaittiin tasapuolisen Proteiinilisäyksen. (Y) kvantitatiivinen densitometristä analyysi suodattimien suoritettiin Image Lab ohjelmisto (ChemiDoc; Bio-Rad Laboratories) ja merkitys määritetään Student T-testi (*, p≤0.05).

Lane M, molekyylimassa merkki (1 kb DNA Ladder, Microtech). Kaistat 2-4: Neljä normaali (kontrolli) näytettä terveistä karjaa. Kaistat 5-7: yhdeksän edustavia kasvainnäytteestä. Kaista 8: negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta lisätty). Ylä- ja alaosat kuvion osoittavat 99% ja 98% homologia, vastaavasti, välinen sekvenssi amplikonien, kloonauksen jälkeen, ja sekvenssi naudan MINCLE talletettu GenBank (XM_010827920.1).

suhteellinen ilmentyminen MINCLE tasojen neoplastisten kudoksissa. Suhteellinen mRNA-tasot laskettuna ΔΔCT menetelmää, edustavat kertaiseksi muutoksia verrattuna virtsarakkonäytteet terveiden nautojen. Kaikki arvot normalisoitiin sisäisen valvonnan β-aktiini. Tulokset edustavat keskiarvot ja keskihajonnat kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. (*, P≤0.05, vs virtsarakon terveistä eläimistä).

morfologisesti, mincle proteiini havaittiin immunohistokemiallisella menettelyjen urothelial kasvainsoluissa vain eikä normaaleissa urothelial soluissa. Kalvomaiseen malli mincle immunoreaktiivisuus havaittiin neoplastiset solut sekä matalan ja korkean asteen papillaarinen urothelial kasvaimet (kuvio 6); Lisäksi hajallaan ja aihekokonaisuuksien neoplastisia urothelial soluja sekä matalan ja korkean asteen invasiivisen uroteelisyöpä osoitti vahvaa immunoreaktiivisuus mincle, vallitsevasti in sytoplasmisen kuvion ulkonäkö. Mincle ekspressiota havaittiin myös tulehdussolujen hajallaan syöpäsolujen; Erityisesti reseptorin ilmentymisen nähtiin kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) (kuvio 7).

membranous malli mincle ilmentymisen nähtiin endoluminaalinen urothelial solujen lisääntymistä (nuolet). Upotus: Non immunoreaktiivisuus nähtiin normaaleissa urothelial soluissa. Mag. 40X; Bar: 100 pm.

Klusteroitu kasvainsolujen osoittivat vahvan sytoplasmisen immunoreaktiivisuus mincle (mustat nuolet). Eristetty immunoreaktiivisia neoplastiset solut nähtiin myös hajallaan virtsarakon seinämä. Immunoreaktiivisuus näkyi myös kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) (punainen nuoli). Mag. 40X. Bar: 100 pm.

Tiedetään, että Mincle assosioituu sovittimen proteiini FcyR joka vaaditaan aloittamiseen signalointia sitoutumalla Syk joka puolestaan ​​aktivoi signalointiryöpyn kautta Card9 ja tämä tapahtuma johtaa induktioon sytokiinin ja kemokiinin kuten CXCL2 [5, 6]. Siksi tutkimme FcyR mRNA: n ilmentymisen sekä normaaleissa että patologisissa virtsarakon näytteiden RT-PCR: llä. Amplikoneja, sekvensointi joista paljastuu FcyR selostukset osoittaa Havaitsemme 97%: n Bos taurus FcyRI (GenBank: AF316499.1), havaittiin syöpänäytteissä vain (Kuva 8). Morfologisesti, vahva soluliman ja membranous immunoreaktiivisuus paljastava odottamaton, poikkeava ekspressio FcyRI näkyi Uroteelisyöpäsolujen (Kuva 9). Sitten tutkimme onko morfologinen ilmentymä Syk-Card9 akselin voitu havaita urothelial soluja terveen ja neoplastisten näytteitä. Vahva immunoreaktiivisuus paljastaen ilmeinen Syk ilmentyminen oli selvästi havaittavissa Uroteelisyöpäsolujen vain (kuvio 10). Lisäksi myös Card9 -proteiiniekspressio immunohistokemiallisesti nähtävissä urothelial kasvainsoluissa. Ei immunoreaktiivisuus Card9 on ilmestynyt urothelial soluissa terveiden näytteiden (kuvio 11).

arviointi FcyR mRNA-ilmentymisen RT-PCR (RT-PCR). M: molekulaarinen merkkiaine (HyperLadder II Bioline); 2-4: terveet virtsarakon näytteitä; 5-7: virtsarakon kasvain näytteet; 8: negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta lisätty). Alempi osa kuvassa on identiteetti 97% kanssa Bos taurus FcγR1 (GenBank: AF316499.1).

Vahva soluliman ja membranous immunoreaktiivisuus osoittaa poikkeava ilmaus FcyR nähtiin Uroteelisyöpäsolujen. Upotus: Ei FcyR ilmentymistä havaittiin normaaleissa urothelial soluissa. Mag. 40X; Bar: 100 pm.

Vahva immunoreaktiivisuus osoittaa ilmeinen ilmaus Syk nähtiin Uroteelisyöpäsolujen. Upotus: Ei immunoreaktiivisuus Syk havaittiin normaaleissa urothelial soluissa. Mag. 40X; Bar: 100 pm.

Vahva sytoplasminen immunoreaktiivisuus osoittaa selvä osoitus Card9 nähtiin Uroteelisyöpäsolujen. Upotus: Ei immunoreaktiivisuus Card9 nähtiin normaaleissa urothelial soluissa. Mag. 40X; Bar: 100 um.

Lopuksi tutkittiin mRNA: n ilmentymisen CXCL2, tulehdusta kemokiini. RT-PCR paljasti läsnäolo cDNA syöpänäytteissä vain; sekvenssit on saatu amplikonien vahvistettiin CXCL2 transkriptien, joka osoitti 98%: n identtisyys Bos taurus CXCL2 (GenBank: NM_174299.3) (kuvio 12).

arviointi CXCL2 mnRNA ilmentymisen käänteistranskriptaasi polymeraasiketjureaktio reaktio (RT-PCR). M: molekulaarinen merkkiaine (HyperLadder II Bioline); 2-4: terveet virtsarakon näytteitä; 5-7: virtsarakon kasvain näytteet; 8: negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta lisätty). Alaosa kuvio esittää 98% identiteetti Bos taurus CXCL2 (GenBank: NM_1742993).

Keskustelu

Olemme havainneet mincle ilmentymistä papilloomaviruksen liittyvän urothelial kasvaimet virtsarakon naudoilla. Tämä on ensimmäinen raportti ilmentymisen mincle eläinlääkinnässä onkologian ja ensimmäinen havainto kuvaava ilmaus toiminnallisten mincle reseptorin neoplastisten solujen lääketieteellisessä kirjallisuudessa. Morfologisesti, mincle proteiini nähtiin urothelial neoplastiset solut ainoastaan, mutta ei normaalissa urothelial soluissa, mikä saattaa merkitä sitä, että taso mincle ilmaisu on niin alhainen vakaan tilan edellytys se ei havaitse immunohistokemiallisella menettelyjä. Emme sulje pois, että mincle havaittu terveillä virtsarakon tulee klustereita lymfoidi- ja makrofagien soluja, jotka ovat yleensä läsnä virtsarakon seinämän Terveiden lehmien.

On mahdollista, että genominen muutokset johtavat dysregulaatio joitakin CLR geenit voivat olla vastuussa mincle sekä FcyRI ilmentymistä urothelial kasvainsoluissa; on myös mahdollista, että mincle ilmentyminen voitaisiin aktivoida joitakin endogeenisten ligandien, koska lukuisia nekroottisen pesäkkeitä, jotka voivat aiheuttaa vapautumista itse komponenttien nähdään urothelial kasvainten virtsarakon karjan. Siksi mincle voi olla osallisena induktioon tulehdusta vastetta tunnistava komponentteja vapautuu kuolleita soluja. Mukaan Suzuki et ai. [13], monet endogeenisiä ligandeja mincle reseptoria vielä tunnistettu.

On ehdotettu, että urothelial solut (mukaan lukien virtsarakon syöpäsolujen itse) kykenevät tuottamaan sytokiineja ja kemokiinin ja osallistuvat esittämiseen syöpäsolun antigeenejä soluihin immuunijärjestelmän [27]. Itse asiassa, jotkut kemokiinireseptoreita on havaittu Uroteelisyöpäsolujen [28]. Viime aikoina jotkut ligandeja kemokiinireseptoreita CXCR4 ja CXCR7, on havaittu erittyvän urothelial cancer ihmisen virtsarakon [29]. Sen vuoksi on ehdotettu, että Uroteelisyöpäsolujen on kyky toimia antigeeniä esittelevät solut (APC: t). Tämä kyky vaikuttaa olevan kliinisesti merkittävää, koska se vaikuttaa toistumisen virtsarakon syövän [30].

Vaikka mincle ilmentymistä urothelial kasvainsoluissa optio jatkotutkimuksia ymmärtämään paremmin roolin tämän reseptorin virtsarakon syövän, tämä raportti on jännittävä kliinistä merkitystä vertailevassa lääketieteessä. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) immunoterapia on tällä hetkellä tehokkain hoito ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä ihmisellä [31]. Vaikka BCG on käytetty hoitoon virtsarakon syöpään lähes 40 vuotta, tapa, jolla se saavuttaa terapeuttinen vaikutus jää muutamassa tutkimuksessa [27]. On osoitettu, että virtsarakon syövän solulinjat kykenevät sisäistää BCG [32]. On oletettu, että sisäistämisen BCG virtsarakon syövän solujen säätelee läsnäolo tiettyjä tuntemattomia onkogeenisten poikkeamia, jotka aktivoivat macropinocytosis [27]. Siksi virtsarakon kasvainsolujen voisi olla rooli alkuperäisen kirjaamisen ja käsittelyn BCG, mikä johtaa immuunijärjestelmän rekrytointi; kuitenkin, patogeneettiset mekanismi (t) on selvitetty, [27]. Toll-like-reseptorien on havaittu viljellyillä normaali ja urothelial kasvainsolujen ja voi olla rooli tuumorin vastaisen koskemattomuuden nonmuscle invasiivisen kasvaimet [33].

Monet kysymykset jäävät yhä vastausta ja monilla aloilla vaativat lisätutkimukset tutkimukset ovat ei vielä arvioinut roolia sisäistäminen BCG virtsarakon syövän solut

in vivo

[27]. Tutkimuksemme avulla voimme oletuksen, että toiminnallinen mincle reseptorin neoplastisten urothelial solut voivat olla keskeinen rooli tunnustetaan ja sisäistäminen BCG. Ehdotamme näyttää vahvistavat viimeaikaiset raportit osoittavat, että ilmentyminen mincle edistää valvontaan

Mycobacterium bovis

BCG-infektio [34].

Jatkotutkimuksissa toivottavasti erittäin hyödyllistä tarjota oivalluksia rooli mincle reseptorin Uroteelisyöpäsolujen tuumorin vastaisessa immunoterapiassa. Tässä yhteydessä mincle reseptori voidaan tutkia perusteellisesti luonnossa esiintyvä naudan urothelial kasvaimia ja karja voi toimia luonnollisena eläinmallissa. On osoitettu, että on korkea sekvenssin identiteetti ihmisen ja naudan muoto mincle ja ne ovat vuorovaikutuksessa ligandien hyvin samalla tavalla [35].

tukeminen Information

S1 Kuva. S1 sekvensointi jälkeen kloonauksen Mincle peräisin heathy näytteistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0141624.s001

(PDF)

S2 kuviossa. S2 sekvensointi jälkeen kloonauksen Mincle patologisten näytteistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0141624.s002

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme Prof. A. Venuti , Istituto dei Tumori ”Regina Elena”, Roma, joka antaa BPV-2 DNA-plasmidi; Prof. A. A. Alfieri, Laboratory Animal Virologian osasto Veterinary Preventive Medicine, Universidade Estadual de Londrina, Brasilia tarjoamiseksi BPV-13 DNA-kätkeminen näytteet ja tri G. Salvatore, Regione Basilicata, ja tri F. Luposella heidän teknistä apua.