Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleita hoitoon ihmisen paksusuolen syövän kemoterapia tehoa vastaan ​​paksusuolen syöpä on edelleen epätyydyttävä. Esillä olevassa tutkimuksessa, vaikutukset samanaikainen eston epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja DNA-metyylitransferaasi tutkittiin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Olemme osoittaneet, että decitabine (DNA metyylitransferaasi inhibiittori) synergized gefitinibin kanssa (EGFR estäjä) vähentää solujen elinkykyä ja pesäkkeiden muodostumista SW1116 ja LOVO soluja. Kuitenkin näiden kahden yhdistelmä yhdisteiden näkyy minimaalinen toksisuus NCM460 solujen normaalin ihmisen koolonin limakalvon epiteelisolujen linja. Yhdistelmä oli myös tehokkaampi inhiboimaan AKT /mTOR /S6-kinaasi kautta. Lisäksi yhdistelmä decitabine gefitinibin kanssa inhiboivat merkittävästi paksusuolensyöpä solujen vaeltamiseen. Lisäksi gefitinibi synergistisesti decitabine aiheuttaman sytotoksisuuden johtui ensisijaisesti apoptoosin kuten on esitetty anneksiini V merkintöjä, jotka lievitti z-VAD-fmk pannulla kaspaasiestäjä. Samanaikaisesti apoptoosia johtuvat yhteistyössä hoitoon gefitinibin ja decitabine seurasi induktion BAX, pilkkoa kaspaasi 3 ja halkaistut PARP yhdessä vähentäminen Bcl-2 verrattuna hoitoon joko lääkkeellä yksin. Mielenkiintoista on, että yhdistetty hoito näillä kahdella lääkkeellä lisääntynyt ilmentyminen XIAP liittyvän tekijän 1 (XAF1), joka on tärkeä rooli solujen apoptoosin. Lisäksi pieni häiritsevä RNA (siRNA) ehtymisen XAF1 vaimensi merkittävästi koolonkarsinoomasoluissa indusoiman apoptoosin yhdistelmä kahta lääkettä. Meidän havainnot ehdotti, että gefitinibi yhdistettynä decitabine kohdistuvan tehostetun solun apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa osallistui mitokondrioiden välittämän reitin ja induktio XAF1 ilmaisua. Lopuksi perustuu havaintoihin Tutkimuksessamme ehdotimme, että yhdistetty anto näiden kahden lääkkeen voidaan pitää uutena terapeuttinen hoito hoitamiseksi paksusuolensyöpä.

Citation: Lou Yf, Zou Zz, Chen Pj Huang Gb, Li B, Zheng Dq, et ai. (2014) yhdistelmä Gefitinibin ja DNA Metylointi Inhibitor desitabiinista Kiinnostavuus Tehostemateriaalit syövän vastaista aktiivisuutta in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10,1371 /journal.pone.0097719

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2014; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2014; Julkaistu: toukokuu 29, 2014

Copyright: © 2014 Lou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Etelä-Kiinan Normal University Science Fund for Young Scholars (Grant nro 13KJ19 Zheng zhi Zou), Bureau of Dongguan kaupungin tieteen ja teknologian 2010 kärkihanke Fund (Grant nro 201028 Xiao-yong Luo). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yksi yleisimmin esiintyviä kasvaimia ja merkittävä syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, mikä korostaa, että tarvitaan tehokkaita keinoja estää ja hoitaa tämän maligniteetti. Hoitoja saatavilla hoitoon paksusuolen syöpä ovat leikkaus, sädehoito, kemoterapia, immunomodulatorisen hoidon, ja molekulaarisesti kohdennettuja hoitoja, kuten anti-verisuonen endoteelin kasvutekijän reseptori (VEGFR) ja anti-epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) hoito [1], [ ,,,0],2]. Näistä molekyylirakennetta kohdistettuja hoitoja, EGFR-täsmähoitoihin yhtenä tärkeitä kliinisiä strategioita on yhä laajalti käytössä metastasoituneen paksusuolen syöpä [3].

EGFR on transmembraaninen glykoproteiini, jossa on solunulkoinen EGF sitovan domeenin ja solunsisäisen alueen, joka sisältää tyrosiinikinaasidomeeniin, että säätelee signalointireittien ohjata solujen proliferaatiota, erilaistumista, huumeiden ja säteilyn herkkyys, ja angiogeneesi [4]. Expression of korkea EGFR on löydetty erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen syöpä, mahalaukun syöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä, ja okasolusyöpä sekä pään ja kaulan [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Yli-ilmentymisen ja konstitutiivisen aktivaation EGFR on liitetty huonoon ennusteeseen paksusuolen syövän potilaille. Koska aktivointi EGFR korreloi paksusuolen syövän etenemisessä, EGFR on joutunut syöpälääke kehitystyötä. Nämä strategiat kohdistaminen EGFR kuuluu käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, kuten setuksimabi, ja pieni molekyyli tyrosiinikinaasiestäjät (TKI), kuten gefitinibi ja erlotinibi. Gefitinibi on synteettinen anilinokinatsoliiniyhdisteiden ja oraalisesti vaikuttava selektiivinen EGFR-TKI joka estää signaalinvälitysreitin mukana leviämisen ja selviytymisen syöpäsoluja. Kliinisessä ympäristössä, gefitinibi hoitoon on hyväksytty erityyppisten syöpien, kuten paksusuolen syöpä [11]. Kuitenkin kehittyvien kliininen kokemus on tuottanut pettymyksen paljastanut, että vaikka gefitinibi osoittavat joitakin antituumorivaikutus paksusuolen syöpä, on korkeatasoinen

de novo

vastustuskykyä tällaista hoitoa [12]. Siksi pyrkimykset ovat käynnissä kehittämiseksi anti-paksusuolen syövän hoito, joka yhdistäisi gefitinibi muiden lääkkeiden kanssa.

Epigeneettiset muutoksia, lähinnä DNA metylaatio ja histonien asetylointi, ovat nyt tunnustettu tärkein mekanismeja, jotka auttavat kasvain pahanlaatuinen fenotyypit [13]. Tämän seurauksena useita lääkkeitä, jotka vaikuttavat epigeneettisellä reittejä on hyväksytty syövän hoitoon ja tällä hetkellä kliinisissä kokeissa [14], [15]. Huomattavaa on, että palautuvuus epigeneettiset muutokset by pienimolekyylisiä estäjiä tarkoittaa, että armottoman vaikutukset olisi minimaalinen ja palautuvia hoidon päätyttyä. Äskettäin DNA metyylitransferaasin inhibiittorit ovat aiempaa kliinisesti edennyt pitkälle kuin inhibiittorit histonideasetylaasien tai histoni metyylitransferaasit, joilla testattu laajasti vaiheen I-III kliinisissä tutkimuksissa [16]. Archetypal DNA metyylitransferaasi inhibiittori decitabine (eli 5-atsa-2′-deoksisytidiini), joka on deoksiriboosin analoginen 5-atsasytidiini, käytetään tällä hetkellä hoidetaan myelodysplastinen oireyhtymä (MDS), ja on tutkittavana hoitoon akuutti myelooinen leukemia (AML) ja muut kiinteät syöpää [17], [18]. Lisäksi decitabine ja suberanilohydroxamic happoa (SAHA, histonideasetylaasi- estäjä) yhteistyössä herkistää koolonkarsinoomasoluissa Fas ligandin indusoiman apoptoosin [19].

Tällä hetkellä suuria ponnisteluja on tehty kehittää joitakin syöpähoitoihin perustuvat pienet molekyylit, jotka on kohdistettu erityisesti DNA demetyloivan proteiinin tai EGFR, kun taas, ei paljon tietoa saatavilla yhdessä vaikutukset EGFR: n estäjien ja demetyloimalla aineina paksusuolensyöpä. Aiemmat tutkimukset osoittivat gefitinibi voi hillitä kemoterapian resistenssin estämällä transmembraaninen kuljettajat ABC perhe, mukaan lukien P-glykoproteiinin (P-gp), usealle lääkkeelle resistenssiä proteiini 1 (MRP1) ja rintasyöpä resistance protein (BCRP) [20]. Perustuen näissä tiloissa, päätimme selvittää, onko yhdistelmä gefitinibin ja decitabine on synergistinen aktiivisuus koolonkarsinoomasoluissa.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme edellyttäen prekliiniset tiedot, jotka osoittivat yhdistelmä gefitinibin ja decitabine oli synergistinen estämällä solujen lisääntymisen, migraation ja aiheuttamaan apoptoosin viljellyissä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Lisäksi olemme toimittaneet todisteita siitä, että gefitinibi yhdistettynä decitabine säädellä solujen apoptoosin osallistui mitokondrioiden välittämän reitin ja induktio XAF1 ilmaisua. Yhdessä nämä kertyvät tiedot voidaan ohjata kehittämään uusia paksusuolen syövän hoitomuotoja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, reagenssit ja huumeet Hoito

paksusuolen syövän solulinjat SW1116 ja LOVO saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä kasvatettiin DMEM-alustassa (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. Soluja kasvatettiin yksikerroksisessa ja siirrostettiin rutiininomaisesti 2-3 kertaa viikossa. decitabine ja gefitinibin ostettiin Selleck Chemicals LLC (Houston TX, USA). MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi], dimetyylisulfoksidi (DMSO), z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (z-VAD-fmk), necrostatin-1 , necrostatin-5 hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Huumeiden hoitoon, desitabiini, gefitinibi, z-VAD-fmk, necrostatin-1, ja necrostatin-5 liuotettiin DMSO vastaavasti, alikvootit säilytettiin -80 ° C: ssa. Kantaliuokset laimennettiin haluttuun lopulliset pitoisuudet kanssa kasvualustaan ​​juuri ennen käyttöä. Ennen lääkkeet hoitoon, soluja inkuboitiin vähintään 12 tunnin ja sen jälkeen korvataan median sisältävien lääkkeiden; DMSO-käsitellyt solut käytettiin mock ohjaus.

elinkykyyn, klonogeeninen Cell Survival ja apoptoosi Analyysit

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen standardia MTT-määritystä. Lyhyesti, solut maljattiin tiheydellä 0,5-1 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 12 tunnin ajan 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa ennen hoitoa alttiina huumeita. Media poistettiin sitten ja soluja käsiteltiin decitabine ja /tai gefitinibi. Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 48 h, 100 ui MTT ratkaisuja (2 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboitiin vielä 4 h 37 ° C: ssa. Muodostuneet formatsaanikiteet liuotettiin DMSO: hon (200 ui per kuoppa) jatkuvasti ravistellen 5 min. Liuoksen absorbanssi mitattiin sitten käyttäen Micro-levyn Reader (Bio-Rad, Hercules, CA) aallonpituudella 495 nm. Tämä määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

klonogeenisten solujen eloonjääminen kokeissa, kiinnittyneet solut samasta 10 cm: n viljelymaljalle, joka trypsinoitiin 1 ml trypsiini-EDTA: a (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) ja inaktivoitu median, joka sisälsi 10% FBS. Solut laskettiin hemosytometrillä ja alhaisella tiheydellä (1000 kuoppaa kohti kuudessa kuoppalevyllä). 24 tunnin kuluttua, lääkkeet lisättiin osoitettu pitoisuus 24 tuntia. Sen jälkeen, kun lääkkeet poisto, solujen annettiin lisääntyä kostutetussa 5% CO

2, 37 ° C: ssa ympäristön 15 päivä tuoreeseen elatusaineeseen. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin 0,005% kristallivioletilla (sigma, St. Louis, MO, USA) analyysi klonogeenisten solujen eloonjääminen kuten aiemmin on kuvattu [21]. Pesäkkeitä muodostavat yksiköt, joissa on enemmän kuin 100-solut laskettiin valomikroskoopilla.

Measurement apoptoosin suoritettiin anneksiini V-FITC: tä (fluoreseiini-isotiosyanaatti) /PI (propidiumjodidia) analyysi kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, solut siirrostettiin ja käsitelty lääkkeillä 48 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja 1 x 10

6-solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan 1 x anneksiini V: n sitoutumisen puskuria. Solut, joille apoptoottisen solukuoleman analysoitiin laskemalla solut värjättiin positiivisia anneksiini V-FITC ja negatiivinen PI, ja myöhäisessä vaiheessa apoptoosin kuten anneksiini V-FITC ja PI positiivinen käyttämällä FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA , USA).

Combination Index

yhdistelmä hoitoon decitabine ja gefitinibin, MTT-määritystä data muunnettiin osa kasvusta vaikuttaa yksittäisten lääkkeen tai yhdistelmän käsitellyt solut verrattuna käsittelemättömiin soluihin ja analysoitiin käyttämällä CalcuSyn- ohjelmistoa (Biosoft, Ferguson, MO, USA) onko yhdistelmä oli synergistinen. Tämä ohjelma perustuu Chou-Talalay yhtälö [23], joka laskee yhdistelmän indeksi (CI). Yleinen yhtälö klassinen isobologram- saadaan: CI = (D)

1 /(Dx)

1+ (D)

2 /(Dx)

2. Jos Dx osoittaa annos yhtä yhdistettä yksinään tarvitaan tuottamaan vaikutus, (D)

1 ja (D)

2 ovat annoksia yhdisteiden 1 ja 2, vastaavasti, tarvitaan tuottamaan sama vaikutus yhdistelmänä. Tästä analyysistä, yhdistetyt vaikutukset kahden yhdisteet voidaan tiivistää seuraavasti: CI 1, CI = 1, CI 1 osoittavat synergistisiä, lisäaine ja antagonistisia vaikutuksia, vastaavasti.

Western Blot analyysi

Solut lyysattiin jäillä 30 minuuttia lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% deoksikoolihappoa, 0,02% natriumatsidia, 1% NP-40, 2,0 mg /ml aprotiniinia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi). Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin väriaineen menetelmällä. Yhtä suuret määrät (30-60 ug) solu-uutetta tehtiin elektroforeesi 6-12,5% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidi (SDS-PAGE) ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Darmstadt, Saksa) vasta-blottauksella. Membraanit blokattiin ja inkuboitiin sitten p-mTOR (Ser2448), mTOR, AKT1, p-AKT (Ser473), p-S6K, S6K, BAX, Bcl-2, pilkottiin kaspaasi 3 (Asp175), lohkaistaan ​​PARP (Asp214) ja Actin vasta (kaikki Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA). Ja XAF1, XIAP vasta ostettiin Abcam (Cambridge, U. K). Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Protein Tech Group, Chicago, IL), huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Detection suoritettiin ECL Kit (GE Healthcare, Munich, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden.

kaspaasiaktiivisuus määritys

fluorometrinen määrityksissä kaspaasiaktiivisuus suoritettiin käyttäen substraattia Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA), kaspaasi 3 ja Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) ja kaspaasi 8. Lyhyesti, solut hajotettiin hajotuspuskuria (10 mM HEPES, 142 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 0,2% NP-40 ja pH 7,2), 10 mM DTT: tä. Inkuboinnin jälkeen 30 minuuttia jäillä, näytteet sentrifugoitiin 12000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja proteiinipitoisuus supernatanteista määritettiin Bradfordin väriaineen menetelmällä. Alikvootit 10 mg /100 ml määritys tilavuus inkuboitiin 140 mM site-specific tetrapeptidi substraatteja Ac-DEVD-AMC kaspaasi 3 ja Ac-IETD-AMC kaspaasi 8 kaspaasi määrityspuskurissa (20 mM HEPES, 100 mM NaCl: a, 1 mM EDTA, 0,01% (paino /tilavuus) CHAPS, 10% (paino /tilavuus) sakkaroosia ja pH 7,2), 10 mM DTT: ssa 30 min. Vapautuminen fluorogeenisen ryhmän AMC määritettiin 37 ° C: ssa VersaFluor fluorometri (Bio-Rad, Hercules, CA), jossa eksitaatio 380 nm ja emissio 440 nm: ssä.

RNA Häiriöitä

sirna (siRNA) ja alas-säätelemiseksi XAF1 geenin ekspressio suoritettiin transfektoimalla RNA-oligonukleotidien kanssa lipofektamiinin 2000 (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi päivä ennen transfektiota, SW1116 ja LOVO-solut maljattiin 35 mm viljelymaljalle RPMI-1640 täydellistä alustaa. Sen jälkeen kun solut saavuttivat 50% -60% konfluenssiin, ne transfektoitiin siRNA aikaisemmin kuvatulla [24]. Lyhyesti, solut laitettiin 1 ml siRNA seosta, jossa on 100 nM siRNA ja 5 ui lipofektamiinia 2000. 8 tunnin kuluttua transfektion 1 ml RPMI-1640 täydellistä alustaa lisättiin, ja kokeet suoritettiin 48 h transfektion jälkeen. Proteiinitasot analysoitiin Western blot. Negatiivinen kontrolli (NC) siRNA ja siRNA vastaan ​​XAF1 syntetisoitiin Shanghai GenePharma Co. For XAF1: 5’AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 ’[25];

uutto Kokonais-RNA ja Reaaliaikainen kvantitatiivinen Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA valmistettiin kokonais-RNA käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita (Promega, Madison, USA) ja Omniscript RT-pakkausta (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Suhteellinen mRNA määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) käyttäen Eppendorf Realplex Mastercycler (Eppendorf, Hampuri, Saksa) ja Quantitect SYBR Green PCR-kittiä (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). XAF1 Alukesekvenssit olivat seuraavat: 5′-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 ’ja 5′-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3’ [26]. Actin (BioVision, Palo Alto, CA, USA) mRNA-tasot käytettiin normalisointi.

Tilastot

Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa ja esitettiin keskiarvona ± SD.

P

arvot laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä ja

P

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastollinen analyysi analysoitiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences (SPSS) (versio 16.0).

Tulokset

Tehostemateriaalit Antineoplastiset aiheuttamia vaikutuksia desitabiinista ja gefitinibin koolonkarsinoomasoluissa

määrittämiseksi yhdistelmän vaikutuksista hoitoon DNA metyylitransferaasi estäjän decitabine ja EGFR-inhibiittorin gefitinibin ihmisen paksusuolen kasvainten solujen elinkykyä, SW1116 [27] ja LOVO solujen [28] kuljettavat villityypin

EGFR

geeni altistettiin eri pitoisuuksilla decitabine tai gefitinibin yksin tai yhdessä enintään 48 tuntia, ja sen jälkeen määrittämällä solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A ja B, decitabine tai gefitinibi yksin aiheutti pitoisuudesta riippuva esto solujen elävyyden IC

50-arvot 24,2 uM (decitabine) ja 4,71 uM (gefitinibi) in SW1116-soluissa, ja IC

50-arvot 21,9 uM ( decitabine) ja 5,33 uM (gefitinibi) LoVo soluissa. Lisäksi Fig. 1A ja B osoittavat, että yhdistelmä decitabine ja gefitinibin oli voimakkaampi inhiboiva vaikutus solujen elinkelpoisuuteen SW1116 ja LOVO-solut kuin kumpikaan yhdiste yksin. Lisäksi Fig. 1A osoitti, että hoito SW1116 solujen kiinteät pitoisuudet decitabine laski IC

50-arvot gefitinibin välillä 4,71 uM (ilman decitabine) 1,25 uM (läsnäollessa 5 uM decitabine) ja 0,19 uM (vuonna läsnäolo 10gM decitabine). Samoin hoito Lövön solujen kiinteät pitoisuudet decitabine laski IC

50-arvot gefitinibin välillä 5,33 uM (ilman decitabine) 0,63 uM (läsnä 10 uM decitabine) ja 0,12 uM (läsnäollessa 20 uM decitabine) (Fig. 1 B).

(A) ja (B) SW1116 ja LOVO soluja viljeltiin ohjaus olosuhteissa (DMSO) tai kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet decitabine (DAC) ja gefitinibin (GEF), yksin tai yhdessä, 48 h, ja sitten arvioitiin kannattavuuden MTT: llä. Tulokset ovat keskiarvoja päällekkäisiä arviointien yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) ja (D) SW1116-soluissa ja LOVO solut maljattiin, käsiteltiin, ja käsitellään kuten A- ja B-annos-vastekäyrä kunkin lääkkeen määritettiin ja yhdistelmä (CI) arvot DAC /GEF pitoisuuden suhde (2,5 :1 in SW1116-soluissa, 02:01 LoVo soluja) lasketaan Chou-Talalayn -menetelmällä 48 tunnin aikapisteessä, jossa biologinen vaste on ilmaistu osa vaikuttaa solujen. Suorakulmio symboli ja Diamond symboli nimeämään CI arvon kullekin fraktion (vaikutus). CI 1, CI = 1, CI 1 osoittavat synergistisiä, lisäaine ja antagonistisia vaikutuksia, vastaavasti. Vaikutus vaihtelee 0 (ei estoa) ja 1 (täydellinen esto). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (E) vaikutus SW1116-soluissa ja LOVO solujen pesäkkeitä muodostavien solujen, kuten arvioitiin klonogeenisten määrityksessä. Varten pesäkkeitä muodostavien määrityksessä klonogeenisten määritys tehtiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Pylväät, kolmen määrityksen keskiarvo; baareja, SD. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. **,

P

0,01, ***,

P

0,001, verrattuna DAC käsiteltyjä soluja. ##,

P

0,01, ###,

P

0,001, verrattuna GEF käsiteltyjä soluja.

Nämä tiedot osoittivat, että kaksi yhdistettä, decitabine ja gefitinibi saattaa synergize estävän solujen elävyys paksusuolen syöpäsoluissa. Vahvistaa tämän synergian, käsittelimme solut kahden yhdistelmä aineiden vakiosuhteessa toisiinsa ja käyttää CalcuSyn ohjelmisto laskea yhdistelmä-indeksi (CI) seuraavat Chou ja Talalay menetelmällä, kuten on kuvattu alla Menetelmät. Kuva. 1C ja D paljasti huomattavan välistä synergiaa aineet (CI 1) in SW1116 ja LOVO soluja. Lisäksi mukaan klonogeeniset solujen eloonjäämisen määritys, huomasimme, että decitabine ja gefitinibin aiheutti synergiavaikutukset estävän klonogeeniset aktiivisuutta SW1116 ja LOVO soluja (Kuva. 1 E). Lisäksi muutaman solun elossa decitabine plus gefitinibin syntyy pesäkkeet, jotka olivat paljon pienempiä kuin ne, jotka syntyvät solujen elossa joko näiden aineiden yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Erityisesti, kun sitä käytetään yhdessä, hoitoon NCM460 solujen normaalin ihmisen koolonin limakalvon epiteelisolujen linja, jossa decitabine ja gefitinibin osoittivat vaikutus on suurempi kuin silloin, kun kukin yhdiste oli käyttää yksittäin, mutta vaikutukset olivat vähemmän kuin lisäaineen viittaa antagonismi (Fig. S1A ja B ). Lisäksi yhdistelmä alhaisen pitoisuuden decitabine (2,5 uM) ja gefitinibin (1 uM LOVO soluja ja 0,5 uM SW1116-soluissa) tehokkaasti kumottiin soluvaelluksen synergisesti (Fig. S2A). Samalla olemme havainneet solujen elävyys paksusuolen syövän soluja käsiteltiin käyttäen kahta ainetta yksin tai yhdistelmänä (Fig. S2B), ja todettiin, että yhdistelmä alhaisen pitoisuuden decitabine ja gefitinibin ei merkittävästi vähentää solujen elinkykyä. Nämä tulokset osoittivat, että vähennys solujen muuttoliikkeen aiheuttama kahta lääkettä ei ollut mukana estoon solujen elinkelpoisuuden.

desitabiinista ja Gefitinibi yhdistelmähoito on tehokkaampi estämään AKT ja mTOR signaalireaktioteissä koolonkarsinoomasoluissa

desitabiinista ja gefitinibin estivät merkittävästi kasvua kahden paksusuolen syöpäsoluissa verrattuna hoitoon joko aineella yksinään. Koska AKT ja mTOR signalointireitteihin olla kriittinen rooli solujen kasvuun ja solujen apoptoosin, määritimme vaikutuksia decitabine ja gefitinibin aktivoinnista näistä reiteistä. Laskimme CI-arvojen edelleen löytää, että yhdistelmä 10gM decitabine 5 uM gefitinibin SW1116-soluissa tai 4 uM gefitinibin LOVO soluissa oli tehokkain. SW1116 ja LOVO soluja käsiteltiin decitabine ja gefitinibin joko yksinään tai yhdistelmänä. 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin Western blot kuten kohdassa menetelmiä. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja B, decitabine (10 uM) ei voi johtaa merkittäviin muutoksiin AKT tai mTOR aktiivisuutta, joka arvioidaan Western blot fosforylaatioon AKT, mTOR ja S6K. Lisäksi havaitsimme minimaalinen vähennyksiä fosforylaation AKT, mTOR ja S6K 5 uM gefitinibin SW1116 ja 4 uM LoVo soluissa. Kuitenkin näiden kahden yhdistelmä huumeiden kumosi kokonaan AKT ja mTOR toimintaa SW1116 ja LOVO soluja (Fig. 2A ja B).

(A) ja (B) SW1116 ja LOVO solut maljattiin, hoidettiin 48 h decitabine (DAC) ja gefitinibin (GEF) joko yksinään tai yhdistelmänä, ja ekspressiotasot AKT, mTOR, S6K, ja fosforylaatio määritettiin Western blot-analyysi kuten kohdassa menetelmät. Expression of β-aktiini toimi latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

desitabiinista parantaa synergisesti Gefitinibi aiheuttama apoptoosi koolonkarsinoomasoluissa

Voit selvittää sytotoksisia vaikutuksia gefitinibin yhdistettynä decitabine johtuivat induktion apoptoosin, SW1116 ja LOVO soluja käsiteltiin kahta yhdistettä, yksin tai yhdistelmänä, 48 h ja sen jälkeen solun apoptoosi määritettiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) värjäystä ja virtaussytometria-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 3A ja C, käsittely gefitinibin (2 uM tai 5 uM) tai decitabine (10 uM) yksin oli heikko vaikutus apoptoosin SW1116-soluissa. Oli kuitenkin merkittävästi korkeampi apoptoosin hinnan löytyi käsittelemällä yhdistelmä gefitinibin ja decitabine (Fig. 3A ja C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin LOVO-solut (Fig. 3B ja C). Lisäksi apoptoosia mitattiin havaitsemalla Saharan G1 väestölle PI värjäys ja virtaussytometria analyysejä. Kuten on esitetty kuviossa. S3, osa-G1 väestön prosenttiosuudet aiheuttama hoitoja näiden kahden lääkkeen yhdistelmällä oli suurempi kuin aiheuttama lääkkeet erikseen.

(A) ja (B) SW1116 ja LOVO soluja viljeltiin ohjaus olosuhteissa ( DMSO) tai kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet decitabine (DAC) ja gefitinibin (GEF), yksin tai yhdistelmänä, 48 tuntia. Ja sitten solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tämä koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja edustavat kaaviot anneksiini V-FITC määrityksissä on esitetty. (C) Kvantitatiivinen mittaus anneksiini V-FITC virtaussytometrialla analyysit osoittivat positiivisia apoptoottisia soluja vasteena DAC ja GEF, yksin tai yhdistelmänä. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. **,

P

0,01, ***,

P

0,001, verrattuna DAC käsiteltyjä soluja. ##,

P

0,01, ###,

P

0,001, verrattuna GEF käsiteltyjä soluja. (D) ja (E) SW1116 ja LOVO-solut esikäsiteltiin 10 uM z-VAD-fmk (zVAD) tai 20 uM necrostatin-1 (Nec1) tai necrostatin-5 (Nec5) 1 h ja sen jälkeen käsittelemällä osoitetut pitoisuudet DAC ja GEF, yksin tai yhdistelmänä, ja vielä 48 tuntia. Ja sitten apoptoottisia soluja määritettiin anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen ja virtaussytometria-analyysi. Tämä koe toistettiin kolmasti. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. **,

P

0,01.

onko vai ei gefitinibille plus decitabine aiheutti kaspaasi cascade, pannulla kaspaasiestäjä z-VAD-fmk (10 uM) käytettiin esikäsitellä SW1116 tai LOVO soluja ennen hoitoa gefitinibin plus decitabine. Kuten on esitetty kuviossa. 3D ja E, z-VAD-fmk voisi huomattavasti rajoittaa solun indusoiman apoptoosin gefitinibille plus decitabine. Kuitenkin, solun apoptoosin laukaisi kahden yhdisteen yhdistelmänä ei voitu estää necrostatin-1 tai necrostatin-5, uusi luokka tehokkaita pienimolekyylisiä estäjiä solunekroosin. Nämä tulokset paljastivat, että apoptoottisen reitin oli mukana solukuoleman aiheuttama gefitinibille yhdistettynä decitabine, paksusuolen syöpäsoluissa.

desitabiinista ja Gefitinibi Yhdistelmähoito muuttaa ekspressiotasot Apoptotic Regulatory tekijät koolonkarsinoomasoluissa

koska apoptoosin on tiukasti säännelty pro- ja antiapoptoottisten jäsenet Bcl-2-proteiinin perheen proapoptoottiset tekijät BAX, BID ja BIM sekä antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-XL tutkittiin SW1116 ja LOVO solut hoidon jälkeen decitabine tai gefitinibin tai niiden yhdistelmän Western blot-analyysi. SW1116 ja LOVO solujen vastaaminen decitabine plus gefitinibin ilmenee lisääntynyttä määriä proapoptoottiset BAX sekä merkittävä vähentäminen tasot anti-apoptoottinen proteiini Bcl-2 (Fig. 4A ja B). Kuitenkin, nämä kaksi yhdistettä yhdessä ei vaikuta ekspressiotasoja muiden jäsenten Bcl-2-proteiinin perheen, mukaan lukien proapoptoottiset proteiinit BID ja BIM sekä antiapoptoottisten proteiinien Bcl-XL (tuloksia ei ole esitetty).

SW1116 ja LOVO solut maljattiin, hoidettiin 48 (DAC) ja gefitinibin (GEF) joko yksinään tai yhdistelmänä. (A) ja (B) ekspressiotasot pilkottiin kaspaasi 3, pilkotaan-PARP, XAF1, XIAP, BAX, Bcl-2 määritettiin Western blot -analyysillä, kuten on kuvattu alla Menetelmät. Expression of β-aktiini toimi latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) ja (D) Kaspaasi 3: n aktiivisuuden määrä määritettiin, kuten on kuvattu alla menetelmien. Tämä koe toistettiin kolmasti. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. (E) ja (F) Kaspaasi 8 aktiivisuus kvantitoitiin kuten kohdassa menetelmät. Tämä koe toistettiin kolmasti. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***

P

0,001.

Inhibitor apoptoosin proteiinin (IAP) on proteiini, perheen toimii inhiboimalla kaspaasiaktiivisuus. X-linked IAP (XIAP), jäsen IAP, ja XIAP liittyvä tekijä 1 (XAF1) tutkittiin koolonkarsinoomasoluissa stimuloidaan decitabine yhdessä gefitinibin. Kuva. 4A ja B osoittavat ettei muutoksia XIAP proteiinin tasot löydettiin SW1116 ja LOVO solut käsiteltiin decitabine ja gefitinibin yksin tai yhdessä. Erityisesti yhdistettynä hoito molempien lääkkeiden huomattavasti lisääntynyt ilmentyminen XAF1 verrattuna yhden aineella (Fig. 4A ja B).

kyvyn testaamiseksi gefitinibin yhdistettynä decitabine aktivoida caspases, halkaistut kaspaasi 3 ja halkaistut PARP tutkittiin SW1116 ja LOVO solujen hoidon jälkeen gefitinibin tai decitabine tai niiden yhdistelmän Western blot-analyysi. Merkittävä lisäys määrien sekä pilkkoa kaspaasi 3 ja halkaistut PARP havaittiin koolonkarsinoomasoluissa käsiteltiin kahta lääkettä samanaikaisesti verrattuna hoitoon yksittäisinä aineina (Fig. 4A ja B). Lisäksi paksusuolen syövän soluja käsiteltiin kahden yhdisteen analysoitiin kaspaasi 3 ja kaspaasi 8 toimintaa fluorogeenisen substraatin pilkkominen. Kuten on esitetty kuviossa. 4C ja D, paksusuolen syövän soluja käsiteltiin kahden yhdisteen yhdistelmänä osoittivat merkittävää kasvua kaspaasi 3: n aktiivisuuden. Lisäksi decitabine plus gefitinibi kohdistama aikariippuvainen kaspaasi 3 toimintaa inductions päälle SW1116 ja LOVO soluja (Fig. 4C ja D). Sen sijaan, mitään muutoksia ei havaittu kaspaasi 8 toimintaan (Fig. 4E ja F).

XAF1 on kriittinen rooli Cellular Apoptoosi laukaisema desitabiinista Yhdistettynä Gefitinibi

Tulokset yllä osoitettu että decitabine yhdistettynä gefitinibin lisäsi XAF1 tasot SW1116 ja LOVO soluja. Sitten kysytään kahta lääkettä samanaikaisesti voi lisätä XAF1 mRNA tasot koolonkarsinoomasoluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A ja B, XAF1 mRNA nosti merkittävästi decitabine plus gefitinibi. Lisäksi paksusuolen syövän soluja käsiteltiin kahden lääkeaineen yhdistelmänä eri aikavälein. Osoitimme, että XAF1 proteiini ja mRNA kohoamiseen decitabine plus gefitinibin ajasta riippuva tavalla (Kuva. 5C, D, E ja F).

(A) ja (B) SW1116 ja LOVO soluja hoidettiin 48 h: n konsentraatiot decitabine (DAC) ja gefitinibin (GEF) joko yksinään tai yhdistelmänä. MRNA ekspressiotasot XAF1 määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. Expression of β-aktiini toimi kontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. **,

P

0,01; **,

P

0,001. (C) ja (D) SW1116 ja LOVO soluja käsiteltiin osoitetun aikavälein osoitetuilla pitoisuuksilla DAC ja GEF yhdistelmänä. Ilmentymistasojen XAF1 määritettiin Western blot -analyysillä, kuten on kuvattu alla menetelmien. Expression of β-aktiini toimi latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. baareja, SD. baareja, SD. Kuten on esitetty kuviossa. baareja, SD.