Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cellular heterogeenisuus on olennainen osa syövän kehittymisen ja etenemisen. Progression voi liittyä syntymisen soluja, jotka osoittavat suurta fenotyyppisen plastisuus (mukaan lukien ”de-eriyttäminen” on primitiivinen kehitykseen valtiot), ja aggressiivinen käyttäytymiseen liittyvien ominaisuuksien (kuten korkea tuumorigeenisia potentiaalit). Havaitsimme, että monet biomarkkerit, joita käytetään tunnistamaan syövän kantasolut (CSC) voi merkitä solualaryhmiä pitkälle edenneessä kliinisessä vaiheessa keuhkosyöpään (pahanlaatuinen Pleuraeffuusiot tai MPE). Siten CSC-biomarkkerit voi olla hyödyllinen live lajitteluun toiminnallisesti erillisiä solualaryhmiä yksittäisten kasvainten, jotka saattavat auttaa tutkijoita hioa ja molekyylitason perustan toiminnallisen heterogeenisyys. Osoitamme, että CD44

hi (CD44-korkea) syöpäsolun alaryhmiä näyttää korkeampi klonaalinen, pesäkkeitä muodostavien potentiaali kuin CD44

lo soluja (n = 3) ja ovat myös tuumorigeenisia (n = 2/2), kun istutetaan hiiren ksenograftimallissa. CD44

hi subsets ilmaista eri alkioon (de-erilaistuminen) ilmaisimia tai kromatiinin sääntelyviranomaisten. Vuonna arkistoidut keuhkosyöpä kudoksia, ALDH markkereita kolokalisoituvat enemmän CD44 kaupungista levyepiteelisyövän (n = 5/7) kuin Adeno karsinooma (n = 1/12). MPE syöpäsolujen ja keuhkosyövän solulinjaa (NCI-H-2122) näytteille kromosomipoikkeavuuksien ja 1p36 poisto (n = 3/3). Koska miR-34a jäljittelee oikean 1p36 deleetiokohta, alhainen miR-34a ekspressiotasot havaittiin näissä soluissa. Pesäkkeitä muodostava tehokkuus CD44

hi soluja, ominaispiirre CSC, voidaan estää mir-34a korvaaminen näissä näytteissä. Lisäksi erittäin tuumorigeenisen CD44

hi-solut rikastetaan solut G2-vaiheen solusyklin.

Citation: Basak SK, Veena MS, Oh S, Lai C, Vangala S, Elashoff D, et al. (2013) CD44

korkea Kasvaimia synnyttävä osajoukot Lung Cancer Biospecimens rikastetaan Low miR-34a Expression. PLoS ONE 8 (9): e73195. doi: 10,1371 /journal.pone.0073195

Editor: Mauricio Rojas, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 toukokuu 2013; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2013; Julkaistu: 03 syyskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Sisätautien, UCLA ja Robert W. Green, pään ja kaulan alueen kirurginen Oncology Program UCLA. Avustukset varat käytettiin reagenssien ja palkan tukea tutkijoiden mukana tutkimuksessa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruun ja analysoinnin.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvain heterogeenisyys voi olla tunnettu ero ilmentyminen solun pinnan markkereita, geneettiset ja epigeneettiset eroja, ja /tai eroja keskeisissä molekyylejä tai efektoreita solujen toimintaa. Cellular heterogeenisuus voidaan luonnehtia erot funktionaalinen (käyttäytymisen) ominaisuuksia solujen (kyky muodostaa klooneja, pesäkkeiden muodostumisen kyky pehmeässä agarissa, kasvaimen kehittymisen jne.). Kun monet tutkimukset ovat päättäneet liittää solunpintamarkkereiden kasvainsoluissa osoitteessa primaarikasvaimen sivusto CSC-käyttäytymiseen liittyvien ominaisuuksien, havaitsimme, että kliinisesti vaiheissa ovat erityisen rikastetaan solualaryhmiä laakeri CSC-biomarkkerit. Niinpä oletetaan, että pitkälle edennyt tauti ei kielletä (ja voi olla edullinen) liittämiseksi tiettyjä biomarkkereita funktionaalisilla fenotyyppejä. Niinpä lähestymistapamme biologinen löytö korostaa suunnittelemalla asianmukaiset toiminnalliset biotestimenetelmiä luonnehtia sekä solu- ja fenotyyppien molekyylibiologia taustalla kasvain aloittamista sekä syövän etenemiseen.

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus sekä miehillä naisia; jossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 80-85% tapauksista [1]. Ymmärtämisessä biologian taustalla korkea kuolleisuus, olemme valinneet edennyt pitkälle tauti malli (MPE). Keuhkosyöpä potilailla, joilla MPE on huomattavasti korkeampi kuolleisuus kuin ilman MPE, tai ne, jotka ovat sytologisesti negatiivisia effusions [2] – [4]. Siten MPE-kasvain taakka on täynnä biologisia ominaisuuksia, jotka vähentävät selviytymisen syöpäpotilailla. Tärkeää on, että suurin sallittu virhe suurin kasvain väestö koostuu heterogeeninen osapopulaatioiden [5]. Osittain tämä heterogeenisuus voidaan luonnehtia biomarkkerit liittyvät tyypillisesti piirteitä CSC (CD44, ALDH, cMET, CD166, MDR-1, uPAR, PTEN, OCT-4, BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2).

objektiivisesti tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, voisimme tunnistaa kasvainsolu osajoukko että ovat aiempaa toimivalta kasvaimen leviämistä ja ylläpito, ja aloittamaan luonnehtia molekyylitason perustan näiden ominaisuuksien. Ensin tutkittiin CD44 selektiomerkitsijänä soluille ennustetaan olevan korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa koska se on aikaisemmin määritellyt CSC eri epiteelin syövät, kuten rinta- [6], pään ja kaulan, [7], [8], haiman [9], [10], ja eturauhasen pahanlaatuisia kasvaimia [11] – [15]. CD44 ilmentyy erittäin eri keuhkosyövän alatyyppejä, [16], ja sen ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen potilailla, [17]. Viimeaikaiset tutkimukset NSCLC solulinjoissa luonnehtia myös CD44

hi solujen CSC [16].

MPE-primääriviljelmissä sisältävät solujen alapopulaation että korkeasti ilmentää CD44 (CD44

hi). Kun nämä solut lajiteltuna MPE-ensisijainen kulttuureissa niillä korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa, kuten siirteen kasvaimia NOD /SCID IL2γR

null hiiret rajoittamisessa laimennosten solutransplantaattien. Nämä ominaisuudet ovat tyypillisiä CSC. Fraktioita CD44

hi solut liittyy kohonnut ilmaus toisen CSC-markkeri liittyy xenobiotic aineenvaihduntaan, ALDH. CD44

hi /ALDH

hi fenotyyppi näkyy sekä levyepiteelisyöpä (SCC) ja adenokarsinooma (AC) keuhkojen, mikä viittaa siihen, että samanlaisia ​​markkeri profiilit voi merkitä behaviorally aggressiivisia (erittäin tuumorigeenisia) solufraktiois- poikki eri ” suvusta ”(histopatologiset alalajit) keuhkosyövässä [18].

MPE kasvaimet yleisesti näyttää hyperploidy ja kromosomipoikkeavuuksien. FISH-analyysi havaitsi samoja erityispiirteitä poikkeavuus 1p36 alueella, mikä viittaa siihen, että tämä alue voi olla tärkeä rooli edistämisessä aggressiivinen käyttäytymiseen ominaisuuksia. 1p36 alue on aikaisemmin tunnistettu sisältävän lokuksen joka koodaa tuumorisuppressorigeeni microRNA (miR-34a). Menetys miR-34a ilmentyminen on osallisena syövän etenemisessä [15], [19]; Tämän tutkimuksen lisää, että todisteita. Erittäin tuumorigeenistä CD44

hi-solut ilmentävät matalan miR-34a, ja miR-34a korvaaminen estää pesäkkeiden muodostumista CD44

hi solujen pehmeässä agarissa. Solusyklin analyysi CD44

hi soluista osoitti, että nämä erittäin tuumorigeenisiä soluja oleskella G2 vaiheessa solusyklin.

Materiaalit ja menetelmät

Pahanlaatuinen pleuraeffuusio (MPE) Collection, Processing ja Cell Culture

Kaikki koehenkilöt tutkimuksessa kävi kirjallinen suostumus menetelmällä hyväksymä Institutional Review board (IRB) klo Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS) ja hyväksyi tutkimuksen IRB -VAGLAHS. MPE yksilöt (M-1, M-2 ja M-3) kerättiin potilailta Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Soluja viljellään, kun läsnä on 20-30% MPE (ensisijainen elatusaineesta tai PCM) kuten aiemmin on kuvattu [5]. (Tukeminen Information S1 ja S2).

Ohjaus Pysyvät solulinjat

Kaksi vakiintuneet solulinjat GM 05399 (normaali fibroblasti) ja H2122 (keuhkosyöpä) käytettiin tutkimuksessa. Fibroblastisolulinjassa GM 05399 saatiin Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ). Solulinja oli peräisin 1-vuotias valkoihoinen mies. Solulinjaa pidetään laboratoriossamme Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), kun läsnä oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) [20]. H2122 keuhkoadenokarsinooma solulinja Adi Gazdar pahanlaatuisesta pleuraeffuusio, ja hankittu Ilona Linnoila ja Herb Oie NCI. Myöhemmin talletettu ATCC (NCI-H2122 [H2122] ATCC® CRL-5985 ™) [21]. Solulinjaa ylläpidetään laboratoriossamme RPMI-1640-väliaineessa läsnä oli 10% FBS [22], [23]. Molemmat solulinjat ovat julkisesti saatavilla.

Vasta

Seuraavia vasta-aineita käytettiin virtaussytometriaa FACS /Lajittelu: Mouse Anti-humaanin IgG2b CD44-FITC, (BD Biosciences # 555478); FITC Hiiren IgG2b κ Isotyyppikontrollit, BD Biosciences # 555742); PE-leimattu hiiren anti-ihmis-CD44, (BD Pharmingen # 555479); PE Hiiri Hiiri IgG2b κ Isotyyppikontrollit, BD Biosciences 555743. Anti-CD166-FITC: tä (hiiren monoklonaalinen, IgG1 Setrotech # MCA 1926F, ensisijainen leimaamatonta anti-cMET (hiiren IgG2a, Abcam # 49210), anti-uPAR (hiiren IgG, Santa Cruz Biotech # 13522), Toissijainen vasta-aine, jota käytetään tutkimuksessa käytettiin: Goat (Fab ’) 2 anti-hiiri-lgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratoriot # M35018).

Immunohistokemia ( IHC) B

Ensisijainen ihmisen keuhkosyöpä kudosta (levyepiteelikarsinooma: SCC ja adenokarsinooma: AC) tai ihmisen keuhkojen kontrollikudoksen (ihmisen normaali alveolaarinen ja keuhkoputkien kudokset) saatiin UCLA Department of Pathology core facility. ksenograftikasvaimissa johdettu CD44

hi solut injektoidaan NOD /SCID (IL2rγ

null) hiiristä poistettiin kirurgisesti, leikataan 0,3-0,5 mm paloiksi ja kiinnitetty etanoliin (Fisher Scientific) tai Z-fix (Anatech, MI). IHC, kohdat 3-5 μ leikattiin ja parafiini ja käsiteltyjen antigeenin hakuun [5] ja värjätä merkki ilmaisun. Aluksi kudosleikkeiden värjättiin yhdellä merkki-vasta-värjäyksen (CD44 tai ALDH). Kun olosuhteet optimoitiin yhden antigeenin värjäystä sitten dual antigeeni värjäytymistä (CD44 ja ALDH) kudosleikkeiden saavutettiin. Parafinoidut kudosleikkeiden poistettiin parafiini ja nesteytyksestä. Sen jälkeen kun antigeeni haku (10 mM natriumsitraatti, pH 6,0 höyryllä 25 minuuttia) ja esto, endogeeniset peroksidaasit pysäytettiin (3% H

2O

2 in 1% natriumatsidia PBS, 30 minuuttia huoneenlämmössä) . Laseja inkuboitiin primääristen kanin polyklonaalinen vasta-aine ALDH1A1 (Abcom Inc. Cat # ab51028), yön yli 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin PBS: llä ja inkuboitiin EnVision + System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (Dako Cat # K4003) 30 minuutin ajan. Levyjä inkuboitiin DAB (Vector Peroxidase Substrate Kit # SK-4100 Nickel Sol) 10-20 minuuttia ja sitten levyt pestiin 5 minuuttia 3 kertaa PBS: llä. Kaksinkertainen värjäys CD44 (R 20 solusta, laskettiin lopussa 10 päivän kulttuuria. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina kloonaustehokkuuden.

Sferoidiviljelmiä Formation in Soft Agar Pitoisuus

Lajittele CD44

hi ja CD44

lo-solut maljattiin 1000 solua /kuoppa kolmena kappaleena kuusi-kuoppaisilla viljelylevyillä, joka sisälsi 0,35% agaria kerrokseksi 0,5% emästä agar (DNA Grade), joka sisältää PCM. Pesäkkeet laskettiin 3 viikkoa pinnoitus, tulokset edustavat keskimääräistä kolmesta itsenäisestä kokeesta.

tuumorigeenisyystesti NOD /SCID (IL2rγ

null) Hiiret

Kaikki hiiret toimivat liittyvä protokolla tutkimukseen hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean UCLA /VAGLAHS. CD44

hi ja CD44

lo-solut lajiteltiin FACS ja ruiskutetaan eri soluannosten (300 /hiiri, 3000 /hiiri ja 30000 /hiiri) oikeaan ja vasempaan kylkeen vastaavasti NOD /SCID (IL2γ

null) hiiristä 100 ui suolaliuosta. Hiiriä seurattiin kasvaimen kasvua sekä laitojen. Tulokset olivat edustettuina ryhmässä keskiarvot kasvaimen tilavuuden, kuten on kuvattu [24].

miR-34a Transfektiotutkimuksia

Tässä tutkimuksessa arvioidaan, että miR-34a on kolonioiden muodostumista tehokkuuden pehmeässä agarissa määrityksen CD44

hi-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko miR-34a (AM17100, Applied Biosystem /Ambion) tai negatiivinen kontrolli (salattu) oligonukleotidi. Samoin CD44

lo-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko anti-miR-34a estäjä (# AM17000, Applied Biosystem /Ambion) tai negatiivinen kontrolli anti-miR oligonukleotidi (# AM17010, Applied Biosystem /Ambion). Transfektio suoritettiin CD44

hi tai CD44

lo-soluissa käyttämällä Lipofec- tamin’ia 2000 (Invitrogen) 6 kuoppalevyillä 50000 solua /kuoppa 100 pmol miR, anti-miR ja ohjaus salattu /oligonukleotideja. Jälkeen 2 päivää transfektion jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin pehmeässä agarissa pesäkkeitä muodostavien tehokkuuden kuten edellä on kuvattu.

Fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) analyysi MPE Näytteet

FISH tutkimukset suoritettiin perustettu protokolla [25]. LSI 1p36 koetin leimattiin spektrin oranssi ja LSI 1q25 koetin leimattiin spektri vihreä ja hybridisoitiin metafaasissa levitteitä kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [26]. Lyhyesti, metafaasissa levitteitä valmistettiin standardin sytogeneettisen menettelyjä. Leimattuja koettimia hybridisoitiin ja pesut suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa tiukkuuden. Leikkeitä hybridisoitiin 37 ° C: ssa yön yli 1-4 ng koetinta, 50% formamidia, 10% dekstraani, 2 x SSC, ja 50 ng Cot 1 DNA tukahduttaa toistuvia sekvenssejä. Metafaasikromosomit vastavärjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli-(DAPI) in Vectashield liuokseen (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Karyotyping kromosomien suoritettiin vakiintuneiden protokollien.

Käänteinen Transcriptase- kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) Detection of mir-34a MPE Näytteitä

Yhteensä RNA eristettiin näytteistä käyttäen TRIzol. miR-34a mitattiin Step One Plus Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Bio järjestelmät, CA) käyttäen Taq-Man MicroRNA Analyysit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja normalisoitu RNU48 tasoilla. 3 ui 20 ng /ul kokonais- RNA: ta käytettiin suorittamaan käänteistranskriptaasi (RT) reaktio (30 min 16 °, 30 min 42 °, 5 min 85 °) käyttäen 10 mM dNTP: itä, MultiscribeRT entsyymiä, 10 x RT puskuri, RNaasi-inhibiittori, Taqman RT-aluketta ja vettä reaktion kokonaistilavuus 15 ul. Sillä qPCR, 10 ui 2 x Taqman Universal PCR Master Mix (o AmpErase UNG ABI), 7 ui vettä, 1 ui Taqman-aluke (miR-34a ja RNU48) ja 2 ui cDNA kunkin reaktiota käytettiin sen jälkeen, vahvistus protokolla (10 minuuttia 95 °, 15 s 95 °, 60 sekuntia 60deg 40 sykliä) käyttämällä vaihetta One Plus Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, CA).

Surface Marker nimeäminen ja Cell Cycle Analysis

Solut värjättiin CD44-FITC- ja PI (propidiumjodidia) solusyklin analyysi (muokattu UCLA /virtaussytometrialla core laitos protokolla). Lyhyesti, 1 x 10

6 yksisoluinen suspensio pestiin PBS /2% PCM, pelletoitiin, ja leimattu hiiren anti-ihmisen IgG2b CD44-FITC-vasta-ainetta (BD Biosciences # 555478) 45 minuutin ajan. huoneenlämmössä pimeässä, kontrolli vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Näytteet suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan puskuria, joka sisälsi 10 mikrogrammaa /ml PI: n ja 11,25 Kunitz yksikköä RNaasi ja inkuboidaan vähintään 30 minuuttia 4 ° C: ssa pimeässä ja analysoitiin virtaussytometrin 30 minuutin kuluessa PI-värjäyksellä .

tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvona ± SD ja analysoitiin kaksipuolisella

t

testi EXCEL ja toistettujen mittausten varianssianalyysillä (ANOVA) käytettiin vertailun Blandgrupp SAS 9.3.

P

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CD44 Expression profiili MPE johdettujen kasvainsolujen

MPE-kasvainsoluja voidaan eristää ja laajennetaan lyhyen aikavälin primääriviljelmissä läsnäollessa MPE nesteen ja autologista ei-kasvainsoluja [5]. Heterogeenisia, kuten ehdokas CSC, ovat läsnä MPE- kasvain väestö, mikä ilmenee vaihteleva ilmentyminen CSC-biomarkkerit: c-MET, uPAR, MDR1, CD166, CD44, ja ALDH. Niinpä sen lisäksi, että

sisäistä

kasvainten morfologiset heterogeenisyys on eroja pinnan CD44 merkintöjä intensiteettiä, ja nämä erot voidaan hyödyntää eristää solualaryhmiä [5].

Ensisijainen viljelmät kolme erilaista MPE-näytteiden (M-1, M-2 ja M-3), sisältävät morfologiset variantit (litteä, ovaali ja pyöristetty muodot) valomikroskoopilla (kuvio 1A, B). Vuoteen 4

th viikon viljelyn jälkeen kiinnittyneet kasvainsolujen näyttää tasaisempi morfologia kuvio kulttuuri (kuvio 1 C). Viljellyt solut tasaisesti express CD44 kaikissa kolmessa Tuumorinäytteissä (kuvio 1 D), mutta merkinnöissä intensiteetti on hyvin vaihteleva ja niiden välillä on samasta näytteestä. Näin ollen, verrattuna soluihin leimattu sekundaarinen vasta-aine yksin, näytteet ovat 96%, 99% ja 98% positiivisia CD44; kuitenkin Mean fluoresenssivoimakkuuksien (rahalaitokset) ja CD44 merkinnät ovat 10861, 5295 ja 2120 vastaavasti. Siten pinta merkintöjä intensiteetti CD44 ilmentyminen voi vaihdella 2-5 kertaiseksi keskuudessa kasvain näytteet, ja on tyypillisesti suuri varianssi keskimääräisen pinnan CD44 merkintöjä

sisällä

yksittäisten näytteiden.

Kasvain solujen M-1, M-2 ja M-3. (A) 100 x (2-3 viikkoa). (B) 400 x (2-3 viikkoa). (C) myöhemmissä vaiheissa kulttuuri 100 x (6-10 viikkoa). (D) CD44- FACS ekspressiokuviota ja rahalaitos. (E) lajittelu CD44

hi ja CD44

lo-solut (5-10%). Lajitellut solut CD44

hi ja CD44

lo pestiin ja maljattiin PCM 2-3 päivää arvioida niiden morfologisia eroja. (F) morfologia lajiteltu CD44

hi soluja ja lajitellaan (G) CD44

lo-solut olivat samanlaisia ​​(100 x). Puhtaus CD44

hi ja CD44

lo solut olivat ≥98%, kun paljastui postitse sort analyysi (tietoja ei esitetty).

puuttuminen Morfologiset erot CD44

hi ja CD44

lo Solut

MPE-primääriviljelmissä hankkia tasaisempi morfologinen kasvumallin ajan. Sen määrittämiseksi, hienoisia eroja kulttuurissa morfologia voisi erottaa CD44

hi from CD44

lo kulttuureissa, M-1, M-2 ja M-3 näytteet leimattiin anti-CD44-vasta-aineen ja lajitellaan FACS, jossa portit asetettu 5% soluista on korkea CD44 merkki ja alhainen CD44 merkki ilme (Fig. 1 E). Puhtaus CD44

hi ja CD44

lo solut olivat ≥98%, kun paljastui postitse sort analyysi (tuloksia ei esitetty). Lajitellut solut CD44

hi (kuvio 1 F) ja CD44

lo (kuvio 1G) pestiin ja maljattiin PCM 2-3 päivää arvioida niiden morfologisia eroja. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että ei ole mitään erottavaa eroa kulttuurin morfologia liittyy pinta CD44 ilme.

CD44

hi Solut näyttää korkea pesäkkeenmuodostuskyvyn

Sen tutkimiseksi CD44

hi solut ovat toiminnallisesti erilainen kuin CD44

lo solujen pesäkkeitä muodostavien tehokkuutta, me lajitellaan ja viljeltiin näitä alijoukkojen kolmesta näytteestä (M-1, M-2 ja M-3). 100-500 solujen CD44

hi tai CD44

lo-solut maljattiin yksittäisiin kuoppiin 12-kuoppalevyillä. Vaikka emme voi havaita merkittäviä eroja alkumaljauksesta tehokkuutta, mutta me todeta, että CD44

hi solut ovat toimivaltaisia ​​muodostavat holoclones kuin CD44

lo-solut (

t

testi ja ANOVA: P 0,05) (kuvio 2A). Siten luontainen biologinen ero CD44

hi ja CD44

lo solujen näyttää luontainen ero osaaminen muodostavat holoclones.

lajitellut solut CD44

hi ja CD44

lo alkaen MPE näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena heidän (A) klonaalinen hyötysuhde (Näyte M-1: pesäkkeitä CD44

hi = 35,8 (SD = 5,04) vs CD44

lo = 21,7 (SD = 6,2) (P = 0,03) ; Näyte M-2 pesäkettä CD44

hi = 59,8 (SD = 3,2) vs CD44

lo = 40,6 (SD = 4,1) (P = 0,003); Näyte M-3 pesäkettä CD44

hi = 53,4 ( SD = 5,3) vs CD44

lo = 33,9 (SD = 3,6) (P = 0,006)); Keskimääräinen vaikutus CD44

hi versus CD44

lo on 17,6 (95% CI: 8,31, 26,89: p = 0,015). (B) pesäkkeenmuodostuskyvyn pehmeässä agarissa. (Näyte M-1: pesäkkeitä CD44

hi = 16,6 (SD = 1,1) vs CD44

lo = 8 (SD = 1,1) (P = 0,0006), Näyte M-2: pesäkkeitä CD44

hi = 27 (SD = 7) vs CD44

lo = 12 (SD = 3) (P = 0,02), Näyte M-3: pesäkkeitä CD44

hi = 24,3 (SD = 6,1) vs CD44

lo = 12,6 (SD = 2,5) (P = 0,03)). Keskimääräinen vaikutus CD44

hi versus CD44

lo on 11,8 (95% CI: 3,41, 20,14; P = 0,026). Sarakkeet, keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeilu; SD, *,

P

0,001 verrattuna CD44

lo ryhmät, (opiskelijan

t

testi). (C) Pehmeä agar saatujen pesäkkeiden CD44

hi-solut (100 x) ja (D) CD44

lo-solut (100 x). (E) Expression profiilia BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2 sekä MMA-4 lajitellun CD44

hi ja CD44

lo-solut analysoitiin käänteistranskriptaasi-qPCR. Näytteen M-3 vain BMI-1 ilmentyy korkealla tasolla CD44

hi väestö kuin CD44

lo solupopulaation. Näytteen M-2 lievää korkeampi ilmentyminen hTERT vuonna CD44

hi soluja kuin CD44

lo soluja. CD44

hi väestöstä näytteen M-1 ilmaisi korkea BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2 sekä MMA-4, kuin CD44

lo väestöstä.

CD44

hi Solut näyttää korkea Sferoidiviljelmiä Muotoilu Kyky pehmytagarissa Cultures

Toinen korvike toimenpide yleisesti käytetty kuvaamaan CSC on ero osaaminen on muodostaa ”ankkurointi itsenäinen” pesäkkeitä pehmeässä agarissa [12]. CD44

hi ja CD44

lo solujen näytteistä (M-A-1, M-10-26 ja M-8-15) arvioitiin maljaamalla lajitellut solut agaroosi- täydennetty PCM. CD44

hi solujen kaikkien kolmen näytteen tasaisesti esiintyy enemmän sferoidiviljelmiä muodostumisen hyötysuhde kuin CD44

lo-solut (

t

testi ja ANOVA: P 0,05) (kuvio 2B). Järeämpään CD44

hi pesäkkeet ovat myös laadullisesti erotettavissa surkastunut pesäkkeiden muodostama CD44

lo-solut (kuvio 2C vs. 2D). Siten CD44

hi soluilla suurempi osaaminen on muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa kuin CD44

lo-solut ovat peräisin samasta keuhkosyövän biospecimen.

CD44

hi Solut varioivasti Näyttö Molecular ominaisuudet luonnehtia CSC

Merkit, jotka luonnehtivat

ehdokas

CSC (hTERT, SUZ12, OCT-4 lauseke jne.) ovat ilmeisiä solupelletteihin eristetään MPE näytteistä [5]; Näin CSC ovat todennäköisesti osa MPE-kasvain mix. Tällaiset CSC markkereita portaattomasti koostuvat sikiön tai Polycomb proteiinin osien ja niiden ilmentyminen voi ennustaa merkintöihin solualaryhmiä jotka omistavat korkea tuumorigeenisia tai pesäkkeitä muodostavat potentiaalit [27]. Sen määrittämiseksi, nämä

ehdokas

CSC markkereita rajoittuivat tiettyihin CD44 lajiteltu subsets, me seulotaan CD44

hi ja CD44

lo solualaryhmiä varten ero mRNA ilmaisun; RT-PCR-monistus BMI-1, hTERT, SUZ-12, EZH2 ja Oct4 suoritettiin. Indeksoitu beeta-tubuliinin mRNA on selvästi vaihtelua ilmentymistä näiden merkkiaineiden sisällä CD44-lajiteltu solualaryhmiä (kuvio 2E). Esimerkiksi BMI-1 ja hTERT mRNA on korkeammin ilmaistaan ​​CD44

hi soluja kuin CD44

lo solujen näytteessä M-3 ja M-2 vastaavasti. Vain näytteessä M-1, odotettua jakaumat CSC markkereita (korkea painoindeksi, hTERT, SUZ12, EZH2 sekä MMA-4) ovat ilmeisiä CD44

hi soluja kuin CD44

lo soluja.

Nämä tulokset osoittavat, että 1) molekyylimarkkereita, jotka koodaavat määritteet kromatiinin rakenteen tai alkion geenejä voi olla läsnä sekä erittäin tuumorigeenisiä ja ei-tuumorigeeniset subsets yksittäisten keuhkosyövän solupopulaatioiden, ja 2), että on merkitty vaihtelua ero ilmentymisen näiden ehdokas ”CSC-biomarkkerit” keuhkosyövässä biospecimens.

CD44

hi solut muodostavat kasvaimia NOD /SCID (IL2rγ

null) Hiiret

Erityisinä molekyylimarkkereina voi luotettavasti erottamaan tuumorigeenistä ei-tuumorigeenisiä solualaryhmiä, voimme erottaa nämä subsets perusteella käyttäytymiseen fenotyyppien? CD44

hi ja CD44

lo solualaryhmiä yksittäisistä kasvainsolupopulaatioissa johdonmukaisesti näyttää erot tarttuu holoclone ja pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista. Keskeinen kokeellinen mitta ”CSC” on kuitenkin, että osoitus korkeamman Tuumorigeenisuustutkimuksissa hiirimalleissa. On osoitettu, että NOD /SCID (IL2rγ

null hiiret ovat herkkiä mallin arvioida erittäin tuumorigeenisia CSC- käyttäytymiseen fenotyypit [16], [28]. Vahvistavan havaittu eroja pesäkkeitä muodostavien ja pallomainen muodostavat kyvyt CD44

hi vs CD44

lo solujen

in vivo

kasvainten synnyssä, tutkimme niiden kyky muodostaa kasvaimia NOD /SCID (IL2rγ

null) hiirissä.

rajoittaminen laimennoksia (30.000 , 3000, 300) lajitellaan CD44

hi ja CD44

lo soluja M-1 ja M-2 Suurimmat sallitut virheet ruiskutettiin oikean ja vasemman sivun vastaavasti NOD /SCID (IL2rγ

null) hiirissä. CD44

hi kasvainsoluja M-1 näyte muodostetaan kasvaimia 3/3 hiirillä sekä 30000 ja 3000 injektoidaan soluannosten, ja yksi 3 hiirtä ruiskutettiin 300 kasvaimen solut (kuvio 3 A, B, C). latenssiaika kasvaimia oli 50-90 päivää, 90-150 päivää ja 150 päivää, 30000, 3000 ja 300 CD44

hi-soluissa (kuvio 3E). Siten kinetiikka kasvaimen muodostumisen erittäin tuumorigeeninen CD44

hi-soluissa oli annoksesta riippuvaa. CD44

hi syöpäsolujen näytteestä M-2 syntyy kasvaimia 2 3 hiirtä 30000 kasvainsolujen kanssa latenssiaika 90-100 päivää, korkeampi latenssiaika kuin havaittu CD44

hi solujen näytettä M -1 (kuvio 3E). Näin ollen vaikka CD44

hi solujen johdonmukaisesti näyttää korkeampi tuumorigeenisia potentiaalit kuin CD44

lo soluja samasta näytteestä, yksittäiset kasvain näytteet voivat näyttää eri kasvukinetiikat arvioinnissa CSC ominaisuuksia käyttäytymiseen biotesteissä.

(A) tuumorigeenisyyteen ja latenssiaika CD44

hi-solut (M-1) ruiskutettiin 30000; 3000 ja 300 solua. Hiiret injektoitiin CD44

hi (oikea kylki) muodostunut kasvaimia ja CD44

lo-solut eivät muodostaneet kasvain (vasen kylki). Numerot (1/3, 2/3 tai 3/3) edustavat useita eläimiä kasvaimen /ryhmä tiettyyn aikaan mittauskohdassa. Ajanjakso päivää kasvaimen istutuksen jälkeen ilmaistaan ​​pitkin X-akselia ja kasvaimen kasvua tilavuus ilmaistaan ​​mm

3 pitkin Y-akselia. Lajittelemattomat vanhempien primaarikasvainten istutettu 500000 solua /hiiret eivät osoittaneet kasvaimen kasvua vielä 3 kuukauden kuluttua kasvainsolun istutuksen (tuloksia ei esitetty) (B) Hiiret joissa kasvaimia oikeaan kylkeen injektoitiin CD44

hi-solujen eikä kasvain havaittiin vasempaan kylkeen injektoitiin CD44

lo-solut (C) resektoitiin kasvaimet muodostuvat CD44

hi soluja hiirissä. (D) FACS-analyysi yhden jotka oli saatu hiiren kasvaimista peräisin CD44

hi soluja M-1 MPE näyte. Kasvain solut osoittavat ilmentymä CD44, cMET, uPAR ja CD166 markkereita. (E) tuumorigeenisyyteen ja latenssiaika CD44

hi ja CD44

lo solujen näytteitä M-1 ja M-2 NOD /SCID (IL2rγ

null) hiirissä.

on huomattava, että CD44

lo solut joko ensisijainen kulttuuri teki

ei

muodostaa kasvaimia vasemmassa kylkiin hiirten aikana koko valvontaväli (Fig. 3 B ja E). Lisäksi teimme myös

ei

tarkkailla kasvainmuodostusta ruiskuttamalla 5 x 10

5

lajittelematonta

soluja, vaikka tämä populaatio oletettavasti sisälsi ~5-10% (tai 25,000- 50000) CD44

hi soluja. Tämä mielenkiintoinen havainto viittaa siihen, että CD44

hi soluja voidaan altistaa estävät vaikutukset ovat kohti kasvaimen kasvua soluilla, jotka on pienempi intensiteetti pinnan CD44 ilmentyminen samassa kasvain väestöstä.

Voit testata, onko istutettu CD44

hi-solut osaltaan heterogeeninen kasvaimia (viittaavia multipotenteista erilaistumisen), Siirto tehty kasvaimet syntyvät CD44

hi M-1-solut extirpated, hajotettiin, ja solupinnan analyysi suoritettiin FACS on yhden solun suspensiot. Kasvain solut pysyivät erittäin positiivinen CD44 merkki, jossa on 98,2% solujen värjäystä positiivinen, vaikka CD44-MFI oli jopa korkeampi kuin alun perin istutettu soluja. Heterogeenisuus joukossa soluja näkyi muuttujalauseke muiden yleisesti yhdistetään CSC biomarkkerit (kuva 3D), [cMET (40,4%), uPAR (47,6%) ja CD166 (27,4%)]. Soluihin, joissa näitä markkereita on myös aiemmin havaittu ensisijainen MPE biospecimen näytteitä, vaihtelevalla fraktiot [5].