Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on arvioida sytokiiniekspressiota perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) vaiheen I keuhkosyöpäpotilaita ja vahvistusta ekspressiokuvioiden altistamalla PBMC keuhkosyöpään solujen

in vitro

. Viisi muuttunut sytokiinien I vaiheessa keuhkosyöpäpotilaita (CCL3, IL8, IL1B, CXCL10, sIL2Rα) havaittiin plasmassa (n = 15) ennen ja jälkeen resektion käyttäen 30-Plex paneeli proteiinin määritys. Geeniekspressiotutkimuksissa käyttämällä kvantitatiivista RT-qPCR suoritettiin PBMC vaiheen I keuhkosyöpään potilailla (n = 62) ennen ja jälkeen resektion, ja verrattuna ei-syöpäpotilailla (n = 32) ennen ja jälkeen leikkauksen hyvänlaatuinen sairaus. Co-kulttuuri kokeita, jotka altistuvat terveen luovuttajan PBMC keuhkosyöpään solujen

in vitro

tehtiin arvioimaan vaikutusta PBMC sytokiiniekspressiota. PBMC geenin ilmentyminen CCL3, IL8 ja IL1B oli suurempi keuhkosyöpäpotilaita verrattuna samaan potilaille kussakin neljä kertaa peräkkäin ajankohtina poistamisen jälkeen niiden kasvainten, kun taas CXCL10 ja IL2Rα olivat pääosin ennallaan. Tämä malli havaittiin myös, kun keuhkosyöpäpotilaita verrattiin ei-syöpäpotilaille. Kun ei-syöpäpotilasta leikattiin hyvänlaatuinen sairauksiin, nämä sytokiiniekspressiota muutokset eivät ole osoitettavissa. Keuhkosyöpä solulinjoissa, mutta ei hyvänlaatuinen keuhkoputken epiteelisoluissa, indusoi samanlaisia ​​muutoksia sytokiini- geeni ja proteiinin ekspression terveen luovuttajan PBMC: t käytettäessä

in vitro

yhteisviljelmässä järjestelmä. Voimme päätellä, että PBMC vaiheen I keuhkosyöpäpotilaita hallussaan erillisiä sytokiiniekspressiota kuvioita verrattuna sekä ei-syöpäpotilasta, ja keuhkosyöpäpotilaita kasvaimen poiston. Nämä ilmentymiskuviot replikoidaan terveen luovuttajan PBMC: t altistettiin keuhkosyövän solulinjoja, mutta ei hyvänlaatuinen keuhkoputken epiteelisoluissa

in vitro

. Nämä havainnot vaikuttavat ymmärtää immuunivastetta keuhkosyöpään.

Citation: Chang DH, Rutledge JR, Patel AA, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) vaikutus keuhkosyöpään Sytokiiniekspressioanalyysi vuonna perifeerisen veren mononukleaarisoluissa. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10,1371 /journal.pone.0064456

Editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 lokakuu 2012; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Valley Hospital Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden Yhdysvalloissa, ja sen odotetaan osuus enemmän kuolemia vuonna 2012 kuin peräsuolen syöpä, rintasyöpä, ja eturauhasen syöpiä yhdistetty [1]. Vaikka keuhkosyöpä on pidetty huonosti immunogeeninen maligniteetti, useat tekijät osoittavat vaikutusta isännän immuunijärjestelmä muuttaessaan keuhkosyövän kehittymisen ja etenemisen. Näitä ovat raportit tehostettu selviytymisen keuhkosyöpää sairastavien potilaiden leikkauksen jälkeisiä infektioita [2], lisääntynyt uusiutuminen potilailla, jotka saavat perioperatiivisen verensiirtoja [3], [4], ja korkeampi esiintymistiheys keskuudessa heikentyneiden henkilöiden kuten ne, jotka testi positiivinen ihmisen immuunikatovirus (HIV) [5]. Huolimatta Näiden havaintojen rooli isännän immuunijärjestelmän kehittymistä ja etenemistä keuhkosyöpään jää epäselväksi.

sytokiinit ja kemokiinit (kemotaktinen sytokiinien) ovat tärkeitä endogeenisiä säätelijöitä immuunijärjestelmää ja niitä erittävät immuunisolujen, sekä kasvain. Vuonna syöpäpotilaan, nämä molekyylit hallussaan ja monimutkaisten rooleja toiminta ja kaupan immuunijärjestelmän ja muiden solujen, mukaan lukien endoteelisolujen esisolut [6]. Sytokiini ja kemokiinin verkot voidaan myös ”kaapattu” syöpäsolujen tarjota suotuisa ympäristö kasvaimen kasvua [6], [7].

Koska epäselvä rooli antitumor immuniteetin keuhkosyöpäpotilaita yhdistettynä maailmanlaajuista merkitystä sytokiinien ja kemokiinien immuunivasteeseen, me arveltu, että keuhkosyövän olisi erityisiä vaikutuksia sytokiinien /kemokiinin ilmaisun ja erityksen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC). Tältä osin tavoitteena tässä tutkimuksessa on kolme. Ensinnäkin, onko potilaalla on vaiheen I keuhkosyöpään näyttelytila ​​muuttunut sytokiinien ilmentymistä kiertävästä plasman ja PBMC ennen mahdollisesti parantava resektio, verrattuna resektion jälkeen, ja tunnistaa ilmentyvät eri sytokiineja. Toiseksi vahvistamaan tämän ero ilmaisua PBMC saatu suurempi kohortin vaiheen I keuhkosyöpäpotilaita, ja verrata näitä tuloksia kohortin olevia potilaita thoraxkirurgian hyvänlaatuisen sairauksia. Kolmanneksi, onko tämä ero sytokiiniekspressiota laukeaa, kun terveitä luovuttajan PBMC altistuvat keuhkosyöpäsoluissa

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasjoukko

Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt The Valley Hospital Institutional Review Board ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET. Kaksi potilasryhmissä tutkittiin. Keuhkosyöpä potilasryhmässä mukana yksilöitä, joille tehdään parantavaa keuhkojen lobectomy ja välikarsinan imusolmukedissektiossa, vaiheen I asema vahvisti patologisesti. Ohjaus potilasryhmälle sisälly ei-syöpäpotilailla thoraxkirurgian hyvänlaatuisen olosuhteet, kuten spontaani ilmarinta, diagnostinen resektio hyvänlaatuinen keuhkojen kyhmy, rakkulainen keuhkosairaus, keuhkoputken, välikarsinan /keuhkojen kystat, ja Palleatyrä korjaus.

Potilaat suljettiin pois tutkimuksesta, jos he saivat krooninen steroidihoitoa, todettiin edennyt keuhkosyöpä (vaihe II, III, IV) patologisesti resektion jälkeen, oli muu samanaikainen syöpiä muu kuin ei-melanooma ihosyöpä, tarvitaan adjuvanttia tai neoadjuvanttikemoterapian , sädehoitoa tai molempia, tai oli ollut HIV-infektion, hepatiitti B tai C tai muita immunosuppressiivisia tai myeloproliferatiivisten sairauksia. Ohjaus potilaita ei, jos ne käynnissä thoraxkirurgian tulehdussairauksien /tarttuvan olosuhteissa (empyema, interstitiaalinen keuhkosairaus, tai aktiivinen pneumoniitti) tai oli ollut muiden syöpien.

Preoperatiivisen otettiin verinäytteet aikana kaksi viikko ikkuna ennen leikkausta, kun taas leikkauksen jälkeinen näytteet saatiin 3 (2-4 kk), 6 (5-7 kk), 9 (8-10 kuukautta) ja 12: n (11-13 kk) leikkauksen jälkeen, ellei toisin mainita.

veren Näytteen kerääminen ja käsittely

Keuhkosyöpä ja ohjata potilas otettiin verta perifeerinen laskimopunktiolla BD Vacutainer CPT Cell valmistaminen Putket natriumhepariini (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Veren käsittely suoritettiin mukaan valmistajan protokollaa. PBMC-pelletit kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa RNA: n uutto ja sen jälkeen määrityksiä. Plasma myös tallennetaan ja säilytetään -80 ° C: ssa.

Terve luovuttajan veren valkosoluja (buffy coat) käytetään

in vitro

kokeissa hankittiin yhteisön Veren Services (Paramus, NJ) . Nämä PBMC valmistettiin sentrifugoimalla verta Ficoll-Paquella PLUS tiheysgradientin keskipitkän (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) 30 minuutin ajan 805 x

g

RCF (suhteellinen keskipakovoima) huoneenlämpötilassa. Eristetty PBMC haettiin ja pestiin kahdesti PBS sentrifugoimalla 15 ja 10 minuutin ajan 453 x

g

4 ° C: ssa. Eristetyt PBMC: t, joita sitten käytetään

in vitro

yhteistyössä luviljelymäärityksistä.

Luminex Assay

Luminex määritys on multiplex helmi-immunomääritys, joka mahdollistaa samanaikaisen mittaus useiden analyyttien (esim sytokiinien) käyttäen kirjaston vasta-kytketyn värikoodattu helmiä (kutsutaan mikropalloja). Sillä alustava seulonta plasman proteiineihin, plasma kerättiin 15 vaiheen I keuhkosyöpäpotilaita ennen leikkausta ja 3-7 kuukautta leikkauksen jälkeen. Plasma analysoitiin sitten käyttämällä Sytokiini Human 30-Plex Panel, LHC6003, (Luminex alusta, Life Technologies, Carlsbad, CA). Määritykset suoritettiin valmistajan protokollan kanssa, sillä poikkeuksella, että näytteet, helmet ja puskuri inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Reaktiot suoritettiin käyttäen Luminex 100 instrumentti (Luminex, Austin, TX), vakio dikäyrät, ja tietoja kerättiin ja analysoitiin käyttäen Luminex 100 Integrated Software versio 2.3. Supernatantit

in vitro

yhdessä viljelemisen kokeissa arvioitiin myös käyttämällä Luminex määritystä, protokollan mukaisesti edellä kuvatulla tavalla. Alkuvaiheen plasma seulonta tutkimusten suhteellinen proteiini tasot esitettiin laskemalla suhde keskimääräisen kertaluokkamuutos proteiiniekspressiossa (ennen leikkausta ja leikkauksen jälkeen), ja muuttaa arvot log

2 mittakaavassa. Potilaat, joilla on vähintään yhden mittauspisteen näytteille ilmaisun yläpuolella Luminex minimaalinen havaitsemistaso sisällytettiin suhde laskelmissa.

PBMC Gene Expression Database

Geeniekspressio PBMC kuusi keuhkosyöpää, ennen ja 2-5 kuukautta sen jälkeen, kun parantava resektion saatiin käyttäen Affymetrix U133 + 2,0 mikrosiruja käyttäen RNA eristettiin PBMC solulysaateista vastakohtana plasmanäytteistä. Tämä työ on kuvattu aiemmin [8]. Hybridisaatio intensiteettiä käytettiin laskemiseen kertaiseksi eroja ennen leikkausta ja leikkauksen jälkeisiä näytteitä.

RNA ja laadun arviointi

RNA uutettiin PBMC lysaateista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Valencia, CA) valmistajan protokollan seuraavin muutoksin. Jäädytetyt PBMC pelletit hajotettiin suoraan RLT puskurissa minimoimiseksi RNA: n hajoamisen. Solulysaatit läpi QIAshredder (Qiagen) ennen jatkopuhdistusta kuvatun protokollan. Ribonculease DNaasi (Qiagen) käytettiin aikana kolonniin ruoansulatus DNA minimoida läsnäolo jäljellä genomista DNA.

RNA laatu ja pitoisuus arvioitiin käyttämällä RNA Nano sirut Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), ja analysoitiin käyttämällä 2100 Expert Software (Agilent). RIN (RNA Integrity Number) uutettua RNA oli alueella 7,0 10,0 keskiarvo 8,8 ± 0,68 kaikille RNA-näytteet Tässä tutkimuksessa käytetyt.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen Käänteinen transkriptio-PCR (RT -qPCR) B

RT-qPCR kokeet tehtiin käyttämällä 7500 Real Time PCR väline Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Kaikki materiaalit ja protokollat ​​saatiin Applied Biosystems. Primer ja koetin sarjaa (taulukko S1) suunniteltiin käyttäen Primer Express Software (Applied Biosystems) noudattaen standardin joukko suunnittelun perusteita, jotka ohjelmisto. Sarjaa jakautuivat intronin ja silloitettu eksonin eksonin risteys ja tehtiin toiveiden mukaan joko Applied Biosystems tai Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Alukkeet ja koettimet testattiin kokeellisesti puuttuisi ennen sen käyttämistä multipleksoinnin. Normalisoi ohjaus käyttää kaikkiin RT-qPCR kokeissa oli β-Actin (geenin symboli ACTB), jota käytettiin viite-geenin kaikissa laskelmissa. RT-qPCR multiplex määrityksissä, joka koostuu kolmesta neljä alukkeiden ja koettimien (mukaan lukien, että ACTB.) Suoritettiin [9].

RT-reaktio suoritettiin 2 ug RNA: ta per reaktio, jossa käytetään High Capacity RNA cDNA-kittiä (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Kvantitatiivinen PCR-reaktio suoritettiin käyttämällä 30 ng cDNA kolmena kappaleena. Kertainen muutos laskelmat tehtiin käyttäen ”vertailevan C (T) menetelmä” valmistajan laatimien [10]. C (T), kierto kynnys, on myös nimitystä Cq (Kvantifiointi sykli) arvo. Laskentaa varten, keskiarvo kolmena kappaleena Cq arvoja käytettiin analyysiin. Cq-arvot normalisoitiin niihin, ACTB.

Soluviljely ja

in vitro

Co-kulttuuri Experiment

A549 ja HCC827 ihmisen keuhkosyövän solulinjat ostettiin ATCC ( Manassas, VA). A549-soluja viljeltiin F12K väliaineessa, HCC827 soluja RPMI. Molemmat viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 0,028% HEPES (4- (2-hydroksietyyli) -1-piperatsiinietaanisulfonihappo), 0,02% natriumpyruvaattia, 0,02% penisilliini /streptomysiiniä, ja 0,004% gentamysiini. Kaikkien käytettävien reagenssien soluviljelyyn hankittiin Life Technologies (Carlsbad, CA). Primaaristen ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (NHBE), joka vastaa BEBM elatusaineessa (jota on täydennetty BEGM luoti kit) ja reagenssit hankittiin Lonza (Allendale, NJ). NHBE kulttuuri ja alakulttuurin suoritettiin myyjän protokollan (Lonza). Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

A549, HCC927 ja NHBE soluja kasvatettiin kaksi päivää 3 ml: ssa alustaa 35 mm (6-kuoppa) ruokia (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) 80-90% konfluenssiin. Kahden päivän jälkeen 0,4 um Transwell-irto-(Corning Corp, Corning, NY) asetettiin kuoppiin ja 5 x 10

6 terveen luovuttajan PBMC: itä, suspendoitiin 3 ml: aan vastaavaa soluviljelyalustaa, lisättiin jokaiseen transwell . Co-kulttuuri valvonta koostui kuoppiin, jotka sisältävät vain täysin soluviljelyaineessa (F12K, RPMI tai BEBM, täydennetty kuten edellä on kuvattu) ilman pahanlaatuista tai hyvänlaatuista epiteelisoluja. Co-viljelmiä inkuboitiin sitten 6 ja 18 tuntia. Inkuboinnin jälkeen soluviljelmän supernatantit kerättiin, sentrifugoitiin (453 x

g

rcf, 4 ° C, 15 min), ja alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa Luminex-määritystä. Geeniekspressioanalyysiä varten, Transvvell- insertit poistettiin ja PBMC: t heti hajotettiin

in situ

käyttäen RLT-puskuria (RNeasy Kit, Qiagen) ja joko säilytettiin -80 ° C: ssa tai käytettiin välittömästi RNA: n RT-qPCR. Virtaussytometrianalyysiä proteiinin ilmentymisen, 10 tuntia sen jälkeen kun PBMC: t on Transwell-irto-, 1 ul /ml Golgi-Plug /Brefeldin A (BD Biosciences) lisättiin estämään proteiinin kuljetusta. PMA (forboli-12-myristaatti-13-asetaatti, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lisättiin valittu kuoppiin positiivisena kontrollina samalla kanssa GolgiPlug. Kun 8 tuntia inkubaation, PBMC kerättiin ja käytettiin virtaussytometria havaita solunsisäisiä sytokiineja.

virtaussytometria

määrittää PBMC solupopulaatioiden, potilaan verta vedettiin BD Vacutainer Plus Plastic K

2EDTA samaan aikaan se oli kerätty RNA. Immuunijärjestelmän solujen populaatiot leimasi virtaussytometrialla seuraavat vakiotoimintamenettelyt perustettu The Valley Hospital Clinical Pathology Laboratory. Virtaussytometria suoritettiin käyttäen Beckman Coulter Cytomics FC500 ja CXP sytometrillä ohjelmisto. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Kaluza ohjelmiston Beckman Coulter. Reagenssit virtaussytometrialla ostettiin eri lähteistä: Anti-ihmis–CD11-PECF594, anti-humaani-IL8-PE, anti-humaani-CD14-FITC ja anti-humaani-IL1B-PE BD Biosciences; anti-humaani-CD8-PE-Cy5, anti-humaani-CD56-PE-Cy7, ja anti-humaani-CCL3-PE: eBioscience (San Diego, CA); anti-ihminen-CD3-ECD ja anti-ihminen-CD45-PE-Cy7 peräisin Beckman Coulter (Brea, CA); anti-ihmisen-CD4-FITC ja anti-ihminen-CD19-PE-Cy5 Dako (Carpinteria, CA).

in vitro

rinnakkaisviljelmätilanteessa kokeissa solunsisäisen sytokiinin värjäytymistä suorittaa seuraten Cytofix /Cytoperm protokollan BD Biosciences. Lyhyesti, PBMC: t yhdessä viljelemisen kokeissa kerättiin, pestiin ja värjättiin solun pinnan markkereita. Sen jälkeen pinta värjäys, solut pestiin, kiinnitettiin Cytofix /Cytoperm ja värjättiin solunsisäisen CCL3, IL8 ja IL1B. Värjäyksen jälkeen solut pestiin jälleen ennen analyysejä.

Tilastollinen analyysi

Erot keskimääräisissä ilmentymisen tasojen syöpäpotilaiden ja verrokeilla ja muutokset keskimääräisen ekspressiotasot aikana aika oli arvioitiin samanaikaisesti käyttäen toistettujen mittausten varianssianalyysillä (ANOVA). Tämän tyyppinen ANOVA osuus samanaikaisen vaikutuksen sekä tekijöiden ilmentymistä [11]. Vertailu syöpäpotilaiden ja verrokeilla olennaisesti arvioi vaikutuksen tuumorin läsnäolon ilmaisun tasoilla, kun taas arvio ilmentymisen ajan funktiona arvioi siitä, että, joille tehdään kirurginen toimenpide, oli kunkin potilaan tutkimukseen.

P-arvot ≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. IBM-SPSS Statistics (versio 19) käytettiin kaikkiin tilastollisia analyysejä.

Tulokset

alustava analyysi Plasma vaiheesta I Keuhkosyöpä Potilaat Sytokiiniproteiinin Levels

arvioida, sytokiinien ja kemokiinien olivat differentiaalisesti ilmaistut plasmassa vaiheen I keuhkosyöpään potilailla (n = 15) ennen ja jälkeen (3-7 kuukautta leikkauksen jälkeen) parantava resektio ihmisen multiplex immunomääritys käytettiin, ja tulokset näytetään taulukossa 1. alkuperäisestä 30 immuunijärjestelmän sytokiinien /kemokiini /kasvutekijä tavoitteet määritettiin Luminex, tasot 21 tavoitteet ylittivät toteamisraja keuhkoissa syöpäpotilaiden plasmanäytteet (taulukko 1), kun taas ekspressiotasot 9 tavoitteiden (tuumorinekroositekijä alfa, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, IL17, granulosyyttimakrofagin stimuloiva tekijä, interferoni gamma) olivat alle määritysrajan sekä ennen leikkausta ja leikkauksen jälkeisiä näytteitä (tuloksia ei ole esitetty).

tunnistaminen 5 geenien lisätutkimuksia

vahvistavat alkuperäisen havainnot 21 tavoitteita tunnistetaan Luminex määrityksen, ja auttaa määrittelemään tavoitteita lisätutkimuksia, me kuulusteltiin microarray tietokanta aiemmin tuotettu laboratoriossamme, joka vertaa malleja geenin ilmentymisen PBMC: saatu vaiheessa I keuhkosyöpäpotilaita ennen ja jälkeen parantava resektion. Samanlaisia ​​proteiiniin tietoja, geenin ilmentymistä, että suurin osa näistä 21 sytokiinien oli korkeampi ennen parantava resektio vaiheen I keuhkosyöpä, verrattuna resektion jälkeen (taulukko 1).

Viisi sytokiinien valittiin jatkotutkimuksiin tutkimalla alustava seulonta plasman proteiineihin tiedot ja mikrosiru (mRNA) tietokannan samanaikaisesti keskittyen tavoitteet, jotka olivat merkittävästi ylös /vaimentua (p /= 0,05). Kuten taulukosta 1, neljästä sytokiinien (proteiineja), jotka havaittiin plasmassa korkeimmalla tasolla

ennen

vaiheessa I keuhkosyöpä resektio (CCL3 (Kemokiini sertin motiivi ligandin 3), IL8 (interleukiini 8), IL6 (interleukiini 6), IL1B (interleukiini 1 beta)), kolme saatiin tukea PBMC geenien ilmentyminen tietoja mikrosiru tietokannasta (

CCL3, IL8, IL1B

) mRNA-tasolla. Samoin kaksi sytokiinien (proteiinit), joiden todettiin alimmille tasoille

ennen

vaiheessa I keuhkosyöpä resektio (CXCL10 ja liukoinen IL2Rα) molemmat tukevat PBMC geenien ilmentyminen tietoja mikrosirulla tietokannasta. Kuva S1 esittää graafisesti yhteenvetona seulonnan plasman proteiineihin tuloksia ja PBMC mRNA tietokanta havainnot 5 geenien valittiin jatkotutkimuksiin:

CCL3, IL8, IL1B, CXCL10,

ja

IL2Rα

.

Vahvistus RT-qPCR of ilmentyvät eri sytokiineja Resektio vaiheen I keuhkosyöpään

vahvistaa ja laajentaa saadut tulokset alkuperäisestä Luminex ja microarray data, PBMC geenin ilmentyminen arvioitiin paljon suurempi kohortit vaiheen I keuhkosyöpään potilailla (n = 62) ja ohjaus potilailla, joille tehdään thoraxkirurgian hyvänlaatuisen sairauksien (n = 32). Demografiset ominaisuudet näiden kahden ikäluokat potilaista on esitetty taulukossa S2.The viisi valittu kohde geenejä,

CCL3, IL8, IL1B, CXCL10,

ja

IL2Rα,

teki lisätutkimuksia toteutuneisiin aika RT-qPCR määrityksessä. Niistä 62 potilaasta keuhkosyöpä kohortti joille tehtiin phlebotomy ennen resektiota, 58 otettiin verinäytteet analysoitavaksi aikana leikkauksen jälkeen, samoin kuin 16 32 verrokeilla. Kuva 1 osoittaa suhteelliset muutokset lauseke havaitaan 5 geenien aikana leikkauksen jälkeen, että keuhkosyövän ja verrokeilla. Mielenkiintoista, PBMC geenien ilmentyminen kolmen sytokiinien (

CCL3, IL8, IL1B

) havaittu plasmassa korkeina

ennen

keuhkosyöpään resektiota alkuvaiheen seulonnassa havaittiin vaimentua

jälkeen

keuhkosyöpään resektio kaikkina ajankohtina. Edelleen samaa mallia ei havaittu kontrolliryhmässä potilailla, joille tehdään thoraxkirurgian hyvänlaatuisen sairauksia. Lopuksi PBMC geeni lauseke 2 sytokiinien (

CXCL10, IL2Rα

), joita ei ole havaittu plasmassa kohonneita

ennen

keuhkosyöpään resektiota alkuvaiheen seulonta eivät olleet merkittävästi erilaiset

jälkeen

resektio (kuvio 1). Analysoituaan nämä tiedot käyttämällä toistuvia ANOVA, käy selväksi, että

IL8

ja

IL1B

ilmaisu merkittävästi vaimentua resektion jälkeen vaiheen I keuhkosyöpään, se toteamus, jolla ei liity vaikutusta of thoraxkirurgian ei-syöpäpotilailla.

CCL3

näyttää myös vaimentua samalla tavalla, siinä määrin, että se lähestyy tilastollista merkittävyyttä (kuva 2). Lisäksi virtaussytometria PBMCdden esittää yhtenäinen populaatio lymfosyyttien alatyyppien kaikissa potilasaineistoihin, mikä viittaa siihen, että muutokset geenien ilmentyminen ei näyttäisi johtuvan eroista soluun edustus PBMC lymfosyyttipopulaatioissa, vaikka nämä tiedot eivät poista mahdollisuutta hienovaraisia ​​vaihdoksia alapopulaatioiden (kuva S2).

Geenien ilmentyminen 5 valittujen sytokiinien PBMC vaiheen I keuhkosyöpä (umpinaiset ympyrät) ja ei-syöpä verrokeilla (avoimet ympyrät) leikkauksen jälkeen ovat osoittaneet. Jokainen leikkauksen jälkeinen piste edustaa keskiarvoa (+/- SEM) kertainen muutos ilmentymisessä että nimetyt postoperatiivinen ajankohta verrattuna ennen leikkausta tasolle, joka ilmaistaan ​​log

2 mittakaavassa. Preoperatiivinen arvot (preop) esitetään nollana viitteellisiä. Muutokset alle nollan edustavat downregulation leikkauksen jälkeen. Sillä syöpäpotilaita, näytteiden määrä Laskelmissa käytetyt ovat: Preop: n = 58; 3 kuukautta: n = 48; 6 kuukautta: n = 43; 9 kuukautta: n = 40; 12 kuukautta: n = 40. verrokeilla, näytteiden määrä Laskelmissa käytetyt ovat: Preop: n = 16; 3 kuukautta: n = 11; 6 kuukautta: n = 9; 9 kuukautta: n = 6; 12 kuukautta: n = 7.

toistettujen mittausten varianssianalyysi käytetään eristämään vaikutuksen läsnäolo tai puuttuminen keuhkosyöpään ilmentymistä

CCL3

(p = 0,07),

IL8

(p = 0,01),

IL1B

(p = 0,004),

CXCL10

(p = 0,4) ja

IL2Rα

( p = 0,69). Kukin pylväs esittää keskimääräistä (+/- SEM) suhteellisen kertaluokkamuutos kunkin sytokiinin sisältää kaikkien leikkauksesta tiedot verrattuna ilmaisun ennen leikkausta, ilmaistuna log

2 mittakaavassa. Negatiivinen suhteellinen kertainen muutos osoittaa downregulation jälkeen vaiheen I keuhkosyöpään resektio.

ilmentäminen

CCL3, IL8

ja

IL1B

on suurempi PBMC vaiheen I Lung syöpäpotilaat verrattuna potilaisiin ilman keuhkosyöpä

Voit selvittää PBMC vaiheen I keuhkosyöpään potilailla on suurempi ekspressiotasot

CCL3, IL8

ja

IL1B

kuin potilailla, joilla ei keuhkojen syöpä, RT-qPCR tulokset ennen leikkausta PBMC näytteitä vaiheen I keuhkosyöpä (n = 62) ja ohjaus kohortteja (n = 32) verrattiin. Kuten kuviossa 3, keskimääräinen ilmentyminen keuhkosyöpäpotilaita oli merkitsevästi suurempi verrattuna ohjaimet

CCL3

ja

IL1B

(10 ja 29 kertaiseksi). Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, keskimääräinen ilmaus

IL8

oli 6 kertaa suurempi keuhkosyöpäpotilaita suhteessa kontrolleihin. Sitä vastoin, vaikka tilastollisesti merkitsevä,

IL2Rα

ilmentyminen oli vain 2 kertaa suurempi keuhkosyöpä potilailla, kun taas

CXCL10

ilmentyminen oli olennaisesti muuttumaton. Tärkeää on, kolmen ja kahdentoista kuukauden kuluttua leikkauksesta, ekspressiotasot näyttävät tasaamiseksi välillä syövän ja ohjaus kohortteja (kuva 3).

. Preoperatiivinen PBMC geeniekspressio I vaiheessa keuhkosyöpään potilailla (n = 62) verrattuna ei-syöpäpotilaille suunniteltu tehdään thoraxkirurgian hyvänlaatuisen taudin (n = 32).

CCL3

: p = 0,003;

IL8

: p = 0,23;

IL1B

: p = 0,05;

CXCL10

: p = 0,55;

IL2Rα

: p = 0,01. B. Kolmen kuukauden postoperatiivinen PBMC geeniekspression I vaiheessa keuhkosyöpään potilailla (n = 48) verrattuna ei-syöpäpotilaille (n = 11).

CCL3

: p = 0,79;

IL8

: p = 0,3;

IL1B

: p = 0,1;

CXCL10

: p = 0,8;

IL2Rα

: p = 0,29. C. Kaksitoista kuukautta leikkauksen jälkeinen PBMC geeniekspression I vaiheessa keuhkosyöpään potilailla (n = 40) verrattuna ei-syöpäpotilaille (n = 7).

CCL3

: p = 0,76;

IL8

: p = 0,52;

IL1B

: p = 0,87;

CXCL10

: p = 0,22;

IL2Rα

: p = 0,58. Kaikkien paneelit, jokainen pylväs edustaa suhde keskimääräinen ekspressiotaso syöpäpotilaiden yli keskimääräisen ekspressiotaso verrokeilla ilmaistuna log

2 mittakaavassa. Positiivinen arvo tarkoittaa, että ilmaisu on suurempi syöpäpotilailla verrattuna verrokeilla. Kaksi otoksen t-testejä käytettiin määrittämään merkitystä erojen ilmaisun.

sytokiiniprofiilin Terve Luovuttajan PBMC Mimics

in vivo

Havainnot jälkeen rinnakkaisviljelemällä Lung Cancer Solulinjat

laajentamiseksi vaikutusten analysointi keuhkosyöpään PBMC sytokiiniekspressiota, joka on

in vitro

yhdessä viljelemisen järjestelmää käytettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kaksi eri ihmisen keuhkosyövän solulinjoja käytettiin alemman transwell kammiot: A549, joka on keuhkokarsinoomasolulinja kätkeminen K-Ras-mutaatio ja HCC827, keuhkojen adenokarsinooman solulinja EGFR-mutaatio (E746-A750 del). Edelleen ohjaus, hyvänlaatuinen NHBE soluja käytettiin myös alemmassa Transvvell- kammioihin. PBMC: t, joita käytetään ylemmässä siirtoaltaat, valmistettiin terveistä luovuttajista, joilla ei ole tunnettua keuhkosyöpä historia.

Altistuminen terveiden luovuttajien PBMC-6 ja 18 tuntia joko A549 tai HCC827 indusoiman säätelyä

CCL3, IL8

ja

IL1B

mRNA ajasta riippuva tavalla verrattuna sham-alttiina PBMC (kuviot 4A ja 4B). Vaikka

IL2Rα

mRNA oli myös voimistunut laajuus on huomattavasti pienempi kuin nähty

IL8

ja

IL1B

. Sen sijaan

CXCL10

ilme oli joko ennallaan tai vaimentua jälkeen koinkubaation kanssa keuhkosyövän solulinjat. Kiinnostavaa kyllä, tämä malli sytokiinin geenin ilmentyminen ei nähty PBMC viljeltiin yhdessä hyvänlaatuinen NHBE soluja (kuvio S3). Lisäksi, sama buffy coats käytetään co-kulttuuri NHBE solujen ja PBMC: (joilla ei ole sytokiinivasteeseen) on myös alttiina A549 ja HCC827 keuhkosyövän soluja, joissa vaste on samanlainen kuin osoitettu kuviossa 4 on selvää, (tietoja ei ole esitetty) .

Keuhkosyöpä solulinjaa viljeltiin yhdessä terveen luovuttajan PBMC: kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. PBMC geenien ilmentyminen ja supernatantin proteiini tasot arvioitiin kullekin 5 valitun sytokiineja. A. Geeniekspressio PBMC alttiina A549-soluja. B. Geeniekspressio PBMC alttiina HCC827 soluihin. Paneelien A ja B, kukin pylväs merkitsee (n = 8 terveiden luovuttajien) suhteellinen kertainen muutos (+/- SEM) välillä keuhkosyöpäsolua alttiina PBMC ja PBMC altistuvat median yksin ilmaistuna log

2 mittakaavassa. Suljettu palkit osoittavat 6 tuntia yhteistyön kulttuurin, kun taas avoin palkit osoittavat 18 tuntia yhteistyön kulttuuri. C. Sytokiini proteiinin tasot supernatantissa yli co-viljelmä A549-solut terveisiin luovuttajan PBMC. D. Sytokiini proteiinin tasot supernatantissa yli co-viljelmä HCC827 solujen terveen luovuttajan PBMC. Paneelien C ja D, kukin pylväs merkitsee (n = 8 terveiden luovuttajien) suhteellinen kertainen muutos (+/- SEM) välillä keuhkosyöpäsolua alttiina PBMC (18 tuntia yhteistyön kulttuuri) ja PBMC altistuvat median yksin ilmaistuna log

2 mittakaavassa. Yksi näyte-t-testejä käytettiin määrittämään merkitystä havaittu keskimääräinen kertamuutoksia. Kaikissa paneelit, tähdellä osoittaa p 0,05. ND ilmoittaa, alle määritysrajan tasolle.

arvioimiseksi Sytokiiniproteiinin tasoilla yhteistyössä kulttuuri järjestelmä, supernatantit kerättiin seuraavat 18 tuntia rinnakkaisviljelemällä keuhkosyöpä solulinjat, ja arvioitiin käyttämällä Luminex määritys (kuviot 4C ja 4D). Vaikka IL8, CXCL10 ja sIL2Rα pitoisuudet jäljitteli vastaavan geenin ilmentymisen data (kuvio 4A ja 4B), CCL3 ja IL1B pitoisuudet olivat alle toteamis- kaikissa näytteissä molempien solulinjojen. Ongelman puute havaittavissa CCL3 ja IL1B viljelmäsuperhatanteissa PBMC arvioitiin käyttäen virtaussytometria solun sisään läsnäolon CCL3, IL8 ja IL1B. Kuten on esitetty kuviossa 5A, solunsisäinen CCL3, IL8 ja IL1B havaittiin CD3 + osa (T-solut) terveen luovuttajan PBMC-, joka oli ollut viljeltiin yhdessä joko keuhkosyövän solulinjassa, mutta ei niitä viljeltiin ilman keuhkosyövän solut. Samanlainen tulos saatiin, että CD14 + PBMC-osa (monosyytit), kuviossa 5B on esitetty. Sitä vastoin CD19 + fraktio (B-solut), ja CD56 + fraktio (NK-solut) ei havaittu kasvua solunsisäisessä Näiden sytokiinien tasot (tuloksia ei ole esitetty).

jälkeen yhdessä viljelemisen, PBMC vahvistetaan ja arvioidaan käyttäen virtaussytometria solunsisäiseen sytokiinien (CCL3, IL8 ja IL1B). Näkyy on yksi edustaja terveestä luovuttajasta (out of 3 suoritettu). A. CD3 + solufraktio. Abskissa edustaa CD3 värjäys, kun taas yksittäisten sytokiinien värjäytyminen heijastuu pitkin ordinaatta. Prosenttiosuus kaksinkertaisesti värjätään solut on kuvattu oikeassa yläkulmassa jokaisen osapaneelin. B. CD14 + solujen fraktio. Abskissa edustaa CD14-värjäys, kun taas yksittäisten sytokiinien värjäytyminen heijastuu pitkin ordinaatta. Prosenttiosuus kaksinkertaisesti värjätään solut on kuvattu oikeassa yläkulmassa jokaisen osapaneelin.

Keskustelu

rooli sytokiinien biologian ihmisen maligniteetti on monimutkainen, mutta suuri osa vuorovaikutus kasvainsolujen ja isännän immuunijärjestelmän solujen ajatellaan välittyvän tämän suuren perheen proteiineja ja glykoproteiinien [6]. Tämän seurauksena on olemassa kasvava määrä kirjallisuutta arvioida seerumin sytokiinien tasojen suhteen viittaavia tekijöitä sekä hematologisia ja kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä. Monet näistä tutkimuksista on kuitenkin vain kun seerumin sytokiinien tasoja syöpäpotilailla kuin terveillä vapaaehtoisilla, jossa korostetaan mahdollisia hyödyllisyys näiden mittausten biomarkkerina [12], [13].