Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epidermaalisen kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät ovat olleet tehokkaita ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita. Kuitenkin hankitun resistenssin lopulta kehittyy useimmilla potilailla huolimatta alustavan myönteisen vastauksen. Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että on olemassa molekyyli- yhteys hankittu resistenssi ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). N-kadheriinin on mukana EMT ja etäpesäkkeiden syöpäsoluja. Täällä analysoimme N-kadheriiniekspressiota ja toimivat erlotinibin kestävä keuhkosyövän solulinjat.

Methods

H1650 solulinjoja käytettiin luomaan alalinjan resistentti erlotinibi (H1650ER). Sitten induktio EMT analysoitiin käyttämällä immunovärjäystä ja western blotteja H1650ER soluissa. N-kadheriinin ilmentymisen resistenttien solujen tutkittiin käyttäen FACS ja western blot. Lisäksi invaasiomääritys suoritettiin karakterisoimiseksi resistentit solut. Vaikutukset N-kadheriinin soluproliferaatioon ja invaasiota analysoitiin. Yhdistyksen N-kadheriiniekspressiota kanssa EMT fenotyyppi tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista analyysiä 13 arkistoidaan, keuhkojen adenokarsinooma kudoksia, ennen ja jälkeen hoidon erlotinibia.

Tulokset

H1650ER soluissa, N- kadheriinin ilmentyminen säädeltiin, rinnastettiin alennettu ilmentyminen E-kadheriinin. Merkityt histologisia muutoksia ja kehittämistä karamaisen morfologia mukaan H1650ER solut tehtiin EMT, mukana lasku E-kadheriinin ja kasvu vimentiinista. Muutos EMT aseman välillä pre-ja jälkikäsittelyn havaittiin 11 ulos 13 tapauksessa (79%). Biopsioissa resistenttien syöpien, N-kadheriinin ekspressio lisääntyi 10 ulos 13 tapauksessa. Induktio EMT oli sopusoinnussa aggressiivinen ominaisuuksia. Esto N-kadheriinin ilmentyminen siRNA testattiin leviämisen vähentämiseksi ja invaasion H1650ER solujen

in vitro

.

Johtopäätökset

data todistaa, että induktio EMT vaikuttaa omalta hankitun vastustuskyvyn EGFR-TKI: in keuhkosyöpä. Se ehdottaa, että N-kadheriinin on potentiaalinen molekyylikohteena hoidossa NSCLC.

Citation: Zhang X, Liu G, Kang Y, Dong Z, Qian Q, Ma X (2013) N-kadheriiniekspressiota Is liittyvä hankinta EMT Fenotyyppikuvaus ja Enhanced Invasion Erlotinibi hylkivät Keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e57692. doi: 10,1371 /journal.pone.0057692

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 28 tammikuu 2013; Julkaistu: 08 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Sopimus apurahan sponsori: Science Research Project Henanin maakunnassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yleisin kuolinsyy johtuu pahanlaatuisten karsinoomien ja käyttää perinteisiä kemoterapeuttisten vastaan ​​keuhkosyöpätapauksista vaatimattomasti tehokas [1] – [3]. Viimeaikaiset edistysaskeleet käyttäen tyrosiinikinaasi-inhibiittorit, jotka spesifisesti estävät epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on säädetty selvästi etua potilasryhmissä, joiden kasvaimet satama geneettisen poikkeavuuksia [4] – [7]. Nämä lääkkeet ovat johtaneet vaikuttavia parannuksia ilman taudin etenemistä (PFS) kemoterapiaan verrattuna. Kuitenkin lääkeresistenssin lopulta syntyy eri mekanismien kautta [8] – [12]. Tämä kehittynyt resistenssi syyksi on kaksi pääasiallista menetelmää. Yksi ehdotettu mekanismi on syntyminen pahanlaatuisen klooni toissijainen mutaatio EGFR kinaasin domeenin (T790M), joka kumoaa estoaktiivisuus TKI: [13] – [14]. Toinen 15: sta 20% tapahtua monistuminen MET reseptorin tyrosiinikinaasin, joka aktivoi alavirran solunsisäisen signaloinnin riippumatta EGFR [15] – [16]. Lisäksi kehittyvien todisteet viittaavat siihen, että hankinta EMT fenotyypin liittyy kehittynyt resistenssi EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) [17] – [20]. EMT on ominaista yhdistetty menetys epiteelisolujen risteyksestä proteiineja, kuten E-kadheriinin, ja voitto mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinistä. Vuonna EMT prosessissa, epiteelisolujen menettävät ominaisuuksia, saada mesenkymaalisten ominaisuuksia, ja tulla liikkuvia ja invasiivisia [21].

N-kadheriinin, joka on mesenkymaaliset kadheriinin liittyvä EMT, on ratkaisevan tärkeää syövän etenemisen suhteen sekä etäpesäkkeiden ja kemoterapiaa vastarintaa. E-kadheriinin ja N-kadheriinin on monia rakenteellisia ja toiminnallisia ominaisuuksia. Molemmat molekyylit perustaa kalsiumista riippuvan homofiilisiä solu-solu tarttuvuus ekstrasellulaaridomeenissaan ja liittyvät catenins niiden solunsisäiset [22]. Yksi piirre EMT on vähentää solu-solu kiinnikkeistä, erityisesti vähentäminen E-kadheriinin, joka on kriittinen säilyttämään fenotyyppi.

Tässä tutkimuksessa arvioitiin, onko induktio EMT liittyi hankittu resistenssi havaittu aikana erlotinibin hoidon ja määrittää rooli N-kadheriinin niillä potilailla, joilla NSCLC ennen ja jälkeen erlotinibin hoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen keuhkon adenokarsinooma solulinja H1650 saatiin Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja viljeltiin kostutetussa 5% CO 2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa, DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, penisilliiniä ja streptomysiiniä. Erlotinibin kestävä solulinja (H1650ER) perustettiin altistamalla vanhempien solujen kasvavia pitoisuuksia erlotinibin, jopa 10 uM, useita kuukausia. Resistentit solut ylläpidettiin alustassa, joka sisälsi 10 uM erlotinibin ennen kutakin koetta.

Reagenssit ja vasta-aineet

Hiiren anti-E-kadheriini-vasta-ainetta (sc-21791) ja monoklonaalinen anti- vimentiinin vasta-ainetta (sc-53464), hiiren anti-β-aktiini-vasta-aine (sc-47778), kanin anti-N-kadheriinin vasta-ainetta (sc-59987), fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (sc-53800), ja PE-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (sc-53464) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Akt (# 9272), S473 p-Akt (# 4060), EGFR (# 2239), ja p-42/44 MAPK (# 4695), olivat kaikki ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). EGFR [pY1068] (CB11007889) ja kanin anti-Erk-vasta-aine (CB1241938) hankittiin Affinity Bioreagents (Golden, CO.).

proliferaatiomääritystä

soluproliferaatiomääritykset mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8-määritys (CCK-8, Dojindo Laboratories, Santa Clara, CA), joka käyttää biopelkistys 2- (2-metoksi-4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2, 4-disulfofenyyli) -2H tetrazolium natrium (WST-8) meripihkanväriseen formatsaaniksi mitata solujen elinkykyä. Lyhyesti, 100 ui H1650 ja H1650ER solut, 2 x 10

4 /ml, inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa erlotinibin 96-kuoppaisille viljelylevyille 48 tuntia. Seuraavaksi elatusaine 96-kaivoista korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 5% CCK-8-reagenssia; tunnin kuluttua, absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin ja arvot korjattiin vähentämällä absorbanssi Verrokkikuoppien joka ei sisällä soluja.

immunohistokemia

kudoksille 13 tapausta keuhkoadenokarsinooma, sekä ennen ja jälkeen erlotinibin hoidon, kerättiin välillä tammikuussa 2008 ja heinäkuu 2011 Henanin Provincal kansan sairaalassa, ja upotettiin parafiiniin. Kasvainkudoksessa Levyt de-paraffinized ja kuivattu käyttäen Slide Brite (Sasco Chemical Group, Inc.). Antigeeni haku suoritettiin käyttäen 0,05 M glysiini-HCl-puskuriin, pH 3,5, joka sisälsi 0,01% (w /v) EDTA, 95 ° C: ssa 20 minuuttia ja värjättiin vasta-aineella ihmisen E-kadheriinin, vimentiinistä ja N-kadheriinin, joka ovat samat kuin in vitro -määrityksiä ,. Arviointi immunovärjäyksen näistä kohdista tehtiin sokea kaksi koulutettua patologeja jotka eivät tienneet kliinisen taustan näytteiden. Intensiteetti E-kadheriinin, vimentiinistä ja N-kadheriinin pisteytettiin ja asetettiin neljään luokkaan sen mukaan, värjäys: 0 0%; 1 1-33%; 2 34-66%; ja 3 67-100%. Kaikki 13 ihmisen kudosten mukana tutkimuksessamme tehtiin periaatteiden mukaisesti vahvistettuja Helsingin julistuksen 1964 ja kaikki myöhemmät versiot. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Henanin maakunnan ihmisten sairaala, kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

Sirna (siRNA) Transfektio

Sirna (siRNA) spesifinen N-kadheriinin ostettiin Invitrogen. Sekvenssi, jota käytetään N-kadheriinin häiritseviä RNA: ita (siRNA) oli 5′-CUAACAGGGAGUCAUAUGGUGGAGC-TdT-3 ’. Minimoida epäspesifinen vaikutuksia häiritsevien RNA: iden ei-kohdistuksen ohjaus siRNA, myös ostettu Invitrogen, käytettiin negatiivisena kontrollina. SiRNA-transfektioreagenssia (Invitrogen) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Koe toistettiin ainakin kolme kertaa, itsenäisesti.

Matrigel Invasion Pitoisuus

Soluja käsiteltiin N-kadheriinin-spesifisiä siRNA: ita 48 tuntia pudotus N-kadheriinin ilmentymisen. Invasion havaittiin käyttäen siirtokuoppaan kulttuuri lisätään 6,5 mm ja 8 um huokoskoko suodattimet (Greiner Bio-One SAS, Courtaboeuf, Ranska). Sitten 3 x 10

4 solua 100 ul: ssa RPMI, jossa 1% FCS siirrostettiin ylemmässä osastossa, ja 600 ui RPMI, 10% FCS lisättiin alempaan kammioon. Solujen annettiin kulkeutua 24 tuntia 37 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen solut ylä- puolella transwell, solujen alapuolella värjättiin 0,1% kristallivioletilla liuosta (Becton Dickinson) ja lyysattiin 10% etikkahappoa kvantifiointiin densitometrisellä mittaus 550 nm: ssä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot -analyysi

proteiinit solulysaateista, jotka oli valmistettu käyttäen RIPA-puskuria [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia ja 1% Nadeoxycholate (pH 7,4)], johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita (1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml pepstatiini A: ta, 10 ug /ml aprotiniinia ja 5 ug /ml leupeptiiniä), havaittiin SDS-PAGE: lla ja sitten sähköllä Immobilon kalvoja (Invitrogen); nämä kalvot myöhemmin koetettiin spesifisten vasta-aineiden. Toissijainen vasta-aineita käytetään piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun vasta-aineita ja kalvo kehitettiin käyttäen ECL kit (Thermo). Tämä koe toistettiin ainakin kolme kertaa, itsenäisesti.

klonogeeninen määritys

H1650 ja H1650ER soluja käsiteltiin 0,05% trypsiiniä ja maljattiin 6-kuoppaisille maljoille 1 x 10

4 solua per kuoppa 0,35% agaroosia DMEM kerrokseksi 0,7% agaroosia samassa väliaineessa. Pesäkkeenmuodostusta havaittiin 2-3 viikon viljelyn. Seuraavat värjäys 0,005% kristallivioletilla, pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Solujen lukumäärä laskettiin ja keskiarvo määrittää kloonaustehokkuuteen.

fluoresoiva Immunosytokemia

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla pestiin kolme kertaa PBS: llä. Ne kiinnitettiin 10 minuutin ajan kylmällä metanolilla ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Peitinlasit blokattiin sitten liuoksessa, jossa oli PBS: ää, 10% naudan seerumia ja 0,1% Tween 20: ssa 1 h. Soluja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen joko E-kadheriinin tai vimentiinista 2 ug /ml 1 tunnin ajan, sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden laimennettu PBS: ään, 5 tai 10% naudan seerumin, ja 0,1% Tween 20: ssa inkuboinnin jälkeen coverslip 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa peitelasit pestiin kuten edellä on kuvattu, ja joka on asennettu liukuu elatusaineessa, joka sisälsi DAPI.

virtaussytometria-analyysi

Cancer soluja erottaa käyttämällä 0,05% trypsiiniä; ne pestiin PBS: llä ja 100 ul: n 10

5-soluja PBS: ssä pantiin 96-kuoppaisille V-pohjaisille levyille ja inkuboitiin RT: ssä 1 h IgG. Solut pestiin kahdesti PBS: llä. Pesujen jälkeen PBS: llä, sitoutunut vasta-aine havaittiin käyttäen vuohen anti-ihmisen-PE tai vuohen anti-ihmisen-CY3, ja analysoitiin FACS: llä (LSRII, Becton Dickinson).

Tilastollinen analyysi

SPSS 13.0 tilastollinen paketti (SPSS Inc., Chicago, IL) käytettiin tietojen analyysejä. Merkitys, niiden erot kovariaattien määritettiin kaksisuuntaisella v2 testi. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Hankinta Erlotinibi Resistance in H1650 Cell Lines Näytteillä Variable signalointireitin aktivointi

erlotinibin kestävä keuhkosyövän solulinjaa H1650 (H1650ER), alun perin peräisin vanhempien H1650 solulinja, osoitti lisääntynyt riippuvuus EGFR signalointi kasvua, kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Viljelemällä tästä solulinjasta, kun läsnä on jatkuvasti korkea konsentraatio erlotinibin aikana useita kuukausia, olemme pystyneet eristämään solulinjat, jotka kykenevät kasvaa erlotinibin pitoisuuksina 10 uM. Hidas nousu kasvu tapahtui, mikä osoittaa, että solulinjan vastustuskykyinen erlotinibille oli kehitetty. Kasvukäyrät on esitetty kuvassa. 1A.

(A) Erlotinibi-resistenttien solujen (H1650ER) vahvistettiin pitkäaikainen altistus kasvavien pitoisuuksien erlotinibin. H1650 emosoluista ja H1650ER ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 103 solua 100 ui per kuoppa, viljeltiin yön yli, ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla erlotinibin 72 tuntia kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO2. Elossa fraktiot määritettiin CCK-8 määrityksessä. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja S.D.s laskettiin. *, P 0,01. (B) H1650 vanhempien ja H1650ER soluja viljeltiin 3 päivää kanssa tai ilman erlotinibin hoitoa (10 umol /l). Kokosolulysaateista valmistettiin ja analysoitiin Western blot, jossa on esitetty vasta-aineilla.

Seuraavaksi tutkimme resistenssimekanismi EGFR-TKI erlotinibi. Käyttämällä Western blotit, me tutkittiin lysaatit sekä vanhempien H1650 ja H1650ER soluja käsitellään 6 tuntia erlotinibin. Erlotinibi hoito esti tehokkaasti EGFR ja Akt fosforylaatio vanhempien H1650 soluja mutta ei H1650ER soluissa. Näissä resistentit solut, P-Akt oli säädelty ja arvioitiin ehdokkaaksi osallistumisesta mekanismi hankittu resistenssi. Toisin kuin pysyviä Akt fosforylaation, Erk fosforylaatio oli alas-säädellä erlotinibin kohtelu resistentit solut. Nämä tulokset viittaavat siihen, että erlotinibin-resistenttien solujen hyväksynyt uuden mekanismin aktivoimiseksi PI3K /Akt-reitin (Fig. 1 B).

2. N-kadheriinin Yliekspressio indusoi epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon (EMT) in Erlotinibi kestävä H1650ER Cells

Tunnistaa markkereita erlotinibin vastarintaa, vertasimme geeniekspression pariksi vanhempien ja kestävä solulinjoissa. N-kadheriinin ilmentyminen erittäin koholla H1650ER solulinjoissa, jota vahvistettiin FACS ja western blot. (Fig. 2A, B). Seuraavaksi morfologiset erot vanhempien H1650 ja kestävä H1650ER solulinjojen havaittiin helposti (Fig. 2C). Molekyylitasolla, nämä silmiinpistävää morfologisia ominaisuuksia olivat liittyy lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten proteiinin vimentiinista ja vähentynyttä ilmentymistä epiteelin markkerin E-kadheriinin (kuvio. 2D, E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että hankinta erlotinibin vastuksen aiheuttama molekyylitason muutoksia, jotka olivat yhdenmukaisia ​​EMT.

(EN) ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymistä N-kadheriinin havaittiin FACS-analyysillä. (B) Solulysaatit H1650 ja H1650ER soluja havaittiin Western blot; lysaatit arvioitiin myös tason N-kadheriinin proteiinia. (C) H1650 emosoluista ja resistenttejä H1650ER solut arvioitiin morfologiset muutokset, jotka ovat yhdenmukaisia ​​EMT. Mittaviivat: 25 pm. (D) Alennettu ilmentyminen E-kadheriinin ja lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista havaittiin käyttäen Western blot. (E) immunofluoresenssi suoritettiin vahvistaa muutoksia markkeriproteiinien joko epiteeli- tai mesenkymaaliset fenotyyppejä. Mittaviivat: 25 pm.

3. Up-modulaatio N-kadheriinin Expression ja EMT löydettiin Koepalat Kestää Syövät

Tunnistaa ilmentymisen N-kadheriinin ja EMT biomarkkereita EGFR-mutantti NSCLC kudosnäytteistä, suoritimme koepaloja potilaille ennen erlotinibi käsittely ja tuolloin, että lääkeresistenssi hankittiin. Kolmetoista potilailla oli kasvainkudoksen käytettävissä sekä ennen että jälkeen TKI hoidon. Ominaisuudet 13 potilaalla on esitetty taulukossa 1. immunohistokemiallinen värjäys Tuumorinäytteet käytettiin analysoimaan proteiinin ekspression epiteelin markkerin E-kadheriinin ja mesenkymaaliset merkki vimentiinista. Epiteelin markkereita havaittiin lähes kaikissa biopsia näytteet pienisoluista keuhkosyöpää ennen erlotinibi hoitoon, kun taas mesenkymaaliset markkereita havaittiin 2 ulos 13 kasvain kudosten. Resistenssitapauksissa syöpiä, ilmaus E-kadheriinin aleni 5 out of 13 koepaloja. Lisäksi 11 (84,6%) ulos 13 kasvainten vimentiinistä ilmaisu lisääntynyt sen jälkeen, kun erlotinibia vastus ostettiin; siten yhteensä 11 yksilöiden osoitti merkkejä EMT vastauksena induktioon lääkeresistenssi.

Kokonaismäärästä tapauksissa 12 ulos 13 tapausta olivat negatiivisia N-kadheriinin lukuun ottamatta yksi adenokarsinooma tapaus, joka oli polttoväli N-kadheriiniekspressiota ennen erlotinibi hoitoon. Toisaalta, ilmaus N-kadheriinin nostettiin 10: ssä 13 koepaloja vastustuskykyisten syöpiä. Immunohistokemiallista ilmentyminen esitettiin yhteenveto taulukossa 2. Edustavia immunohistokemiallisella värjäykset on esitetty kuviossa 3A.

(A) häviäminen E-kadheriinin ja lisää sekä vimentiinista ja N-kadheriinin ilmentymisen havaittiin näiden kasvainten (alempi paneeli), verrattuna niiden vastaavan ensisijaisen kasvaimia (ylempi paneeli). Mittaviivat: 100 pm. Suurennos, × 200.

4. Voimavarojen Kasvua ja Invasion nostettiin vuonna H1650ER Solut

induktio EMT oli sopusoinnussa aggressiivinen ominaisuuksia, kuten lisääntynyt klonogeeniset kasvu, solun liikkuvuus ja invaasiota. Edelleen karakterisoimiseksi H1650ER soluja, vertasimme kasvua vanhempien ja resistenttejä solulinjoja käyttäen solu-laskenta-määritys; prosenttiosuus elävien solujen laskettiin suhteessa käsittelemättömien kontrollien (Fig. 4A). Olemme myös suorittaa Matrigel päällystetyn kammion määritystä, joka oli kasvussa solujen invaasion H1650ER solujen verrattuna vanhempien soluihin (Fig. 4B). Lisäksi olemme havainneet, että H1650ER solut hankittiin tuumorigeenisemmiksi fenotyyppi, joka on dokumentoitu lisääntynyt klonogeenisten kasvua (Fig. 4C).

(A) kasvukäyrät H1650, H1650ER solut ja kaikki muut solut tehtiin rutiini kulttuuri välineellä. Arvot esittävät keskiarvoa solujen määrä ± S.D. kolminkertaisten kuoppien kerta-pisteen ja edustavat kolme yksittäistä kokeita. Virhe palkit osoittavat SD; *, P 0,01; **, P 0,001. (B) Vanhempien solut ja H1650ER-solut ympättiin Matrigel kuorrutettu polykarbonaattisuodattimille analysoida invasiivisen potentiaaleja. Mittaviivat: 25 pm. Tulokset saatiin kolmesta kokeesta, ja pylväät edustavat S.D.s; *, P 0,01. (C) Vanhempien solut ja H1650ER solulinjaa viljeltiin myös pehmeässä agarissa testataan niiden kyky muodostaa pesäkkeitä, kun 15 päivää inkuboinnin jälkeen. Alkuperäinen suurennos, × 10. Tulokset saatiin kolmesta kokeesta.

5. Down-modulaatio N-kadheriinin ilmentyminen on H1650ER Solut alensivat Invasion

H1650ER solut, jotka ekspressoivat suuria määriä N-kadheriinin oli alaspäin moduloitu lyhytaikaisella transfektiolla siRNA: illa. Nämä tehokkaat siRNA tuotetaan merkittäviä vähennyksiä N-kadheriinin proteiinin (Fig. 5A) verrattuna kaksi ohjaus solulinjoja: villityypin solulinjan ja solulinja transfektoitu lipofektamiinia. Samaan aikaan, N-kadheriinin hiljentäminen vähentää AKT-fosforylaation (kuvio. 5B). Vaimennussäätely N-kadheriiniekspressiota nähtiin lisääntynyt invaasio kykyjä Matrigel päällystettyä kammio verrattuna villityypin soluja tai mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5C).

(A) N-kadheriiniekspressiota että H1650ER transfektoiduissa soluissa siRNA kohdistaminen N-kadheriinin 48 tunnin kuluttua. Proteiinin ekspressio mitattiin virtaussytometrialla, yksi edustava koe. (B) kyky hyökkäys arvioidaan transfektion jälkeen 48 tuntia, käyttäen matrigeeliä päällystetty kammioon ja 20% FCS, kuten kemoattraktantti. Mittaviivat: 25 pm. (C) muutokset AKT ja fosfori-AKT kinaasiaktiivisuuden taso upon N-kadheriinin siRNA hiljentäminen Western blot.

Keskustelu

Tässä esitämme näyttöä siitä, että kehittynyt resistenssi, EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori, erlotinibin keuhkosyöpä välittyy epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että H1650 keuhkosyövän soluja kehittäneet vastustuskyvyn erlotinibin ja läpikävivät EMT fenotyypin muutokset, jotka olivat yhdenmukaisia ​​vähentynyttä ilmentymistä epiteelin markkerin E-kadheriinin ja lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten markkereita vimentiinista. Lisäksi näissä kliinisissä näytteissä, esikäsittely- syövät näytteillä histologialtaan adenokarsinoomaa säilynyt kalvomainen värjäyksen E-kadheriinin, kun taas positiivinen ilmaus vimentiinista oli useammin tunnustettu kehittynyt, jälkikäsittely syöpiä, mikä osoittaa, että jotkut kasvaimet koki EMT. Erityisesti meidän tiedot osoittavat, että EMT liittyy erlotinibin vastarintaa NSCLC, kuten aiemmin raportoitu [24] – [25].

Aberrant ilmentymä kadheriinit tai kadheriinin vaihto, on yksi tärkeimmistä tapahtumista EMT tietyntyyppisissä syövän [26] – [27]. Inaktivointi E-kadheriinin on tärkeä tapahtuma kasvaimen etenemistä [28] – [29]. Epänormaali aktivointi kadheriinin, kuten N-kadheriinin, olisi myöhempi tapahtuma, joka edistää angiogeneesiä, aivojen etäpesäke, ja siihen liittyy huono säilyminen [30] – [31]. Tutkimuksessamme N-kadheriinin taso säädellään ylöspäin H1650ER soluissa. Immunohistokemia osoitti myös, että N-kadheriinin ilmentyminen merkitsevästi yläreguloituja toistuvia, jälkikäsittely keuhkosyöpä yksilöitä, jotka on kerätty 10 ulos 13 potilaalla. Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn N-kadheriinin vähentää kasvun ja invaasion H1650ER solujen

in vitro

. Poikkeava N-kadheriinin ilmeikäs asema sekä

in vitro

ja

in vivo

valaisee hypoteesia, että ratkaiseva roolit N-kadheriinin sijaita paitsi EMT, mutta myös tuumorimetastaasissa ja erlotinibin vastus. Kuitenkin enemmän expremental tiedot ovat tarpeen tarkistaa hypoteesia. Koska kaikki keuhkoadenokarsinooma ovat sentitve TKI, koska vain muutama solulinjat ovat herkkiä TKI, kuten A549, PC9, HCC827, CALU-3, HCC4006 ne, jotka saavat hankittu mutaatio EGFR-geenin [21], [32 ] – [35]. Vuonna rajoitettu herkkä solulinjojen tutkimusta suhteesta N-kadheriinin ja vastus on vielä vähemmän. Yamauchi M, et al [32] todettiin myös N-kadheriinin ilmentyminen merkitsevästi yläreguloituja gefitinibin kestävä PC9 /ZD solujen kätkeminen hankittu resistentti mutaatio T790M että EGFR-geenin, muut solut, jotka ilmentävät N-kadheriinin havaittiin resistenttejä erlotinibi (A549, H157, ja H322), ja että estäminen N-kadheriiniekspressiota käyttämällä siRNA johtanut merkittävään väheneminen elinkelpoisuutta A549 ja H322-soluissa.

Muut tutkijat ovat raportoineet, että N-kadheriinin ohjaa liikkuvuutta ja muuttoliike syöpäsolujen tukahduttamalla Akt fosfory- [36] – [37]. Yhteisymmärryksessä osavastuu p-Akt aktivaation hyökkäystä joidenkin syöpäsolujen linjat ilmentävät N-kadheriinin, huomasimme, että erlotinibin tukossa EGFR ja ERK-fosforylaation muttei Akt fosforylaation erlotinibin kestävä H1650ER soluissa. Pysyviä Akt-fosforylaation erlotinibin kestävä keuhkosyövän soluja, viittaavat siihen, että nämä solut antaa vaihtoehtoisen mekanismin aktivoimiseksi PI3K /Akt hengissä [38] – [39]. Ehdotamme, että Akt aktivaatio saattaa olla yhteydessä N-kadheriinin ylössäätöä, jota tuettiin tuloksemme että jatkuva Akt-fosforylaation erlotinibin kestävä keuhkosyövän soluja voitaisiin ratkaista N-kadheriinin estäjä. Tämä näyttää olevan sopusoinnussa kirjallisuutta. Tanaka H et ai. osoittavat, että N-kadheriinin hiljentäminen vähentää AKT-fosforylaation, kun taas N-kadheriinin yliekspressio lisää AKT-vaikutusta eturauhasen syöpäsolujen [40]; Vastaavasti, Wallerand H et ai. osoittavat, että N-kadheriinin ilmentyminen liittyy Akt aktivointi ja korkea invasiivisuus ihmisen virtsarakon syövän solulinjat [41]. Joten näyttää siltä, ​​että N-kadheriinin ei ole vain biomarkkeri TKI vastustuskyky altistumisen jälkeen EGFR: n estäjien, mutta myös toimiva molekyyli.

Yhteenvetona Tutkimuksemme tarjoaa uuden käsityksen mekanismeja NSCLC ja TKI vastus, paljastaen että säätelyä N-kadheriinin in H1650 ER soluissa johtaa lisääntyneeseen kasvaimen solujen vaeltamiseen, invaasiota ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Tuloksemme viittaavat myös siihen, että ylläpito EMT fenotyypin H1650ER soluissa saattaa liittyä jatkuva ilmentyminen N-kadheriinin. Siksi N-kadheriinin voi toimia lupaava uusi kohde syöpien hoitoon, joilla on hankittu vastustuskyky EGFR TKI. Koska N-kadheriinin ilmentyy solun pinnalla, voimme myös pohtia, onko terapeuttisia kohteita käyttäen N-kadheriinin-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita on tehoa näissä syöpäsoluissa, joilla on hankittu vastustuskyky EGFR-tyrosiinikinaasi.

Tiedoksi

kirjoittajat ovat kiitollisia Zheng Wang (Department of Respiratory Medicine, Hefei No.1 kansan sairaalan Hefei, Anhui, Kiina) ja Xiao Li (Department of Respiratory Medicine, Henanin maakunnan kansan sairaalan Zhengzhou, Henan, Kiina) varten kommentteja käsikirjoituksen.