Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kliiniset tutkimukset ovat vahvistaneet turvallisuuden valikoivasti onkolyyttisten adenovirusten hoidossa pitkälle edenneitä syöpiä. Kuitenkin yhä tehokas virukset voivat aiheuttaa enemmän myrkyllisyyttä ja siksi se olisi hyödyllistä, jos replikointi voitaisiin tarvittaessa kumota. Analysoimme viruksia, joissa on syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) tai verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) -promoottori ohjaamiseksi replikaatiota. Tulehduskipulääkkeet voivat laskea Cox-2-proteiinin tasot ja siksi arveltu, että myös promoottori voi vaikuttaa. Koska Cox-2 moduloi ilmentymisen VEGF, myös VEGF promoottori saattaa olla hallittavissa. Ensin arvioitiin vaikutus anti-inflammatoriset aineet on promoottorin aktiivisuutta tai adenovirus infektiivisyys

in vitro

. Lisäksi olemme analysoineet onkolyyttinen tehoa virusten

in vitro

ja

in vivo

kanssa ja ilman reagenssien. Lisäksi vaikutus viruksen replikaatioon analysoitiin. Huomasimme, että RGD-4C tai Ad5 /3 muunnettu kuitujen parantunut onkolyyttisten tehoa virusten

in vitro

ja

in vivo

. Huomasimme, että molemmat promoottorit voivat vaimentua deksametasonilla, natriumsalisylaatti tai salisyylihappoa. Onkolyyttiset tehokkuus korreloi promoottorin aktiivisuutta ja

in vitro

viruksen tuotantoa voitaisiin kumotaan aineiden.

In vivo

näimme hyvä terapeuttinen teho virusten malli annetaan laskimoon metastaattisen kohdunkaulan syöpä, mutta estävää vaikutusta deksametasonin ei ollut tarpeeksi vahva antamaan merkittäviä eroja monimutkaisessa

in vivo

ympäristössä. Tuloksemme viittaavat siihen, että anti-inflammatoriset lääkkeet voivat vaikuttaa replikaatio adenoviruksen, joka voisi olla merkitystä tapauksessa replikaatioon liittyviä haittavaikutuksia.

Citation: Kanerva A, Lavilla-Alonso S, Raki M, Kangasniemi L, Bauerschmitz GJ, Takayama K, et al. (2008) systeeminen terapia kohdunkaulan syövän kanssa mahdollisesti Säädettävien Onkolyyttiset adenovirukset. PLoS ONE 3 (8): e2917. doi: 10,1371 /journal.pone.0002917

Editor: Alfred Lewin, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 toukokuu 2008; Hyväksytty: 07 heinäkuu 2008; Julkaistu: 13 elokuu 2008

Copyright: © 2008 Kanerva et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat EU FP6 THERADPOX ja Apotherapy, HYKS Research Funds (EVO), Sigrid Juseliuksen säätiö, Suomen Akatemia, Emil Aaltosen säätiö, Suomen Syöpäyhdistys, Helsingin yliopisto, Sohlberg säätiö, Instrumentarium Research Fund, Suomi Oncology ry, Helsinki Biomedical Graduate School, Helsinki Graduate School in Biotechnology and Molecular Biology, Suomen Kulttuurirahasto, Research Foundation Bayer Schering Pharma, Deutsche Forschungsgemeinschaftin /DFG ja Biocentrum Helsinki. A. H. on K. Albin Johansson tutkimusprofessori on Suomen Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

patogeneesi kohdunkaulan syöpä on ominaista jatkuva infektio korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HPV), yleisesti hyväksyttyjä edellyttämällä kohdunkaulan syövän aloittamista. Murto potilaista, HPV-infektio etenee dysplasia ja syövän

in situ

invasiivisia syövän ja etäpesäkkeitä [1]. Vain muutama viruskannat ovat vastuussa kohdunkaulan kasvaimet, joista HPV16 osuus on yli puolet ilmoitetuista tapauksista. Valitettavasti kumpikaan parannukset kirurgiassa eikä sädehoidossa on vähentynyt merkittävästi potilaiden kuolleisuutta kehittyneitä, toistuva tai etäpesäkkeitä. American Cancer Society arvioi, noin 9 700 uutta tapausta ja 3 700 kuolemantapausta kohdunkaulasyövän 2006 [2]. Kuitenkin, kohdunkaulan syöpä on edelleen suurin syy gynekologisen syövän kuolleisuus maailmanlaajuisesti yli 270 000 kuolemantapausta vuonna 2002 [3].

Adenoviraaliset geeniterapiaa on ehdotettu uutena hoitovaihtoehto edennyt syöpä [4]. Kuitenkin tehokas kasvaimen transduktio edelleen rajoittava vaihe saavuttamiseksi kliinisiä tuloksia. Onkolyyttiset adenovirukset voivat olla hyödyllisiä tässä suhteessa [5]. Nämä virukset ovat sytolyyttinen luonto,

ts.

Replikatiivista elinkaaren viruksen tulosten isäntäsolussa tuhoa. Muutokset virusgenomissa vähentää replikaation normaaleissa kudoksissa, kun taas kasvainsolut edelleen sallia tuottavaa replikaation johtavat syöpäsolun hajoaminen (oncolysis). Tyypin I onkolyyttisten adenovirukset on menettämisestä toiminnon mutaatiot viruksen genomin, joka kompensoidaan mutaatiot syöpä, mutta ei normaaleissa soluissa. Tämä voidaan saavuttaa sisällyttämällä deleetioita alussa adenovirusgeenien jolloin mutantti E1-proteiinit kykene sitoutumaan solun proteiineja, joita tarvitaan viruksen replikaatioon normaaleissa soluissa, mutta ei syöpäsoluja. Tyypin II viruksia, kasvain tai kudosspesifisiä promoottoreita korvata endogeeninen virus- promoottorit, kuten E1A-promoottori, rajoittaa virusreplikaation kohdistaa kudoksiin, jotka ilmentävät promoottori.

Vaikka kliiniset kokeet ovat vahvistaneet turvallisuudesta onkolyyttisten adenovirusten hoitoon kehittyneitä syöpiä [6] – [9], useimmat tutkimukset ovat esillä melko heikennettyjä viruksia. Niinpä yhä tehokkaampia aineita saattaa aiheuttaa enemmän myrkyllisyyttä ja siksi se olisi hyödyllistä, jos replikointi voitaisiin tarvittaessa kumota. Geenien ilmentyminen tietyistä promoottoreista voidaan säädellä. Esimerkiksi varhaisen kasvun vaste geeni 1 (

egr

-1) edistäjän /promoottorin, on käytetty säädeltävä promoottori erityinen ilmaisu HSV-TK gliooma soluissa ja voi saada aikaan säteilyn [10] . Toinen asetus strategia on käyttää hypoksian indusoituvat promoottorit [11]. Edelleen säätely voidaan saavuttaa kemiallisesti indusoitavissa olevia promoottoreita. Esimerkiksi tetrasykliini-aktivoidun promoottorin voidaan käyttää säätelemään geeniekspressiota ja sen jälkeen proteiinin tuotantoa tetrasykliiniä suun kautta. Peruuttaminen lääkkeen nopeasti kumoaa geeniekspressiota [12].

Cox-2 on nopeutta rajoittava entsyymi prostaglandiinisynteesiä ja se osallistuu valvontaan tulehdusreaktioita vastauksena vamman tai infektion. Käytä steroideihin kuulumattomia tulehduskipulääkkeitä (NSAID) on ilmoittanut, että toiminta ja myös taso Cox-2-proteiinia voidaan säädellä. Vaikka muut tekijät kuin promoottorin aktiivisuus on usein rooli proteiinin ekspressiotasoja, tutkimukset ovat osoittaneet, että aktiivisuus Cox-2-promoottorin korreloi hyvin proteiinin ilmentyminen [13]. Lisäksi aktiivisuus Cox-2-promoottorin osalla terveistä normaaleista kudoksista on alhainen, ellei se indusoi kasvutekijät (kuten VEGF), sytokiinien tai kasvaimen tekijät [14]. Mitä adenoviruksia, olennaisimmat elin myrkyllisyys on maksassa. Näin ollen on hyödyllistä, että maksan ilmentyminen Cox-2 on alhainen [15], [16]. Cox-2 voi olla rooli syövän synnyn monien epiteelisyöpien, ja ekspressiotasot on yhdistetty kasvaimen invasiivisuus ja angiogeneesissä [14]. Nämä syyt ovat johtaneet hyödyntäminen Cox-2-promoottorin, kuten kasvaimen promoottori syövän erityinen ilmaisu [15] – [20].

VEGF on tärkeä rooli induktioon kasvaimeen liittyvän angiogeneesiä, kuten se on välittäjänä endoteelisolujen proliferaatiota, erilaistumista, ja verisuonten läpäisevyyttä [21]. VEGF ilmentyy laajalti aikana kasvaimen kehittymisen ja sitä havaitaan kaikkein haitallisimpia epiteelikasvaimissa [18], [19], [21] Cox-2 tai kasvutekijöiden, kuten TGF-β1 voi säädellä VEGF [22], [23]. Edelleen, kuohkea kiinteä kasvain massat sisältävät hypoksinen alueita, joissa on korkea HIF-1 transkriptiotekijän, joka puolestaan ​​indusoi VEGF ja Cox-2: n ilmentymisen [23]. Siten sääntely ja ilmentyminen Cox-2: n ja VEGF liittyvät. Näin ollen, se ei ole täysin yllättävää, että myös VEGF-promoottori on osoittaneet käyttökelpoisuutta kasvaimen erityinen ilmaisu [18], [19], [24]. Edustaa tähän asti tutkimaton mahdollisuus on sääntely Cox-2: n ja VEGF promoottorit mukaan tulehduskipulääkkeet. Tämä saattaa tarjota turvakytkin tapauksessa promoottori välittämien haittavaikutuksia kliinisissä tutkimuksissa.

Kliininen kohdunkaulansyöpä näytteet ilmentävät korkeita Cox-2, kun se ei ole havaittavissa normaalissa epiteelisolujen kohdunkaula. Lisäksi on asteittain lisääntynyt Cox-2 tasossa riippuen taudin vaiheessa, ja myös kasvaimen koon. Cox-2: n ilmentymisen on myös negatiivinen ennustava tekijä eloonjäämisen [25], [26]. Mitä tulee VEGF ja kohdunkaulan syövän, korkean esikäsittely taso on todettu liittävät suuria kasvaimia, strooman invaasio ja lantion imusolmuke etäpesäke. VEGF ilme myös korreloi huonon ennusteen [27] – [29]. Tämän vuoksi molemmat promoottorit vetoavat ehdokkaita kohdunkaulansyövän erityisiä geenihoitolähestymistavat.

Natrium ja salisyylihappo ovat NSAID, joka entsymaattisesti estävät Cox-2. Lisäksi on raportoitu, että nämä aineet vähentävät Cox-2-mRNA-tasoja, joita voitaisiin välittyy modulaation promoottorin aktiivisuus [13], [30]. Deksametasoni on anti-inflammatorinen steroidi, joka estää ilmentymistä sekä Cox-2-mRNA: n ja proteiinin [30]. Edelleen, posttranskriptionaalisen mRNA epävakauden voi olla tärkeä mekanismi deksametasonin [31]. TGF-β1 on peptidi, kasvutekijä ja anti-inflammatorinen sytokiini, joka on tuotettu monia soluja, vaan se havaitaan eniten keskittynyt nisäkkään verihiutaleiden. Se voi moduloida esimerkiksi solujen lisääntymisen ja erilaistumisen, angiogeneesin ja metastaasin, ja sen on osoitettu olevan vaikutusta COX-2-tasoja [32].

Oletimme, että voi olla mahdollista vähentää adenoviruksen replikaatio farmakologinen interventio. Tarkemmin, olemme analysoineet onkolyyttisten viruksia, joissa on syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) tai verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) -promoottori ohjaamiseksi ilmentymistä

E1A

, ja arvioidaan vaikutus tulehdusta reagenssit [natriumsalisylaatin, deksametasoni, salisyylihappoa ja transformoiva kasvutekijä-β1 (TGF-β1)] on oncolysis ja replikointi

in vitro

ja

in vivo

tehoa. Kuten valvonta, me sisältyi retinoblastoomasolulinjassa (Rb) -p16 reitin selektiivinen Δ24-pohjainen tyypin I onkolyyttisten virus [33] ja villin tyypin adenoviruksen. Lisäksi, kuten on käynyt ilmi, että määräävä tekijä tehokkuuden jäljittelevän adenovirusten on geenikuljettimia tehokkuus [34], käytimme kuitu muutettu, tarttuvuuden parannettu viruksia.

Tulokset

infektiivisyys ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat

in vitro

kohdunkaulan syövän solulinjoissa C33A, SiHa, CaSki- ja HeLa infektoitiin isogeenisiin lusiferaasin ilmentäviä mukana joko adenoviruksen serotyyppi 5 kapsidi (Ad5luc1), kimeerinen kapsidi säätimellä verkkotunnuksen serotyypistä 3 (Ad5 /3luc1) tai RGD-4C-kapsidin muutos (Ad5lucRGD). Kolmessa neljästä solulinjojen, infektio Ad5 /3luc1 johti 6-14-kertainen lusiferaasin ilmentymistä verrattuna Ad5luc1 (5 000 viruspartikkelin (vp) /solu, Fig. 1 b-d). Kuitenkin C33A-solut, joissa on korkea ilmentymisen coxsackie-adenovirus-reseptorin [19], [35], Ad5luc1 oli tehokkain (7-kertaiseksi, Fig. 1 a). Ad5lucRGD ei lisätä tarttuvuutta kohdunkaulan syövän solujen

in vitro

, paitsi SiHa-soluissa (2,5-5,5-kertainen parannus, Fig. 1b).

(a-d) Solulinjat olivat tartunnan Ad5luc1, Ad5 /3luc1, ja Ad5lucRGD. Lusiferaasiaktiivisuus ilmaistaan ​​suhteellisina valoyksiköinä (RLU) normalisoidaan kokonaisproteiinipitoisuus. (E-h) vaikutus tulehdusta reagenssit transduktion tehokkuus kapsidin osalta modifioitujen adenovirusten. Solut tartunnan aineiden esiintyminen. Arvo ilman reagenssit asetettiin 1, ja suhteellinen lusiferaasin arvot näkyvät. Kukin piste edustaa keskiarvoa kolmesta kokeesta ± keskivirhe. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,0001

versus

Ad5luc1.

vaikutus tulehdusta reagenssit transduktion tehokkuus kapsidin osalta modifioitujen adenovirusten

Kohdunkaulan syöpä solulinjat infektoitiin kapsidi osalta modifioitujen adenovirusten läsnä ollessa aineita. Kuten on esitetty kuviossa. 1e-h, deksametasoni lisäsi transduktion tehokkuus kaikki virukset SiHa ja CaSki solulinjoissa. Muita analysoidaan aineita oli vain vähäinen vaikutus.

asetukseen Cox-2: n ja VEGF vetäjistä on tulehdusta reagenssien

transkriptionaalinen aktiivisuus Cox-2: n ja VEGF promoottorit arvioitiin kohdunkaulan syöpäsolujen linjat ja ilman tulehdusta reagenssien natriumsalisylaatti, deksametasoni, salisyylihappo ja TGF-β1 (Fig. 2a-h). Ad5luc1, joka sisältää erittäin vahva CMV-promoottori, jota käytettiin vertailussa, ja suhteelliset lusiferaasiaktiivisuudet on esitetty. Kaiken VEGF-promoottori indusoi korkeamman transgeeniekspression kuin Cox-2 (Fig. 2b, d, f, h). Promoottori ilmentyminen oli hyvin sopusoinnussa aikaisempien tietojen Cox-2: n ja VEGF mRNA: n ilmentymisen näissä solulinjoissa [19]. Vaikka molemmat promoottorit voivat vaimentua anti-inflammatorisilla aineilla, VEGF oli säännöllisesti vaikuttaa (Fig. 2b, d).

Yksikerrokset esi-inkuboitiin reagenssien ja C33A (a, b), SiHa (c, d ), CaSki (e, f) ja HeLa (g, h) solut infektoitiin 1 000 viruspartikkelia (vp) /solu Ad5luc1 (CMV ohjaamalla lusiferaasi), Adcox-2Mluc tai AdVEGFluc, ja lusiferaasin ilmentyminen analysoitiin. Siirtogeenin ilmentymisen tasolla Cox-2: n ja VEGF-promoottorit verrataan CMV-promoottorin (%). Kukin piste edustaa keskiarvoa neljästä kokeesta, ± keskivirhe. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,0001

versus

ole ainetta.

Onkolyyttiset adenovirukset näkyy tehokas tappaminen kohdunkaulan syöpäsolujen

in vitro

Yksisolukerroksiset kohdunkaulan syövän solut infektoitiin onkolyyttisiä adenovirukset, villityypin viruksen ja Ad5luc1, joka on

E1

-deleted ohjaus virus (Fig. 3a-d). Kaikissa solulinjoissa, määrälliset soluja tappava testi osoitti sytolyysi kanssa onkolyyttisiä virusten ja villin tyypin virus, kun taas Ad5luc1 aiheutti vähäisiä solun tappaminen. Useimmissa solulinjat, oncolysis parani merkittävästi kanssa replikoituvista verrattuna Ad5luc1. Edelleen, oncolysis aiheuttama RGDCRADcox-2R oli merkittävä myös C33A ja CaSki soluja annos 10 vp /solu käytettiin (Fig. 3a, c). Kaikki solulinjat, solujen tappaminen Ad5-Δ24RGD oli verrattavissa villityypin adenovirus, kun taas teho RGDCRADcox-2R: n ja Ad5 /3VEGF-E1 oli heikompi.

(a-d) Yksikerrokset infektoitiin RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD, villityypin adenoviruksen ja Ad5luc1 (

E1

-deleted ohjaus virus). Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTS-määritys. OD

490 arvot infektoimattomia soluja asetettiin 100%. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe neljänä kokeiluja. (E-f) C33A-solut injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin, ja kehittynyt kasvainten annettiin kehittyä. Hiiriä hoidettiin joko (e) kolme kasvaimensisäisenä injektiota 1 x 10

9viruspartikkelia (vp) on Ad5luc1, villityypin viruksen tai onkolyyttisiä adenovirukset kolmena peräkkäisenä päivänä, tai (f) yksi suonensisäinen injektio 1 x 10

11 vp. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,0001

versus

Ad5luc1. Viivat esittävät keskivirhettä.

Onkolyyttiset adenovirukset toimitetaan terapeuttista tehoa hiiren kohdunkaulan syövän mallien

in vivo

Advanced ihonalainen C33A kasvaimia hoidettiin kolme kasvaimensisäisenä injektiota 1 × 10

9 vp of Ad5luc1, villityypin viruksen, Ad5 /3VEGF-E1, RGDCRADcox-2R tai Ad5-Δ24RGD kolmena peräkkäisenä päivänä, tai yhdellä suonensisäinen injektio 1 x 10

11 vp, että sama viruksia. Hoito onkolyyttisten viruksia antoi merkittävää terapeuttista tehoa molemmissa malleissa (Fig. 3e, f:

P

0,0001 RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 tai Ad5-Δ24RGD

versus

Ad5luc1 ). Villityypin adenovirus ei näy merkittävää vaikutusta kasvaimen kasvuun (

P

= 0,1471 ja 0,8297

versus

Ad5luc1 varten kasvaimensisäistä ja laskimoon malleja, vastaavasti).

Anti tulehduksellinen reagenssit pienensi oncolysis aiheuttama Cox-2: n ja VEGF-promoottorin ajettu onkolyyttisiä adenovirukset ja villin tyypin adenoviruksen

vaikutus tulehduskipulääkkeet päälle onkolyyttisiä adenovirukset ja villin tyypin virus analysoitiin C33A ja SiHa yksisolukerrokset. Yksikään analysoitu reagenssien (deksametasoni, salisyylihappoa ja natriumsalisylaatti) aiheuttanut merkittävää soluja tappavaa omasta tai yhdessä replikaatiopuutteiset

E1

-deleted Ad5luc1 (Fig. 4a, e). Solun tappaminen tehoa replikoituvista pelkistettiin deksametasonin (Fig. 4b, c, f-h), salisyylihappoa (Fig. 4c) ja natriumsalisylaatti (Fig. 4f, g).

(a- h) Cell yksisolukerroksia esi-inkuboitiin aineita, ja C33A (a-d) ja SiHa (e-h) solut infektoitiin Ad5luc1, villityypin viruksen, Ad5 /3VEGF-E1 ja RGDCRADcox-2R. Soluja tappava teho replikoituvista pelkistettiin deksametasonin (b, c, f-h) ja natriumsalisylaatti (c, f, g). Osoittaakseen vaikutuksen aineiden

sinänsä

solun selviytymisen, toinen mock on lisätty ruudut a ja e. Y-akselilla ylityspaikka ilmaisee solujen elinkelpoisuuden ilman virusta tai aineita, kun taas ”0” oikealla puolella se osoittaa solujen eloonjääminen ilman virusta mutta aineilla.

in vivo

vaikutusta deksametasonin terapeuttisesta tehosta onkolyyttisten tai villityypin adenoviruksia. (I) Ihonalainen C33A kohdunkaulan syövän kasvainten annettiin perustaa ja hiiriä hoidettiin yhdellä suonensisäisellä injektiolla 1 x 10

11 viruspartikkelien (vp) on onkolyyttisten viruksia tai ei virus. Vuonna RGDCRADcox-2R ryhmät, 3 x 10

8 vp injektoitiin kasvaimen päivinä 1, 3 ja 5. Lisäksi hiiret saivat intraperitoneaalisesti deksametasoni tai PBS: ää. (J) Human munasarjasyöpä (Hey) kasvaimia perustettiin nude-hiirissä, ja käsiteltiin kasvaimensisäisenä injektioita 3 x 10

8 vp RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD tai virusta ei päivinä 1 , 3 ja 5. Hiiret saivat intraperitoneaalisesti injektoimalla PBS tai deksametasoni päivittäin. Viivat esittävät keskivirhettä. Huolimatta viittaavia suuntaus jossain ajankohtina, deksametasoni ei vaikuttanut kasvainten kasvua merkittävästi yleisanalyysi kummankaan mallin. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,0001

versus

no ainetta. Viivat esittävät keskivirhettä.

in vivo

vaikutusta deksametasonin terapeuttisesta tehosta onkolyyttisten tai villityypin adenoviruksia

ihonalainen C33A kohdunkaulan syövän kasvainten annettiin kehittää ja hiiriä hoidettiin yhdellä suonensisäisellä injektiolla 1 x 10

11 vp Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD tai ei virus. Vuonna RGDCRADcox-2R ryhmät, 3 x 10

8 vp injektoitiin kasvaimen päivinä 1, 3 ja 5. Tämän jälkeen hiiret satunnaistettiin vatsaonteloon deksametasonin tai PBS hoitoon (Fig. 4i). Ad5-Δ24RGD käytettiin mallina olevan onkolyyttisten virusta kudosspesifisen promoottorin. Villityypin virusta ei voitu käyttää, koska se ei tuota mitään tehoa mallissa (Fig. 3). Vaikka muutamia lupaavia joskin pieniä trendejä, deksametasoni ei vaikuttanut kasvaimen kasvua merkittävästi (

P

= 0,5726-0,9909

verrattuna

virus vain). Kuitenkin kaikki onkolyyttisten adenovirusten edelleen näyttämään antituumoriteholla kuin edellisessä kokeessa (kaikki

P

0,0001

versus

mock).

Jos haluat nähdä voisimme harjata pois replikointi vaimennusvaikutus deksametasonin nopeasti kasvava, erittäin aggressiivinen ihonalaisen mallia, käytimme Hey munasarjasyöpäsoluja (Fig. 4j). Edellinen työ ehdotti, että virukset käytetään tässä olisi replikoitua Hei soluissa [36], [37]. Ksenografteja käsiteltiin kasvaimeen injektiot 3 x 10

8 vp viruksia tai virusta ei päivinä 1, 3 ja 5. Hiiret saivat intraperitoneaalisesti injektoimalla PBS tai deksametasoni päivittäin, ja kasvaimen kasvua seurattiin. Jälleen vaikka on ehdotettu, vaimennus virusreplikaation (

ts.

Suurempi kasvaimia), deksametasonia ei ollut merkittävää vaikutusta terapeuttista tehoa analysoitiin virusten (

P

= +0,8897-0,9441). Antituumorivaikutuksen tehoa onkolyyttisten adenovirusten edelleen huomattava verrattuna mock-hoitoa (kaikki

P

0,0001).

Vaikutus deksametasonin replikaatio Cox-2: n ja VEGF-promoottorin ajetaan onkolyyttisten adenovirukset ja villityypin adenoviruksen kohdunkaulan syöpäsolujen

in vitro

Analysoimme

in vitro

tuotannossa virionien by RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 ja villi -tyyppinen adenovirus SiHa- solujen ja ilman deksametasonikäsittelyn (Fig. 5a-c). Kaiken deksametasoni vähensi replikointi analysoitu viruksia. Replikointi RGDCRADcox-2R vähennettiin 2-, 7- ja 10-kertainen 24, 60 ja 96 h, tässä järjestyksessä (Kuva. 5a:

P

0,0001 60 h). Samanlainen mutta heikompi vaikutus nähtiin Ad5 /3VEGF-E1 (Fig. 5b: 1,5-3,5-kertainen,

P

= 0,0640 96 h). Replikaatio villityypin virus oli merkittävästi vähentynyt 96 h (Fig. 5c: 40-kertainen,

P

0,0001).

(a-c) SiHa kohdunkaulan syövän yksisolukerrokset olivat viruksia yksinään (10 viruspartikkelin (vp) /solu) tai yhdessä deksametasonin kanssa, ja viruksen tuotanto analysoitiin plakkimäärityksellä. Vaikka selvä suuntaus varhaisessa ajankohtina, ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta deksametasonin

in vivo

lisääntymään johtuen suurempi vaihtelu

in vivo

(d-f). Ihmisen munasarjasyöpä kasvaimia perustettiin nude-hiirissä ja käsiteltiin yhtenä kasvaimeen injektio 3 x 10

8 vp. Hiirille annettiin intraperitoneaalisesti injektoimalla deksametasonin tai PBS: ää päivittäin. Neljä kasvaimia /ryhmä kerättiin päivinä 2 ja 4, ja määrää tarttuvien hiukkasten analysoitiin TCID

50. ***

P

0,0001

verrattuna

virus yksin. N. A. = ei analysoitu. Viivat esittävät keskivirhettä.

Vaikutus deksametasonin replikaatio Cox-2: n ja VEGF-promoottorin ajettu onkolyyttisiä adenovirukset ja villityypin adenovirusta on syöpäsolujen

in vivo

asetus lisääntymään deksametasonilla

in vivo

analysoitiin ihonalaisen ihmisen munasarjan Hey adenokarsinooma käsitellyt kasvaimet kasvaimensisäisenä ruiskeita päivänä 0. Puolet hiirille annettiin vatsaonteloon injektioita deksametasonia päivittäin. Kasvaimet analysoitiin päivinä 2 ja 4. Vaikka deksametasoni vähensi replikointi Ad5 /3VEGF-E1 ja villityypin viruksen varhaisessa ajankohtana, ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Fig. 5d-f, kaikki

P

= 0,1283-0,6144).

keskustelu

Koska ensisijainen adenovirus reseptori saattaa olla usein poissa tai ilmaistu poikkeuksellisesti pitkälle kasvaimissa [34], ensin analysoidaan

in vitro

transduktio tehoa fiber muutettu, tarttuvuuden parannettu adenovirusvektoreita, jotka ilmentävät lusiferaasia siirtogeenin (Fig. 1). RGD-4C muutos ei näytä olevan kovin tehokas lisäämään geeninsiirtoa, mutta Ad3 reseptorin kohdentaa uudelleen virus oli varsin tehokas kolmessa neljästä solulinjojen (kuvio 1a-d). Lisäksi arvioimme vaikutus tulehdusta reagenssit transduktion tehokkuus, ja havaitsi joitakin lisääntyminen transgeeniekspression jälkeen deksametasonihoito kahteen neljästä kohdunkaulan syövän solulinjoissa (kuva 1 f, g) Koska merkittävä määräävä tekijä teho onkolyyttisten adenovirusten on tarttuvuutta [34], käytimme geneettisiä kuitu muunnoksia parantamiseksi solun tappava vaikutus. Arvioimme

in vitro

sytolyyttinen teho näiden onkolyyttisten adenovirusten kohdunkaulan syövän solulinjoissa, ja löysi korrelaatio onkolyyttisten teho, geenikuljettimia ja promoottorin aktiivisuutta,

eli

vahvempi promoottori ja korkeampi tarttuvuus, sitä ankarampi onkolyyttisten teho (Fig. 3a-d).

Mikä tärkeintä, kaikki analysoidut onkolyyttisten adenovirukset ollut tilastollisesti merkitsevä terapeuttista tehoa sekä paikallisesti että systeemisesti hoito skeema hiiren kohdunkaulan syövän ksenograftien (Fig. 3e, f). Jonkin verran vaihtelua teho nähtiin välillä

in vitro

ja

in vivo

tuloksia joidenkin virusten. Tämä voi johtua viimeaikaisen löydöt viittaa siihen, että vaikka geeni toimitus

in vitro

riippuu lähinnä ensisijainen adenoviruksen reseptoreihin, hyötyosuus asiat näyttävät hallitsevat osalta

in vivo

tehoa. Esimerkiksi se on yhä hyväksytty, että vaikka sitoutuminen CAR on tärkeä tekijä Transduktiomenetelmiä

in vitro

, muualla kuitu voi olla vieläkin enemmän merkitystä

in vivo

[38]. Samanaikaisesti aiempien tulosten kanssa muita solulinjoja [37], [39], villityypin adenovirus ei ollut tehokas C33A soluissa

in vivo

huolimatta aktiviteetti

in vitro

. Vaikka oletamme tämä koskee eroja

in vitro

ja

in vivo

ympäristöissä (esim. Strooman, verisuoniston, reseptorin ilmentymisen), työtä on jatkettava asian selventämiseksi.

Kun Cox-2: n ja VEGF-promoottorin ajetaan ilmentymistä arvioitiin, molemmat promoottorit havaittiin aktiivisia kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Kaiken VEGF promoottori aktiivisuus oli suurempi kuin Cox-2 kaikissa solulinjoissa, ja verrattavissa aiempiin tietoihin [19]. Tärkeää on, aikaisemmat tutkimukset ovat raportoineet, että normaalit maksasolut eivät ilmennä VEGF [40]. Myös Cox-2 tasoa heikommaksi kohdunkaulan syöpäsolut olivat korkeammat kuin mitä on raportoitu maksan aiemmin [16]. Merkittävästi vähentää VEGF-promoottorin välitteistä lusiferaasin ekspressiota nähtiin natriumsalisylaatin, deksametasoni ja salisyylihappo (Fig. 2b, d). Natriumsalisylaattia vähensi myös Cox-2-promoottorin ohjauksessa ilmentymistä (Fig. 2e).

Kun solukuolemaa kokeet suoritettiin, kun läsnä oli anti-inflammatoriset aineet, deksametasoni ja natriumsalisylaatti oli tehokas vähentämään oncolysis (Fig. 4). Mielenkiintoista on, että vaikutus ei rajoitu onkolyyttisiä adenoviruksia, mutta myös villityypin virus näkyy heikompi sytolyysi, kun deksametasonia oli läsnä. Näin ollen vaikutus ei ehkä ole täysin liittyvän promoottorin valvontaan replikointi, mutta hieman yleisempi ilmiö viruksen replikaation saattaa myös mukana. Yksi heikentyneen lisääntymään ehkä alassäätöä merkityksellisten reseptorien tarvitaan infektion. Aiemmin olemme ja muut ovat analysoineet modulaatio adenoviruksen pääasiallinen reseptorin ilmentymisen solun pinnalla eri aineiden, kuten useita kemoterapeuttisten aineiden ja anti-inflammatoriset reagensseja. Löysimme mitään vaikutusta reseptoriin tasolla, joka arvioidaan virtaussytometrialla analyysi, deksametasonikäsittelyn jälkeen, kun taas toiset havaita lievää alentaminen sekä ensimmäisen reseptorin ja α

Vp integriinien [41], [42].

vaikutus deksametasonin serotyypistä 3-reseptori ei ole tutkittu, eikä ollut solulinjoja käytetään tässä aiemmin tutkittu suhteessa muihin asiaan adenoviruksen reseptoreihin. Siksi analysoitiin vaikutusta aineiden geeninsiirtovälineen ja totesi, että joissakin tapauksissa lusiferaasin ekspressio lisääntyi (Fig. 1 e-h). Siten alennetaan replikointi nähnyt täällä ei luultavasti johtuu reseptoriin downregulation.

Toinen mekanistinen mahdollisuus saattaa liittyä induktion Cox-2-viruksen replikaatio

sinänsä

. Osalta herpes, sytomegalovirus, ja muita DNA-viruksia, on osoitettu, että virusinfektio indusoi COX-2 [43], [44]. Lisäksi havainto, että COX-2 vähentää replikaation näiden virusten viittaa siihen, että Cox-2: induktio on hyödyllistä viruksen leviämistä. Nämä virukset voivat käyttää anabolisia vaikutuksia Cox-2 optimoimiseksi niiden replikaation tehoa. Alustavat tiedot viittaavat siihen, että sama voi myös olla totta adenoviruksen, mikä saattaa auttaa selittämään, miksi onkolyyttisten vaikutus villityypin adenovirus lievitti deksametasonilla [45].

Vaikka oncolysis todennäköisesti korreloivan replikointi virus, tutkimme tätä erikseen. Kuten odotettua, virusreplikaation pelkistettiin deksametasonikäsittelyn

in vitro

(Fig. 5a-c). Tämä näyttää tukevan teoreettisen olettaen, että oncolysis on tiukasti sidoksissa virusreplikaation. Koska ihmisen adenovirukset eivät monista tuottavasti hiiren normaaleissa kudoksissa [46], ihmisen hiirissä käytettiin replikointiin vaimennus

in vivo

tutkimuksissa. Näissä malleissa, jos replikaatio ja /tai solukuolemaan tehoa alennetaan

in vivo

deksametasonin, kasvaimia hiirissä, joita käsiteltiin viruksella ja deksametasonin olisi suurempi kuin virus vain käsitelty. Molemmissa malleissa tutkittiin, deksametasoni ei ole merkittävästi vähentää tuumorin vastaista tehokkuutta on analysoitu onkolyyttisten adenovirukset, vaikka suuntaus tähän suuntaan (kuvio. 4i-j, kaikki

P

≥0.1654). Lopuksi analysoidaan määrä tarttuvien hiukkasten ihonalainen kasvaimia ja ilman deksametasonikäsittelyn (Fig. 5d-f). Vaikka suuntaus näkyvä varhaisessa ajankohtina, ei nähty merkittäviä eroja, mikä voi johtua vaihtelu tyypillistä

in vivo

kokeita.

Todennäköisin syy ristiriita havaittu

in vitro

ja

in vivo

vaikutusta deksametasonin onkolyyttisten potentiaalia virukset voivat liittyä suurempi monimutkaisuus

in vivo

malleissa. Näistä ongelmista olivat hyvin osoitettu tuoreessa tutkimuksessa, jossa kasvua VEGF tasot Cox-2 positiivisia ja Cox-2 negatiivinen haimasyöpäsoluissa havaittiin hoidon jälkeen suuria pitoisuuksia Cox-2-inhibiittorit, mikä viittaa siihen, että suhde Cox-2-proteiinia inhibition ja VEGF tai Cox-2-promoottorin ilmentymistä ei aina tiukasti sidoksissa [47]. Vastoin odotuksia, sekä Cox-2 positiiviset ja negatiiviset

in vitro

malleissa näytetä kohonneeseen VEGF seuraavista Cox-2-estoon. Kuitenkin Cox-2 positiivinen kasvain

in vivo

mallissa, ei-pahanlaatuiset solut ilmaisivat merkittävästi vähentynyt taso hiiren VEGF mikä heikentää koko VEGF ja kasvaimen angiogeneesiä ja kasvua, kun taas Cox-2 syöpäkasvain näytetä lisääntynyt kasvaimen kasvua. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että kasvain strooman voi olla huomattava vaikutus ilmaus Cox-2 ja siihen liittyviä tekijöitä.

Toinen piirre koskee ei-lineaarinen suhde E1A tasojen ja tehoa virusreplikaation. Classic tutkimukset viittaavat siihen, että erittäin vaihteleva E1A tasot mahdollistavat tehokkaan lisääntymään ilman suoraa korrelaatiota E1A ilmentymisen ja virionin tuotanto [48]. Siten se on hyvin mahdollista, että vaikka E1A ilmentymisen vaikuttivat vuoksi deksametasonia estäen promoottorit, vaikutus ei ollut dramaattinen tarpeeksi nähtävä ero kasvaimen kasvukäyrät. Deksametasoni säätelee useita komponentteja sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin.