Krooninen sairaus

tiivistelmä

Signaalin poikkeavuuksia ihmisen soluissa yleensä aiheuttaa odottamattomia seurauksia yksilön terveyden. Keskitymme tällaisia ​​tapahtumia mukana JAK-STAT signaalin polkuja, erityisesti ne käynnistyvät poikkeava aktivoitu STAT3, joka on onkoproteiinia joka osallistuu keskeisiä prosesseja solujen selviytymisen, kasvun ja lisääntymisen monenlaisissa kasvaimissa, sekä immuunijärjestelmän sairaudet. Perustamalla STST3 signaali perustuva korkean suoritustehon lääkeseulontamenetelmä järjestelmä ihmisen keuhkosyövän A549-soluja, olemme seulottu kirjasto luonnollisista tuotteista, jotka sisälsivät puhdistettua yhdisteitä lääkekasvien. Yksi yhdiste, nimeltään Brevilin A osoitti vahvoja STST3 signaali esto ja STAT3 signaali riippuvainen solujen kasvun esto. Lisätutkimukset paljastivat, että Brevilin paitsi estää STST3 signalointia vaan myös STAT1 signalointi sytokiinien aiheuttama fosforylaatioon STAT3 ja STAT1 sekä ilmentymistä niiden kohdegeenien. Lisäksi löysimme Brevilin voisi vaimentaa Jaks toimintaa estämällä Jaks tyrosiinikinaasialueeseen JH1. Tasot sytokiinien indusoiman fosforylaation tilastoja ja muut alustat vähentänyt dramaattisesti käsittelemällä Brevilin A. roolit Brevilin Kohdistusryhmän on Jaks toimintaan mukaan Brevilin A voi ei ainoastaan ​​käyttää STST3 estäjä vaan myös yhdisteen estämällä muita JAK- STAT hyperactivation. Siten nämä havainnot tarjosi vahvan sysäyksen kehittää selektiivisten JAK-STAT-inhibiittorit ja lääkeaineet parantamiseksi eloonjäämistä potilailla, joilla hyperactivated Jaks ja STAT.

Citation: Chen X, Du Y, Nan J, Zhang X, Qin X, Wang Y, et ai. (2013) Brevilin A Novel luonnontuote, Estää Janus kinaasiaktiivisuuden ja Blocks STST3 Signaling syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10,1371 /journal.pone.0063697

Editor: Mark Jackson, Case Western Reserve University, Yhdysvallat

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2012 Hyväksytty: 05 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 1104FK CA123 The Science and Technology tukihanke Gansun Providence QW; 2009DFA30990 ministeriön Science and Technology of kansantasavallan Kiinan 0708WCGA149 päässä Gansun maakunnan tieteen ja teknologian ja 2009AA01A130 National Natural Science Foundation of China J.Y. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ääriviivat JAK-STAT signaalireitin on valmis lähes 20 vuotta sitten [1]. Lisää tutkimuksia jatketaan sitten signaalin yksityiskohdat mukaan lukien proteiini vuorovaikutusten, post-muunnokset, transkription asetuksia, ja fysiologisia vaikutuksia. Janus-kinaasi (JAK) perhe sisältää neljä tyrosiinikinaasin jäsentä, kuten JAK1, JAK2, JAK3 ja Tyk2, joka transdusoida sytokiini-indusoitujen signaalien kautta signaalimuunta- ja aktivaattoreita Transcription (STAT). Yleensä reseptori liittyy Jaks aktivoitiin heti reseptorin dimerisaatiota läsnäollessa sytokiineja. Samaan STAT sytoplasmassa rekrytoitiin reseptoreihin ja fosforyloitiin Jaks. Tyrosiinifosforyloitunutta STAT muodostettu homo- tai heterodimeerejä fosfotyrosiinin SH2 vuorovaikutusta, ja kulkeutua tumaan käynnistämään transkriptioiden kohdennettujen geenien [2]. Epänormaaliin aktiivisuuteen JAK-STAT-signaalit on pidetty linkki monien sairauksien, mukaan lukien syöpää ja immuunijärjestelmän häiriöt. Aberrated STAT aktiivisuus korreloi tavallisesti erilaisia ​​kasvaimen kasvua, ja etenemisen erilaisia ​​syövän pahanlaatuisten kasvainten, sekä vastauksena sytokiinien ja mutantti proteiinityrosiinikinaaseja. Seitsemästä STAT perheen jäsentä (STAT1-STAT6, jossa on kaksi riippumatonta koodaamien geenien STAT5A ja STAT5B), STAT3, sekä Stat5: n jossakin määrin, useimmiten aktivoidaan melko paljon ihmisen kiinteiden kasvainten ja leukemioiden [3] – [5 ].

monissa STST3 konstitutiivista aktivoitu syöpäsolujen joko viljellyissä ihmisen kasvainsoluja tai tuotettu hiiri malleja, estämällä STST3 signalointi estävät solujen kasvua, apoptoosin ja vähentää solujen etäpesäke. In gliooma tai glioblastoomasolut [6], [7], rintasyöpäsoluissa [8], paksusuolen syövät [9], levyepiteelisyöpä peräisin kasvaimia [10], eturauhasen syöpäsolujen [11] – [13] ja melanoomat [14], [15], kohdistaminen häiriöt STAT3 aktiivisuuden häiritsemällä RNA: t, jotka ilmentävät hallitseva negatiivinen STST3 muotoja tai soveltamalla erityisiä signalointi estäjät huomattavan alas säädellä STAT3 aiheuttama geenit, kuten CyclinD1, Bcl-xl, c-Myc, Surviviinispesifisiä ja muita geenejä säädellään solunjakautumissykliä ja soluproliferaatiota, ja sitten myöhemmin vähentää solujen kasvua ja parantaa solujen apoptoosin [16], [17]. Etäpesäke on tärkein syy huonoon ennusteeseen ja caner liittyvien kuolemien verrattuna kasvaimen synnyn ja kasvaimen kasvua. STAT3 nyt on pidetty yksi kriittisistä onkoproteiineja välittävä säätely soluinvaasiota ja kasvain microenvironment. Ihmisen paksusuolen syövän STST3 aktivoitiin jotka saivat huonon ennusteen [18]. Proteiineja, jotka liittyvät maahanmuutto- ja invaasion syöpäsolujen, kuten metalloproteinaaseja (MMP-1, MMP-2, MMP-10,

jne

.) Ja Twist, säädeltiin STAT3 aktivointi [19] – [21] . IL-6 indusoi JAK /STAT3-signalointi on välttämätöntä tunkeutumisen verenkierrossa syöpäsoluja. Kasvain- IL-6 auttaa kiertävän rintasyöpä ja melanooma palauttaa

in situ

tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä alueilla [22]. Viime aikoina on raportoitu, että jatkuvasti aktivoitu STST3 yllä NF-KB aktiivisuuden kautta p300 välittämää reittejä. NF-KB: n aktiivisuuden dramaattisesti vähentynyt STST3 RNAi monissa STST3 konstitutiivisen aktivoidaan syöpäsolujen [23], mikä viittaa siihen, että STST3-inhibiittorit voivat myös olla mahdollisia rooleja estää NF-KB: n toimintaa ja parannetaan kasvun estäminen näissä syöpäsoluissa.

Exploring JAK-STAT signaalin inhibiittorit erityisesti STST3 inhibiittoreiden suurikapasiteettisten lääkeseulontamenetelmä (HTS) on tehokas tapa löytää mahdollisia erityisiä huumeita kohdistaminen STST3 tai alkupään JAK-kinaasien.

Oma N. Chau

ja kollegat kehittivät eturauhassyöpäsolulinja joka sisälsi STST3 reportterlkonstruktiomme korkea seulontaan STAT3 aktivaattoreita ja inhibiittorit [24]. Tässä loimme samanlaisen STST3 signalointi perustuen lusiferaasireportterista seulonta järjestelmä ihmisen keuhkosyövän solulinjassa A549, joka osoittaa konstitutiivista aktivoituu STST3 toimintaa ja voitaisiin indusoida sytokiinien kuten IL-6, EGF, ja HGF [25]. Seulomalla, Brevilin A, uusi luonnollinen tuote, osoittivat merkittäviä JAK-STAT signalointi esto ilman välitöntä-suoraa solun myrkyllisyyden 1400 lisää yhdisteitä, jotka alun perin ovat peräisin kasveista, joista suurin osa tunnettiin rohdosvalmisteita. Brevilin A laittanut Edullinen solujen kasvun estäminen DU145 ja MDA-MB-468, nämä kasvaimet ovat riippuvaisia ​​STST3 signalointi [17], [26]. Edelleen tutkimus osoitti, että Brevilin lamaantuminen aktiivisuus Janus-kinaasi tyrosiinikinaasikimeerojen JH1 domain, ja sitten vähennetään fosforylaatiota alavirran efektorien. Brevilin A voi toimia mahdollisena huume kohdistus aiheuttamien sairauksien JAK-STAT poikkeavuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineita STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-AKT, pSer9-GSK-3β, c-Myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-Tyk2, pSer536-p65 ja p65 saatiin Cell Signaling Technology; Vasta-aineita c-Src, pTyr (PY99), GAPDH ja His-tag saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc .; pGL4.20 vektori ja lusiferaasisubstraattia Steady Glo hankittiin Promega; M-MLV ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi kit saatiin Invitrogen Life Technologies Corporation; PD180970, AG490, Staurosporiini, doksorubisiini, ATP: n ja EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity helmet hankittiin Sigma-Aldrich; Interleukiini-6 (IL-6), interferoni α (IFNa) ja interferoni γ (IFNy) oli peräisin PeproTech. Ni

+ affiniteettikromatografialla helmet saatiin GE Healthcare Life Sciences. 10 × PK kinaasipuskuria saatiin New England Biolabs (NEB).

Plasmidit ja Solulinjat

sekvenssi, joka sisältää 16 x SIE plus yksi TATA työnnettiin pGL4.20 väliin KpnI ja HindIII. SIE-luc-puro-konstrukti transfektoitiin A549-solulinja. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, solut valittiin 5 ug /ml puromysiiniä ja 2 viikkoa, sitten 2,5 ug /ml vielä 2 viikkoa. Kloonit poimittiin ylös ja analysoidaan erikseen. Jotka koodaavat ihmisen JAK1-JH1 domain, JAK2-JH1 domain, JAK3-JH1 domain, Tyk2-JH1 domain ja c-Src kloonattiin PLV-SV40-puro lentivirus ekspressiovektorin erikseen. Muihin sekvenssit Flag-His dual-tunnisteita fuusioitu C-pään kunkin Jaks-JH1 domain. c-Src fuusioitiin yhden Flag tag C-terminaaliin. Kukin edellä konstruktien transfektoitiin HEK293T- yhdistettynä PMD-2.G ja pCMV-dr8.74 auttaja levittäjinä viruksen pakkaukseen. Supernatantti elatusaine kerättiin 48 tunnin jälkeen ja niitä käytettiin infektoimaan HEK293T- yön yli, sitten korvattiin tuoreella väliaineella vielä 24 tuntia. Stabiileja solujen altaat valittiin puromysiinin läsnä ollessa (2,5 ng /ml) 7 päivää.

Cell Culture

Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ( FBS), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml).

huumeseulonta

Luontaistuotteet lääkeaineiden seulonta olivat National yhdiste Resource Center (Original kirjasto toimittaja instituutin oli BioBioPha Co., Ltd.). Yhdisteet luonnontuotteista (10 mM) laimennettiin DMEM (10% FBS) ja 100 uM (laimennettu yhdisteet). A549R solut lääkkeiden seulomiseksi maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 (100 ul /kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää). Kaksitoista tuntia myöhemmin, 25 ui laimennettuja yhdisteitä 75 ui tuoretta DMEM (10% FBS) lisättiin kuhunkin erottaa hyvin vielä 24 h: n 1

st kierros seulonta pitoisuus 25 uM. 12,5 ui laimennettu yhdisteet 87,5 ui tuoretta DMEM lisättiin varten 2

nd kierros seulonta pitoisuus 12,5 uM. DMSO käytettiin ajoneuvo (0,25% vuonna 1

st pyöreä seulonta ja 0,125% 2

nd kierros seulonta). IL-6 (250 ng /ml) ja PD-180970 (250 nM) käytettiin tiedossa stimulaattori ja estäjä tarkistaa järjestelmän vaste kullekin kierrokselle seulonnan yhdellä levyllä. Järjestelmän vaste katsotaan normaaliksi, kun IL-6 indusoi yli 2,5 kertainen fluoresenssi ja PD-180970 on esitetty 40% -50% fluoresenssi esto kullakin kierroksella seulonta. Käytimme counterscreen olettaen, että tunnetun inhibiittorin PD-180970 on merkittäviä signaalin inhibitio, ja mahdolliset inhibiittorit olisi aina suorituskyky on parempi kuin PD-180970. Koska positiivinen kontrolli PD-180970 (250 nM) aina osoitti fluorenssisuhteessa antavia 50% ja voi estää STAT3 fosforylaatiota merkittävästi, kun arvioituna Western-blot-analyysi, päätimme 50% on ”cut off” arvo, niin mikä tahansa yhdiste, joka osoittaa fluoresenssin suhde ohjaus solujen ≤50% (

eli

fluoresenssi esto ≥50%) on poiminut. Yksityiskohdat voidaan tiivistää seuraavasti: Vaihe 1, 1

st kierros seulonta, Yksi hyvin One yhdiste, 25 uM, lusiferaasianalyysissä vain. Yhdisteet poiminut aina FR (fluorenssisuhteessa) on ≤50%. Tämän vaiheen jälkeen otetun yhdisteistä saattaa sisältää jonkin verran liian myrkyllisiä niistä. Poissulkemiseksi fluoresenssi aiheuttama esto sytotoksisuutta, Step2 sovellettiin. Vaihe 2, 2

nd kierros seulonta, 12,5 uM kutakin yhdistettä vaiheesta 1, ja kaksi toisintoa lusiferaasin ja MTT-määritysten sovellettiin. Jos FR% on ≤50% Δ (CV% – FR%) on ≥30%, yhdisteitä voidaan poiminut jatkotutkimuksiin. Liian myrkyllisiä yhdisteitä suljettiin pois tässä vaiheessa. Poikkeama ”30%” on empiirinen arvo, joka pystyi erottamaan liian myrkyllisiä yhdisteitä ja tiettyjä yhdisteitä. Täällä, FR, Fluoresenssi Ratio = Fluoresenssi arvoa kohdellaan hyvin jaettuna fluoresenssin arvo kontrollikuoppa; CV, elinkykyyn = Solujen eloonjääminen arvoa kohdellaan hyvin jaettuna Solujen eloonjääminen arvo kontrollikuoppa; Lusiferaasianalyysi suoritettiin Fluoresenssi arvo; MTT-analyysi suoritettiin Cell Survival arvo. (Prosentuaalinen osuus Fluorescence inhibitio = 100% – FR%; Suhteellinen Cell kasvun estäminen = 100% – CV%).

lusiferaasimääritystä, 50 ui lusiferaasisubstraattia Steady Glo lisättiin (50 ul /kaivo) . Sen jälkeen kun oli inkuboitu 10 minuuttia, fluoresenssi mitattiin Vektori3 Monitasoinen Plate Counter (Perkin Elmer). MTT: solunelinkykyisyysmääritys, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin 4 tunnin inkubaation jälkeen. Tuloksena olleet kiteet liuotettiin 100 ul DMSO: hon ja absorbanssi intensiteetti mitattiin Vektori3 490 nm: n aallonpituudella.

Western-Blot, immunosaostus ja Cell Värjäys

Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä kolme kertaa ja hajotettiin RIPA-lyysipuskuria 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA , 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Roche), 1 x fosfataasinestäjällä cocktail (Roche)). Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 x rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhtä suuret määrät proteiineja, määritettiin BCA-menetelmällä (Pierce, Thermo), erotettiin sitten SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Merck). Proteiinit havaittiin mainituilla vasta-aineilla.

HEK293T-solut ekspressoivat Flag merkitty Src esikäsiteltiin DMSO, PD180970 (500 nM) ja Brevilin A (15 uM) 4 tunnin ajan erikseen. Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä kolme kertaa, ja hajotettiin 500 pl hajotuspuskuria (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 7,4) läsnä ollessa proteaasi-inhibiittoriseosta ja fosfataasin estäjä cocktail. Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 x rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhtä suuret määrät proteiineja BCA menetelmillä, inkuboitiin sitten anti-FLAG M2 Affinity helmiä 8 tuntia 4 ° C: ssa. Src-proteiinin näytteitä eluoitiin 0,1 M glysiini-HCI, pH 3,5 ja neutraloitiin Tris-HCI: a (0,5 M, pH 7,4).

apoptoosimäärityksessä, solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille. Kaksitoista tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on 10 uM Brevilin A 24 tuntia. Sitten solut altistettiin anneksiini-V-PI dual värjäystä prosessi protokollassa anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime Biotekniikan instituutti).

Proteiinin puhdistus ja kinaasimääritys

C-terminaalinen His-merkitty hSTAT3 rekombinanttiproteiini on ilmaistu

E.coli

,

Rosetta

ja puhdistettiin Ni

+ affiniteettikromatografialla.

hSTAT3

CDS kloonattiin pET28b, ja indusoitiin 0,5 mM isopropyylitio-β-galaktosidaasi-37 ° C: ssa 6 h. Inkluusiokappaleet sentrifugoitiin 12000 x rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa sen jälkeen, kun ultraäänikäsittelyllä hoidon koko

E. coli

soluja. Sitten inkluusiokappaleet lyysattiin lyysipuskurilla (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfaatti, 20 mM imidatsoli, 8 M ureaa, pH 7,5). Ni

+ affiniteettikromatografialla helmiä käytettiin sitten laskostumattoman His-merkitty hSTAT3 sitova. Kolonniin uudelleenlaskostus valittiin ja lopuksi uudelleenlaskostettu STAT3 proteiini eluoitiin eluutiopuskurilla (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfaatti, 250 mM imidatsoli, pH 7,5). Sen jälkeen ioninvaihto- prosessin puhdistettu hSTAT3 proteiinia PBS: ssä (10% glyseroli) jäädytettiin lisäanalyysiä.

Arvioitu 5 x 10

8 HEK293T soluja, jotka ilmentävät Flag-His-merkittyyn Tyk2-JH1 kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurilla (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfaatti, 20 mM imidatsoli, pH 7,5). Ni

+ affiniteettikromatografialla helmiä käytettiin sitten Flag-His-merkitty Tyk2-JH1 sitova. Proteiini eluoitiin 250 mM imidatsolia ja laimennettiin ANTI-FLAG M2 Affinity helmiä sitovan ja inkuboitiin M2 Affinity helmiä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tyk2-JH1 proteiini lopulta eluoitiin PBS: llä, joka sisälsi 3 x FLAG-peptidi (500 ng /ml, 30 min huoneenlämpötilassa) edelleen kinaasimääritys.

Arvioitu 150 ng hSTAT3-proteiinia ja 20 ng Tyk2-JH1 kinaasin oli esi-inkuboitiin 1 x kinaasipuskuria, kun läsnä on konsentraatio sarja 10, 20, 40, ja 80 uM, 10 minuuttia. ATP lisättiin reaktioon pitoisuus 200 uM 50 ul lopulta tilavuuteen. Kinaasireaktio jatkettiin sitten 37 ° C: ssa 2 h, ja se lopetettiin 5 x proteiini -näytepuskuria (95 ° C, 5 min). 20 ui kutakin näytettä ladataan SDS-PAGE ja Western-blot-analyysi.

RT-PCR: llä ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Yhteensä mRNA uutettiin viljellyistä soluista, joissa TianGen DNA: n puhdistus kit . Käänteinen transkriptio suoritettiin M-MLV käänteistranskriptio (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR valmis Roche Cyber ​​Green PCR-seosta Kit Biorad C1000 lämpösyklilaitteeseen. Alukeparit RT-PCR olivat seuraavat:

GAPDH

eteenpäin 5′-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 ’, käänteinen 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3’;

socs3

eteenpäin 5′- CCATGGTGGTGAAGACGC-3 ’, käänteinen 5′-CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3’ [27];

IRF-1

forward5′-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 ’, käänteinen 5′-TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3’ [28].

Data Analysis ja tilastolliset menetelmät

Jokainen analyysi toistettiin kuten merkitty. Suhteellinen solujen elinkyky ilmaistiin prosentteina (%) suhteessa käsittelemättömään kontrolliin soluja. Virhepylväät edusti keskihajonta (± SD). Data analysoitiin ANOVA menetelmän kunkin kahden ryhmän vertailu testejä. Blot ja kuvasignaalin intensiteetti kvantifioitiin käyttäen ImageJ2X ohjelmistoa. P-STAT3 ja p-p65 kertamuutoksia normalisoituivat yhteensä STST3 ja p65 vastaavasti, kun taas p-AKT ja p-GSK-3β muutoksia normalisoituivat GAPDH.

socs3

ja

IRF-1

mRNA tasoeroja normalisoitiin yhteensä

GAPDH

mRNA. Kvantifiointi numerot ovat edustettuina pohjaan blotteja. Kertamuutoksia anneksiini-V fluoresenssi normalisoitiin solulaskennan. IC

50 (GI

50) laskettiin SPSS19 ohjelmisto (regressio-probit-menetelmä). Histogrammit ja kaaviot piirrettiin Alkuperä 8 ohjelmisto.

Tulokset

perustaminen STAT3 perustuvaa signalointia korkean suoritustehon lääkkeenseulontasysteemissä.

A549-soluja transfektoitu lusiferaasireportteri vektori, SIE-luc-puro, joka sisältää toistuvia STAT3 elementteihin (16 x SIE, sis indusoituva element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Fig. S1). Vakaa solulinja A549R yhdestä klooni valittiin sitten. Tämä klooni kykeni vastaus sekä sytokiinien ja inhibiittorit osallisena STAT3 signalointia (Fig. 1A). IL-6 indusoi noin 5 x kertaiseksi fluoresenssi, ja PD-180970 käsittely osoitti noin 50%: n inhibition lusiferaasiaktiivisuus. pitoisuudet IL-6 ja PD-180970 hoitoja ei vaikuta solujen kasvua merkittävästi (Fig. 1 B). PD180970, tunnetut Src-inhibiittori, kykeni inhiboimaan STAT3 toimintaa osittain A549 solulinja on raportoitu [25] (Fig. 1 C).

Luciferase (A) ja MTT (B) määritykset A549R käsiteltyjen solujen PD-180970 (250 nM) ja IL-6: (250 ng /ml), vastaavasti. A549R solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 (100 ul /kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää). Kaksitoista tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on IL-6: n tai PD-180970. Bars esittävät keskihajonnan (± SD) (kolme riippumatonta toistoa, n = 5 kussakin toista). *** p 0,001, ** p 0,01, * p 0,05, merkittävä suhteessa ajoneuvon hallinnan. NS, ei tilastollista merkittävyyttä. (C) PD-180970 estää STAT3 aktiivisuutta A549R soluissa. A549R solut levytettiin ja viljeltiin 100 mm ruokia 70% yhtymäkohta. Sitten soluja käsiteltiin PD-180970 (250 nM) 24 tuntia. DMSO: ta käytettiin kontrollina.

Merkintä on Brevilin a: STAT3 Signaling Inhibitor

Compounds (1440 kpl) luonnontuotteista (taulukko S1) seulottiin, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Vuonna 1

st kierros seulonta, katsotaan myös karkea seulonta, yksi yhdiste-one hyvin strategian pitoisuus 25 uM käytettiin. Yhdeksän yhdisteet osoittivat yli 50% fluoresenssin inhibitio (taulukko S2, arvot punainen). Vuonna 2

nd kierros seulonta, 12,5 uM yhdisteet valittiin edelleen lusiferaasianalyysissä sekä ylimääräisiä MTT solunelinkykyisyysmääritys. Vain yksi yhdiste, nimeltään Brevilin A (Fig. 2A pseudoguaiane sesquiterpene iältään

Litsea glutinosa

, antamat tiedot alkuperäisen toimittajan) oli vielä yli 50% fluoresenssi esto, kun taas näytteillä poikkeama (yli 30% ) välillä solujen elinkykyä (CV) ja fluorenssisuhteessa (FR). Me spekuloida, että signaali erityinen estäjien tulisi osoittaa enemmän signaalin esto kuin solukasvuneston 24 tunnin kuluessa, ja että 2

nd kierroksella seulonta, jos FR% on ≤50% andΔ (CV% – FR%) on ≥30%, yhdisteitä on poiminut jatkotutkimuksiin (taulukko S3). Niistä 9 yhdisteiden 1

st kierros seulonta, vain Brevilin täytti vaatimukset (Fig. S2). Näytti siltä, ​​että voisimme saada samat tulokset arvioimalla Z tulokset on 1

st kierros seulonta (taulukko S4). Western-blot lisäksi osoittanut, että Brevilin lamaantuminen STAT3 tyrosiinin 705 fosforylaation pitoisuus tarkoitettujen 12,5 ja 25 uM 24 tuntia hoidon A549R soluissa (Fig. 2B). Signaalin esto ja solun elinkelpoisuutta analysoitiin sitten lusiferaasi ja MTT-määrityksellä on sarjanumero pitoisuuksia Brevilin Hoito 24 h (Fig. 2C). Brevilin näytteillä parempi STST3 signalointi esto annoksesta riippuvaisella tavalla (IC

50 = 10,6 uM) kuin solujen elinkelpoisuus esto 24 h (GI

50 20 uM), mikä osoittaa, että se on merkki spesifinen estäjä yli yhdiste, joka suoraan tappaa viljellyt solut perustuen solun myrkyllisyyttä. Sitten Valitsimme pitoisuuksia noin 10 pM jatkotutkimuksiin.

(A) rakenne Brevilin A. (B) Brevilin estää STST3 fosforylaation A549R soluissa. A549R solut levytettiin ja viljeltiin 100 mm ruokia 70% yhtymäkohta. Sitten soluja käsiteltiin Brevilin A (12,5 uM ja 25 uM) 24 tuntia. DMSO: ta käytettiin kontrollina. (C) STAT3 signalointi estyi Brevilin A annoksesta riippuvaisella tavalla. A549R solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 (100 ul /kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää). Kaksitoista tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on Brevilin A eri pitoisuuksilla vielä 24 h (20 uM, 17,5 uM, 15 uM, 12,5 uM, 10 uM, 7,5 uM, 5 uM, 2,5 uM ja 1 uM). Lusiferaasi ja MTT-määritykset suoritettiin sitten. Bars osoittavat keskihajonnan (± SD) (3 riippumatonta toistoa, n = 5 kussakin uusinta).

Brevilin Estää konstitutiivisesti Activated-STAT3 Driven DU145 ja MDA-MB-468 solut

Ihmisen eturauhassyöpä DU145 ja rintasyöpä MDA-MB-468-solulinjoja osoitti konstitutiivisen STST3 aktiivisuutta. Sitten kysyä Brevilin voi estää STST3 aktiivisuutta näissä kahdessa solulinjassa. Kuvio 3A ja B osoittivat, että Brevilin estää STST3 signalointi ja ajasta riippuvaisella tavalla sekä DU145 (Fig. 3A) ja MDA-MB-468 (Fig. 3B). Testata signaali spesifinen esto, tasot fosforylaation p65-Ser536, AKT-Ser473 ja GSK-3β-Ser9 analysoitiin. Mielenkiintoista on, Brevilin A ei näytteille vastaavaan vaikutuksia fosforylaatioon näiden proteiinien (Fig. 3A, 3B ja 3C), mikä osoittaa, että Brevilin ei saa antaa vaikuttaa tai on vähemmän vaikutuksia muihin solun signaaleja. Esto STAT3 toiminnan johtaa yleensä alas-säätely kohdegeenien,

esim.

, C-Myc ja CyclinD1 [17]. Tässä sen jälkeen, kun käsiteltiin Brevilin A 24 tunnin ja 48 tunnin, sekä c-Myc ja CyclinD1 ilmentymistä vähennetään DU145 ja MDA-MB-468-soluja (Fig. 3d). Lisääntynyt lohkaistaan ​​PARP havaittiin myös (Fig. 3E), mikä osoittaa, että Brevilin indusoi DU145 ja MDA-MB-468 apoptoosia 24 tunnin kuluttua hoidon [29]. Se on yhdenmukainen raportteja, että esto STST3 toiminta johti solujen kasvun estäminen in DU145 [30] ja MDA-MB-468-solujen [31]. Sitten solujen elinkyky mitattiin DU145 ja MDA-MB-468-soluja, samoin kuin ihmisen ei-transformoitu telomeraasia kuolemattomiksi fibroblasteja BJ-soluja (hTERT-BJ, kuolemattomaksi normaali solulinja). hTERT-BJ solut oli pienempi STAT3 aktiivisuus (Fig. 4A) ja näin ollen käytettiin negatiivisena kontrollina soluja. Sen jälkeen käsiteltiin Brevilin A 24 h, 48 h ja 72 h, Brevilin osoitti lisää merkittävästi solujen kasvun inhibitio DU145 ja MDA-MB-468 kuin hTERT-BJ sekä 5 uM ja 10 uM (Fig. 4B, vasemmalla ja keskellä). Useita muita yhdisteitä, mekanismeja, jotka tunnetaan solun elinkelpoisuutta, valittiin kontrolleiksi. AG490, joka on JAK estäjä, voivat estää JAK-STAT signalointi riippuvaista solukasvua (

esim.

, DU145 ja MDA-MB-468); Staurosporiini, joka on tunnettu yleiseurooppalainen estäjä [32], inhiboi paljon solun prosesseja ja yleensä osoittaa mitään solutyypin spesifisyys; Doksorubisiini, villisti käytetty yhdiste, kykenee indusoimaan apoptoosia ja estää solujen kasvua [33]. Vertaamalla vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen joukossa DU145, MDA-MB-468 ja hTERT-BJ soluissa 24 tunnin kuluttua lääkehoidon (Fig. 4B, oikealla histogrammi), AG490 osoittaa samanlaisia ​​vaikutuksia (jossa Brevilin A) näihin soluihin, kun taas doksorubisiini ja Staurosporiini ollut erityisyyttä solujen elinkelpoisuuden tai kasvun näistä soluista. Jatkotutkimuksiin anneksiini-V-värjäys paljasti, että Brevilin osoitti vahvempaa apoptoosin induktiota varten DU145 ja MDA-MB-468 (noin 2,2 ja 4,4 kertaisesti, vastaavasti) kuin hTERT-BJ (~1.3 kertainen) 24 tunnin kuluttua käsittelystä (kuvio. 4C).

STAT3 tyrosiinin 705 fosforylaatio inhiboitui Brevilin A annoksella (5 uM, 10 uM ja 15 uM 2 h) ja aika (10 uM 30 min, 60 min ja 120 min) riippuu tapoja sekä DU145 (A) ja MDA-MB-468-soluissa (B), kun taas fosforylaatio p65-Ser536 (A ja B), AKT-Ser473 ja GSK-3β-Ser9 (C) ei ollut vaikutusta vastaavasti (10 uM, 2 h). (D) c-Myc ja CyclinD1 jälkeen vähentynyt 24 tunnin ja 48 tunnin hoidon Brevilin A (10 uM). Solut maljattiin ja viljeltiin 100 mm ruokia 12 tuntia, sitten käsiteltiin Brevilin A kuvattu. (E) Pilkottua PARP kasvoi DU145 ja MDA-MB-468-solujen Brevilin A (10 uM) hoitoa 24 tuntia. DMSO: ta käytettiin kontrollina.

(A) STAT3-tyrosiinin 705 fosforylaatiota ei havaittu hTERT-BJ, DU145 ja MDA-MB-468-soluja. (B) vasemmalla ja keskellä kaavioita, hTERT-BJ, DU145 ja MDA-MB-468-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 8 x 10

3 (100 ul /kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää) . Kaksitoista tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on Brevilin A (5 uM ja 10 uM) 24 tunnin ajan, 48 tuntia ja 72 tuntia, solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Oikea histogrammi, 12 tuntia myöhemmin solut maljattiin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on Brevilin A (10 uM), AG490 (100 uM), doksorubisiini (1 uM) ja Staurosporiini (100 nM ja 500 nM) 24 h. Dox, doksorubisiini. Sta, Staurosporiini. Bars osoittavat keskihajonnan (± SD) (3 riippumatonta toistoa, n = 3 kussakin toista). *** P 0,001, ** p 0,01, * p 0,05. NS, ei tilastollista merkittävyyttä. (C) Soluja maljattiin 24-kuoppaisille levyille. Kaksitoista tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, kun läsnä on 10 uM Brevilin A 24 tuntia. DMSO: ta käytettiin kontrollina. Sitten solut altistettiin anneksiini-V-PI dual värjäys prosessi. Sama valotus ohjelmaa käytettiin kullakin aallonpituudella.

Brevilin lohkoina Sytokiini aiheuttama STAT Signaling

Sytokiinit, kuten interleukiinit ja interferonit, yleensä indusoi STAT3 aktivointi kautta kanoninen JAK-STAT-reitin. On raportoitu, että STST3 aktivoitiin DU145 ja MDA-MB-468 kautta IL-6 autokriinisten silmukoita [34], [35]. Tässä, kun läsnä on muita IL-6 hoidon, olemme huomanneet, että Brevilin voi estää STAT3 aktivaatiota vasteena IL-6 induktio HEK293T-, Hela ja HepG2-soluissa (kuvio. 5A). Voit testata, onko tämä esto Brevilin A mukana muiden sytokiinien välittämä STAT3 aktivointi, IFNy ja IFNa käytettiin. Lyhyesti, IL-6 indusoi STAT3 aktivointi kautta IL6R-gp130-JAK-reitin [36], kun taas IFNy ja IFNa vuoksi se aktivoimalla tyypin II ja tyypin I interferonin reseptorin JAK reitin vastaavasti [37]. Sen jälkeen esikäsittely Hela kanssa Brevilin A Tyr705 fosforylaatiota STAT3 oli suuresti esti odotetusti (Fig. 5B). Transkriptio

socs3

(vaimennin sytokiinien signalointia proteiini 3) geeni säätelee STST3 aktivointi suoraan vastauksena sytokiinien kuten IL-6 [38], joten mRNA taso

socs3

yleensä kuvastaa transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3. Mittasimme mRNA taso

socs3

vastauksena IL-6 tai ilman Brevilin esikäsittely RT-PCR: llä HEK293T-, Hela ja HepG2-soluissa. Brevilin esti STST3 välittämää

socs3

transkriptio kaikilla nämä solut dramaattisesti (kuvio. 5C). Reaaliaikainen PCR tulokset osoittivat suunnilleen 70%: n vähennys

socs3

mRNA jälkeen käsiteltiin Brevilin A läsnä ollessa IL-6: n HEK293T-soluissa (kuvio. 5D).

Solut maljattiin ja viljeltiin 100 mm: n annoksia 12 tuntia, sitten väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella ilman seerumia vielä 12 tuntia. Brevilin A (10 uM) lisättiin 30 minuuttia esikäsittelyn jälkeen soluja käsiteltiin IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) ja IFNy (1500 U /ml) 2 tuntia. STAT3 fosforylaatiota analysoitiin sitten Western-Blot (A ja B). (C) Solut maljattiin ja viljeltiin 100 mm: n annoksia 12 tuntia, sitten väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella ilman seerumia vielä 12 tuntia. Brevilin A lisättiin 30 min esikäsittely (HEK293T-, 10 uM, Hela ja HepG2, 15 uM), sitten soluja käsiteltiin IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) ja IFNy (1500 U /ml) 4 tuntia.

Socs3

mRNA analysoitiin RT-PCR: llä. (D) Reaaliaikainen qPCR analyysi

socs3

mRNA: n HEK293T-soluissa, joita käsiteltiin Brevilin A läsnä ollessa IL-6 (250 ng /ml). (E) Brevilin estää IFNa- ja IFNy aiheuttama Tyk2 ja JAK2 fosforylaatio vastaavasti sekä STAT1 tyrosiinifosforylaatio HeLa-soluissa kuin käsitellään (B). (F)

IRF

mRNA analysoitiin RT-PCR: llä HeLa-soluissa, kun läsnä on IFNa hoidot on kuvattu edellä.

Brevilin lohkoina Janus-kinaasi Activity

Koska Brevilin voi estää JAK2 ja Tyk2 fosforylaation vastauksena IFNy ja IFNa (Fig. 5E), me sitten testattiin vaikutuksia Brevilin A STAT1 signalointi. Tulokset osoittivat, että STAT1 fosforylaatio ja sen kohdegeenin

IRF1

laskivat läsnäollessa Brevilin jälkeen sytokiinien induktion (kuvio. 5E ja 5F). Nämä ominaisuudet paljastaa, että mahdollinen suora inhibitorinen kohteet Brevilin A voi paikantaa ylävirtaan STAT3 ja STAT1 signalointi.