Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen etäpesäke liittyvä geeni 1 (MTA1) on erittäin assosioituneet jossa etäpesäkkeitä eturauhassyövän; kuitenkin, molekyyli toiminnot MTA1 jotka helpottavat etäpesäke jäävät epäselviksi. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että hiljentämisen MTA1 siRNA käsittely johtaa säätely E-kadheriinin ilmentymisen fosforylaatio AKT (p-AKT) ja vähentää invasiivisuus eturauhasen syöpäsoluja. Osoitamme, että MTA1 ilmaistaan ​​yli 90% eturauhassyövän kudoksissa, erityisesti metastaattisen eturauhassyövän kudoksen, vertaamalla ei-ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kudoksessa. RT-PCR-analyysiä ja Western-blot-määritys osoitti, että MTA1 ilme on huomattavasti korkeampi korkeasti metastaattinen eturauhassyöpä PC-3M-1E8 solua (1E8) kuin huonosti metastaattinen eturauhassyöpä PC-3M-2B4-soluissa (2B4). Hiljentäminen MTA1 ilmentyminen siRNA käsittely 1E8 soluissa lisäsi solujen pahanlaatuisia merkkiä, mukaan lukien solun liima kyky, vähensivät solujen invasiivinen kyky ja muutti polariteetin solun tukirangan. 1E8-soluja yli-ilmentävät MTA1 oli vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin, kun taas 1E8-soluja käsiteltiin MTA1 siRNA oli korkeampi ilmentyminen E-kadheriinin. Ilmaisu Fosforyloidun AKT (p-AKT) tai esto p-AKT wortmanniinilla käsittely (100 nM) muuttunut merkittävästi toiminta MTA1 sääntelyssä E-kadheriinin ilmentymisen. Muutoksia E-kadheriinin ilmentymisen muuttunut rooli p-AKT solujen pahanlaatuisen merkkiä. Kaikki nämä tulokset osoittavat, että MTA1 on tärkeä rooli säätelyssä pahanlaatuisiin eturauhassyöpäsolujen kautta p-AKT /E-kadheriinin kautta. Tutkimus tarjoaa myös uusi mekanistinen rooli MTA1 säätelyssä eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Citation: Wang H, Fan L, Wei J, Weng Y, Zhou L, Shi Y, et al. (2012) Akt sovittelee Etäpesäke-Associated Gene 1 (MTA1) ekspressiota sääteleviä E-kadheriinin ja edistäminen invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 7 (12): e46888. doi: 10,1371 /journal.pone.0046888

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2012; Hyväksytty: 06 syyskuu 2012; Julkaistu: 05 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Natural Science Foundation of China (30973184) (www.nsfc.gov.cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuinen syöpien ja on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista American men [1]. Hoito vika eturauhassyövän johtuu usein imusolmuke ja /tai etäinen elin etäpesäke. Molekyylimekanismeihin eturauhassyövän etäpesäkkeiden ja invaasio eivät ole hyvin selvitetty. Lisääntyvä todistusaineisto on osoittanut, että ihmisen etäpesäke liittyvän geenin 1 (MTA1) on avaintekijä tuumorimetastaasissa [2]. Eräs tutkimus, joka käyttää serologinen analyysi yhdistelmä-cDNA-ekspressiokirjastoja (Serex) havaitsivat, että MTA1 on edullisesti ilmaistuna paneelin pahanlaatuisen eturauhassyövän kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin, mikä viittaa siihen, että MTA1 voidaan tarvita eturauhassyövän etäpesäkkeiden [3] Toisessa tutkimuksessa havaitsivat, että MTA1 selektiivisesti yli-ilmentynyt metastaattinen eturauhassyöpä verrattuna kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä ja eturauhasen hyvänlaatuisesta kudoksen [4]. Nämä tutkimukset osoittivat, että MTA1 voi olla tärkeä rooli etäpesäkkeitä eturauhassyövän; kuitenkin mekanistinen merkitys MTA1 prosessissa eturauhassyövän etäpesäkkeiden on edelleen huonosti ymmärretty.

MTA1 alun perin tunnistettiin ero cDNA seulomalla käyttämällä erittäin metastaattisen rintasyövän solulinjat [5]. MTA1 geeni koodaa uutta proteiinia, joka sisältää runsaasti proliinia sisältävän alueen (SH3-sitova motiivi), oletettu sinkki sormimotiivi, leusiinivetoketju motiivi ja 5 kopiota SPXX DNA-sitova motiivi [6]. MTA1-proteiinin on havaittu, että nukleosomiin remodeling histonideasetylaasi (Nurd) kompleksi, joka on osoitettu muokata tai uudistaa kromosomit [7]. MTA1 fyysisesti vuorovaikutuksessa histonideasetylaasi (HDAC), joka on tärkeä rooli histoni deasetyloinnilla ja muuttaminen transkriptionaalisen säätelyn [8]. Koska merkittävä säätelijä solujen kohtalo rooli synnyssä ja etenemisessä monien pahanlaatuisten kasvainten, MTA1 on herättänyt laajaa huomiota [2].

(A-C) tyypillisiä tuloksia MTA1 värjäyskuvio määritettiin immunohistokemiallisesti on esitetty normaalissa eturauhaskudoksessa (A), paikallinen eturauhassyöpä kudoksen (B), ja metastaattisen eturauhassyövän kudoksen (C). Tulokset B ja C osoittivat MTA1 ilmentymistä sekä ytimien ja sytoplasmassa. Alkuperäinen suurennos A-C on 200-kertainen ja yksityiskohtainen suurennos on 400-kertainen. (D) kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi MTA1 RNA-tasoissa 2B4 ja 1E8-soluja (ylhäällä). Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna 2B4-soluissa. (E) proteiini ekspressiotasojen MTA1 on 2B4 ja 1E8-solut analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita, ja tulokset kvantifioitiin (ylhäällä). Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna 2B4-soluissa. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

epiteelisolujen kehittyä syöpäsoluja, epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) täytyy tapahtua [9]. EMT johtaa epiteelisolujen kerrokset menettää napaisuuden ja solu-solu kontakteja ja laukaisee remontin solun tukirangan [10], [11]. E-kadheriinin pidetään tärkein indikaattori esiintyminen EMT [12]. E-kadheriinin näyttelee tärkeä rooli pahanlaatuinen fenotyypit, mukaan lukien soluadheesion, solun erilaistumisen ja solurakenne. Säätely E-kadheriinin on liitetty inaktivointi EMT [13], [14]. Näin ollen E-kadheriinin on ehdotettu olla vahva tuumorisuppressori syövän kehittymisessä [14], [15]. Histoni deasetyloitumista ja /tai hypermetylaatiota CpG saarten E-kadheriinin on osoitettu olevan tärkein mekanismit E-kadheriinin hiljentäminen kasvaimissa [15], [16], [17]. MTA1 on osoitettu olevan rooli histonin deasetylointia, muuttaminen kromatiinin rakennetta ja transkriptionaalisen säätelyn [18], [19]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että MTA1 mahdollisesti säädellä E-kadheriinin. Lisäksi MTA1 on osoitettu vaikuttavan EMT fenotyypit [20], [21]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että E-kadheriiniekspressiota ylössäädellään melanooman ja kohdunkaulan syöpäsolut käsitelty MTA1 siRNA [22]. Nämä tutkimukset eivät keskittyä mekanismi sääntelystä muutokset E-kadheriinin geeniekspressiota MTA1. Fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /AKT reitin uskotaan olevan tärkeä merkitys ihmisen syövän etenemisessä, mukaan lukien etenemisen eturauhasen syöpä [23], [24]. MTA1 on havaittu säätelemään AKT ilmentymistä [25]. Jos haluat muuttaa pahanlaatuisen fenotyypin syövän solujen MTA1 /AKT-reitin voi aktivoida geenejä ja antagonisoivat geenien tukahduttaa lisääntymistä ja /tai solujen etäpesäke. Äskettäin PI3K /AKT-reitin on osoitettu olevan keskeinen säätelijä EMT [26], [27]. E-kadheriinin on myös keskeinen säätelijä EMT ja estäjä syövän kehityksen voidaan säädellä PI3K /AKT-reitin [28]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että MTA1 muuttaa pahanlaatuisen fenotyypin syöpäsolujen ja säätelee ilmentymistä E-kadheriinin jota AKT-fosforylaation-riippuvaisen mekanismin. Tässä prekliinisen tutkimus antaa ymmärtää paremmin roolien MTA1 ja muodostaa perustan edelleen kliinisen tutkimuksen MTA1 tavoitteeksi geeni.

(A) Käsittely MTA1 siRNA vähentynyt MTA1 ilmaisun tehokkaasti ja parantaa E-kadheriinin ilmentymisen . Proteiini tasot analysoitiin Western blotting ja normalisoitiin P-aktiini. Kun määritellään, kuinka kaistaintensiteettejä näkyy (ylhäällä). Tähdellä (*) tai timantti (◊) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1 tai E-kadheriinin tasoilla, vastaavasti, verrattuna käsittelemätön solujen ja negatiivinen kontrolli siRNA-transfektoiduissa soluissa, n = 3. (B) liima määrä kvantitoitiin MTT-määritystä, ja edustavasta kokeesta on esitetty. Kyky solujen kiinni kiinteään pintaan oli merkittävästi voimistunut soluihin, jotka oli hoidettu MTA1 siRNA. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna käsittelemätön solujen ja negatiivinen kontrolli siRNA-transfektoiduissa soluissa. (C, D, ja E) käyttäminen Matrigel

TM-pinnoitettu transwell järjestelmä, invasiivinen kyky käsiteltyjen solujen MTA1 siRNA testattiin. Määrällinen määrä invasiivisia solujen pohjasta Transwell-irto näkyy alemmassa paneelissa. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna käsittelemätön solujen ja negatiivinen kontrolli siRNA-transfektoiduissa soluissa. (F, G ja H) muutokset solun tukirangan rakennetta havaittiin konfokaalimikroskopialla: Red värjäytymistä edustaa α-tubuliinin. Sininen värjäys edustaa ytimet. The ’jalat’ lyhenivät, ja polarisaatio heikensi käsitellyissä soluissa MTA1 siRNA. Nämä muutokset osoittavat alentunut kyky liikkua (400-kertainen). Edustava tulos kolmen erillisen kokeen näytetään kaikille data.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja väriaineet

Kaikki reagenssit tässä tutkimuksessa olivat analyyttistä laatua ja ovat kaupallisesti saatavilla. Ensisijainen vasta Tässä tutkimuksessa käytetyt ostettiin seuraavat yritykset: MTA1 vasta-aine oli Santa Cruz Biotech, USA; E-kadheriinin vasta-aine oli peräisin Epitomics Inc, USA; α-tubuliinia ja β-aktiini vasta olivat Sigma, Saksa, ja p-AKT (Ser473) vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology, USA. Alkalinen fosfataasi-konjugoitua anti-kani-anti-hiiri- tai anti-vuohi-IgG: t ostettiin myös Sigma. FITC- ja Cy3-konjugoitu IgGs ostettiin PTG lab, USA. DAPI (4, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi, (2 ug /ml: ssa metanolia)) hankittiin Taufkirchen, Saksa. Wortmanniini ostettiin myös Sigma.

(A) Western blotting tulokset osoittivat, että hoito MTA1 siRNA lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen 48 tunnin jälkeen. Tähdellä (*) tai timantti (◊) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1 tai E-kadheriinin tasoilla, vastaavasti, verrattuna negatiiviseen-ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa. (B) Western-blottaus-analyysi osoitti myös, että lyhytaikaisella transfektiolla plasmidilla, joka koodasi täyspitkää MTA1 laski E-kadheriinin ilmentymisen 48 tunnin jälkeen. Tähdellä (*) tai timantti (◊) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1 tai E-kadheriinin tasoilla, vastaavasti, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Muutokset kvantitoitiin (ylhäällä). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

kudosnäytteitä ja solulinjat

kudosnäytteistä normaalin eturauhasen, paikallinen eturauhassyöpä ja metastaattinen eturauhassyöpä saatiin Department of Pathology Tongji sairaala, joka on sidoksissa Huazhong tiede ja teknologia. Kaikki metastaattisen eturauhassyövän kudokset otettiin potilailta, jotka olivat dokumentoitu etäpesäkkeitä ja tehtiin höyläysleikkaus eturauhasen (TURP) lievittää virtsateiden tukkeuma (etäinen etäpesäke ja positiivinen luukuvaus, M1 kasvaimeen imusolmukkeisiin etäpesäke TNM lavastus) . Tutkimus hyväksyi paikallinen tutkimuksen eettinen komitea (REC) Tongji sairaalan Huazhong tiede ja teknologia periaatteen mukaisesti Helsingin julistuksen II. Kaikki kirjallinen suostumus dokumentteja kukin osallistuja saatiin rekisteröinnin yhteydessä. Huonosti metastaattinen ihmisen eturauhasen adenokarsinooma PC-3M-2B4 solulinja (2B4) ja erittäin metastaattinen ihmisen eturauhasen adenokarsinooma PC-3M-1E8 solulinja (1E8) ostettiin professori Zhengjie (Beijing University, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco-BRL, USA), 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (Si Jiqing, Hangzhou, Kiina).

(A) Western blot-analyysi osoitti, että hoidon MTA1 siRNA voi estää AKT fosforylaatio jälkeen 48 tunnin siRNA hoitoa. Tähdellä (*) ja timantin (◊) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1 ja E-kadheriinin tasoilla, vastaavasti, verrattuna negatiiviseen-ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa. (B) Soluja inkuboitiin joko p-AKT-estäjällä wortmanniini (100 nM) tai DMSO: ta eri aikoja 24 48 tuntia, ja solun proteiinit uutettiin. Western-blotting-analyysi osoitti, että wortmanniini hoitoa edistetään ilmentymistä E-kadheriinin ja inhiboi ilmentymistä MTA1 24 tunnin kuluttua. Tähdellä (*), timantti (◊), tai kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1, E-kadheriinin tai p-AKT tasoilla, vastaavasti, verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin. (C) pakottaminen yli ilmentyminen p-AKT lyhytaikaisella transfektiolla Myr-AKT plasmidin vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja lisääntynyt ilmentyminen MTA1 24 tunnin kuluttua. Kvantifiointi bändit näkyy (ylhäällä). (D) Solut transfektoitiin MTA1 siRNA: n läsnä tai poissa ollessa myr-AKT-plasmidi tai wortmanniini 48 tuntia. Western-blotting-analyysiä käytettiin arvioimaan muutoksia E-kadheriinin ilmentymisen. Tähdellä (*), timantti (◊), tai kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) MTA1, E-kadheriinin tai p-AKT tasoilla, vastaavasti, verrattuna negatiiviseen-ohjaus siRNA-transfektoiduissa solut. Kvantifiointi kaistojen intensiteettien näkyy (ylhäällä). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen analyysi MTA1 suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä. Vahasta ja uudelleenhydratoitu kudoksen leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisella anti-ihmisen MTA1 vasta-ainetta 1:100 laimennus- ja pestiin sitten PBS: llä. Biotinyloitu vuohen anti-kani-immunoglobuliinin (DAKO, Kioto, Japani) lisättiin sitten osiot 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun leikkeet pestiin PBS: llä, peroksidaasikonjugoitua avidiini (DAKO), levitettiin sitten. Peroksidaasin havaittiin altistamalla osat liuokseen, jossa oli 0,05% 3, 3-diaminobentsidiinillä ja 0,01% H

2O

2 Tris-HCI-puskuriin (3, 3-diaminobentsidiinillä liuosta) ja 3-6 minuuttia huoneen lämpötilassa. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä.

(A) Soluja käsiteltiin myr-AKT plasmidin tai tyhjän vektorin 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa E-kadheriinin siRNA. Liima kyky testattiin käyttäen MTT-määritystä, ja tyypillinen Koetulos esitetään. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu myr-AKT-koodaus plasmidin poissa ollessa E-kadheriinin siRNA. (B) Soluja inkuboitiin wortmanniinilla (100 nM) tai DMSO: ssa 24 tuntia ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman E-kadheriinin siRNA: ssa 48 tuntia. Käyttäen MTT-määritystä, liima kyky solujen testattiin. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin. Kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna wortmanniini-käsiteltyjen solujen puuttuessa E-kadheriinin siRNA. (C, D, ja E) Soluja käsiteltiin myr-AKT-plasmidin tai tyhjän vektorin 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa E-kadheriinin plasmidi. Matrigel

TM-pinnoitettu siirtokuoppaan järjestelmää käytettiin analysoimaan invasiivisia ominaisuuksia solujen. Määrällinen määrä invasiivisia solujen pohjasta Transwell-irto esitetään (oikea paneeli). Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu myr-AKT-koodaus plasmidin poissa ollessa E-kadheriinin siRNA. (F, G ja H) Soluja käsiteltiin myr-AKT-plasmidin tai tyhjän vektorin 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa E-kadheriinin plasmidi. Muutokset solujen tukirankansa seurattiin konfokaalimikroskopialla. Red värjäys edustaa α-tubuliinin, ja sininen värjäys edustaa ytimet (400-kertainen). (I, J, ja K) Soluja käsiteltiin wortmanniini (100 nM) tai DMSO: ssa 24 tuntia ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman E-kadheriinin siRNA: ssa 48 tuntia. Matrigel

TM-pinnoitettu siirtokuoppaan järjestelmää käytettiin mittaamaan muutoksia solujen invasiivisia kyky. Määrällinen määrä invasiivisia solujen pohjasta transwell-insertin on esitetty (oikea paneeli). Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin. Kolmio (Δ) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) verrattuna wortmanniini-käsiteltyjen solujen puuttuessa E-kadheriinin siRNA. (L, M ja N) Soluja käsiteltiin wortmanniini (100 nM) tai DMSO: ssa 24 tuntia ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman E-kadheriinin siRNA: ssa 48 tuntia. Muutokset solujen tukirankansa seurattiin konfokaalimikroskopialla. Red värjäys edustaa α-tubuliinin, ja sininen värjäys edustaa ytimet (400-kertainen). Edustava tulos kolmen kokeen on esitetty kaikki tiedot.

RT-PCR: llä ja immunoblottauksella

RT-PCR-analyysi, kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä Trizol -reagenssia (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska), ja cDNA syntetisoitiin M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR suoritettiin käyttäen PCR vahvistavan järjestelmän (Biometra, USA). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Oligo 6 ohjelmisto, tunnistetaan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) ja Invitrogen. MTA1 alukesekvenssit olivat seuraavat: Forward: 5′-CTCTGCGCATCTTGTTGGACATA -3 ’ja Reverse: 5′-TCAGCTTCGTCGTGTGCAGATAG -3’. Jotta sisäinen standardi, β-aktiini alukesekvensseissä olivat seuraavat: Forward: 5’GCACCACACCTTCTACAATG -3 ’ja Reverse: 5’TGCTTGCTGATCCACATC TG -3’.

Western blot -analyysit, solut lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris /HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS: ää ja 0,5% (w /v) natriumdeoksikolaatti). Vastaavat määrät solu-uutteiden (150 ug) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelissä (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo (PVDF). Membraanit blokattiin 25 mM Tris (pH 8,0), joka sisälsi 125 mM NaCl: a, 0,1% Tween 20, 5% rasvatonta maitoa 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin laimennetun primaaristen vasta-aineiden (MTA1: 1:200, E-kadheriinin ja p -AKT: 1:2000 ja β-aktiini: 1:1000) 4 ° C: ssa yön yli. Inkubaation jälkeen primaaristen vasta-aineiden, toissijainen vasta-aineita lisättiin yhdellä 1:1000 laimennus. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet visualisoitiin alkalisella fosfataasilla ja BCIP /NBT-värjäys.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, kokonais-RNA eristettiin solulinjoista Trizol-reagenssissa (Invitrogen , Cergy Pontoise, Ranska). Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen cDNA-synteesi (Amersham Bioscience, NJ). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA) käyttämällä QuantiTect SYBR Green (Qiagen, CA). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express 3.0-ohjelmiston, jonka tunnuksena Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) ja Invitrogen. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena. Olosuhteet kvantitatiivinen PCR-reaktiolle olivat seuraavat, yksi sykli 50 ° C: ssa 15 min, yksi sykli 94 ° C 2 min, 40 sykliä 94 ° C: ssa 15 s, 56 ° C: ssa 20 s, ja 70 ° C: ssa 20 s. Lopussa PCR-reaktion, näytteet alistettiin sulamisanalyysikokeita spesifisyyden varmistamiseksi amplikonin. MTA1 alukesekvenssit olivat: Forward: 5′-GCAGCTGAAGCTGAGAGCAAGTTA-3 ’; Reverse: 5’-CCTTGACGTTGTTGACGCTGA -3 ”. E-kadheriinin alukesekvensseissä olivat: Forward: 5’TACACTGCCCAGGAGCCAGA -3 ’; Reverse: 5 ’TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; Sisäisen standardin, GAPDH alukesekvenssit olivat: Forward: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 ’; Reverse: 5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3 ’.

Cell transfektio

solulinjoja viljeltiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille tai pulloissa 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa (Heraeus, Saksa). Sillä siRNA transfektiota solut transfektoitiin 200 pmol /ml siRNA duplex käyttäen 5 ui Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen), kun solut olivat 20% konfluentteja mukaan valmistajan protokollaa. Tarkastukset sisältyvät transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu salattu negatiivinen kontrolli siRNA (Ruibo, Kiina). Plasmidin transfektion, 4 x 10

5-solut maljattiin 6-kuoppaiselle levylle ja transfektoitiin käyttäen 4 ug plasmidia ja 10 ui Lipofectamine

TM 2000 kuoppaa kohti. Täyspitkä MTA1 plasmidi (pEGFP-C1 /MTA1) luovutti ystävällisesti professori My Mahoney (Thomas Jefferson University), ja tyhjän vektorin (pEGFP-C1) säilytettiin meidän lab. PCMV-SPORT6 E-kadheriinin plasmidi ostettiin YRBIO (Kiina), ja E-kadheriinin geeni subkloonattiin pcDNA vektoriin meidän lab. PcDNA myr-HA-AKT2 (MYR-AKT) plasmidi ostettiin Addgene (https://www.addgene.org/; Addgene plasmidi 9016), ja tyhjä pcDNA myös säilynyt meidän lab. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja proteiini mitattiin Western blotilla. MTA1 siRNA-sekvenssit olivat seuraavat: Forward: 5′-CCCUGUCAGUCUGCUAUAA dTdT 3 ’ja Reverse: 3’ DTDTGGGACAGUCAGACGAUAUU 5 ’. E-kadheriinin siRNA sekvenssit olivat seuraavat: Forward: 5’CAGACAAAGACCAGGACUA dTdT 3 ’ja Reverse: 3’ dTdT GUCUGUUUCUGGUCCUGAU 5 ’.

Euroopan invaasiomääritys

invaasiomääritys, 5 x 10

3-soluja siirrostettiin 100 ui RPMI 1640 median päällä polyeteenitereftalaatti (PET) kalvoja päällystetty matrigeelin

TM (1,5 mg /ml, BD Biosciences) sisällä siirtokuoppaan soluviljelmissä insertit (24-kuoppaiset insertit , 8 um huokoskoko; Corning Life Sciences, Corning, NY). Alaosaan täytettiin 600 ui RPMI 1640 väliainetta, joka sisälsi 20% FBS: ää, ja supernatantti NIH3T3-solut (hiiren alkion fibroblasti-solulinja), joka toimii kemotaktinen tekijä (CF). Soluja inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sen jälkeen solut kiinnitettiin 2,5% (v /v) glutaraldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla. Invasiivisen solut geelillä pohjassa visualisoitiin mikroskoopilla (Leica, Saksa) ja kvantitoitiin laskemalla solujen määrä kolmesta satunnaisesti valitusta kentät 100-kertainen suurennus.

Kiinteän faasin adheesiomääritys

Tarttumismääritys suoritettiin käyttäen tetratsolium-kolorimetrinen koe (MTT). Yhtä suuri määrä soluja (4 x 10

4 solua per kuoppa) ympättiin 96-kuoppaisille levyille, jotka oli esipäällystetty 1 ug /ml fibronektiiniä (FN) (Sigma, Saksa). Vertailun vuoksi sama määrä soluja oli myös ympättiin levyille päällystettiin naudan seerumin albumiinia (1% w /v). 1 tunnin jälkeen levyt upotettiin PBS: ään, joka sisälsi 1 mM MgCl

2 poistamiseksi tarttumattomat solut. Sitten Tarttuvien solujen lukumäärä mitattiin MTT-määrityksellä ja luettiin 490 nm: ssä. OD-arvot ovat solujen osuus, jotka kiinni FN-päällystetty 96-kuoppaiselle levylle. Määrä tarttuvuus laskettiin seuraavalla yhtälöllä: arvo OD kokeen /arvo OD kontrolli x 100%.

Konfokaalimikroskopia kuvantamisen

Immunofluoresenssivärjäystä , 1 x 10

4-solut ympättiin lasipeitinlevyille (halkaisijaltaan 13 mm). Sen jälkeen, kun solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä, solujen kalvot läpäiseviksi 0,2% (v /v) Triton X-100 PBS: ssä, ja epäspesifinen sitoutuminen estettiin 5% BSA: ta (w /v) PBS: ssä. Ensimmäinen vasta-aine levitettiin objektilasien 4 ° C: ssa yön yli (α-tubuliinin: 1:50, MTA1: 01:20, ja E-kadheriinin: 1:100). Inkuboinnin jälkeen ensimmäisellä vasta-aineella, solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja inkuboitiin FITC tai Cy3-konjugoitu IgG klo 1:50 laimennos PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tumat värjättiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa DAPI. Solut huuhdeltiin PBS: lla ja havaittujen käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Japani).

Co-immunosaostus (Co-IP) B

1E8 solut kasvoivat 10 cm ruokia sitten kerättiin non -denaturing lyysipuskuria (20 mM Tris ,, PH 8, 135 mM NaCl, 10% glyseroli, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA, Roche täydellinen mini proteaasi-cocktail-inhibiittoreita. Kaikki seuraavat menettelyt olivat suoritetaan jäällä. lyysipuskuria liukeneva lysaatit, kerätään poiston jälkeen 4 tunnin ajan ja sentrifugoimalla 12000 rpm 20 minuuttia 4 ° C: ssa. Kun putki 1 mg solulysaatti lisättiin 40 ui MTA1 vasta-ainetta, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa . seuraavana päivänä sisältävä solulysaatti vasta-ainetta levitettiin proteiini G-kytketty Sepharose-helmiä (Abcam) 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa. helmet pestiin 3 kertaa lyysipuskurissa. Lopuksi supernatanttia lisättiin 25 ui 2 x latauspuskuria . Western-blottaus suoritettiin erottamisen jälkeen proteiinin ja helmet kiehuvan.

tilastollinen

Aineisto analysoitiin ANOVA. Tilastollinen analysoida suoritettiin SPSS version 13.0 ohjelma.

Tulokset

ilmentyminen MTA1 vuonna eturauhassyövän

Vahvista ilmentymisen MTA1 ihmisen eturauhassyövän, immunohistokemiallinen värjäys analyysi MTA1 suoritettiin normaalissa eturauhasessa, paikallinen eturauhassyöpä ja metastasoituneen eturauhassyövän kudosnäytteet (resurssit ja kriteerit kudoksen nimitykset on kuvattu materiaalit ja menetelmät -osiossa). Tulokset osoittivat, että normaalissa eturauhasessa, MTA1 ilmentyminen oli tuskin havaittavissa (kuvio 1A). Kuitenkin paikallinen eturauhassyöpä näytteet, positiivinen värjäys MTA1 havaittiin ytimet 6 15 tutkituissa kudoksissa (kuvio 1 B). Lisäksi, 27 30 kasvaimen metastaattinen eturauhassyöpä kudoksiin, korkea MTA1 värjäytymistä havaittiin sekä sytoplasmassa ja ytimet syöpäsolujen (kuvio 1C). Määrällinen analyysi positiivisen värjäytymisen MTA1 kuviossa 1A-C kuvassa S1. RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi suoritettiin mittaamaan ekspression MTA1 RNA: n ja proteiinin tasot, vastaavasti, PC-3M-1E8 (1E8), ja PC-3M-2B4 (2B4) soluihin [29], [30]. Tulokset näistä analyyseistä on esitetty kuviossa 1D ja E, jotka osoittavat, että MTA1 RNA: n ja proteiinin tasot olivat läsnä molemmissa solulinjoissa, mutta eri ekspressiotasoja. MRNA ekspressiotasot MTA1 oli 0,38 ± 0,01 ja 0,83 ± 0,02 varten 2B4 ja 1E8-soluja, vastaavasti, ja proteiinin ilmentyminen tasot 2B4 ja 1E8-soluja 0,58 ± 0,04 ja 0,83 ± 0,02, vastaavasti (p 0,05, n = 3 kullekin). Olemme havainneet, että 1E8 solut ilmensivät noin kaksi kertaa korkeampi MTA1 RNA: n ja 1,5-kertaa suurempi MTA1 proteiinin tasot verrattuna 2B4-soluissa. Siksi 1E8 solulinja valittiin tutkia biologisten ominaisuuksien MTA1 eturauhasen karsinooma in vitro.

vaikutus MTA1 hiljentäminen on pahanlaatuinen fenotyyppi 1E8 solujen

käytetään siRNA alas -regulate ilmentymistä MTA1 on 1E8 soluissa. Kolme paria siRNA: ita vastaan ​​MTA1 suunniteltiin. Varmistimme tehoa siRNA Western-blottauksella (kuvio S2). Vähintään 60% knockdovvn MTA 1-proteiinin taso saatiin käyttämällä siRNA-3 #, joten päätimme parin meidän jatkotutkimuksiin (kuvio 2A). Olemme myös yliekspressoidaan MTA1 taustalla MTA1 siRNA, joka vahvisti vaikutus tuomat siRNA-3 # soluissa (kuvio S3). SiRNA-transfektoiduissa soluissa analysoitiin myös ekspression E-kadheriinin proteiinia. Western-blot-analyysi osoitti, että ilmentymistaso E-kadheriinin oli suurempi MTA1 siRNA-käsitellyt solut (48 tuntia transfektion jälkeen), mikä osoitti, että MTA1 voi olla rooli negatiiviseen säätelyyn E-kadheriinin. Seuraavaksi analysoitiin tarttuvuuden kyky MTA1 siRNA-käsiteltyjen 1E8-soluja käyttäen kiinteän faasin määrityksessä yhdessä MTT-määritystä (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa). Samasta päällystämätön pitoisuus FN, tarttumista kyky MTA1 siRNA-käsitellyissä soluissa oli merkittävästi suurempi kuin kontrollisolut. Edustava kuva näytetään. Liima hinnat käsittelemätön, negatiivinen kontrolli siRNA-käsiteltyjen ja MTA1 siRNA-käsitellyt solut olivat 40,07 ± 6,23, 50,22 ± 4,99 ja 99,62 ± 9,62, vastaavasti (p 0,05, n = 3, kuva 2B). Tutkimme myös vaikutuksia MTA1 on invasiivisuus on 1E8 solujen käyttäen Matrigel

TM-pinnoitettu transwell malli. Määrät soluja alareunassa kalvon, joka heijastuu invasiivisuus soluista oli 597 ± 6,24, 590 ± 5,77 ja 201 ± 2,40 varten käsittelemätön, negatiivinen kontrolli siRNA-käsitellyn ja MTA1 siRNA-käsiteltyjä soluja, vastaavasti (p 0,05, n = 3 kuvio 2C-E). Korjauksilla solujen solun tukirangan organisaatioon ja polariteetti ovat mukana myös kasvainsolun etäpesäkkeitä [31] Siksi tutkimme tukirankansa rakenteet MTA1 siRNA-käsitellyissä soluissa konfokaalimikroskopiaa ja totesi, että ”jalat” on MTA1 siRNA-käsiteltyjen soluja lyhentää, ja että solun polariteetti heikensivät kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 2F-H MTA1: punainen, ytimet: sininen). Nämä tulokset viittaavat edelleen siihen, että MTA1 voi olla mukana pahanlaatuinen fenotyypit syöpäsolujen, kuten tarttuvuus, invasiivisuus, solun tukirangan rakennetta ja solun polariteetti.

MTA1 säätelee ilmentymistä E-kadheriinin

Vahvista roolia MTA1 säätelyssä E-kadheriinin ilmentymisen, käsittelimme 1E8 soluja MTA1 siRNA ja täyspitkän MTA1 plasmidi eri aikoja 24-48 tuntia (translationaalinen taso).