Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Hemoglobiini (Hgb) on tärkeimmät happea ja hiilidioksidia kantaja-soluissa erytroidilinjasta ja on vastuussa hapen toimitus respiring kehon kudoksiin. Kuitenkin Hgb on myös ilmaistu nonerythroid soluissa. Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmaus Hgb ihmisen kohdunkaulan syöpä soluja ja sen rooli kohdunkaulan syövän tutkittiin.

Menetelmät

Ilmaisu taso Hgb kohdunkaulan syövän kudoksissa määritettiin kvantitatiivisen käänteistranskriptaasi-PCR: llä (qRT-PCR). Olemme käyttää useita menetelmiä, kuten RT-PCR, immunoblottaus, ja immunohistokemiallinen analyysi, vahvistaa Hgb ilmentymisen kohdunkaulan syövän soluissa. Vaikutukset ektooppinen ilmentyminen Hgb ja Hgb mutanttien oksidatiivisen stressin ja solujen elinkyky tutkittiin solujen reaktiivisten happiradikaalien (ROS) analyysi ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) array, vastaavasti. Sekä Anneksiini V fluoresenssi virtaussytometrialla ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys käytettiin, vastaavasti, arvioida solujen apoptoosin.

Tulokset

qRT-PCR-analyysi osoitti, että Hgb-α- (HBA1) ja Hgb-β-globiini (HBB) geenien ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi kohdunkaulan karsinooman kuin normaalissa kohdunkaulan kudoksissa, kun taas ekspressio hematopoieettisten transkriptiotekijöiden ja punasolujen erityisiä markkerigeenit ei lisääntynyt. Immunovärjäys vahvistivat, ilmentymistä Hgb syöpäsoluissa kohdunkaulan. HGB mRNA ja proteiini havaittiin myös ihmisen kohdunkaulan sinoomasolulinjoja SiHa- ja CaSki ja Hgb ilmentyminen ajan säätelee vetyperoksidin aiheuttama oksidatiivista stressiä. Tärkeää on, ektooppinen ilmentyminen villin tyypin HBA1 /HBB tai HBA1 sijasta mutantteja HBA1

H88R /HBB

H93R kykene sitomaan hemo, tukahdutti oksidatiivista stressiä ja parannettu solujen elinkykyä.

Johtopäätökset

esillä olevat havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, että Hgb on ilmaistu kohdunkaulan karsinooman soluissa ja voi toimia antioksidanttina, lieventävien oksidatiivisen stressin aiheuttama vahinko kohdunkaulan syövän soluissa. Nämä tiedot tarjoavat merkittävä vaikutus paitsi globiini biologian lisäksi myös ymmärrystä kohdunkaulan syövän synnyssä liittyy oksidatiivista stressiä.

Citation: Li X, Wu Z, Wang Y, Mei Q, Fu X, Han W ( 2013) karakterisointi Aikuisten α- ja β-Globiinin Kohonnut vetyperoksidilla kohdunkaulan syöpäsolut Play solua suojaavana rooli hapettumista vastaan ​​Loukkaukset. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10,1371 /journal.pone.0054342

Editor: Russell O. Pieper, University of California-San Francisco, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 12 joulukuu 2012; Julkaistu: 17 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (sivusto on https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (nro 31201033, 31270820, 81230061 ja 81001184), ja oli osittain tuettu jonka avustuksia National Basic Science ja kehitysohjelmaan Kiina (sivusto on https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (nro 2012CB518103 ja 2012CB518105). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hemoglobiini (Hgb), suuret hemin proteiini punasolujen, helpottaa hapen ja hiilidioksidin määrää veressä. HGB: ssä molekyyli on kokoonpanoon neljän pallomainen proteiinin alayksiköstä. HgbA, yleisin tyyppi Hgb aikuisilla ihmisillä, on tetrameeri koostuu kahdesta hemin sisältävää α- ja β-alayksiköt pysyvät yhdessä ei-kovalenttisten vuorovaikutusten (α

2β

2) [1], [2] . Muut selkärankaiset Hemi sisältävien proteiinien rakenteellisia homologiaa globiini ketjuja ovat myoglobiinin, joka on yleisesti todettu selkärankaisten sydämet ja poikkijuovaisten ja sileiden lihasten [3], cytoglobin, enimmäkseen kuvattu sidekudoksen [4], ja neuroglobin, ilmentyy laajasti aivoissa [ ,,,0],5].

yhteinen toiminta HGBS kuin selkärankaisen tärkein hapen ja hiilidioksidin kantaja on suhteellisen uusi sopeutumista evoluution aikana, tarvitaan varmistamaan oikean hapen luovutusta kaikkien solujen kehon kautta keinot verisuoniverkoston . Tämän lisäksi klassinen rooli, HGBS voi suorittaa solun muiden toimintaa, kuten solunsisäinen hapen kuljetusta, hapen tunnistava, NO puhdistusjärjestelmä, vetyperoksidi puhdistusjärjestelmä, ja raudan aineenvaihduntaa asetuksen [6]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu havaitseminen Hgb ketjujen muissa soluissa kuin erytroidihierarkian sarja, mukaan lukien neuronit [7], [8], [9], verkkokalvon soluihin [10], [11], alveolaariset epiteelisolujen [12], [ ,,,0],13], [14], kohdun limakalvon [15], rotan munuaisen mesangiaalisten solujen [16], maksasoluissa [17] ja makrofagit [18]. Se oli arveltu, että funktio Hgb hermosoluissa voi olla hapen varastointikapasiteetti [9]. Alveolaarisissa epiteelisoluissa, hypoksian indusoiman Hgb ekspressio voi olla rooli hapen tunnistava reitti [14]. Microarray analyysit MN9D dopaminergisten stabiilisti transfektoitujen solulinjojen kanssa Hgb-α-globiinin (HBA1) ja Hgb-β-globiini (HBB) ketjut paljasti muutoksia geenien mukana happea homeostaasin ja mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation [7]. Lisäksi Hgb yliekspressio on osoitettu vähentävän oksidatiivisen stressin, mikä viittaa siihen, että Hgb toimii antioksidanttina [16], [17].

Oksidatiivinen stressi aiheuttaa epätasapainossa muodostuisi aktiivisia happiaineenvaihduntatuotteiden ja tahtia johon ne ovat puhdistetun entsymaattisella ja ei-entsymaattisella antioksidantteja, ja se on liitetty patogeneesiin ja komplikaatioihin useiden sairauksien, kuten syövän [19]. Ylituotanto tai riittämätön poisto reaktiivisen hapen (ROS), kuten vetyperoksidi, hydroksyyliradikaalien ja superoksidi anioni liittyy syövän synnyn [20] ja invasiivisuus [21]. Entsymaattisten ja ei-entsymaattisten antioksidantti puolustusmekanismeja säätelevät solujen hapetus-pelkistys-tasapainossa, ja siksi monien tautien patogeneesissa. Kuitenkin käsityksemme roolien hapetin ja antioksidantin järjestelmien syövän synnyn ja kasvainten kehittymiseen on edelleen vähäistä. Yllättävää kyllä, tuore tutkimus osoitti, että Hgb toimii hapettumista estävä peroksidaasia, lieventävien vetyperoksidi aiheuttamaa oksidatiivista stressiä [22].

Advances in high-throughput sirutekniikalla ovat mahdollistaneet vertailun geeniekspressioprofiilien välillä primaarikasvainten ja normaali kudoksiin. Microarray-pohjainen geenin ilmentymisen analyysit tunnistettu Hgb geenit ilmentyvät differentiaalisesti kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rintasyövän [23], munasarja- serous karsinooma [24], ja kolorektaalisyövän [25]. Tuore proteomic tutkimus osoitti, että seerumin HBA1 ja HBB tasot olivat merkitsevästi koholla munasarjasyöpää sairastavilla potilailla verrattuna terveisiin naisilla [26]. Vaikka lähde vapaan Hgb seerumissa oli tuntematon, sen oletetaan olevan seurausta oksidatiivisen stressin aiheuttaman hemolyysin. Mekanismit sääntelyä Hgb ja sen toiminnallinen seurauksista kiinteissä kasvaimissa on vielä täysin ymmärretä.

Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että Hgb-α, aikuinen ketju 1 (HBA-a1), ja Hgb- β, aikuisten ketju 1 (HBB-b1) on ilmaistu karsinoomasoluja useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. HGB ekspressiota havaittiin kliinisesti resektoitiin yksilöiden ihmisen kohdunkaulan kudosten ja oli säädellään ylöspäin kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että oksidatiivisen stressin up-regulation Hgb ilme. Tärkeää on, Hgb yliekspressio vähennetään oksidatiivisen stressin ja paransi kannattavuutta kohdunkaulan syöpäsoluja. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että Hgb voi olla osa endogeenisen antioksidantin puolustusjärjestelmä, suojella soluja hapettumista vastaan ​​potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä.

Tulokset

Lisääntynyt Hgb gene expression in Kohdunkaulan syöpä Näytteet

tutkimiseksi ilmennetty eri geenien kohdunkaulan syövän, analysoimme aikaisemmin julkaistu microarray aineisto mukaan lukien 33 kohdunkaulan syöpää ja 24 normaalia näytteitä. Verrattuna normaaliin kohdunkaulan epiteelin, kohdunkaulan syöpä näytteet osoittivat merkittävää nousua ilmaus HBA1 ja HBB-geenit (taulukko 1). Ilmaisulla transkriptiotekijöiden punasolujen erilaistumiseen [27], mukaan lukien NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL ja GATA1 ei kasvanut. Lisäksi, ekspression muita hemoglobiinin geenien (HBD, HBE1, HBG2, HBQ1 ja HBZ) ja punasolujen markkeri geenejä, kuten SPTB, ERAF ja ALAS2 eivät osoittaneet merkittävää kasvua. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kohonnut HBA1 ja HBB ilmaisun kohdunkaulan syöpä ei johtunut erytropoieesin mutta eri mekanismilla.

Jotta vahvistaa mahdollista roolia Hgb ihmisen kohdunkaulansyövän, ekspressiotasoja of HBA1 ja HBB tutkittiin 20 kohdunkaulan syövän yksilöitä ja 10 normaalia kohdunkaula kudosnäytteiden by qRT-PCR-analyysillä. Erityinen alukkeet HBA1 ja HBB suunniteltiin qRT-PCR mukaan National Center for Biotechnology Information (NCBI) tietokantaan. Spesifisyyden alukkeet HBA1 ja HBB amplifikaatio varmistettiin käyttäen RNA: ta ihmisen luuytimen ja ääreisverenkierron positiivisena kontrollina (kuvio. 1A). Ensinnäkin, RT-PCR-koe suoritettiin sen määrittämiseksi ilmentymistasojen HBA1 ja HBB geenien 20 kohdunkaulan syövän näytettä (Fig. 1 B). Yhdenmukainen microarray aineisto, qRT-PCR-analyysi osoitti, että ekspressio HBA1 ja HBB oli merkittävästi korkeampi kohdunkaulan syövän kudoksissa kuin normaalissa kohdunkaulassa kudoksissa (Fig. 1 C ja D). Ilmaisulla transkriptiotekijöiden erytropoieesia, kuten GATA-1, KLF1, ja SCL /TAL1 [27], ei muuttunut merkittävästi kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna kontrolleihin (tuloksia ei ole esitetty). Ilmaisu punasolujen markkeri geenejä, kuten SPTB, ERAF, ei säädelty kohdunkaulan syövän kudoksissa, mikä osoittaa, että kasvu Hgb ilmaisua ei liittynyt erytropoieesia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Hgb voi olla merkitystä ihmisen kohdunkaulan syövän kehitykseen.

(A) Vahvista spesifisyys HBA1 ja HBB alukkeita qRT-PCR, ilmaus HBA1 ja HBB tutkittiin ihmisen luuytimen ja ääreisverenkierron solujen. Retrotranscriptase vapaa (-) negatiivisena kontrollina, H

2O kuin järjestelmän ohjaus. Herra, Marker. (B) cDNA: kohdunkaulan syövän näytteitä valmistettiin ja analysoitiin ilmentymisen HBA1 ja HBB RT-PCR: llä. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. H

2O järjestelmänä ohjaus, T, edustaa primäärikasvain näytteitä. Ilmentymistasojen HBA1 ja HBB mitattiin qRT-PCR: llä 20 ihmisen kohdunkaulan syövän näytteet ja 10 normaalia kohdunkaulan kudoksen valvonta. Kvantifiointi osoitti normalisoitu HBA1 ja HBB tasolla (log

10) koko parittoman normaali kohdunkaulan (n = 10) ja kohdunkaulan syöpä (n = 20) näytteet on esitetty. Tukey laatikot edustavat ylä- ja alakvartiilit jaettuna mediaani ja viikset ovat suurimmat ja pienimmät arvot, lukuun harha edustaa piireissä. Kaikki erot olivat tilastollisesti merkitseviä

P

0,05 (C ja D).

havaitseminen Hgb Proteiini Kohdunkaulansyöpä Kudokset

ilmaus Hgb proteiinitasolla tutkittiin käyttäen kaupallista vasta-aineita hyvin puhdistettua ihmisen Hgb. Koska korkea homologia globiinin proteiinit, spesifisyyden vasta-aineen havaitsemiseksi HBA1 ja HBB ketjut varmistettiin transfektoimalla ihmisalkion munuaisen HEK293-solujen ilmentämisvektorit, jotka EGFP-merkitty globiini isoformeja (Hba-a1, HBB-b1 , Hba-x, HBB-y, Hba-z), joka ei osoittanut mitään rajat reaktio muiden globiinit immuunivärjäykseen kokeissa (Fig. S1). Välttämiseksi ristireaktiivisuus verisolujen, kohdunkaulan syöpä kudokset pestiin perusteellisesti PBS ennen kiinnitystä. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,01. (B) HBA1 ja HBB proteiinin ilmentyminen indusoitiin H

2O

2 hoitoa. Kokosolulysaateista saatu SiHa-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman H

2O

2 (1 mM, 48 h) analysoitiin HBA1 ja HBB tasolla. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) HBA1 ja HBB mRNA: t olivat ajan säätelee H

2O

2 hoitoa HEK293-soluissa. HEK293-soluja käsiteltiin H

2O

2 (1 mM, 36 h). Käänteistranskriptio-PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (D) Annos ja aika riippuvuus vasteen SiHa solujen H

2O

2 hoitoa. SiHa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksia (0, 0,25, 0,5 ja 1 mM) H

2O

2 8, 16, 24 tai 36 tunnin ajan. Suhteellinen HBA1 mRNA taso määritettiin qRT-PCR. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD (n = 3). Arvot normalisoitiin HBA1 tason ohjaus (0 mM, 8 h), joka oli asetettu 1. Yksisuuntainen ANOVA testi useiden vertailujen käytettiin analysoimaan eroja hoitojen.

**

P

0,01;

***

P

0,001, verrattuna 0 mm hoitoon.

tarkastella mahdollisia annoksesta ja riippuvuus H

2O

2 aiheuttama säätely ylöspäin Hgb, SiHa soluja käsiteltiin erilaisilla H

2O

2 pitoisuudet eri aikaväleillä ja analysoitiin tavanomaisella qRT-PCR. Kuten nähdään Fig. 4D, H

2O

2 lisääntynyt Hgb mRNA annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Vaikutusta oksidatiivista stressiä ilmentyminen GATA-1 ja KLF1, jotka ovat transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät Hgb ilmaisun aikana erytropoieesin tutkittiin. Yhdenmukainen aikaisemmassa tutkimuksessa hepatosyyteissä [17], ylös-säätely Hgb H

2O

2 ei välittämä GATA-1 ja KLF1, viittaa siihen, että eri taustalla mekanismi saattaa olla mukana (Kuva. S5 ).

vaimennus ROS Generation ja apoptoosin by HBA1 /HBB tai HBA1, mutta ei HBA1

H88R /HBB

H93R yliekspressio kohdunkaulan syövän solut

tutkimiseksi biologisten roolia Hgb kohdunkaulan syöpäsolujen HBA1 ja HBB olivat yli-ilmentää ohimenevä transfektiolla SiHa soluja. Lisääntynyt ilmentyminen HBA1 ja HBB vahvistettiin immunoblottauksella (Fig. 5A). Perustuen aikaisemmassa tutkimuksessa osoittaa, että tietyt oksidatiivisen stressin indusoima geenien on hapettumista estävä toimintojen [30], me arveltu, että Hgb voi olla antioksidanttisia ominaisuuksia kohdunkaulan syövän solujen vastauksena oksidatiivista stressiä. Siksi tarkasteltiin solunsisäisiä tasoja ROS käsitellyissä soluissa H

2O

2 käyttämällä fluorogeeniset antureista ja Superoksidianionin. Kohdunulkoinen ilmaus HBA1 /HBB SiHa- käsitellyissä soluissa eksogeenisen H

2O

2 tukahdutti solunsisäistä tuotantoa H

2O

2 ja superoksidianionia määritettynä immunofluoresenssianalyysin avulla (kuvio. 5B ja C) . Kvantifiointi ROS virtaussytometrialla osoitti, että fluoresenssin intensiteetti soluissa, jotka yliekspressoivat HBA1 /HBB oli merkittävästi alhaisempi kuin soluissa, jotka on transdusoitu ohjaus lentiviruksen (Fig. 5D ja E). Prosenttiosuus kohti yhteensä solujen määrän, joilla on korkea kunkin ROS soluissa yli-ilmentävät HBA1 /HBB väheni merkitsevästi verrattuna transfektio tyhjällä vektorilla kontrollina (

P

0,05, n = 3 kussakin ryhmässä; Fig . 5F ja G). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin CaSki-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Se, että ekspressiotaso HBA1 kohdunkaulan syövän solulinjoissa on suurempi kuin HBB viittaa siihen, että useiden bioaktiivisten molekyylien, paitsi heterodimeeri muotoja, mutta myös monomeerin tai homodimeerin muotoja HBA1 proteiini voi olla läsnä samanaikaisesti kohdunkaulan syövän solut. Tueksi tätä käsitystä, SiHa solut pelkästään transfektoitu HBA1 ja sitten käsiteltiin eksogeenisen H

2O

2. Yhdenmukainen Tuoreen tutkimuksen [31], prosentuaalinen kohti yhteensä solujen määrän kanssa solunsisäisiä tasoja ROS soluissa yli-ilmentävät HBA1 oli merkittävästi pienempi kuin transfektoiduissa soluissa kontrollivektorilla (Fig. 5 H). Hävittää mitään yleistä tai epäselektiivinen vaikutus johtuu epäspesifinen yliekspressio protiens, tuottamaamme solulinjaa, joka ilmentää inaktiivinen muoto Hgb kuljettaa aminohapon muutos His koordinoinnista vastaa hemo proteesin ryhmä (HBA1

H88R [ ,,,0],31] ja HBB

H93R, Fig. S6). Kuten voidaan nähdä kuviosta. 5I, solunsisäinen ROS tasoja soluissa, jotka yliekspressoivat HBA1

H88R /HBB

H93R ei vähentänyt merkitsevästi verrattuna, että solut transfektoitu tyhjällä vektorilla, viittaa siihen, että hemi-sitoutumisen aktiivisuutta tarvitaan Hgb hapettumista estävä toiminto.

(A) kaikkiaan solulysaatteja SiHa-soluja, jotka on transfektoitu kontrollina plasmidi- tai HBA1 ja HBB ekspressioplasmidit analysoitiin anti-Hb-vasta-ainetta vahvistaa yliekspressio globiini proteiineja. Ohjaus ja HBA1 /HBB- yli-ilmentävät solut värjättiin fluorogeeniset koettimina solunsisäisen H

2O

2 ja superoksidianionia ja altistuvat solunulkoiseen H

2O

2 (1 mM) 10 min. Immunovärjäys vahvisti, että solunsisäinen sukupolven H

2O

2 (B) ja superoksidianionin (C) oli tukahdutettu HBA1 /HBB yli-ilmentäviä soluja. Virtaussytometria-analyysi vahvisti nämä tulokset (D ja E), ja osoittivat, että solunsisäiset tasot H

2O

2 ja superoksidianionin olivat korkeammat altistuneiden solujen solunulkoiseen ärsykkeiden kuin käsittelemättömissä soluissa (B ja C). Kvantitatiiviset analyysit vahvistivat, että solunsisäistä sukupolven H

2O

2 (F) ja superoksidianionia (G) estyi HBA1 /HBB-yliekspressoivia soluja (mustat sarake) enemmän kuin verrokeilla soluissa (harmaa pylväs;

P

0,05). Kvantitatiiviset analyysit vahvistivat, että solunsisäinen sukupolven ROS väheni HBA1 yli-ilmentäviä soluja (musta pylväs, H), mutta ei HBA1

H88R /HBB

H93R yli-ilmentäviä soluja (musta pylväs, I) enemmän kuin verrokeilla vector-yli-ilmentävät solut (harmaa sarake). *

P

0,05; **

P

0,01;

N

P

0,05.

laktaattidehydrogenaasin (LDH) sytotoksisuusmääritys, joka mittaa vapautumista LDH elatusaineeseen, suoritettiin tutkimaan solujen elinkelpoisuuden alle oksidatiivista stressiä. SiHa solut yli-ilmentävät HBA1 ja HBB osoitti LDH vapauttamisnopeudet 22,1 ± 2,2% ja 32,5 ± 3,4% hoitovasteen 0,5 mM ja 1 mM H

2O

2 24 tunnin ajan, vastaavasti, verrattuna 29,6 ± 3,1 % ja 34,6 ± 2,1%, vastaavasti soluissa transfektoitu tyhjällä vektorilla (

P

0,01 ja

P

0,05 0,5 ja 1 mM H

2O

2, vastaavasti; n = 3 kussakin ryhmässä) (Fig. 6A). SiHa solujen elinkelpoisuuden paransi myös HBA1 ja HBB yli-ilmentyminen, kun soluja käsiteltiin 0,5 mM ja 1 mM H

2O

2: ssa 36 tuntia (

P

0,01). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HBA1-yliekspressio SiHa-solut (Fig. 6B). Sitten tutkittiin, onko funktio Hgb parantaa solujen elinkelpoisuutta riippuu sen Hemi-sitoutumisaktiivisuus käyttämällä HBA1

H88R /HBB

H93R mutantteja, jotka eivät kykene sitomaan Hemi mutta säilyttää ketjun konformaatio. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 6B, mutaatio His koordinoinnista vastaa hemin proteesin ryhmä (HBA1

H88R ja HBB

H93R) on HgbA heikentää kykyä parantaa solujen elinkykyä.

(A) elinkelpoisuus SiHa solujen käsitelty 0, 0,5, ja 1 mM H

2O

2 12, 24 ja 36 h solunulkoista oksidatiivisen stressin arvioitiin LDH vapautumisen määrityksellä. SiHa-solut, jotka on transfektoitu HBA1 /HBB-ilmentävillä vektoreilla (musta pylväs) kohonneen vastustuskyvyn H

2O

2-indusoitua solun verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla (harmaa pylväs). Samanlaisia ​​kokeita muotoon sekä HBA1-yli-ilmentymisen soluissa ja HBA1

H88R /HBB

H93R-yliekspressio soluissa (B). SiHa-solut transfektoitiin ilmaistuilla plasmideilla. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut käsiteltiin 1 mM H

2O

2 tai jätettiin käsittelemättä 22 tunnin ajan. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen seurattiin anneksiini V värjäyksessä, mitä seurasi FACS-analyysi (C). SiHa-solut transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidit ja neljäkymmentä tuntia myöhemmin, käsiteltiin kuten (A), kaspaasi-3-aktiivisuus eri ryhmään mitattiin käyttämällä spesifisiä kaspaasisubstraatin AcDEVD-pNA, kuten on kuvattu kohdassa materiaalit ja menetelmät. Absorptioarvoilla ilmaistiin kontrolli, joka oli asetettu 1 (D ja E). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kolme kertaa, ja tulokset on ilmaistu keskiarvoina ± SEM. *

P

0,05; **

P

0,01;

N

P

0,05.

ROS (superoksidi, vetyperoksidi ja hydroksyyli radikaalit) ovat voimakkaita solunsisäisiä hapettimet ja induktorien hapettumista, joka on ehdotettu kriittinen sääntelyviranomaisten apoptoosin [32] ja hoitoja antioksidantit suojaavat soluja apoptoosin [33]. Koska läsnäolo Hgb (joko HBA1 tai HBA1 /HBB) johtaa vähentää tuotantoa interacellular ROS, on mahdollista, että tällaisia ​​soluja säilyy kyky suojautua oksidatiivisen loukkauksia. Niinpä esiin kysymyksen siitä Hgb välittämä suojaa solukuolemaa SiHa soluissa oli yksinkertaisesti siksi alentunut kertymiseen solun ROS. Tutkimme tämän mahdollisuuden määrittämällä vaikutus villityypin HBA1 /HBB, HBA1, ja mutantit, HBA1

H88R /HBB

H93R-yli-ilmentymisen, kun H

2O

2: n indusoiman apoptoosin virtaussytometrisellä analyysillä käyttäen SiHa-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, tulokset osoittivat, että väestö apoptoottisten solujen aiheuttama H

2O

2 estyi sekä HBA1 ja HBA1 /HBB-yliekspressio soluissa, mutta ei HBA1

H88R /HBB

H93R -overexpression soluja. Aktivointi kysteiiniproteaasi, jota kutsutaan kaspaasi-3 ja sukupolven ROS pidettiin avain vaiheet solukuoleman induktio [34], ja on tunnettua, että ROS: n syntyminen mitokondrioita aktivoi kaspaasi-3-yhteistyön kautta sytokromi

c

, Rahastolla-1 ja kaspaasi-9 [35]. Me tutkimme seuraavaksi vaikutus Hgb on kaspaasi-3 aktivaation. Yhdenmukainen anneksiini V: n sitoutumisen määritys, huomasimme, että kasvava kaspaasi-3 aiheuttamat 0,5 mM ja 1 mM H

2O

2 inkuboinnin jälkeen 12, 24 ja 36 tuntia, vastaavasti, voidaan merkittävästi pienentää sekä HBA1 ja HBA1 /HBB-yliekspressio soluissa, verrattuna tyhjän vektorin (Fig. 6D). Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen HBA1

H88R /HBB

H93R SiHa- soluissa ei ollut tehokkaita estämään H

2O

2 aiheuttama kaspaasi-3 aktivaation (kuvio. 6E), mikä viittaa siihen, että heme- sitovaa aktiivisuutta tarvitaan sen toimintaa. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä HBA1 ja HBA1 /HBB yliekspressio voi olla antioksidantti kautta huuhteluilman ROS, mikä suojaa kohdunkaulan syövän soluja oksidatiivista stressiä vastaan ​​aiheuttamaa vahinkoa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Hgb ilmentyminen kohonnut kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna normaaliin kohdunkaula kudoksiin. Tämä on ensimmäinen näyttö siitä, että α- ja β-globiini ketjut Hgb ilmaistaan ​​syöpäsoluissa kohdunkaulan. Käytimme kohdunkaulan sinoomasolulinjoja SiHa ja CaSki tutkia Hgb-α ja Hgb-β mRNA ja proteiinin ilmentymisen käyttäen kolmea erilaista lähestymistapaa: RT-PCR, immunovärjäys ja western blot-analyysi. Lisäksi Hgb heikennettyjä vetyperoksidi aiheuttamaa oksidatiivista stressiä kohdunkaulan syöpäsoluja, toimii antioksidanttina.

pitkäaikainen käsitys, että Hgb ilmentyy vain soluissa erytroidilinjasta on kyseenalaistettu viime tutkimukset osoittavat Hgb ilmaisun nonerythrocytes, kuten neuronien [7], [8], [9], verkkokalvon solujen [10], [11], alveolien epiteelisolujen [12], [13], [14], kohdun limakalvo [15], rotan munuaisen mesangiumsoluissa [16], maksasoluissa [17] ja makrofagit [18]. Päätehtävä Hgb erytrosyytteihin on kuljettaa happea keuhkojen kudoksiin ja kuljettaa hiilidioksidia kudoksista keuhkoihin. Biologinen toiminta Hgb vuonna nonerythroid soluissa on vielä selvittämättä, ja sen fysiologinen on vielä Kiistanalaista. Hgb yliekspressio hiiren dopaminergisten solulinja, MN9D, muuttunut ilmentyminen eri geenien happea homeostaasin ja mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio, viittaa siihen, että Hgb voi toimia hapen varastointia molekyyli neuronien [9]. HGB yli-ilmentyminen rotan munuaisten mesangiosyyttien linja SV40-MES13 ja ihmisen maksasolusyövän HepG2 pienentää vedyn peroksidi- aiheuttamaa oksidatiivista stressiä, mikä viittaa siihen, että Hgb toimii antioksidanttina [16], [17].

Vaikka