Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resveratrol on lupaava chemopreventive aine, joka välittää monia solukohteita osallisina syövän signalointireittejä. p53 on ehdotettu rooli syövän vastaista ominaisuudet resveratrol. Olemme tutkineet resveratrol aiheuttama sytotoksisuuden H1299-solut, jotka ovat ei-pienisoluisen keuhkosyövän soluista, jotka on osittainen deleetio geenin, joka koodaa p53-proteiinin. Tulokset H1299-soluja verrattiin kolmen solulinjoja, jotka ekspressoivat konstitutiivisesti villityyppisen p53: rintasyöpä MCF-7, adenocarcinomic alveolaarinen pohjapinta epiteelin A549 ja ei-pienisoluista keuhkosyöpää H460. Solujen elinkelpoisuus määritykset paljastivat, että resveratroli vähensi elinkelpoisuus kaikki neljä näistä solulinjoista annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. MCF-7, A549 ja H460-soluja herkempiä resveratrol kuin oli H1299-solut, kun se altistetaan lääkkeen 24 tunnin pitoisuus on yli 100 uM. Resveratrol myös lisääntynyt p53-proteiinin tasot MCF-7-soluissa muuttamatta p53-mRNA-tasot, mikä viittaa siihen, translaation jälkeistä modulaatio proteiinin. Resveratrol aiheuttama sytotoksisuuden näissä soluissa oli osittain välittävät p53 ja mukana kaspaasien aktivaatio 9 ja 7 ja pilkkominen PARP. Vuonna H1299-soluissa, resveratroli indusoima sytotoksisuus oli vähäisempää ja (toisin kuin MCF-7-soluissa) solukuolemaa ei ollut mukana kaspaasi aktivointi. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​sen havainnon kanssa, että MCF-7-solut positiivisesti leimattiin TUNEL altistuminen 100gM resveratrol taas H1299 solujen samanlaisissa olosuhteissa ei leimattiin TUNEL. Ohimenevä transfektio villin tyypin p53-GFP-geenin aiheuttama H1299 solut vastaavat paremmin pro-apoptoottisen ominaisuudet resveratrol, samalla löydökset p53-positiivisia MCF-7-soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että terapeuttinen strategia perustuu käyttöön resveratrolin hoitoon kasvaimia, jotka ovat tyypillisesti reagoimattomia perinteisiin hoitoihin koska menetys normaalin p53-toiminto.

Citation: Ferraz da Costa DC, Casanova FA, Quarti J, Malheiros MS, Sanches D, dos Santos PS, et al. (2012) Ohimenevä transfektio villityypin p53-geenin laukaisee resveratrolin indusoiman apoptoosin syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (11): e48746. doi: 10,1371 /journal.pone.0048746

Editor: Waldemar Dębiński, Wake Forest University, School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 helmikuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 12 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Costa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (CAPES); Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); ja Fundação do syöpä Brasiliassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on merkittävä kansanterveysongelma maailmanlaajuisesti, ja määrä syöpään liittyvien kuolemien odotetaan kaksinkertaistuvan seuraavien 50 vuoden aikana [1]. Epidemiologiset todisteet osoittavat, että ruokailutottumukset ovat tärkeitä riskitekijöitä liittyy syövän kehitystä ja että phytochemicals, joita löytyy luonnollisesti hedelmiä ja vihanneksia voi välittää useita tuumorikohteita [2], [3]. Kliinisiä sovelluksia on ehdotettu näiden ruokavalion bioaktiivisten molekyylien, koska niiden suuri kyky estää, hakea, tai viivyttää useita karsinogeenisia vaiheet [4], [5], [6].

resveratrolin (3,5,4 ”-trihydroxy-

trans

-stilbene), joka kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1940, on luonnollinen fenolisia joka esiintyy monenlaisia ​​kasveja, kuten viinirypäleitä, marjoja ja pähkinöitä. Tämä molekyyli on luokiteltu fytoaleksiinin, koska se on syntetisoitu kasvien vastauksena erilaisiin ympäristön stressin olosuhteissa, kuten sieni-infektioita, ja UV-säteilyä [7], [8]. Resveratrol löytyy sekä

cis-

ja

trans-

stereoisomeeriset muodot;

trans

-isomeeri muotoa, joka liittyy useimpien molekyylin biologisia vaikutuksia. Resveratrol ravinnon yhdiste on kuvattu tehokas aine, joka pystyy estämään sydän-, tulehdusta, ja neurodegeneratiiviset sairaudet, kuten liikalihavuuden ja diabeteksen [7], [9]. Molekyyli voi myös moduloida monenlaisia ​​molekyyli tavoitteita, mukaan lukien ne, jotka ovat osallisina syövän signalointireittejä [8], [10].

syövän vastainen potentiaali resveratrol todettiin vuonna 1997, kun sen kyky estävän kaikkien kolmen vaiheen syövän (eli aloittamista, edistäminen ja eteneminen) osoittivat ensimmäisinä [10]. Myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että molekyyli osoittaa syövän vastaista aktiivisuutta, kun niitä testataan eri kokeellisissa malleissa [11], [12]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että mekanismit vastuussa chemopreventive molekyylin ominaisuuksiin liittyvät läheisesti sen antioksidantti ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia [13].

Resveratrol liittyy säätelyyn useiden solureiteillä, kuten esto karsinogeenien aktivointi, stimulaatio karsinogeeni myrkkyjä entsyymien, modulaatio proteiineja, jotka ovat osallisina syövän etenemiseen ja apoptoosin [14], [15], [16], ja angiogeneesin inhibitiota [17]. Tutkimukset viittaavat myös siihen, että resveratroli voidaan herkistää kasvaimia tiettyihin syövän kemoterapeuttiset lääkkeet [18]. Yhdessä nämä havainnot esittänyt riittävästi näyttöä suorittamista varten kliinisten tutkimusten tutkia chemopreventive ja kemoterapeuttisen ominaisuuksia tämän bioaktiivisten aineiden [4], [12].

p53 on kasvaimen soriproteiini joka on olennainen rooli ehkäistä syövän kehittymisessä indusoimalla solukierron pysähtymisen tai apoptoosin vasteena genotoksinen stressiä. Tämä proteiini säätelee ensisijaisesti ubikitiinipromoottori ligaasilla MDM2, joka sitoutuu p53 ja tavoitteet sen hajoamiselle proteasomien. Normaali p53-toiminto on kadonnut tai ei-aktiivinen noin 50% ihmisen syövistä [19], [20], [21], [22].

Resveratrol pystyy aiheuttamaan p53-riippuvaista solukuolemaa JB6 hiiri epidermaalinen solulinjassa [23], ja osallistuminen p53 anti-karsinogeeninen toiminta resveratrolin on perustettu monenlaisia ​​solujen [7], [16], [23], [24], [25], [ ,,,0],26]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että apoptoosia esiintyy vain soluja, jotka ekspressoivat villityypin p53, mutta ei p53-mutatoitu tai p53-vajaiden solujen [23], [27]. Tarkka rooli resveratrolin p53-negatiivinen tuumorisolulinjoja, jotka voivat olla resistenttejä tavanomaisille kemoterapeuttiset aineet seurauksena menetys p53-ilmentymistä tai toimintaa, ei ole tutkittu laajasti [28], [29], [30]. On ratkaisevan tärkeää, onko transfektio villityyppisen p53 pystyy palauttaa proapoptoottiseen vaikutuksia resveratrol varten arvioimiseksi edelleen geeniterapiatekniikoilla joilla pyrittiin vahvistamaan viallisen p53-molekyylin. Useat tutkimukset p53 geeniterapian ovat osoittaneet tehokkuutta tätä lähestymistapaa ei ainoastaan ​​kasvainsolulinjoissa, vaan myös kliinisissä kokeissa [31].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia resveratrol solulinjassa, joka harjoittaa osittain poistettu p53-geenin, ja testasimme hypoteesin, että lyhytaikaista transfektiota p53 aiheuttaisi näiden solujen kyetä vastaamaan proapoptoottiseen ominaisuudet resveratrol. Suoraan tutkimaan asiaa, me transfektoidut H1299-solujen, jotka eivät ilmennä p53-geenin, ja verrattiin tuloksia, jotka on saatu MCF-7 ihmisen rintasyövän solulinjaa, joka on laajasti tutkittu ja että konstitutiivisesti ekspressoi villityypin p53-geenin.

Huomasimme, että lyhytaikaista transfektiota villin tyypin p53-GFP-geeni aiheuttaa H1299 solujen tulla herkempiä resveratrol ja reagoi sen proapoptoottiseen ominaisuuksia, samoin kuin havainnot MCF-7-soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että hakemus resveratrol, yhdistettynä muihin menetelmiin edistää p53 aktiivisuuden soluissa, kuten geeniterapian avulla villityypin p53-geenin tai kemikaaleja, jotka palauttaa p53-toiminto, on lupaava uusi terapeuttinen strategia syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

1. Reagenssit

Kaikkien käytettävien reagenssien tässä tutkimuksessa olivat analyyttistä laatua. Anneksiini V /propidiumjodidia Apoptosis Assay Kit, naudan insuliinia, MTT: tä (3,4,5-dimethiazol-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi), fenyyliarsiinioksidin oksidi, pifithrin-α, PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), PRIMA-1, proteaasi-inhibiittorit cocktail (# 8340), ja

trans-

resveratrolin (3,5,4′-trihydroksi-

trans

-stilbene) ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Okadahappo ja BAX inhibiittoripeptidin (V5) oli Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Z-VAD-FMK [Z-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F] oli peräisin Calbiochem (San Diego, CA, USA). Z-LEHD-FMK oli R p53 rev: 5′-CTT CTT TGG CTG GGG AGA GG-3 ’(626bp); GAPDH fwd: ATC ACC ATC TTC CAG GAG GCG; GAPDH rev: CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG (574bp). Densitometriset määrällisesti bändejä määritettiin käyttäen ImageJ ohjelmiston version 1.43r.

6. H1299 transfektion

täyspitkän p53-EGFP-plasmidi saatiin Genscript Corp. (Piscataway, NJ, USA). Ohimenevä transfektio Kokeet suoritettiin käyttäen Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Analysointiin GFP-p53, solut maljattiin lasipohjaisella ruokia 48 tuntia ennen hoidon aloittamista. Soluja leimattiin 10 ug /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 30 minuutin ajan ja pestiin kolme Imes PBS: llä [35]. Kuvat kerättiin käyttämällä -konfokaalimikroskoopilla (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) ja analysoitiin käyttäen Zeiss LSM Image Browser ohjelmisto, versio 4,2,0121.

7. Anneksiini V /propidiumjodidi apoptoosimäärityksessä

Solut 70-80% konfluenssiin maljattiin 24-kuoppaisille lasi-bottom ruokia ja määritykset suoritettiin käyttäen anneksiini V /propidiumjodidia Apoptosis Assay Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden . Kuvat kerättiin käyttämällä -konfokaalimikroskoopilla (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa). Kuvien saamiseksi seuraavilla aallonpituuksilla käytettiin: anneksiini V-FITC: tä (EX /EM ~488 nm /~540 nm) ja propidiumjodidilla (EX /EM ~495 nm /~635 nm). Kuvat analysoitiin käyttämällä Zeiss LSM Image Browser ohjelmisto, versio 4,2,0121.

8. TUNEL määritys

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick end merkinnät (TUNEL) suoritettiin käyttäen Click-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Positiiviset kontrollit saatiin käsittelemällä soluja deoksiribonukleaasi I, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteet analysoitiin käyttämällä konfokaalista fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss International, Oberkochen, Saksa). Kuvat analysoitiin käyttämällä Zeiss LSM Image Browser, versio 4,2,0121.

9. Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tietojen analysointi ja epälineaarinen taantumat suoritettiin käyttäen SigmaPlot ohjelma (v. 10,0, Systat Inc., CA, USA) integroitu SigmaStat ohjelmisto (v. 3.2, Systat Inc. CA, USA). Opiskelijan

t

-testi käytettiin vertaamaan keinoin, ja

p

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Resveratrol vähentää ihmisen rinta- ja keuhkosyövän solujen elinkelpoisuuden aikaa ja annosriippuvaisesti

Koska p53 on ehdotettu rooli syövän vastaista ominaisuudet resveratrol, testasimme sytotoksisia vaikutuksia tämän yhdisteen MCF-7 rintasyöpä, A549 keuhkosyöpä ja H460 keuhkosyövän solulinjat (jotka ekspressoivat villityypin p53) ja p53-puutteellisia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa H1299. Kuten odotettua, p53-mRNA: n ekspressio varmistettiin RT-PCR: llä p53-positiivisia solulinjoja, mutta ei H1299-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Testata, onko resveratrol oli sytotoksinen vaikutus, kukin solulinjoja viljeltiin eri resveratrol pitoisuuksina 10-500 uM 5 min, 24 h, ja 48 h. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT väheneminen määrityksessä. Resveratroli vähensi MCF-7, A549, H460 ja H1299 solujen elinkelpoisuuden ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1). Herkkyys MCF-7, A549 ja H460-soluja oli suurempi kuin H1299, erityisesti silloin, kun solut altistettiin 24 h resveratrol suurempina pitoisuuksina 100 uM. Altistuminen 500 uM resveratrol 24 tai 48 h vähensi elinkelpoisuuden MCF-7-solujen lähes nollaan (Fig. 1A). Hyvin samanlaiset profiilit havaittiin A549 ja H460-solut (Fig. 1 C ja 1 D). Sen sijaan noin 50% ja 20% H1299-solujen pysyi elinkelpoisia 24 ja 48 h, vastaavasti (Fig. 1 B). DMSO ajoneuvon (0,5%) ei vaikuta elinkelpoisuutta kontrollisolujen (tuloksia ei ole esitetty). Testasimme myös vaikutuksia resveratrol perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC), joka on vähemmän transformoitua solulinjaa verrattiin syöpäsolulinjoja tutkittu. Resveratrol näytetään ei-merkittävä vaikutus PBMC: elinkelpoisuuden (kuvio. S1), mikä viittaa siihen, että sytotoksinen vaikutus tämän yhdisteen on spesifinen syöpäsolulinjoja.

MCF-7 (A), H1299 (B), A549 (C), ja H460-soluja (D) käsiteltiin eri pitoisuuksilla

trans

-resveratrol (10-500 uM) laimennettuna DMSO: ssa 5 min, 24 h ja 48 h. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Lopullinen DMSO-konsentraatio elatusaineessa on 0,5%. Tulokset (n = 4) ilmaistaan%: iin vertailu- arvoon nähden, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM

2. Resveratrol aiheuttama sytotoksisuutta MCF-7-solut välittävät p53 aktivaation

Matkapuhelinverkko tasot p53 tutkittiin resveratrol saaneilla MCF-7-soluissa. Solut altistettiin eri pitoisuuksia resveratrolin 24 tuntia, ja tasot p53 ja MDM2 määritettiin western blotting -analyysi (kuvio. 2A). Resveratrol pitoisuuksilla 100 ja 200 uM tuotti merkittävän (

p

0,05) annosriippuvaista kokonaismäärän kasvu taso p53. Tämä kasvu ei liittynyt nousu solutasolla MDM2. P53 /MDM2 suhde, määritettynä densitometrisellä kvantifiointiin, paljasti, että kohonneet p53 seuraavista stimulaation resveratroli ei ole liitetty lisääntyminen MDM2 välittämän proteiinien hajoaminen. p53-mRNA-tasot eivät muutu, kun MCF-7-soluja käsiteltiin resveratrol samoissa koeolosuhteissa (Fig. 2B), mikä viittaa siihen, että nousu solujen tasoilla p53-proteiinin eivät johtuneet stimulaation p53-geenin ilmentymisen.

resveratrolin p53 ja MDM2-proteiinin tasot (A) ja p53-mRNA-tasot (B) MCF-7-soluissa. Solut altistettiin eri pitoisuuksia resveratrolin tai DMSO: ta (0,5%) 24 tuntia. Proteiini-tasot määritettiin western blotting-analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. GAPDH ilmentymistä käytettiin kontrollina. Paneeleissa A ja B tiedot edustavat 3-5 itsenäisen kokeen, ja bändi intensiteetit graafisesti kunkin joukko kuvia. (C) MCF-7-solujen elinkelpoisuus läsnä ollessa p53-spesifinen estäjä pifithrin-α. Soluja altistettiin 30 uM pifithrin 1 h ennen käsittelyä eri

trans

-resveratrol pitoisuudet (50-200 uM). Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset (n = 3) ilmaistaan%: n ohjaus, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM *

p

0,05 verrattuna vastaaviin ohjaus (Opiskelijan

t

-testi).

resveratroli välittämää lisäys p53 tasojen ei havaittu kun solujen altistaminen tämän yhdisteen 24 tunnin jälkeen poistamalla resveratrol elatusaineesta vielä 24 h ajan (tietoja ei esitetty). Altistuminen MCF-7-solujen 200 uM resveratrol edistää fosforylaation tarkistuspisteen-2-proteiinia (Chk2, proteiinia, joka liittyy useisiin soluprosesseihin, kuten p53: n aktivaatio vasteena DNA-vauriolle) on Thr68 (Fig. 3A) ja lisäsi solutasolla p21, joka on yksi tärkeimmistä p53: een reagoiva geenien (Fig. 3B).

Effects of resveratrolin fosfo-Chk2 (A) ja p21-proteiinin tasoa (B) MCF-7-soluissa. Solut altistettiin eri pitoisuuksia

trans-

resveratrolin tai DMSO: ta (0,5%) 24 tuntia. Proteiini-tasot määritettiin western blotting-analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. GAPDH ilmentymistä käytettiin kontrollina. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, ja juovien voimakkuudet on esitetty graafisesti jokaisen joukko kuvia.

*

p

0,05 verrattuna vastaaviin ohjaus (Opiskelijan

t

-testi).

Voit selvittää resveratroli aiheuttama MCF -7 solukuoleman välittää p53, MTT vähennys määritys suoritettiin, kun läsnä oli pifithrin-α, erityinen p53-estäjä, joka estää transkription p53: een reagoiva geenien ja myös estää p53-välitteisen apoptoosin [36] (Fig. 2C ). Solut altistettiin pifithrin-α 30 uM 1 tunti ja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla resveratrolin 24 tuntia. Havaitsimme suurempi elävien solujen määrä näissä olosuhteissa (Fig. 2C, harmaat pylväät) kuin ilman pifithrin-α (Fig. 2C, mustat pylväät), mikä viittaa mahdolliseen osallistumiseen p53 resveratrol solukuolema.

Tutkimme myös vaikutuksia PRIMA-1, p53 aktivaattori huume, on p53-positiivisen syöpäsolun linjat. PRIMA-1: tä pitoisuutena 100 uM vähentää solujen elinkykyä, ja yhdistelmä tämän lääkkeen kanssa 100 uM resveratrol voimisti sytotoksista vaikutusta resveratrolin MCF-7, A549 ja H460-soluja (Fig. 4).

soluja altistettiin 24 tuntia 100 uM

trans-

resveratroli, 100pM PRIMA-1 tai 100 uM

trans-

resveratroli plus 100pM PRIMA-1 100 uM. Tulokset edustavat 3 itsenäistä koetta.

3. Resveratrol ei indusoi apoptoosia H1299 p53-null-solut

Voit testata, onko resveratroli aiheuttama MCF-7 solukuolema on apoptoosivälitteisten, teimme anneksiini V /propidiumjodidi määrityksessä. Resveratrol 100 uM indusoidun fosfatidyyliseriini eriyttämispolitiikan (prosessi, joka osoittaa apoptoosin), kuten on esitetty anneksiini V-leimattujen solujen kuviossa 5. Tämä vaikutus kumottiin läsnä pifithrin-α, mikä osoittaa, että p53-välitteinen apoptoosi esiintyy solut. Propidiumjodidia-leimattuja soluja ei havaittu samoissa olosuhteissa. TUNEL määritys suoritettiin myös MCF-7 ja H1299 soluja. Resveratrol aiheuttama apoptoottista solukuolemaa havaittiin MCF-7-soluissa, mutta ei H1299-soluissa (kuvio. 6). Resveratrol aiheuttama apoptoosin MCF-7-soluissa liittyy merkittävä proteolyyttisen kaspaasi 9 ja kaspaasi 7 (Fig. 7A). Poly (ADP) riboosi-polymeraasi pilkottiin kahteen pientä palasia altistuminen kasvavia konsentraatioita resveratrol. O kaspaasien aktivaatio 9 ja 7 havaittiin p53-negatiivinen H1299-solut (Fig. 7B). Testata mahdollisuutta, että resveratroli-solukuolema välittävät kaspaasi signalointireiteissä MCF-7, mutta ei H1299, teimme MTT väheneminen määrityksessä läsnä pannun kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK (Fig. 4C). Solut altistettiin 50 uM Z-VAD-FMK 1 h ja sitten käsiteltiin eri pitoisuuksilla resveratrolin 24 tuntia. Määrä elinkelpoisia MCF-7-soluissa oli merkittävästi suurempi, kun läsnä on 100 tai 200 uM resveratrolin (Fig. 7C, harmaat pylväät) kuin inhibiittorin puuttuessa (kuvio. 7C, mustat pylväät), mikä viittaa siihen, että kaspaasit osallistuvat resveratrol n aiheuttamaa solukuolemaa. Z-VAD-FMK ei vaikuttanut elinkelpoisuutta H1299 solujen samoissa olosuhteissa. Mahdollista osallistumista caspases tutkittiin myös käyttämällä kaspaasi 9-spesifinen estäjä Z-LEDH-FMK. MCF-7, mutta ei H1299 oli suurempi prosenttiosuus eläviä soluja verrattuna kontrolli läsnä ollessa Z-LEDH-FMK (Fig. S2).

Soluja käsiteltiin

trans-

resveratrolin (100 uM) tai DMSO: ta (0,5%), ja määritettiin käyttämällä anneksiini V /propidiumjodidia Apoptosis Assay kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eräässä kokeessa, solut altistettiin 30 uM pifithrin 1 h ennen käsittelyä

trans

-resveratrol. Kuvat kerättiin konfokaalimikroskopiaa (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa). Anneksiini V-FITC fluoresenssin: EX /EM ~488 nm /~540 nm; ja propidiumjodidia fluoresenssi: EX /EM ~495 nm /~635 nm. Jokainen kuva näytetään on edustaa kaksi erillistä koetta.

Soluja käsiteltiin

trans-

resveratrolin (100 uM) ja leimattiin käyttäen Click-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). TUNEL fluoresenssi: EX /EM ~495 nm /519 nm. Jokainen kuva edustaa kaksi erillistä koetta.

(A) kaspaasi 9, kaspaasi 7, ja PARP mukaan resveratrolin MCF-7-soluissa. (B) kaspaasi 9 ja kaspaasi 7 H1299 altistuneiden solujen resveratrol. Länsi blotting -analyysi, solut altistettiin eri pitoisuuksia resveratrol. Tulokset edustavat 3-4 itsenäisen kokeen, ja bändi intensiteetit graafisesti kunkin joukko kuvia. (C) MCF-7 ja H1299-soluja esi-inkuboitiin 50 uM kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK 1 h ennen käsittelyä eri pitoisuuksilla

trans

-resveratrol. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset (n = 3) ilmaistaan% valvonnan, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM *

p

0,05 verrattuna vastaaviin ohjaus (Opiskelijan

t

-testi).

tarkasteltiin mahdollisesta osallisuudesta Bax että resveratrol- indusoiman apoptoosin MCF-7-soluissa mittaamalla solujen tasoa tämän proteiinin ja soveltamalla erityistä Bax peptidi-inhibiittori (V5) jälkeen solujen käsittely resveratrol. Havaitsimme suurempi Bax tasoja soluissa, joita käsiteltiin 100 uM resveratrolin ja korkeammat numerot elävien solujen läsnä ollessa V5, mikä viittaa siihen, tämän pro-apoptoottisen proteiinin MCF-7 solukuoleman kaskadin (Fig. S3).

4. H1299-solut vaativat p53 apoptoosiin vasteena resveratrol altistumisen

Sen määrittämiseksi, onko p53: n in H1299-soluissa aiheuttaa solujen tulla altis vaikutuksille resveratrol, teimme ohimenevä transfektiokokeissa villityyppisen p53 GFP-plasmidin. MTT-määritys suoritettiin p53-transfektoiduista H1299 testata sytotoksisuuden resveratrol näissä soluissa. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 100 uM resveratrolin vielä 24 tuntia. Sytotoksista vaikutusta resveratrolin H1299-soluissa on parantunut (eli soluista muuttui herkempiä yhdiste) kautta p53 ilmentymistä (Fig. 8A). Vaikutukset resveratrolin H1299-soluissa sekä MCF-7-solut näyttävät olevan riippuvaisia ​​villityyppinen p53-toiminto. Ohimenevä transfektio p53-GFP laukaisi resveratroli aiheuttaman apoptoosin H1299 (Fig. 8B). Määrä transfektion tehokkuuden Näissä kokeissa saadut oli noin 60% (kuvio. 8C). Sulautunut kuvia fluoresenssimikroskopialla (Fig. 8D) osoittavat, että suurin osa p53-transfektoidut solut apoptoosin (valkoiset nuolet).

(A) p53-transfektoiduista ja ei-transfektoituja H1299-soluja käsiteltiin resveratrolin ( 100 uM). Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset (n = 4) ilmaistaan% valvonnan, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM *

p

0,05 verrattuna vastaaviin ohjaus (Opiskelijan

t

-testi). (B) Soluja transfektoitiin ohimenevästi täyspitkän p53-EGFP-plasmidi ja käsiteltiin resveratrolin (100 uM). Sitten solut double-leimattu Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ja Click-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging Pitoisuus (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Hoeschst fluoresenssi: EX /EM ~350 nm /461 nm. TUNEL fluoresenssi: EX /EM ~495 nm /519 nm. Yhdistetyssä kuvia, nuolet osoittavat solukuolemaa p53-transfektoiduista soluista. (C) nopeus transfektion tehokkuus H1299 soluja. (D) Kun määritellään apoptoottisten ja ei-apoptoottiset transfektoidut H1299 solujen altistuksen jälkeen resveratrol.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia resveratrol on p53 puutosta ei-pieni ihmisen keuhkosyövän solulinjassa H1299 verrattuna vaikutuksiin resveratrol syövän solulinjoissa (ihmisen rintasyöpä MCF-7, keuhkosyöpäsolua A549 ja H460), jotka ilmentävät villityyppistä p53. Hypoteesi testattu oli, että p53 transfektion H1299 soluja, jotka kantavat osittain poistettu p53-geenin, tekee nämä solut pystyvät vastaamaan resveratrol proapoptoottiseen ominaisuuksia. MCF-7, A549 ja H460-soluja havaittiin olevan herkempi resveratrol aiheuttama sytotoksisia vaikutuksia kuin oli H1299-soluissa. Resveratrol indusoi kaspaasi-välitteistä apoptoosia in MCF-7-soluissa, mutta ei H1299-soluissa, ja lyhytaikaista transfektiota villin tyypin p53 sulatettu H1299 alttiita pro-apoptoottisen vaikutusten resveratrol.

H1299-solut olivat resistenttejä resveratrol etenkin suurilla pitoisuuksilla, kuin oli p53-positiivisen syöpäsolun linjat. Puute p53 ilmentymistä H1299 voi selittää sen suurempi vastustuskyky solukuolemaa verrattuna p53-positiivisia MCF-7-soluissa. H1299 ei apoptoosiin altistumisen jälkeen resveratrol, toisin kuin MCF-7. Muut mekanismit solukuoleman voi liittyä tämän vaikutuksen;

esim

., Tuore tutkimus osoitti, että resveratroli laukaisee vuorovaikutuksen prosessien, joita esiintyy apoptoosin aikana, solusyklin pysähtymiseen ja autophagy kasvainsoluissa [37].

resveratrolin aiheuttamaa sytotoksisuutta ja apoptoosin välitettiin osittain p53: MCF-7-soluissa, kuten on esitetty solujen elävyys kokeet suoritettiin, kun läsnä on p53-spesifinen estäjä pifithrin-α. Endogeeninen tasot p53-proteiinin olivat huomattavasti korkeampia läsnäollessa resveratrol, joka on yhteistyössä toisen raporteissa [38], [39]. Esillä olevassa tutkimuksessa lisäys p53 tasojen ei seurannut kasvua MDM2 tasoilla, mikä viittaa siihen, että korkea p53 /MDM2 suhde heijastuu alemman ubikitiinistä riippuvainen p53 hajoamista tasolla, todennäköisesti seurauksena vakautusjärjestelmistä toimivat proteiinin .