Krooninen sairaus

tiivistelmä

11β-hydroxysteroid dehydrogenaasien (11beta-HSD) moduloida mineralokortikoidireseptoreihin reseptorin transaktivaatiota glukokortikoidien ja säännellä pääsyä glukokortikoidireseptoriin. Isotsyymin 11beta-HSD2 selektiivisesti ilmaistaan ​​mineralokortikoidireseptoreihin kohdekudoksissa ja sen aktiivisuus pienenee erilaisissa sairaustiloissa epätavallisiin natriumin retentio ja verenpainetauti, kuten näennäinen mineralokortikoidireseptoreihin liikaa. Koska 50% potilaista, joilla olennaisten verenpaineesta ovat insuliiniresistenssi ja hyperinsulinemic, me arveltu, että insuliini downregulates 11beta-HSD2 aktiivisuutta. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että insuliini vähentää 11beta-HSD2 aktiivisuutta syövän paksusuolen solulinjoissa (HCT116, SW620 ja HT-29), transkriptionaalisella tasolla, on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. Vaimennussäätely oli ohimeneviä ja uusia proteiinisynteesiä. Pathway analyysi käyttäen mRNA: profilointia paljasti, että insuliinihoito modifioitu ekspressiota transkriptiotekijän perheen C /EBPs (CCAAT /enhancer-sitovia proteiineja), mutta myös glykolyysin liittyviä entsyymejä. Western blot ja reaaliaikainen PCR vahvisti säätelyä C /EBP beeta isoformit (LAP ja LIP) ja voimakkaampi kasvu estävä isoformin LIP. EMSA ja reportterigeeni analyysit osoittivat roolin C /EBP beeta-isoformien HSD11B2 geeniekspression sääntelyä. Lisäksi, eritystä laktaatti, sivutuotteena glykolyysin, on osoitettu välittävän insuliinista riippuvainen HSD11B2 downregulation. Yhteenvetona osoitamme, että insuliini downregulates HSD11B2 lisäämällä LIP ilmaisun ja täydennetty laktaatti eritystä. Tällaiset mekanismit ovat kiinnostavia ja potentiaalista merkitystä natriumin takaisinimeytymiseen paksusuolessa.

Citation: Andrieu T, FUSTIER P, Alikhani-Koupaei R, Ignatova ID, GUETTINGER A, Frey FJ, et al. (2014) insuliini, CCAAT /edistäjän-sitojaproteiinit ja Lactate Säännellä Human 11β-hydroksisteroididehydrogenaasi tyypin 2 gene expression in Colon Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (8): e105354. doi: 10,1371 /journal.pone.0105354

Editor: Jaap A. Joles, University Medical Center Utrecht, Alankomaat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2013; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2014; Julkaistu: 18 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Andrieu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Swiss National Foundation for Scientific Research Nr. 3100-122135, 3100-61505,00, 3100A0-102153 /1 ja 3100A0-138670 (BMF FJF). Kansallinen osaamiskeskusten in Research (NCCR), TransCure (FJF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mineraalikortikoidireseptoriin (MR) on välttämätön munuaisten natriumin käsittelyyn epiteelikudoksissa kuten paksusuolen ja munuaisten ja verenpaineen säätelyyn ihmisillä. Fysiologinen ligandi MR on aldosteronin [1]. Toinen Lisämunuaissteroidihormonia, kortisolin, esiintyy samanlainen affiniteetti ja transaktivaation mahdollisuudet MR kuin aldosteronin. Pitoisuudet seerumissa kortisolin ovat 100-1000 kertaa suurempi kuin aldosteronin. Mekanismi mahdollistaa aldosteronin olla ensisijainen ligandi MR

in vivo

, vaikka suurempia pitoisuuksia kortisolin on entsyymi, joka inaktivoi kortisolin, erityisesti MR ilmentävissä soluissa [2]. Tämä entsyymi, 11β-hydroksisteroididehydrogenaasi tyypin 2 (11beta-HSD2) koodaa HSD11B2 geenin ja muuntaa biologisesti aktiivisen kortisolin osaksi kortisoni, steroidi vähäinen affiniteetti ja aktivointi potentiaalia MR [3]. Siten vähentynyt aktiivisuus 11beta-HSD2 aiheuttaa kortisolin-välitteisen MR aktivaation, mikä johtaa munuaisten natriumin retentio, tukahduttaminen reniini ja suola-herkän verenpaineen nousu [4], [5].

Monet potilaat tyypin 2 diabetes on alhainen reniiniaktivisuus plasmassa ja ovat suola herkkiä [6] – [8]. Lisäksi olemme hiljattain havaittu yhdistys suolaa-herkkyyden ja alhaisempaa 11beta-HSD2 jälkeläisissä tyypin 2 diabeetikoilla [9]. Näin ollen on järkevää spekuloida, että insuliini downregulates HSD11B2, ja tällä mekanismilla, aiheuttaa kortisolin välittämä munuaisten tai paksusuolen natriumretentiota minkä seurauksena reniini tukahduttamista.

On osoitettu, että insuliinin ja hyperinsulinemia säännellä perheen transkriptiotekijöiden CCAAT /tehostajana sitovia proteiineja (C /EBPs) [10], [11] ja että tämän perheen jäseniä ohjaavat transkription HSD11B1 [12] – [14]. Analyysi promoottorin HSD11B2 geenin transkriptiotekijän tietokanta (Transfac) ohjelma paljasti useita oletetun sitoutumiskohtia C /EBPs asemissa -4362 bp, -1985 bp: n, -177 bp: n ja -198 bp transkription alkaa sivuston ihmisen HSD11B2 geenin. Siksi me arveltu, että insuliini säätää alas HSD11B2 stä C /EBPs.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja tarvikkeet

Soluviljely materiaali oli Becton Dickinson Labware (Basel, Sveitsi) ja Corning (Bodenheim, Saksa). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja Mc Coy n hankittiin Sigma Chemicals (Buchs, Sveitsi). Naudan sikiön seerumia (FBS) oli peräisin Biochrom AG (Berliini, Saksa). Insuliini, sykloheksimidi (CHX), PD098059, Natrium diklooriasetaatti (DCA), natrium-L-laktaatti ja 5,6-dichlorobenzimidazole 1β-D-ribofuranosidi (DRB) ostettiin Sigma-Aldrich (Fluka AG, Buchs, Sveitsi). Seuraavat solulinjat hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA): ihmisen koolonkarsinoomasolulinja HT-29 (hakunumero: HTB-38), SW-620 (CLL-227), HCT116 (CCL-247) ja JEG-3- (HTB-36). Akt Inhibitor VIII oli peräisin Calbiochem (Merck, Zug, Sveitsi). Adenosiini-5′-trifosfaatti [gamma-

32P] ([gamma

32P] ATP) oli Perkin Elmer (Maanstraat, Alankomaat).

Soluviljelmät

HCT116, SW-620 ja HT-29-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mmol /L glutamaattia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa 5%: CO2-95% ilmaa. Kaikki solulinjat maljattiin soluviljelymaljoille ja kasvatettiin DMEM: ssä 10% FBS konfluenssiin. Soluja inkuboitiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 0,3% FBS: ää aikana insuliinia ja DCA hoitoon. Soluja käsiteltiin 48 h DCA ja 24 h insuliinilla. Soluja inkuboitiin 10% FBS aikana laktaattia hoidon jälkeen 24 h synkronoinnin DMEM 0,3% FBS.

RNA: n valmistaminen ja ekspressiotaso

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen AG, Basel , Sveitsi) mukaan valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA (1 ug) käytettiin synteesissä ensimmäisen juosteen cDNA käyttäen IMPROM-II Reverse Transcriptase (RT) RT-puskuria (Promega catalys AG, Wallisellen, Sveitsi) mukaan valmistajan protokollaa. Spesifisten mRNA määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR) ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Multiplex-PCR suoritettiin valmistajan protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analyysit-on-Demand (Gene Expression Assay Mix) olivat eukaryoottisen 18S rRNA endogeeninen kontrolli (4310893E), HSD11B2 (Hs00388669_m1), CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin (C /EBP) alfa (Hs00269972_s1), C /EBP beta (Hs00270923_s1) ja C /EBP delta (Hs00270931_s1). Suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin käyttäen vertailevaan CT (kynnys sykli) menetelmällä, joka koostuu normalisoituminen määrän kohdegeenin kopioiden endogeenistä viite geeni (18S rRNA), nimetty kalibraattori. Taso HSD11B2, C /EBP-alfa, C /EBP: n beeta ja C /EBP delta-mRNA: n ilmentymisen kunkin käsiteltyjen solujen normalisoitiin saatu tulos käsittelemättömät solut. Määrä tavoite normalisoida 18S rRNA endogeeninen viitataan kaavasta: 2

-ΔΔCT. Vahvista toistettavuus mRNA määrittämisen, vähintään 3 riippumatonta kokonais-RNA otot suoritettiin. Jokainen käänteiskopioijaentsyymin polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) määritys analysoitiin kolmena kappaleena ja ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SD.

mittaaminen 11beta-HSD2 aktiviteetti

Soluja viljeltiin 6- kuoppaisille levyille tiheydellä 0,5 x 10

6 solua /kuoppa. Käsittelyn jälkeen viljelyalusta poistettiin ja soluja inkuboitiin 45 min 1 ml: ssa alustaa, joka sisälsi 2 pCi [1,2,6,7-

3H] Kortisoli (60-80Ci /mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK) 6-kuoppaisille levyille. Inkuboinnin jälkeen reaktio lopetettiin ja steroidit uutettiin lisäämällä kolme tilavuutta etyyliasetaattia. Sentrifugoinnin jälkeen orgaaninen faasi poistettiin ja haihdutettiin huoneenlämpötilassa. Jäännös liuotettiin uudelleen 30 ui stop-liuosta (2 mM kortisoli ja 2 mM kortisoni metanolissa). Kymmenen mikrolitraa sovellettiin piidioksidilla päällystettyä TLC-levyt (G-25, UV254, Macherey- Nagel, Oensingen, Sveitsi) ja ratkaistu käyttämällä kloroformi: etanoli (09:01). Steroidit visualisoitiin ultraviolettivalolla ja kaavittiin tuikenestettä. Radioaktiivisuus mitattiin käyttäen Packard 2000CA Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL). Kokeet suoritettiin ei-alustan rajoittavat olosuhteet, joissa metabolia oli aina vähemmän kuin 40%. Spesifinen aktiivisuus ilmaistiin pikomoolille (pmol) per mikrogrammaa proteiinia tunnissa. Kokeelliset tulokset laskettiin ilmaisemalla muuntokurssit kortisolin kortisoni läsnäollessa insuliini, prosentteina että vastaavan valvonnan puuttuessa insuliinin [15].

Western blot-analyysi

proteiinin uutto ja Western blot analyysit tehtiin kuten aiemmin ilmoitettua [16]. Lyhyesti tumauutteita eristettiin CelLytic Nuclear Extraction protokollan (Sigma Chemicals, Buchs, Sveitsi). Western blot -analyysiä varten, proteiinin kokonaismäärän (100 ug) ja tumaekstrakteilla (60 ug) ladattiin denaturoivalla 10% polyakryyliamidigeelillä. Membraani blokattiin yön yli ja inkuboitiin kanin polyklonaalista vasta-aineella 11beta-HSD2 (H-145,1:500), C /EBP-alfa (sc-61X, 1:5000), C /EBP beta (sc-150X, 1: 5000), β-aktiini (sc-1616R, 1:500) tai HDAC1 (sc-7872, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Pestiin nitroselluloosakalvot inkuboitiin vuohen anti-kani-IgG-piparjuuriperoksidaasi-konjugaattia (sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (ECL) reagenssi (Amersham, Buckinghamshire, UK). Densitometrisesti alttiina elokuvien suoritettiin ja proteiiniin ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä.

havaitsemiseksi IGF1 ja insuliinin reseptoreihin solut joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 100 nM insuliinin 24 tuntia ja lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi 1 mM natriumortovanadaatti, 2 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia. Lysaatit inkuboitiin joko IGFR tai insuliini-reseptorin vasta-aineita (3027, 3025, Cell Signaling), 4 ° C: ssa yön yli. Aamulla, näytteitä inkuboitiin proteiini A /G Plus Agarose (Santa Cruz Biotechnology) 1 tunnin ajan 40 ° C: ssa. Helmet pestiin, keitettiin SDS-latauspuskuria ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla.

De novo

proteiinisynteesiä

HT-29-soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja esikäsitelty proteiinisynteesiä (tai translaation venymä) estäjä, CHX (10 uM) 1 tunti ennen kuin lisättiin insuliinin (10

-7 M). Lopussa 24 h hoito, solut kerättiin RNA: n eristys ja qRT-PCR-analyysillä.

HSD11B2 mRNA: n stabiilisuuteen

HT-29-soluja viljeltiin, kuten edellä on esitetty ja insuliinia ( 10

-7 M) 12 tuntia. Transkriptio pysäytettiin DRB (25 uM) ja solut kerättiin erillisiin aikoina (0-12 h) ja RNA: n eristys ja qRT-PCR-analyysillä.

Sirna (siRNA) kokeissa

HT-29-soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan suosituksia. Transfektioseos poistettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 24 tuntia. Soluja inkuboitiin edelleen tavanomaisissa kasvuolosuhteissa vielä 24 tuntia ennen mRNA: n uutto. SiRNA-dupleksit C /EBP-alfa tai C /EBP beta (Qiagen AG, Basel, Sveitsi) ja negatiivinen kontrolli siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) käytettiin transfektioon, jonka lopullinen pitoisuus on 50 nM.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) ja tumauute valmisteen

noin viisi miljoonaa ja kiinnittyneet solut irrotettiin 3 ml: lla PBS jäällä ja pelletoitiin 5 min ajan 900 g. Pellettejä säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes proteiinia uuttamalla. Tumauute valmistelu ja EMSA suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. Proteiini saanto määritettiin Bradfordin menetelmällä. EMSA koettimet pariuttamalla komplementaarinen yksijuosteinen oligonukleotidit ja leimattiin [gamma-

32P] ATP: tä ja T4-polynukleotidikinaasia. Spesifinen sitoutuminen kilpaili merkitsemätön oligonukleotidit, jotka on tunnistettu, että C /EBP tekijöiden 100X-mooliylimäärä (5′-tgcagattgcgcaatctgca-3 ’; nukleotidisekvenssin motiivit kohteita ovat röyhkeä). Sitova reaktiot suoritettiin 10 ui: aan puskuria [20 mM HEPES, pH 7,5; 35 mM NaCl; 60 mM KCI; 0,01% NP 40; 2 mM DTT; 0,1 mg /ml BSA: ta; 4% ficollia], joka sisälsi 1,75 pmol leimattua koetinta, 4 ug tumaproteiinit ja 1 ug poly (dl-dC). Seoksia inkuboitiin 4 ° C: ssa 20 min läsnä ollessa tai ilman leimaamatonta kilpailijaa. DNA-proteiini-kompleksit erotettiin 5% polyakryyliamidigeelissä 0,5 x Tris-boraatti-EDTA-puskurissa 90 minuutin ajan 140 V: Geelit kuivattiin 2 tuntia 80 ° C: ssa ja analysoitiin fosfo- Cyclone (Packard).

Kromatiini immunosaostus

ChIP määritykset suoritettiin ohjeiden mukaisesti Upstate Biotechnology Inc., kuten aiemmin on raportoitu [18]. Puhdistettu DNA-fragmentit monistettiin PCR: llä alukkeilla havaita 210 bp: n fragmentti, joka sisälsi -177C /EBP, -198C /EBP sivustojen sisällä HSD11B2 promoottori (eteenpäin: 5′-GCAACTTTGGGACTTTGTTCCGGC-3 ’; taaksepäin: 5′-AGAGGGACACTCGCTTTCTCTGCT-3’ ).

qRT-PCR-analyysi käyttäen ihmisen diabetes RT

2 Profiler PCR Arrays

RT

2 Profiler PCR Arrays PAHS-30C (SA Biosciences, MD, USA) oli tarkoituksena on analysoida 84 liittyvistä geeneistä ihmisen insuliini signalointireitille. RT-PCR suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). HT-29-soluja käsiteltiin 24 tuntia insuliinilla (10

-7 M). Kokonais-RNA (1 ug) käytettiin templaattina cDNA: n syntetisoimiseksi RT

2 First Strand kit (SABiosciences). PCR-syklin ehto oli seuraava: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 60 s. Lopussa PCR-syklien vaiheet, tiedot kustakin näytteestä näytetään sulamiskäyrä. ABI SDS-ohjelmisto (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään kriittisen kynnyksen (Ct), joka oli syklin, jossa lineaarinen vaihe kunkin näytteen kynnyksen tasolla. Beta-2-mikroglobuliinin käytettiin taloudenhoito geeni. Ilmentyminen HSD11B2 varten 3 kokeiden kyseessä seurattiin rinnakkain reaaliajassa PCR joka vahvistaa merkittävästi downregulation insuliinia. Records oli syrjäytti vuonna GEO tietokantaan kanssa hakunumerolla GSE51677.

Transient transfektion ja reportterigeenimäärityksessä

Transfektiot suoritettiin FuGENE HD transfektioreagenssin (Roche, Rotkreuz, Sveitsi) käyttäen 3 ml liuos 1 mg plasmidia. Vektori pCMV-HRL (

Renilla reniformis lusiferaasi

) (Promega catalys AG, Wallisellen, Sveitsi) käytettiin normalisointia transfektion tehokkuutta. Konstrukti p4.5 kb-HSD11B2 oli antelias lahja de. K. Yang [19]. P0.2 kb-HSD11B2 plasmidirakenne kuvattu aiemmin [18]. Ilmentämiseen transkriptiotekijöiden, eri määriä vektorit pCMV-LIP ja pCMV-LAP, antelias lahja U. Schibler [20], lisättiin DNA-seos. 6 tunnin kuluttua transfektion väliaine korvattiin normaalilla kasvualustaan ​​18 tuntia. Tämän jälkeen solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuudet havaittiin kanssa Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega catalys AG, Wallisellen, Sveitsi) ja MediatorsPhL Luminometer (Sovittelijat Diagnostic Systems, Wien, Itävalta). Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus ilmaistiin suhteessa Renilla lusiferaasi tilille erot transfektion tehokkuutta. Kun CMV-LacZ-ohjaus vektori transfektoitiin, Dual-Light-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin määrittämään lusiferaasiaktiivisuus. Transfektiot vahvistettiin useita toisistaan ​​riippumattomia kokeita.

mutageneesi

HSD11B2 promoottorin mutantit tuotettiin p4.5 kb-HSD11B2 ja p0.2 kb-HSD11B2 konstrukteja käyttämällä QuikChange II XL-sivuston -johdetussa mutageneesin kittiä (Stratagene, Basel, Sveitsi). Seuraavia alukkeita käytettiin: 5′-GTGGAACTTGAGAGCTCGAGCAGTTCCCTTCACCTCTGG-3 ’ja 5′-CCAGAGGTGAAGGGAACTGCTCGAGCTCTCAAGTTCCAC-3′ ja -4362 C /EBP ja 5’-CTCGAGCGCAGCCGCTCCAGGACTTTGTTCCGGCTTTTTC-3 ’ja 5′-GAAAAAGCCGGAACAAAGTCCTGGAGCGGCTGCGCTCGAG- 3’ varten -198 C /EBP. Alleviivattu ja lihavoitu kirjaimet edustavat mutatoituja emäksiä.

bioinformatiikan ja tilastot

Data ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SD kolmesta näytteestä edustavan koe toistettiin ainakin kolme kertaa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

testiä tai ANOVA analyysit ja seurasi toisin testi Tukey virhe suojaa. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

p

0,05, *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001. Transkriptiotekijän sitoutumiskohtia analysoitiin kanssa Match-ohjelman.

Tulokset

Jatkuva insuliinihoitoa pienenee 11beta-HSD2 aktiivisuutta ja HSD11B2 geenin ilmentymisen paksusuolen syövän solulinjoissa

asetus entsyymin aktiivisuus insuliini tutkittiin HSD11B2 ilmentävät [16] – [18], [21] ihmisen paksunsuolen solulinjoissa (HCT116, SW620 ja HT-29) (Fig. 1A). Soluja inkuboitiin 24 tuntia insuliinilla (10

-11 M-10

-7 M) soluviljelyelatusainetta sisälsi 0,3% FBS. Insuliini aiheutti annosvaste väheneminen 11beta-HSD2 aktiivisuutta kaikilla testatuilla paksusuolen solulinjojen kanssa merkittävä väheneminen 10

-9 M HCT116 solulinjassa (

p

0,05). Tämä vaikutus ei rajoitu paksusuolen solulinjoja, koska samanlaisia ​​tuloksia saatiin HSD11B2 ilmentävien [19] JEG-3-soluissa (kuvio. S1). Johtuen vankka vaste (≈30%: n vähennys), olemme edelleen tunnettu siitä, molekyylitason mekanismeja HT-29-soluja.

(

) 11beta-HSD2-aktiivisuus mitattiin

3H -cortisol /kortisoni muuntaminen määritys paksusuolen solulinjoissa 24 tunnin inkuboinnin jälkeen insuliinilla (10

-11-10

-7 M). Aktiivisuus mitattiin HCT116 puuttuessa insuliinin asetettiin 100%. (

B

) Annos-vaste vaikutuksen insuliinin (10

-9-10

-5 M) päälle HSD11B2 mRNA (harmaat palkit) ja toiminta (käyrä) HT-29-solujen käsitelty 24 h. (

C

) Aika riippuvainen vaikutus insuliinin (10

-7 M) päälle HSD11B2 mRNA (harmaat palkit) ja toiminta (käyrä) HT-29-soluja. (

D

) Aika riippuvainen vaikutus insuliinin (10

-7 M) on 11beta-HSD2 proteiinin tason.

Jatkuva insuliinihoitoa pienenee HSD11B2 geenien ilmentyminen, aktiivisuus ja proteiinin HT-29-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla

seuraava vahvistaneet onko insuliini on vähennetty 11beta-HSD2 aktiivisuutta osuu sen geenin ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 1A). Kasvavia pitoisuuksia insuliinin välillä 10

-9-10

-5 M aiheutti pitoisuudesta riippuvainen lasku HSD11B2 mRNA-tasot 24 tuntia käsittelyn jälkeen (Fig. 1 B). Maksimaalinen vaikutus havaittiin pitoisuudella 10

-7 M, jossa HSD11B2 mRNA aleni 50% (

p

0,05) (Fig. 1 B); ja aktiivisuus 35% (

p

0,05) (Fig. 1 B). Sen jälkeen, tutkimme ajasta riippuva sääntelyn vaikutus insuliinin HSD11B2 geenin ilmentymistä, aktiivisuutta, ja proteiinin tasolla. Kuten kuviossa 1C on esitetty, ajasta riippuva väheneminen 11beta-HSD2 aktiivisuus havaittiin merkittävä väheneminen 12 tunnin käsittelyn jälkeen (

p

0,05). Mielenkiintoista HSD11B2 mRNA kasvoi ensimmäisen 10 h ja laski sen jälkeen. 16 tunnin jälkeen mRNA saavutti minimiverotasot ja pysyivät alhaisina jopa 48 tuntia (

p

0,05) (Fig. 1 C). Yhteisymmärryksessä, HSD11B2 proteiini vähennettiin 18 h ja 24 h insuliinihoidon (Fig. 1 D).

vaimennussäätely HSD11B2 oli palautuvia poistamalla insuliinin keskipitkällä 24 h inkuboinnin jälkeen. Todellakin, 48 tuntia poistamisen jälkeen, HSD11B2 mRNA-tasot valvonta- ja insuliinilla hoidetut olosuhteet olivat samanlaiset (Fig. 2A). Seuraavaksi HT-29-soluja käsiteltiin 24 h insuliinin poissa ollessa ja läsnä ollessa proteiinisynteesi-inhibiittorin, sykloheksimidin (CHX). Insuliinin vaikutus vähentää HSD11B2 mRNA poistettiin läsnä ollessa CHX, mikä osoittaa, että

de novo

proteiinisynteesiä tarvittiin (Fig. 2B). Sen määrittämiseksi, onko insuliini vähentää HSD11B2 mRNA: n stabiilisuuteen, arvioimme puoliintumisaika HSD11B2 mRNA standardin mRNA hajoamisen määrityksessä, jossa käytettiin 25 uM DRB, estäjä mRNA-synteesiä. Kuten kuviossa 2C, insuliini eivät muuttaneet puoliintumisaika HSD11B2 mRNA.

(

) 11beta-HSD2 aktiivisuus mitattiin HT-29-solujen läsnä ollessa (mustat palkit) ja ilman (valkoiset pylväät) 10

-7 M insuliinia 24 tuntia. Insuliini vaikutus oli palautuva huuhtoutumisen PBS 24 h tai 48 h seuranta (viivoitetut pylväät). (

B

) HSD11B2 ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR: HT-29, jotka on esikäsitelty proteiinisynteesi-inhibiittorin CHX (10 uM) 1 tunti ja käsiteltiin insuliinilla (10

-7 M) 24 h. Kukin tietopiste on ilmaistu prosentteina kontrolli arvon. (

C

) HT-29-soluja esikäsiteltiin (täytetyt ympyrät) tai ilman (täytetty vinoneliö) insuliinin (10

-7 M) 12 tuntia. Solut käsiteltiin sitten 25 uM mRNA: n synteesin estäjä DRB, ilman tai insuliinin kanssa (10

-7 M) (määritellään aika nolla). Tällä ilmoitettuina ajankohtina sen jälkeen, kokonais-RNA eristettiin, ja vakaan tilan tason HSD11B2 mRNA arvioitu. Kukin tietopiste on ilmaistu prosentteina suurimmasta määritetty ajanhetkellä nolla.

Insuliini koulutusjakson analyysi

Jotta ymmärtää molekyylitason mekanismi, jonka insuliini down-regulation HSD11B2 pyrittiin luonnehtia insuliinin väylän HT-29. Western blot kokeet osoittivat ekspression ja aktivaation IGF-1 (IGFI-R) ja insuliinin reseptorit (IR) on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 3 A, B). Molemmat reseptorit fosforyloituu ensimmäisten 10 min, kun insuliini, kun taas IR oli herkempi kuin IGFI-R pieniä annoksia insuliinia (kuviot. 3 A, B). Rooli alavirran kinaasien insuliinista riippuvainen HSD11B2 tukahduttaminen arvioitiin käyttäen PD098059 ja AKT VIII inhibiittorit. Kuvio 3C esittää, että molemmat reitit, MAPK /ERK ja PI3K koulutusjakso, välittämän insuliinin vaikutus.

(

) Expression ja fosforylaatio insuliinin reseptorin insuliinin aika (0 60 min) ja annos (0-1000 nM) riippuvaisella tavalla. (

B

) Expression ja fosforylaatio IGF-1-reseptorin insuliinin aika ja annosriippuvaisesti. (

C

) HSD11B2 mRNA-ekspressiota tarkkailtiin qRT-PCR läsnä insuliinia, AKT-estäjällä (AKTVIII, 0,1 uM ja 10 uM) tai MEK estäjä (PD098059, 1 uM).

Yhteensä mRNA insuliinilla hoidetut HT-29-solut uutettiin ja suoritettiin RT

2 profilointi määrällisesti insuliinin ilmentämistä reaktiotien komponenttien. Ihmisen insuliini signalointireitin RT

2 Profiler PCR Array profiilit ilmentymistä 84 liittyvistä geeneistä insuliiniresponsiivisten geenejä. Kaksikymmentäkaksi geenejä säädellään eri tavalla HT-29-solujen jälkeen insuliinihoitoa on esitetty taulukossa S1 ja reitit mukana on kuvattu järjestelmää kuvion 4 RT

2 Profiler paljasti luonteenomainen insuliinia tunteettomuudesta, joilla on alentunut ilmentyminen insuliinia polku komponentit: IR, IGFI-R, insuliinin reseptori substraatti (IRS2) ja insuliini säännelty glukoositransportterin (GLUT-4). Jatkuva insuliinihoito edistetään myös Glykolyysivaiheen HT-29-soluja. Vaikka insuliini säännelty glukoositransportterin GLUT-4 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi, GLUT-1 koodaus messenger nostettiin, helpottaa tuontia glukoosin soluihin, riippumatta kasvutekijän stimulaatiota. Heksokinaasilla 2, entsyymin, joka fosforyloi glukoosi-6-P, nopeutta rajoittava vaihe Glykolyysivaiheen oli säädelty yhdessä pyruvaattikinaasia 2 (PKM2), joka muuntaa PEP pyruvaatiksi. Sen sijaan, entsyymiä, joka defosforyloitiin fruktoosi 1, 6 bifosfaatin fruktoosiksi-6-fosfaatti ja osaltaan antagonisoimalla glykolyysin säädeltiin vähentävästi.

mRNA: t kvantitoitiin 24 tuntia sen jälkeen, kun insuliini (10

-7 M) käsittely käyttäen RT

2 Profiler PCR Arrays PAHS-30C. Sääteli selostukset näkyvät punaisina ja alassäädetty selostukset näkyvät vihreinä.

Vaikutus insuliinin C /EBP-alfa, C /EBP beta, ja C /EBP delta mRNA

Esitämme todisteita kuvassa 5B, että hoito HT-29-solujen eri pitoisuuksilla insuliinin (10

-9-10

-5 M) 24 tuntia aiheutti pitoisuudesta riippuvainen lisäys C /EBP beta mRNA ilmaisun. Sen sijaan, insuliinin tukahdutti ilmentyminen C /EBP-alfa-mRNA: n ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. Pitoisuutena 10

-7 M, insuliini pienensi C /EBP-alfa-mRNA 51% (

p

0,01), kun taas C /EBP delta mRNA: n ilmentymisen oli ennallaan. Nämä tulokset osoittavat, että insuliinista riippuvainen väheneminen HSD11B2 mRNA, korreloi ekspressiokuviota 2 ulos 3 tutkittiin jäsenten C /EBP-perheen transkriptiotekijöiden HT-29-soluja.

(

) pitoisuus riippuvia vaikutuksia insuliinin 11beta-HSD2, C /EBP-alfa, ja C /EBP beeta-proteiinin tasoja. HT-29-soluja viljeltiin 24 h ilman ja kasvavien pitoisuuksien kanssa insuliinia (10

-9-10

-5 M), sitten talteen Western blotting arvioida ilmentymisen 11beta-HSD2, C /EBP-alfa , C /EBP beta. (

B

) Pitoisuus riippuvia vaikutuksia insuliinin C /EBP-alfa, C /EBP beta, ja C /EBP delta mRNA ilmaisun. HT-29-soluja käsiteltiin kuten kohdassa (A). Taso C /EBP-alfa (avoimet ympyrät), C /EBP beta (avoimet neliöt), ja C /EBP delta (umpinaiset kolmiot) mRNA mitattiin käyttämällä qRT-PCR S18 sisäisenä kontrollina. Ekspressiotasot käsitellyissä soluissa normalisoitiin käsittelemättömiin kontrolleihin (100%). Edustavia tietoja vähintään kolmen erillisen kokeen. Suhteellinen voimakkuus määritettiin densitometrinen skannaus. Suhde suhteelliset tiheydet 11beta-HSD2 beeta-aktiini soluissa viljellä abscence hormoni pidettiin 100% (kontrolli). Suhde suhteelliset tiheydet tumauutetta proteiinien HDAC-soluilla ilman hormonia pidettiin 100% (kontrolli). * LIP oli havaittavissa kontrollinäytteissä, joten LAP /LIP-suhde ei ole laskettu. (

C, D

) hiljentäminen C /EBP-alfa (

C

) ja C /EBP beeta (

D) B suoritettiin käyttäen siRNA. Ilmaisu C /EBP-alfa, C /EBP beeta (vasen paneeli) ja HSD11B2 (oikea paneeli) mRNA mitattiin käyttämällä qRT-PCR.

Insuliini-säätely C /EBP-alfa ja C /EBP beta proteiinit

Sen tutkimiseksi, C /EBP-alfa tai C /EBP beta olla rooli insuliinista riippuvainen tukahduttaminen HSD11B2 geenin ilmentymisen, ilmaus C /EBP-alfa ja C /EBP beta HT 29 solut analysoitiin Western-blotit (Fig. 5A). C /EBP-alfa-mRNA voi johtaa kahden polypeptidin, joiden koko on 42 kDa ja 30 kDa [22], [23] kun taas C /EBP beta saattaisi kehittyä aktivoiva tai inhiboiva isoformin (LAP, 38 kD tai LIP, 21 kDa vastaavasti) [20], [24]. Hoito HT-29-solujen insuliinin 24 tunnin lisäsi ydinvoiman tasot C /EBP-alfa (isoformin 42 kDa), sekä C /EBP beeta-isoformeja LAP ja LIP, ja vähensi ydin- tasot C /EBP-alfa (isoformin 30 kDa) annoksesta riippuvalla tavalla. Samanaikaisesti ilmentymistä HSD11B2 laski samanaikaisesti maksimaalinen vaikutus saadaan 10

-6 M insuliinia (Fig. 5A). Kuitenkin vastauksena sama annos insuliinia, kasvu LIP (≈130 kertainen 10

-6 M insuliini) oli suurempi kuin vuonna LAP (≈3 kertainen 10

-6 M insuliini), tuloksena on laskeva LAP /LIP suhde (Kuva. 5A). Expression of C /EBP-alfa (isoformin 42 kDa) oli hieman lisääntynyt, kun taas ilmaus C /EBP-alfa (isoformin 30 kDa) pieneni 50% (Kuva. 5A).

HSD11B2 geenin ilmentyminen on ylä- säädellään C /EBP-alfa /beeta hiljentäminen

vaikutus C /EBP-alfa /beeta knockdown annetun HSD11B2 arvioitiin HT-29-soluja. On näyttöä tästä siRNA transfektointikokeessa että C /EBP-alfa ja C /EBP beta mRNA vaimentua merkittävästi (Kuva. 5C, D, vasen paneeli). Tärkeää on, että mRNA tasot HSD11B2 lisääntyi seuraavien transfektion siRNA vastaan ​​molemmat isoformit (Fig. 5C, D, oikea paneeli).

Insuliini sääntely C /EBP-DNA-kompleksit

in silico

analyysi ihmisen HSD11B2-geenin promoottorisekvenssin paljasti 4 oletetun sitoutumiskohtia C /EBPs sijaitsee asemissa -4361, -1985, -198 ja -177 bp transkription aloituskohdasta (taulukko 1). Sivusto -4361 on suurempi ottelun konsensussekvenssi (taulukko 1). Eri koettimet leimattiin ja inkuboitiin, kun läsnä on tumauutteiden eristetty insuliinilla hoidetut HT-29-soluja. EMSA suoritettiin koetin sisältävä konsensus C /EBP sitoutumiskohtaan paljasti kolme erityistä komplekseja (Fig. 6A, kaista 1, totesi C1-3). Signaalit palautettiin kilpailee leimaamattoman koetin kätkeminen konsensus C /EBP päällä (Fig. 6A, kaista 6), kun taas muuttunut, kun koetin kanna mutatoitunut C /EBP sivustoja (Fig. 6A, kaista 7). Näin ollen, C1-3-signaalit voivat vastata C /EBP: n /DNA-kompleksit. C /EBP sitoutumisen konsensuskoetin nostettiin lisääntynyt kesto insuliinihoidon (Fig. 6A, kaistat 1-5), joka heijastaa tehostetun C /EBP beeta saapuvat Western Blot (Kuva. 5A). Mielenkiintoista, intensiteetti C2 kasvanut yli C1, C2 ollessa runsaampaa suhteen C1 24 h kuluttua insuliinihoitoa kuin verrokeilla (kaistat 1, 5).

(A) Nuclear proteiinit eristettiin HT -29 solut sitoutuvat tunnistettu C /EBP-alfa /beeta-sivustoja.

4 ug tumauutteiden eristetty insuliinilla hoidetut (annetun ajanjakson ajan, 10

-7 M) tai käsittelemätöntä HT-29-soluja inkuboitiin radioaktiivisesti koetin kattaa konsensus C /EBP-alfa /beeta-sivuston läsnä ollessa tai poissa ollessa ei-radioaktiivisella leimalla (100 x) kilpailija koetin (kok C /EBP-alfa /beeta- tai mut C /EBP-alfa /beeta) (lanes1-7) . Nuolet osoittavat C /EBP-alfa /beta /DNA-siirtymät (C1, C2, C3) erotettiin vapaasta koetin geelielektroforeesilla.