Krooninen sairaus

tiivistelmä

Drug kohdistaminen on aktiivinen tutkimus- ja nano mitoitetaan lääkeainekuljetussysteemeihin pidä valtavat mahdollisuudet hoitoon kasvaimet. Tässä tutkimuksessa uutta syklodekstriini (CD) -pohjaisen nanohiukkasten lääkeaineen antojärjestelmä on koottu, ja tunnettu siitä, että hoito folaatin reseptori-positiivisten [FR (+)] syöpä. Vesiliukoinen foolihappoa (FA) konjugoidun CD harjoittajat (FACDs) onnistuneesti syntetisoitiin ja niiden rakenteet varmistettiin 1D /2D-ydinmagneettinen resonanssi (NMR), matriisi-laserdesorptio ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrillä (MALDI- TOF-MS), korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), Fourier-muunnos infrapuna (FTIR), ja ympyrädikroismilla. Drug komplekseja adamatane (Ada) ja sytotoksisten doksorubisiini (Dox) kanssa FACD oli saada helposti sekoittaa liuotinsaostusta. Keskikoko FACD-Ada-Dox oli 1,5-2,5 nm. Isäntä-vieras liittymisvakiolla

K

A oli 1,639 M

-1 määritettynä aiheuttama ympyrädikroismilla ja hydrofiilisyyttä FACDs oli huomattavasti parantunut verrattuna modifioimattomaan CD. Soluunottoa ja FR sitova kilpailukykyinen kokeet osoittivat tehokkaan ja edullisesti kohdistettu annostelu Dox osaksi FR-positiivisia kasvainsoluja ja jatkuvaa lääkeaineiden vapautumisen profiili nähtiin

in vitro

. Toimituksen Dox osaksi FR (+) syöpäsolut

kautta

endosytoosin havaittiin konfokaalimikroskopiaa ja huumeiden oton kohteena nanohiukkasten oli 8 kertaa suurempi kuin ei-kohdistuva lääkkeiden komplekseja. Meidän telakointi tulokset viittaavat siihen, että FA, FACD ja FACD-Ada-Dox voisi sitoa ihmisen siili vuorovaikutuksessa proteiini, joka sisältää FR verkkotunnuksen. Hiiren sydänlihassolujen sekä fibroblastien käsiteltiin FACD-Ada-Dox oli merkittävästi alhaisempi reaktiivisen hapen, lisääntynyt pitoisuus glutationi ja glutationi-peroksidaasin aktiivisuus, joka osoittaa alentuneen mahdollisuuksia Dox-kardiotoksisuuteen. Nämä tulokset osoittavat, että kohdistuva lääkkeiden monimutkainen Justus on huumeiden yhdistys ja lääkeaineen pitkittyneen vapautumisen ominaisuudet hyvällä biologinen yhteensopivuus ja fysiologisia vakautta. Uuden FA-konjugoitu β-CD-pohjainen lääke kompleksi voisi olla lupaava anti-kasvain hoitoa FR (+) syöpä.

Citation: Yin JJ, Sharma S, Shumyak SP, Wang ZX, Zhou ZW, Zhang Y, et ai. (2013) Synthesis ja biologinen arviointi Novel foolihappo Reseptori-Kohdennettu, β-syklodekstriini-Based Drug Complexes Cancer Treatment. PLoS ONE 8 (5): e62289. doi: 10,1371 /journal.pone.0062289

Editor: Caterina Cinti laitos Kliinisen fysiologian, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italia

vastaanotettu: 06 joulukuu 2012; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2013; Julkaistu: 02 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Yin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr JJY tukee jälkeisten apurahan College of Pharmacy, University of South Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd., Tampa, Florida. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on johtava tappaja ihmisten kaikkialla maailmassa, osuus 7,6 miljoonaa kuolemantapausta (noin 13% kaikista kuolemista) vuonna 2008 [1]. Kaiken kaikkiaan arviolta 12,7 miljoonaa uutta syöpätapausta ja 7,6 miljoonaa syöpään kuoli vuonna 2008, 56% uusista syöpätapauksista ja 63% syöpäkuolemista esiintyy vähemmän kehittyneillä alueilla maailmassa [2]. Yleisimmin diagnosoitu syövät maailmanlaajuisesti ovat keuhko (1,61 miljoonaa 12,7% kokonaismäärästä), rinta (1380000, 10,9%) ja peräsuolen syöpiä (1230000, 9,7%). Novel, turvallisia ja tehokkaita hoitoja selvästi ja pikaisesti rajoittaa näitä korkeita kuolleisuustilastoja. Neljä suurta moduulit syövän hoitoon kuuluu leikkaus, säteily, kemoterapiaa ja immunoterapia [3]. Nämä hoidot ovat ainoa onnistunut silloin, kun syöpä havaitaan varhaisessa vaiheessa, tai rajoitettu tiettyjen syöpien (esim leukemia). Johtuen kyvyttömyys havaita syöpä varhaisessa vaiheessa, useimmat potilaat läsnä pitkälle kanssa laaja paikallinen tunkeutuminen ja etäpesäke. Kehittyneen kasvaimia, erityisesti niiden kasvainten, kehitetty epiteelikudosten, kuten keuhko-, paksusuoli-, rinta-, eturauhas- ja haimassa, nämä hoidot ovat vähemmän onnistuneita. Kemoterapia on yksi tärkeimmistä keinoista syövän hoitoon, jonka tavoitteena tappamaan kasvainsoluja tai estämään niiden leviäminen säilyttäen normaalit solut elimistössä [3]. Solunsalpaajalääkeaineet on yleensä kapea turvamarginaali, ja käytetään yhdessä annetaan tavallisesti korkeintaan siedetty annos maksimaalisen syöpäsolun tappaminen [4]. Ne tappavat kasvainsoluja suoraan sytotoksisuuteen, tai aktivoimalla isännän immuunivasteen, inhiboimaan prosessit kasvainsolujen, ja apoptoosin indusoimiseksi [5]. Kuitenkin useimmat potilaat eivät vastaa näitä lääkkeitä ja ne kokevat usein vakavia haittavaikutuksia, kuten vaikeaa ripulia ja hiustenlähtö. Ensisijainen syy tähän on, koska lääke tappaa sekä normaaleissa että kasvainsoluissa alhaisen huumeiden valikoivuus ja huumeiden tasoilla kasvainsolut ovat liian alhaiset. Lääkeresistenssin ja annosta rajoittavia toksisuuksia ovat suuria ongelmia menestyksen syövän kemoterapiaa [6]. Viime vuosikymmenen aikana, nano-mittakaavan, kohdistuva lääkkeiden annostelu on herättänyt paljon huomiota keinona parantaa parantava vaikutus olemassa olevien kemoterapeuttisten aineiden ja vähentää niiden haitallisia vaikutuksia [7], [8]. Viimeaikainen dramaattinen kehitys nanoteknologian ovat luoneet lukemattomia syövän vastaisen nano-lääkkeet; mutta useimmat nykyiset nano-lääke järjestelmien jäävän vuonna puhdistamisen helppous, toistettavuus ja tuote-erien yhdenmukaisuuden [9], [10]. Valmistelu ja karakterisointi nano-lääkeainesekoituk- erityisesti vesipitoisille lääkkeen kompleksit on edelleen suuri haaste.

antrasykliiniglykosidijohdannaiset antibioottia, doksorubisiini (Dox), on voimakas, laajakirjoinen syöpälääke, joka vaikuttaa interkalatoivista sisällä DNA ja estämällä DNA-synteesi [11]. Dox usein käytetään joidenkin leukemiat ja Hodgkinin lymfooma, sekä syövät virtsarakon, rinnan, mahan, keuhkojen, munasarjojen, kilpirauhasen, ja pehmytkudoksen sarkooma. Tavallisilla kemoterapeuttisten annoksina Dox on kardiotoksisia ja se voi myös lisätä riskiä leukemia varsinkin kun se annetaan suurina annoksina tai yhdessä eräiden muiden kemoterapia-aineiden tai sädehoidon [11] – [16].

tavoitteena tämän raportin on esittää menetelmä, jolla syntetisoidaan uusi ja tehokas lääke monimutkainen kohdistuva lääkkeiden annostelu (kuvio 1). Yhdistämällä kohdennusmolekyylejä, lääkeaineen kantajina ja sytostaattien monimutkaiseksi pitäisi taata vakautta konjugaatin liikkeessä ja vakuuttaa hajoavuuden lääkkeen vapauttamiseksi. Β-CD oli vectorized foolihapon (FA) kohdistaa folaatin reseptoreita (FR: t) on kasvainsolun pinnalla. Dox sisältävät FR kohdistaminen β-CD: t syntetisoitiin monivaiheisen reaktio, jossa a- ja γ-amidi monomeerit sekä di-CD substituoitu FA operaattorin puhdistettiin ja täysin tunnettu paneeli spektrin tekniikoita.

in vitro

lääkeaineen vapautumisprofiili määritettiin dialyysin ja fluoresenssin mittaus, ja kohdistuva lääkkeiden sitova

in vitro

kvantitoitiin virtaussytometrillä ja konfokaalimikroskopialla. Sytotoksisuutta eri lääkkeen kompleksit mitattiin ja biomarkkerit liittyvät vapaa Dox-kardiotoksisuuteen tutkittiin myös solutasolla.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

β-syklodekstriini hydraatti ja cerim (IV) sulfaatti tetrahydrate ostettiin yhtiöltä Acros Organics (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ammoniummolybdaattia (para) tetrahydrate ostettiin Alfa Aesar Inc. (Ward Hill, MA).

p

tolueenisulfonyylikloridia,

N

,

N

’-dicyclohexyl-karbodi (DCC), foolihappo (FA),

N

hydroksisukkinimidin (NHS), doksorubisiinihydrokloridi, 1-adamantaanikarbonyylikloridia, ammoniumbikarbonaattia, natriumatsidia, trifenyylifosfiini, 2 ’, 7′-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA), 5, 5’-ditiobis (2-nitrobentsoehappo) (DTNB), pelkistettyä glutationia (GSH), vetyperoksidi, kaliumhydroksidi, natriumhydroksidi, fosforihappo, ammoniumhydroksidiliuosta, ninhydriini, suolahappoa, jodi, rikkihappo, etikkahappo, deuteriumoksidia, kloroformi-d, dimetyylisulfoksidi-d

6, ja CM Sephadex C

25 ostettiin kaikki Sigma-Aldrich Chemicals Co. (St. Louis, MO). Paraformaldehydiä saatiin EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ). Bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä kit hankittiin Pierce (Rockford, IL). CM-H

2DCFDA ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Pro-prep (TM) Protein Extraction Kit ostettiin Intron Biotechnology Inc. (Kyungki-Do, Korea). Glutationi peroksidaasi (GPX) iinianalyysikitissä saatiin BioVision Inc. (Milpitas, CA). Spectra /Por dialyysikalvoa, jonka molekyylipaino cutoff 3000 Da ostettiin Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Kaikki liuottimet kromatografisten eristäminen olivat analyyttistä laatua. HPLC-laatuista asetonia, butanolia, asetonitriili (ACN), etyyliasetaatti (EtOAc), heksaani, metanoli, 1-propanoli (1-PA), 2-propanoli, dikloorimetaani (DCM), pyridiini, dimetyyliformamidi (DMF), dimetyylisulfoksidi ( DMSO) ja ohutkerroskromatografialla levyillä (1000 um ja 200 um) ostettiin Fisher Scientific Co. (Fair lawn, NJ). Lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, naudan sikiön seerumia, ja vastasyntyneen vasikan seerumia ostettiin Hyclone Laboratories Inc. (Logan, UT). FR ja β-aktiini-vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). HRP hiiren anti-kani-IgG-monoklonaalinen vasta-aine hankittiin ProSci Inc. (San Diego, CA). Pierce ECL Western blotting substraatti hankittiin Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA).

Solut ja Cell Culture

JEG-3: n ja JAR (molemmat ihmisen istukasta peräisin koriokarsinooma), HT -29 (ihmisen paksusuolen syöpä), MCF-7 (ihmisen rintasyöpä), H9C2 (2-1) -soluja (hiiren sydänlihassolujen) ja 3T3 (hiiren fibroblasti) solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . JEG-3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa oli 10% vastasyntyneen vasikan seerumia; JAR ja MCF-7-soluja viljeltiin RPMI-1640, jossa on 10% vastasyntyneen vasikan seerumia; HT-29-soluja viljeltiin McCoyn 5A 10% vastasyntyneen vasikan seerumia; ja 3T3-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 5% CO

2 ja 90-100%: n suhteellisessa kosteudessa 37 ° C: ssa. Medium uusiminen toteutettiin 2-3 kertaa viikossa, ja solut jatkoviljeltiin kun ne saavutettiin 80-90% konfluenssiin. Dia valmistelu, 2 x 10

4 solut maljattiin 0,7 cm x 0,7 cm Nunc brändin kammio diat Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Solut pestiin kolme kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja peitettiin Vectashield merkki asennus alustassa, joka sisälsi 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) hankittiin Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA).

Western blot -määritys

proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-menetelmällä sen jälkeen, kun proteiini uuttamalla soluista. Ilmentymisen taso FR JAR, HT-29, MCF-7 ja 3T3-solulinjat määritettiin Western blot-määrityksellä. Lyhyesti, yksisoluiset kerrokset pestiin PBS: llä ja sitten lysaatit keitettiin 10 minuutin ajan ja erä käytettiin arvioimaan proteiinipitoisuuden suhteen BCA-määrityksellä. Alikvootti koko proteiinia (0,2 mg), analysoitiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Jälkeen elektroblot ja geelien päälle polyvinylideenidifluoridi (PVDF) levyt (Millipore, Bedford, MA), suodattimet blokattiin huoneenlämmössä Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa Tween-20 (TBST) puskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 % Tween 20, ja 150 mM NaCl), joka sisälsi 10% rasvatonta maitoa, ja sitten inkuboitiin TBST-puskurissa yön yli 4 ° C: ssa 1:200 laimennoksella FR-vasta-aineen ja 1:10,000 laimennus β-aktiini-vasta-aine. Kun oli pesty TBST-puskurilla, blotteja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa hiiren anti-kani-IgG-monoklonaalinen vasta-aine laimennettiin 1:3,000 TBST-puskurilla, ja sitten paljasti tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL).

Chemical Synthesis of Foolihappo acid Receptor-Kohdennettu, β-syklodekstriini-Based Drug Complexes

Syntetisoidaksesi mono-6-deoksi-6 – (

p

-tolylsulfonyl) -β-syklodekstriini (Ts-CD), joka on liuosta, jossa oli

p

tolueenisulfonyylikloridia (846,3 mg, 4,44 mmol) 5 ml: ssa ACN: ää, lisättiin 80 ml: aan vesipitoista liuosta, jossa oli β-CD: n (5,0 g, 4,44 mmol) ja NaOH (434,8 mg, 10,8 mmol) tipoittain 15 minuutin aikana. Sen jälkeen kun oli sekoitettu 4 tunnin ajan 0 ° C: ssa N

2 ilmakehässä, liuos neutraloitiin lisäämällä 0,6 ml 2,0 N kloorivetyhappoa, ja tuote kiteytettiin uudelleen 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten se pestiin asetonilla. Ts-CD saatiin saannolla 84,6% (kuvio 2 ja kuviot S1 S2).

Mono-6-atsido-6-deoksi-β-syklodekstriiniä (N

3 -CD) saatiin saattamalla Ts-CD ja natriumatsidia 5 tunnin ajan 80 ° C: ssa, jonka saanto on 91,5%. Mono-6-deoksi-6-aminoβ-syklodekstriini (NH

2-CD): N

3-CD ja trifenyyli- phophine liuotettiin DMF: ään, ja lisättiin ammoniakin ja liuosta sekoitettiin 3 päivää 50 ° C: ° C. Lopullinen liuos uudelleenkiteytettiin asetonista, jolloin saatiin yhdiste NH

2-CD 79%: n saannolla (kuvio 2 ja kuvio S3), joka puhdistettiin ioninvaihtokolonniin deionisoidulla vedellä ja 0,1 M (NH

4)

2CO

3.

Ada-COCI liuotettiin anhydraattina DCM sekoittaa Et

3N, ja sitten sekoitettiin huoneen lämpötilassa 3 tunnin ajan N

2. Doksorubisiinihydrokloridi lisättiin sitten, sekoitettiin yön yli ja erotettiin preparatiivisella ohutkerroskromatografialla (TLC). Ada-Dox saatiin ja puhdistettiin flash-pylväskromatografialla, jonka saanto oli 80,5% (kuvio 2 ja kuvio S4).

Seosta, foolihappoa (20 mg, 0,045 mmol), 1,2 ekvivalenttia DCC: tä (11 mg , 0,054 mmol) ja 1,2 ekvivalenttia NHS (6 mg, 0,054 mmol) vedettömässä DMF: ssa (5 ml), sekoitettiin huoneenlämpötilassa typpi-ilmakehässä ja pimeässä 3 tunnin ajan. Sen jälkeen, 50 mg NH

2-CD (1 ekvivalentti) ja 0,8 ml: ssa pyridiiniä, lisättiin ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa pimeässä 8-40 tuntia. Reaktioseos saostettiin sitten 50 ml: lla asetonia ja huuhdeltiin peräkkäin kolme kertaa 50 ml: ssa asetonitriiliä, etyyliasetaattia, ja etanolin poistamiseksi hydrofobisten sivutuotteita. Saatu keltainen sakka (48 mg) kerättiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin 20 ml: aan deionisoitua vettä. Kirkas vesiliuos (15 ml) saatiin tyhjösuodatuksella, joka dialysoitiin deionisoitua vettä yhden viikon ajan, ja dialyysi veden uusitaan päivittäin. Vesipitoinen liuos väkevöitiin 5 ml: ksi ja kromatografoitiin CM Sephadex C

25 ioninvaihto- flash-pylväskromatografialla deionisoidulla vedellä ja sen jälkeen preparatiivisella nestekromatografialla eluoitiin 1-PA: EtOAc: H

2O: NH

3H

2O (6:1:2.5:1). Tuotteet sisälsivät foolihappoa konjugaatit ja toinen öljyinen keltainen sivutuotteena napaisuus samanlainen haluttu tuote. Lopuksi, diastereomeerit olivat täysin puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä asetonissa kolme kertaa, ja kuivattiin vakuumissa uunissa yön yli. Tämä johti siihen, että tuotteiden, mono-6-deoksi-6- (γ- (2

S

) -2 – [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yyli) metyyli ] amino} fenyyli) formamido] pentaanidionihapon) -β-syklodekstriinin (γ-FACD) 11,6 mg (kuviot S5 S5) 41,6%: n saannolla (tummankeltainen jauhe), mono-6-deoksi-6- (α- ( 2

S

) -2 – [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yyli) metyyli] amino} fenyyli) formamido] pentaanidionihapon) -β-syklodekstriiniä (α-FACD ) 3,2 mg (kuviot S7 S8) 11,4%: n saannolla (vaaleankeltainen jauhe), sekä pieni määrä di-mono-6-deoksi-6 – ((2

S

) -2- [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yyli) metyyli] amino} fenyyli) formamido] pentaanidionihapon) -β-syklodekstriiniä (FA-di-CD) 3,4 mg (kuvio S9) on 7,1% tuotto (kuva 2).

muodostuminen vieras-isäntä inkluusiokomplekseja välillä Ada-Dox ja foolihapon konjugoidun syklodekstriinit valmistettiin rasaostamalla ja kuivaus menetelmää 01:01 stoikiometria. FACDs (1 ekv) liuotettiin veteen, ja liuosta DMSO: ssa Ada-Dox (1 ekv) lisättiin syklodekstriinin liuosta ja sekoitettiin sitten yön yli 4 ° C: ssa, jota seuraa osittainen haihduttamalla. Sakka otettiin talteen suodattamalla.

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) ja Matrix-laserdesorptio ionisaatio-of-Flight Mass Spectrometer (MALDI-TOF-MS) B

korkean resoluution

1H NMR -spektrit tallennettiin digitaaliseen NMR Spectrospin Bruker Avance 600 MHz ja 800 MHz (Bruker Biospin Co., The Woodlands, TX). Vapautuminen kinetiikka huumeiden mitattiin käyttäen Perkin-Elmer Lambda 2 UV /vis kaksinkertainen palkki spektrofotometrillä. Fluoresenssimikroskopia kuvat saatiin Applied Precision DeltaVision järjestelmä (Issaquah, WA) varustettu Olympus käänteismikroskoo- IX 70 (Tokio, Japani). Kuva työasema sisältää SoftWoRx ohjelmisto digitaalisen kuvan hankinta, dekonvoluutio, ja optinen osastointi.

Massaspektrit saatiin Bruker Daltronics AUTOFLEX MALDI-TOF (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA), jossa α-syaani -4-hydroksikanelihappo (CHCA) kuin matriisin (10,0 mg /ml, Thermo Scientific Pierce). Tietojen analysointi suoritettiin mMass ohjelman.

korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) B

HPLC analyysit tehtiin Agilent 1260 Infinity HPLC-järjestelmää (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA ), joka sisälsi G1312C liuotin toimitukseen binary pumpusta, G1379B kaasunpoistolaite, joka on G1329B automaattinen näytteenotin, joka on G4212B valokuva-diodirividetektori, joka on G1321B Fluoresenssidetektori ja ChemStation käyttöohjelmistot (Ilm B. 04. 03). HPLC oli varustettu Agilent Eclipse Plus C

18 -kolonnia, jonka hiukkaskoko on 3,5 um, ja pylvään koko 100 mm x 4,6 mm, joka laitettiin pylvääseen uunissa (G1316A), jolla on vakio lämpötila 25 ° C: ssa . Liikkuva faasi koostui asetonitriilin ja veden (Gradient). Pylväs virtausnopeus asetettiin 1,0 ml /min, samalla kun HPLC paine kontrolloitiin välillä 260-290 baaria.

HPLC-UV /haihtuvia valonsirontadetektoria (ELSD) ja HPLC-DAD /fluoresenssi erottaminen -olosuhteet olivat seuraavat: eluentti A, vesi; eluentti B, asetonitriili; gradientti, 0-6 min (10-15% B), 6-50 min (15-40% B), 50-60 min (40-80% B), ja tasapainotettiin sitten 10% B: tä 8 minuutin ajan virtaus 1,0 ml /min. ELSD asetettiin koetin lämpötilassa 70 ° C, voitto 7 ja sumuttimen typpi säädettiin 2,5 baaria.

fouriermuunnos Infrared Spectroscopy (FTIR) B

käytettävät instrumentit FTIR analyysi oli Perkin-Elmer 1725-sarjan FTIR spektrometri (Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT) varustettu huonelämpötila deuteroitu triglysiinisulfaatti sulfaatti ilmaisimen ja ohjataan Perkin-Elmer 7300 PC. Käytetty ohjelmisto keräämiseen FTIR-tulokset olivat Spectrum version 5.3.1.

Ympyrädikroismi Analysis

Sirkulaaridikroismispektrit rekisteröitiin 25 ° C: ssa Aviv malli 215 ympyrädikroismilla spektrometri (Aviv Biomedicals Inc., Lakewood, NJ) käyttämällä 0,1 cm: solun kolme skannausta 0,1 nm kaistanleveys. Pitoisuus lääkeaineiden oli 50 uM DMF: ssa, ellei toisin mainita. Synergia H4 hybridi multi-mode mikrolevynlukijaa ostettiin BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT).

Transmission (TEM) ja Atomic Force Microscopy (AFM) B

morfologia ja koosta FACD-Ada-Dox supramolecules arvioitiin siirto (TEM) ja atomivoimamikroskooppi (AFM). Vesiliuosta FACD-Ada-Dox oli suoraan tihkunut päälle 300-mesh kupari verkkoon ja kuivattiin tyhjöuunissa 35 ° C: ssa 4 h, sitten kuvat havaittiin TEM (JEM 100CX, JEOL Ltd, Tokio, Japani) kiihtyvällä jännitteellä 160 kV. Sillä AFM kuvia, näyte liuotettiin kahden deionisoituun veteen (1,0 mg /ml), alikvootti liuosta (5,0 ui) täpläksi juuri pilkotaan kiille pinnan ja kuumennettiin 37 ° C: ssa 3 tunnin ajan. Imaging suoritettiin Multimode Nanoscope AFM salakuuntelu tilassa, käyttäen nestettä solun, J skanneri ja 200 pm ulokkeet 1 nm Si

3 N

4 vihjeitä.

3- (4, 5- dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) Pitoisuus

JAR, HT-29 ja 3T3-solut ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja pidettiin yön yli DMEM-alustassa. Soluja käsiteltiin sitten Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, tai NFACD-Ada-Dox eri pitoisuuksina ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitattiin lisäämisen jälkeen MTT. MTT pelkistetään mitokondrioiden dehydrogenaasien elävissä soluissa sinisen mageta värillinen formatsaanisakaksi. Absorbanssi liuenneen formatsaaniksi näkyvällä alueella korreloi määrä ehjiä aktiivisia soluja. Sytotoksisuus arvioitiin viitaten IC

50-arvo, joka määriteltiin tarvittu konsentraatio 50%: n vähennys säilyminen perustuu eloonjäämiskäyrien. IC

50-arvot laskettiin annos-vaste käyrät (eli solujen hengissäsäilymisosuus

vs

. Lääkeaineen pitoisuus) saatiin usean jäljitellä kokeita.

Drug Release Assay

in vitro

vapautumisen profiilit ja kinetiikasta huumeisiin FACD-Ada-Dox ja prodrug Ada-Dox määritettiin dialyysimenetelmällä. Lyhyesti, 3 ml vesipitoista lääkkeen lisättiin 1 ml: aan PBS: ää (pH 7,4, 0,01 M). Seos suspendoitiin dialyysipussiin (molekyylipainon cutoff: 3000 Dal) ja dialysoitiin 10 ml: lla PBS, joka sisälsi 50% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa varovasti ravistellen kolmen päivän ajan. 20 ul: n alikvootti otettiin näyte inkubointielatusaineeseen nimetyissä ajankohtina ja säilytettiin pakastettuna analyysiin. Vapautunut Ada-Dox kvantitoitiin mikrolevylukijalla λ

Ex

= 490 nm ja λ

Em

= 600 nm. Kalibrointikäyrä valmistettiin käyttämällä eri pitoisuuksia vapaan Ada-Dox.

virtaussytometria

virtaussytometrinen analyysi suoritettiin FACS (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) laskemalla 10000 Tapahtumat. Arvioida apoptoosia solujen jossa eri lääkeaineilla käsitellyt yhtä suurissa pitoisuuksissa, Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox ja NFACD-Ada-Dox lopullisessa pitoisuudessa 5,0 uM lisättiin valmisteltuun 35 mm: n petrimaljoille, jotka sisältävät 2 × 10

5 HT-29, MCF-7, tai JAR soluja 3,0 ml: ssa viljelyalustaa. Soluja inkuboitiin 2 tuntia, jotta oton huumeita. Ennen analyysiä, solut pestiin huolellisesti PBS: llä kolme kertaa, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen keskipitkällä inkuboinnin jälkeen. Kerätyt solut dispergoitiin uudelleen 500 ul: aan tuoretta PBS: ää ja värjättiin 20 ui DAPI 1,0 uM: virtaussytometria-analyysiä. Fluoresenssi Dox-sukuinen molekyyli mitattiin λ

EX

490 nm ja λ

EM

600 nm. Käsittelemättömistä soluista inkuboitiin DMEM yksinään (joka sisälsi 10% FBS: ää, jota oli täydennetty 1% penisilliini) käytettiin valvontaa.

Folate Receptor-Binding kilpailun määritys

lääkkeen oton kompetitiomäärityksessä JAR-solut (FR positiivinen) ympättiin 35 mm: n petrimaljoille, jotka sisältävät 5 x 10

5-soluihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa FACD-Ada-DOX 2 uM 5 tuntia, kun läsnä on FA 5, 10 tai 50 uM. Tämän jälkeen solut pestiin PBS: llä kolme kertaa, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Talteen solut dispergoitiin uudelleen ja fluoresenssivoimakkuudet määritettiin virtaussytometrillä.

CLSM

konfokaali kuvia tallennettiin PerkinElmer UltraView ERS spinning levy -konfokaalimikroskoopilla (PerkinElmer Inc. , Waltham, MA). JAR tai JEG-3-solut ympättiin peitinlaseja kahdessa-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli. Soluja inkuboitiin sitten kanssa tai ilman 5,0 uM lääkkeitä 2 tuntia. Solut pestiin PBS: llä kolme kertaa poistamaan sitoutumaton huumeiden ja kiinnitetään 2 ml 4%: paraformade huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Kiinnitetyt solut pestiin kolme kertaa ja sitten asennettu alustassa, joka sisälsi DAPI (1,5 ug /ml). Objektilasit kovettunut yön yli pimeään. Tutkia ottoa huumeita 2 h soluissa käsitelty eri lääkettä komplekseja, solut altistettiin lääkkeitä eri inkubaatioaikojen (15 min lisäys). Kuvat kerättiin ja analysoitiin.

Molecular Docking sitoutumisen FA ja sen konjugaatit Human Hedgehog Vuorovaikutus proteiini (HHIP) B

Valitettavasti kiderakenteet ihmisten ja eläinten RCF /SLC19A1, FR /FRα /FLOR1, FRβ /FLOR2, FRγ /FLOR3, FRδ /FLOR4 ja PCFT /SLC46A1 ei ole ratkaistu tähän mennessä. Rakenteita ei bakteerien ja hiivan homologeja on raportoitu ja siten on epätodennäköistä, rakentaa homologiamalli. Olemme tehneet alustavia telakointi tutkimuksen FA ja sen konjugaattien HIPP joka sisältää FRα verkkotunnuksen tutkittiin käyttämällä Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA), kuten meille aikaisemmin [17], [18]. Useat toiminnalliset moduulit Discovery Studio 2.1 sovellettiin myös Diverse Lihakkuus Generation, Laske Molecular Properties, Luo Multiple Linear Regression Model, ja CDOCKER. Ohjelmaa ajettiin käyttämällä Dell optiplex755 palvelimen ja Chemoffice2002 (CambridgeSoft, Cambridge, MA) käytettiin yhdisteen rakenteellisen hienostuneisuus. Kiderakenne HHIP valittiin Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb/) ATE ID 2WFT [19], jonka havaittiin sisältävän FRα verkkotunnuksen kun etsinyt Pcam 26,0 tietokanta (https://pfam.sanger.ac.uk/). Pfam-tietokanta on suuri kokoelma proteiinin perheitä, kutakin edustaa usean sekvenssin rinnastukset ja HMM. Molekyylidynamiikan (MD) simuloitu jäähdytys prosessi suoritettiin käyttäen jäykkää proteiinia ja joustava ligandin. Ligandi-FRα vuorovaikutusten laskettiin joko GRID I, GRID II, tai koko voimakentän. Viimeinen minimointi vaiheessa levitettiin kunkin ligandin telakointi aiheuttaa. Aikana ligandi valmistelu, kaksoiskappale rakenne poistettiin. Vaihtoehdot ionisaatio muutosta, tautomeeri tai isomeerin sukupolvi, Lipinski suodatin ja 3D generaattori olivat kaikki asetettu tosi [20]. Sen jälkeen, kun puhdistetut kanssa CHARMM, yhdisteet telakoitu osaksi mahdollista sitoutumiskohtaa proteiinin. Telakointi toteutettiin huomioon sähkölle ja van der Waalsin (VDW) voima, joka oli pehmennetty eri tasoilla aikana telakoinnin prosessi, mutta tämä pehmentävä poistetaan Lopullisessa minimointiin [21] .For kukin määritelty VDW tai staattisen koetin , vuorovaikutusta kaikkien proteiinin atomien säilytettiin näissä ruudukon pistettä. Ligandin atomien välissä ruudukon pistettä, tri-lineaarista interpolaatiota käytettiin lähentää energioita. Harmoninen potentiaali kanssa voimavakio on 300 kcal /mol levitettiin ulkopuolella verkkoon rajan.

määritys Cellular reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot

solunsisäisten ROS tasoilla hiiri H9C2 (2 -1) solut kvantifioitiin käyttäen CM-H

2DCFDA koettimena ROS tuotanto [22]. CM-H

2DCFDA on kloorimetyylijohdannaiseksi H

2DCFDA, käyttökelpoinen indikaattorina ROS soluissa. H9C2 (2-1) soluja ympättiin lautasen tiheydellä 3 x 10

6 solua kuoppaa kohti ja niitä viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Solut käsiteltiin Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, tai NFACD-Ada-Dox, ja huuhdeltiin sitten PBS: llä. Sen jälkeen, fluoresenssi-intensiteetti mitattiin. Lääkeaineen pitoisuus oli 2,0 uM H9C2 (2-1) soluja. Ohjaus solut käsiteltiin ajoneuvon DMSO: hon lopulliseen pitoisuuteen 0,05% (v /v).

Solunsisäiset ROS tasot hiiren 3T3-soluissa kvantitoitiin käyttäen dikloori määritystä [23]. 3T3-solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 10

5 solua kuoppaa kohti, ja niitä viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Solut käsiteltiin Dox, Ada-Dox, tai FACD-Ada-Dox 5,0 uM, sitten solut huuhdeltiin sitten PBS: lla, sen jälkeen 75 ui PBS: ää, ja 25 ui liuosta, jossa oli 2 ’, 7’-dichlorfluorescein-diasetaatti (DFCH-DA) lopulliseen konsentraatioon 62,5 uM PBS-puskurissa lisättiin kuhunkin kuoppaan. Fluoresenssi kustakin kuopasta mitattiin 35 ° C: ssa välittömästi liittämisen jälkeen reagenssin ja 5 minuutin välein 1 tunnin ajan 1 sekunnin integrointi ajan, käyttäen 485 ja 535 nm viritys- ja emissioaallonpituudet. Tallennus fluoresenssin voimakkuutta ajan käytettiin indeksinä yksittäisten solunsisäisiä tasoja ROS 3T3-soluissa. Vastaus Menetelmän tarkistettiin käyttäen H

2O

2 käyrä. Viisi itsenäistä koetta suoritettiin per hoito.

mittaus glutationiperoksidaasi (GPX) Toiminta ja GSH Content

Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-menetelmää sen jälkeen kun proteiini uuttamalla soluista. Toiminta GPX ja sisältö GSH skaalattiin proteiinipitoisuus korjaamaan eroja biomassan erilaisia ​​homogenaatteihin. Tasot GSH solut määritetään menetelmän Beutler

et ai

. [24], joka perustuu muodostumista 2-nitro-5-tiobenzoic happoa DTNB: n läsnä ollessa GSH. Lyhyesti, 25 ui trikloorietikkahappoa (15%) lisättiin 50 ul: aan homogenaattia, mitä seurasi sentrifugointi 13 000

g

5 min 4 ° C: ssa. Supernatantti alikvootti (50 ui) sekoitettiin 50 ui 3,4 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) PBS: ään liuotettuna, 1 ml PBS: ää, ja 250 ui DTNB: tä PBS: ssä (20 mg /ml). Absorbanssi mitattiin 412 nm: ssä 15 minuutin kuluttua ja sitä verrataan standardikäyrän GSH (0,01-0,5 mM). GPX-Aktiivisuus mitattiin perustuen hapettumista GSH jonka GPX kytketty katoaminen alennetussa nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADPH), jonka glutationireduktaasin.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Vertailua arvot useille hoitoryhmien suoritettiin yksi- tai kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Bonferronin monivertailukoetta osoitteessa

P

0,05. Erot kahden ryhmän analysoitiin parittomia Studentin

t

-testi.

P

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

synteesi FACDs ja FACD-Ada-Dox ja rakenteellinen määrittäminen Spectral Techniques

synteettinen menetelmä FR kohdistaminen β-CD perustuu adamantaani-Dox supramolecule on esitetty kuviossa 2. rakentamiseksi supremolecule, kohdistuksen lääkeaineen kantajina valmistettiin ensin. Mono-6-amino-6-deoksi-CD (NH

2-CD) syntetisoitiin lähtöaineena menetelmän mukaisesti Petter

et ai

. [25] joitakin muutoksia. b.