Krooninen sairaus

tiivistelmä

Withaferin A (WA), joka on merkittävä bioaktiivisen komponentin Intian yrtti

Withania somnifera

, indusoi solukuolemaa (apoptoosia /nekroosia) useita kasvainsolutyypeissä, mutta molekyylitason mekanismia taustalla sytotoksisuutta edelleen heikko. Me raportoimme tässä, että 2 uM WA solukuolema valikoidusti androgeeni-erottelua PC-3 ja DU-145 eturauhasen adenokarsinooma soluissa, kun taas sen myrkyllisyys oli lievempää androgeeni herkkien LNCaP eturauhasen adenokarsinooma soluissa ja normaalin ihmisen fibroblastit (TIG-1 ja KD ). WA tappoi myös PC-3 solujen sferoidiviljelmiä muodostava väliaine. DNA-siru-analyysi paljasti, että WA huomattavasti mRNA-tasoja c-Fos ja 11 lämpöshokki- proteiineihin (HSP: t) PC-3 ja DU-145, mutta ei LNCaP ja TIG-1. Western-analyysi osoitti lisääntyneen ekspression c-Fos ja vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisen proteiinin c-FLIP (L). Expression of HSP kuten HSPA6 ja Hsp70 esti huomattavan koholla; kuitenkin, koska siRNA-välitteinen väheneminen HSF-1, HSP-indusoivan transkriptiotekijä, vähentää PC-3 solujen elinkykyä, on todennäköistä, että nämä lämpöisku- geenit olivat mukana suojata solukuolemaa vastaan. Lisäksi, WA indusoi reaktiivisten hapen lajien (ROS) PC-3 ja DU-145, mutta ei normaalien fibroblastien. Immunosytokemiassa ja immuno-elektronimikroskoopilla paljasti, että WA häirinnyt vimentiinista tukirankansa, mahdollisesti indusoimalla ROS sukupolvi, c-Fos ilmaisun ja c-FLIP (L) tukahduttaminen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että useita tapahtumia seuraa häiriöitä vimentiinista solun tukirangan pelata keskeisiä rooleja in WA välittämän solukuoleman.

Citation: Nishikawa Y, Okuzaki D, Fukushima K, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et al. (2015) Withaferin indusoi solukuoleman valikoidusti androgeenin Independent syöpäsolujen mutta ei normaalissa fibroblastisoluissa. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10,1371 /journal.pone.0134137

Editor: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN

vastaanotettu: 13 helmikuu 2015; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2015; Julkaistu: 31 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Nishikawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen S (nro 15101006), Scientific Research B (nro 20370081 ja 23370086) ja kartoittava tutkimus (nro 21651085) ja HN ja tieteellisen tutkimuksen C (nro 22570185) ja NY alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology of Japan (https://www.mext.go.jp/englanti /).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Withaferin A (WA), merkittävä bioaktiivisia ainesosa ayurvedic lääkkeiden kasvi

rohtokoisio

, indusoi solukuoleman monissa kasvainsoluissa [1-3]. Erityisesti, WA annosriippuvaisesti indusoi apoptoottista solukuolemaa, jota välittää laskostumattoman proteiinin vaste (UPR), joka laukaisee kertyminen väärin laskostuneen proteiinin endoplasmakalvostossa (ER), ja se aiheuttaa myös apoptoosin välittämän reaktiivisen hapen (ROS) in ihmisen munuaissyövän (Caki) solut [4], [5]. WA kykenee voimakas antiproliferatiivinen vaikutukset estämällä Hsp90 kaperonitoiminta, aiheuttaen siten hajoaminen Hsp90 asiakkaan proteiinien haimasyövän solulinjoissa Panc-1, MiaPaCa2, ja BxPc3; tämä vaikutus on päinvastainen, että proteasomin estäjä MG132 [6]. WA estää ekspressio ihmisen papilloomaviruksen E6 /E7-onkogeenit, palauttaa p53-reitin aktiivisuutta, ja indusoi apoptoosia kohdunkaulan syövän CaSki-soluissa [7]. WA aiheuttaa solusyklin pidätyksen G2 /M vaiheessa eturauhassyövän solulinjoissa [8], ja indusoi apoptoosia ihmisen melanooman soluissa tuottamalla ROS ja alaspäin säätäminen Bcl-2 [9].

WA sitoutuu suoraan jotta vimentiinista kovalenttisesti muokkaamalla kysteiinitähde (Cys328) aiheuttaen vimentiinistä filamentit keräämiseen ja colocalize F-aktiini ja siten häiritsevät vimentiinista tukirankansa [10], [11]. WA aiheuttama vimentiinista aggregaatiota liittyy muutoksia solujen muoto, vähentynyt liikkuvuus, ja kohonnut vimentiinistä fosforylaation Ser38 [12]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että WA voidaan käyttää kohdentamaan etäpesäkekasvainten soluihin [12], [13]. Vaikka WA estää epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) tukahduttamalla vimentiinista toiminto [14], vaikutus vimentiinista yksinään ei voi selittää kaikkia WA välittämän subsellulaarisista tapahtumia, jotka johtavat solukuolemaan. Todellakin, WA sitoo myös β-tubuliinin aiheuttaen vakavia häiriöitä normaalin karan morfologia [15], ja myös häiritsee solujen järjestäminen useiden muiden välissä hehkulanka (IF) verkot, kuten periferiinin, neurofilamentin-kolmikon proteiinia, ja keratiinin [12]. Siksi täysin ymmärtää molekyylitason mekanismi WA-solukuolema, meidän on tunnistettava lisää molekyylitason kohteet WA.

kasvaimia synnyttävän transkriptiotekijä c-Fos säätelee geenien ilmentyminen, yhdessä kesäkuu tai muita emäksisiä leusiini- vetoketju proteiineja, osana aktivaattorin proteiinin 1 (AP-1) dimeeriä monimutkainen. Vaikka c-Fos kykenee antiapoptoottisia toimintoja, tuoreet raportit viittaavat siihen, että se voi myös edistää apoptoosia [16], [17]. Aktivoitu c-Fos /AP-1 pohjustaa PC-3 ja LNCaP eturauhassyöpä (PCa) solujen apoptoosiin suoraan sitovaa promoottorialueen anti-apoptoottisen geenin c-FLIP (L), mikä tukahduttaa sen transkription [18]. Apoptoosi edellyttää myös aktivaation tuumorinekroositekijän (TNF) liittyvien apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) /Apo-2L; Tämä TRAIL: n indusoiman apoptoosin on tuskin havaittavissa normaaleissa soluissa [18].

patogeneesi eturauhasen kasvaimia on aluksi androgeeniriippuvaisissa; kuitenkin, monet potilaat edetä metastaattinen kastraation-resistenttejä (androgeeni-riippumaton) PCa (mCRPC) [19]. Androgeenista riippumaton PCa soluja (esim PC-3 ja DU-145) osoittavat varsi-ominaisuuksiltaan, kun taas androgen reagoiva PCa soluja (esim LNCaP) eivät [20-22]. Anneksiini A1, fosfolipidiä sitova proteiini ja säädin glukokortikoidien aiheuttaa [23]. NANOGP8, joka on retrogene koodaa NANOG1 kaltaista proteiinia, on myös tärkeä rooli säätelyssä kantasolujen kaltaisia ​​PCa soluihin [24]. Side-populaatio soluja ihmisen PCa solulinjoista ja Ksenograftikudoksista tehdään täydellisempi EMT ja ovat aggressiivisempia kuin homologinen bulk-populaatio soluja [25]. Siten EMT näyttää tiiviisti kehitystä mCRPC. Tähän mennessä ei huumeita on kehitetty, joka tehokkaasti ja voimakkaasti tappavat mCRPCs mutta ei normaaleissa soluissa.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tutkimaan, WA voi tappaa mCRPCs mutta ei normaaleissa soluissa, ja jos on, tunnistaa olennainen molekyylitasolla WA. Olemme havainneet, että WA (2 uM) selektiivisesti solukuolema androgeeni-riippumaton PC-3 ja DU-145-PCa-soluissa, mutta ei LNCaP-androgeenille reagoivien PCa soluja tai TIG-1 normaalien fibroblastien. DNA-siru ja Länsi analyysit paljastivat uudet molekyylikohteista WA jotka voivat määritellä erillisiä vastauksia näiden solulinjojen WA. Koska WA tappoi PC-3 solujen sferoidiviljelmiä muodostavat viljelmät, ehdotamme, että WA voi toimia alkaa molekyyli kehittämiselle indusoivien lääkkeiden solukuoleman syövän kantasolut (CSCS).

Tulokset

TIG-1 ja LNCaP ovat vähemmän herkkiä WA kuin PC-3 ja DU-145

ensimmäisen kerran todettu, että WA tehokkaasti indusoi solukuoleman PC-3 ja DU-145, mutta LNCaP olivat vähemmän herkkiä WA jälkeen (kuvio 1). Sen määrittämiseksi, onko ihmisen normaaleja fibroblasteja (TIG-1) osoittavat myös muuttunut vastustuskyky WA, vertasimme elinkelpoisuutta TIG-1 alttiina 2 uM tai 4 uM WA sen elinkykyä LNCap, PC-3 ja DU-145. Elinkelpoisuus PC-3 ja DU-145 väheni merkittävästi 8 h kuluttua 4 uM WA hoito (vaaleanpunainen nuolet kuvassa 1A). Sen sijaan elinkelpoisuutta TIG-1 pysyi korkealla tasolla, joka on samanlainen kuin LNCaP, jopa 8 h kuluttua 4 uM WA hoito, kun enemmän kuin puolet PC-3 ja DU-145 oli kuollut (vihreät nuolet kuvassa 1A ). Solujen elinkelpoisuus DU-145 oli korkeampi kuin PC-3: 4, 8, ja 24 h.

(A, B) Solujen elinkelpoisuus mitattiin 4, 8, ja 24 tunnin kuluttua 2 uM ( A) tai 4 uM (B) WA hoitoa. NT, ei-käsitelty. Vihreä ja sininen nuolet osoittavat kaltereiden eloonjääneiden solujen, kun taas vaaleanpunainen ja punaiset nuolet osoittavat palkit soluja, jotka kuolivat samoissa olosuhteissa. Keltaiset nuolet osoittavat näytteitä käytettiin DNA microarray-analyysi. Pylväät edustavat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Purple nuolet osoittavat merkittäviä vähennyksiä elinvoimaisten solujen (*,

P

0,05; **,

P

0,01).

hoidon jälkeen 2 uM WA, elinkelpoisuus PC-3 pelkistettiin 4, 8, ja 24 tuntia, kun taas DU-145 tuli elämättömiä vain 24 h (punaiset nuolet kuviossa 1B). Sen sijaan, TIG-1 ja LNCaP pysyi elinkelpoinen 24 h (siniset nuolet kuvassa 1B). Inkubointi näiden solujen pidempään osoitti, että TIG-1 pysyi elinkelpoinen jopa 96 tuntia, kun taas LNCaP tuli elämättömiä 72 h (S1A ja S1C kuvassa), mikä viittaa siihen, että 2 uM WA käsittely ei aiheuta kuolemaa TIG-1, mutta kuolema LNCaP oli vain viivästynyt. Toinen ihmisen normaalia fibroblastien linja (KD) myös osoitti vastustuskykyä 2 uM WA hoito (S1B kuvio). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että TIG-1 ja LNCaP-solut ovat vastustuskykyisempiä WA kuin PC-3 ja DU-145-soluja.

Up-regulation c-Fos jälkeen WA hoidon korreloi solujen elävyyden

geenien tunnistamiseksi, jotka olivat ylös- tai alassäädetty näissä solulinjoissa seuraavat WA hoidon selvitimme transcriptomes TIG-1, LNCaP, PC-3, ja DU-145 käyttäen Agilent SurePrint G3 Human mikrosirut. Tutkimme mRNA-tasot PC-3 ja TIG-1 4 tunnin ja 24 h, mikä jälkeen 2 uM WA käsittelyyn, LNCaP ja DU-145 4 tunnin ja 8 tunnin, vastaavasti, sen jälkeen 4 uM WA käsittely (keltainen nuolet kuviossa 1A ja 1B). Kertaiseksi muutoksia geenien ilmentyminen määritettiin vertaamalla hybridisaatiosignaaliin intensiteettien välillä käsitellyt näytteet WA rinnastettavalle dimetyylisulfoksidin (liuotin). S1 Taulukko näyttää luettelon differentiaalisesti ilmentyvien geenien, järjestetään alenevassa kertainen muutos PC-3; kaikki geenit luetellaan olivat myös säädelty yli 4-kertaisesti DU-145. Scatterplots osoittavat, että mRNA tasot analysoidaan geenejä riittävän korkea (raaka signaalin intensiteettiä 10), jotta fysiologisesti merkittäviä vertailuja (S2 Kuva).

Koska yli-ilmentymisen c-Fos indusoi apoptoosia ihmisen kolorektaalikarsinoomasta solujen [ ,,,0],17], keskityimme c-Fos ja FosB geenit, jotka olivat näkyvästi säädellään ylöspäin PC-3 ja DU-145, mutta olivat heikosti säädellään ylöspäin TIG-1 ja vielä vähemmän LNCaP (S1 taulukko; vaaleanpunainen ja turkoosi nuolet S2 kuvassa). PC-3, nämä proteiinit olivat huomattavasti sääteli 4 tunnin kuluttua 4 uM WA hoito, jota seuraa asteittainen nostaminen jälkeen (kuvio 2A). In DU-145, c-Fos oli näkyvästi up-säännellään 4 h, mutta sen ilmentyminen väheni vähitellen jälkeenpäin; samanlainen malli havaittiin TIG-1, vaikka ylössäätöä oli vähemmän näkyvästi kuin DU-145 (kuvio 2A). LNCaP, c-Fos taso oli erittäin alhainen, ja oli havaittavissa vain 24 tuntia. Huomattavaa on, että järjestykseen solujen elinkelpoisuuden (ks 1A) oli identtinen järjestyksessä c-Fos ilmentymisen tason 8 h kuluttua 4 uM WA hoito (LNCaP TIG-1 DU-145 PC-3 ). Lisäksi kun 2 uM WA hoitoa, samanlaisen c-Fos ylössäätöä havaittiin sekä PC-3 ja DU-145; kuitenkin hyvin vähän c-Fos ilmentymistä havaittiin TIG-1 ja LNCaP (kuvio 2B); Näin, WA aiheuttama c-Fos-ekspressio korreloi solujen elinkykyä. Sen sijaan, FosB ja FosB2 eivät merkittävästi säädelty, ja niiden ilmentymistasot eivät korreloi solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2A).

(A, B) Western blot analyysi tunnistaa c-Fos (FosB) TIG-1, LNCaP, DU-145, ja PC-3-solujen 4, 8, ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen 4 uM (A) tai 2 uM (B) WA. NT, ei-käsitelty. (C) Western blot analyysi tunnistaa c-Fos, PARP, FLIP ja GAPDH PC-3-soluja 12 h kuluttua 4 uM WA hoidon läsnä ollessa (+) tai puuttumista (-) ja kolmesta eri siRNA: iden (X-Z) alkaen Origene. (D) elinkelpoisuus PC-3-soluissa, kun siFos hoidon. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen; vaaleanpunainen nuolet osoittavat tilastollisesti merkittävä väheneminen solujen määrä seuraavissa siFos hoidon (**,

P

0,01). (E) populaatio apoptoottisten, nekroottisen ja elävät solut selvästi värjättiin anneksiini V-EnzoGold, 7-AAD-Red, ja GFP. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen; punainen, sininen ja vihreä nuolet osoittavat tilastollisesti merkittäviä muutoksia (**,

P

0,01). (F) Western blot-analyysi c-Fos, PARP, FLIP, ja GAPDH DU-145 12 h kuluttua 4 uM WA hoitoa läsnäollessa (+) tai puuttumista (-) siRNA: iden; siFos tai siGL2 (siControl). (G) elinkelpoisuus DU-145-soluissa sen jälkeen, kun eksogeeninen yliekspressio pcDNA3-FLIP tai pelkästään vektorilla läsnä ollessa DMSO: ta (liuotin) tai 4 uM WA.

siRNA-välitteisen knockdovvn-c-Fos ( siFos) pelastaa solukuoleman PC-3 [18]. Siksi tutkimme minkälainen solukuoleman (eli apoptoosin tai kuolio) pelastaminen siFos. Näitä kokeita varten käytimme siFos_Z (kuvio 2C). Ensin vahvistettu PC-3, joka elinkelpoisuus väheni merkittävästi 48 tunnin ja 72 tunnin kuluttua WA hoidon (kuvio 2D). FACS-analyysi (S3 kuvassa) paljasti, että korko kuolion oli alhaisempi siFos käsiteltyjä soluja kuin käsitellyissä soluissa siGL2 (negatiivinen kontrolli) 8 h käsittelyn jälkeen joko DMSO yksinään tai WA (2 uM tai 4 uM), mikä viittaa siihen, että yli-ilmentyminen c-Fos aiheuttama WA on rooli asiakkuutta nekroottinen solukuolema (punaiset nuolet kuvassa 2E-i). Sitä vastoin samoissa olosuhteissa, kannattavuus laski (siniset nuolet kuvassa 2E-ii) ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt (vihreät nuolet kuvassa 2E-iii ja 2E-iv). Näin ollen, yli-ilmentyminen c-Fos korreloi WA-indusoituvaa solukuolemaa PC-3. Se on edelleen vaikeasti, jos c-Fos on mukana määrittämiseksi solujen elinkelpoisuuden tai vain muuntaa solukuoleman tilassa apoptoosin kuolion vaikuttamatta solukuoleman induktioon. Emme voineet tutkia tätä DU-145, koska molemmat siGL2 ja siFos aiheutti solukuolemaa samalla tasolla.

c-Fos kykenee sen proapoptoottiset toimintoa PC-3 ja LNCaP osittain tukahduttaa ilmaus c- FLIP (L), joka me kutsuvat ”FLIP” jäljempänä [18]. FLIP taso pienensi WA kohtelu kaikissa soluissa testataan (kuvio 2B); vähentäminen FLIP oli erityisen merkittävä DU-145, erityisesti 24 tunnin kuluttua 2 uM WA käsittely (kuvio 2B, kaista 16), suhteessa vähennykset TIG-1, LNCaP ja PC-3 (kuvio 2B, kaistat 4 , 8, ja 12). Tämä havainto viittaa siihen, että WA välittämä solukuolema tapahtuu osittain alentuneen ilmentymisen FLIP. Western blot-analyysi osoitti, että taso FLIP ei ollut vähennetty siFos_Z käsittely PC-3 (kuvio 2C, kaista 6), kun taas siFos_X tai siFos_Y hoito pienensi hieman FLIP tasolla (kuvio 2C, kaistat 4 ja 5). In DU-145, FLIP taso samalla vähennetään käsittelemällä siControl tai siFos_Z (kuvio 2F, kaistat 3 ja 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että modulaatio c-Fos taso liittyy jotenkin, mutta ei suoraan vaikuta alennettu FLIP tasolla. Siitä huolimatta, eksogeeninen ilmentyminen FLIP in DU-145 pelastettu WA-solukuolema (kuvio 2G). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että WA aiheutti kaksi riippumatonta tapahtumaa, eli kasvu c-Fos tason ja vähentää FLIP tasolla, aiheuttaa solukuoleman.

ilmentäminen HSP geenien on sääteli jälkeen WA hoidon

Seuraavaksi, huomasimme, että 11 lämpöisku- proteiini (HSP) geenit (

HSPA6

,

DNAJA4

,

HMOX1

,

HSPA1B

,

HSPA1L

,

HSPA1A

,

DNAJB1

,

DNAJB4

,

HSPH1

, ja

SERPINH1

) olivat 45 parhaiten ajan geenien in PC-3 (S1 taulukko). HSP: t ovat molekyyli saattajia, jotka joutuvat nopean ja vahvan induktio stressi. PC-3 ja DU-145, HSPA6 oli yhtäkkiä sääteli 4 h kuluttua WA hoidon, kun taas TIG-1 ja LNCaP, taso HSPA6 proteiini oli erittäin alhainen (kuvio 3A). Sen sijaan ekspressiotasot DNAJA4 (Hsp40 jäljempänä) ja HSPA1B (HSP70 jäljempänä) osoitti vastaavaa vähitellen kasvaa näissä soluissa (kuvio 3A).

(A) Western blot analyysi havaitsemiseksi HSPA6, Hsp40, HSPA70, EGR -1, PAR-4, ja GAPDH (kuormituksen valvonta) TIG-1, LNCaP, DU-145, ja PC-3-solujen 0, 4, 8 ja 24 tunnin kuluttua 4 uM WA hoitoa. Nuoli osoittaa bändin bona fide EGR-1. (B) vaikutus siHSPA6 ilmaisun PC-3 solujen kasvua. (I) kaavamaisen tässä kokeessa. (Ii) Western blot-analyysi vahvistaa, että pudotus on HSPA6 proteiinin siHSPA6, suhteessa soluihin, käsiteltiin siGL2 (negatiivinen kontrolli). (Iii) vaikutus siHSPA6 ja siGL2 PC-3 solujen kasvua, tai ilman WA hoitoa. Arrow korostaa väheneminen PC-3 solujen kasvua. (C) vaikutus siHSF-1 ilme PC-3 solujen kasvua. (I) Kaavio tätä koetta. (Ii) Western blot-analyysi vahvistaa knockdovvn HSP proteiinin siHSF-1, suhteessa solujen käsitelty siGL2 (negatiivinen kontrolli), ja onko HSF-1 Knockdown vaikuttaa HSP proteiinin tasot osoittamalla HSPA6, Hsp40, HSPA70, ja GAPDH PC-3-solut. (Iii) vaikutus siHSF-1 ja siGL2 PC-3 solujen kasvun, kanssa tai ilman WA hoitoa. Arrow korostaa väheneminen PC-3 solujen kasvua. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen; pinkki, vihreä ja sininen nuolet osoittavat merkittävää laskua elinvoimaisten solujen (*,

P

0,05; **,

P

0,01).

Jotta alentaa HSPA6 proteiinin WA käsiteltyjä soluja, suoritimme siRNA-välitteisen knockdovvn PC-3 (kuvio 3B-i). Olemme vahvistaneet onnistunut Knockdown Western blottauksella (kuvio 3B-ii). Olemme kuitenkin havaittu vain vähän muutoksia solujen elinkelpoisuuden siHSPA6 käsiteltyjä soluja suhteessa käsiteltyjen solujen negatiivinen kontrolli-RNA (siGL2) (punaiset nuolet kuvassa 3B-iii), mikä viittaa siihen, että yliekspressio HSPA6 ei ole syy solukuoleman jälkeen WA käsittely.

seuraavaksi suoritetaan siRNA-välitteisen knockdovvn lämpöisku- kerroin proteiini 1 (HSF1), suuret transkriptiotekijä mukana ylös-säätely HSF geenien [26], käyttäen samanlaista koeasetelma (kuvio 3C-i). Western-analyysi vahvisti, että HSF1 pudotus käyttäen siHSF1 vähentynyttä ilmentymistä sekä HSF1 ja HSPA6 (kuvio 3C-ii). Sen sijaan tasot Hsp40 ja HSP70 pysyi muuttumattomana (kuvio 3C-ii), luultavasti koska suuri lähtötasolle endogeenisen Hsp40 ja HSP70 (katso kuvio 3A). Kuitenkin hoito PC-3-solujen kanssa siHSF1 lisääntynyt solukuolema (vihreä ja sininen nuolet kuviossa 3C-iii), mutta kasvu ei ollut näkyvissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tuntemattomien proteiinien ajan säätelee HSF1 suojata PC-3-solujen solukuolemaa vastaan.

neljä varhaisen kasvun vaste (EGR) geeniä rankattu 40 WA aiheuttama geenien (S1 taulukko) . Tasot EGR-1 ja EGR-3 pysyi vakiona seuraavat WA hoidon (S3 kuvassa); Siksi emme välittäneet näiden proteiinien myöhemmissä analyyseissä. Toisin kuin aiemman raportin [27], eturauhas- apoptoosin vaste-4 (PAR-4) ei ollut säädelty jälkeen WA hoitoa joko mRNA (vihreä nuolenpäitä S1 kuvassa) tai proteiinin taso (S3 kuvassa). Siksi nämä geenit voivat olla mukana määritettäessä solujen elinkelpoisuuden (katso kuva 1).

WA indusoi stressin vastaus aloitettu ER ja mitokondriot eturauhassyöpäsoluissa

WA indusoi apoptoosin välittämää ER stressiä ihmisen munuaisen karsinoomasolut [4] ja

Xenopus laevis

A6 munuaisen epiteelisolujen [28]. Gene ontologia analyysi DNA-siru data (S5 kuvio) käyttäen NextBio järjestelmä vahvisti, että kärkipään rikastettu geenin sarjaa sisälsi ER stressiin liittyviä UPR geenejä (ID, GO: 0006986; S4 kuvassa). Sen määrittämiseksi, ovatko ER stressin aiheutettiin eriasteisina TIG-1 ja PC-3 jälkeen WA hoidon, suoritimme western-analyysi 2, 4 ja 8 h kuluttua 4 uM WA hoitoa. PC-3, induktio CHOP ilmentymisen ja kaspaasi 3 ja PARP pilkkominen havaittiin, mikä viittaa siihen, että ER-stressi vasteen aktivoinnin kautta CHOP on tärkeää, (kuvio 4). Kuitenkin siRNA-välitteisen knockdovvn CHOP mukaan CHOP ei ole merkitystä, että kaspaasi 3 (S6 Kuva). Sen sijaan, fosforylaatio eIF2α on Ser51 oli tehoton, mahdollisesti heikon aktivoinnin PERK; näin ollen myötävirtaan tapahtumia, kuten kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen olivat tuskin havaittavissa TIG-1 (vasemmanpuoleisin paneelit kuvassa 4). Tämä heikko vaste ER stressi voi selittää, miksi TIG-1 on vastustuskykyinen WA hoitoon (katso kuvio 1 B). LNCaP, kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen ei havaittu 8 tuntia; Näin ollen tässä solulinjassa ER stressin vastaus aktivoitiin tasolle välimuoto kuin TIG-1 ja PC-3; vastus LNCaP WA saattaa johtua tästä viivästymisestä alavirran tapahtumia. Vaikka CHOP aiheutettiin jälkeen WA hoidon DU-145, pikku kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen havaittiin (oikeanpuoleisin paneelit kuvassa 4). Näin ollen, apoptoottista solukuolemaa DU-145 saattaa johtua pääasiassa lisääntyneestä c-Fos-ekspressiota ja vähentää FLIP ilmaisun sijasta ER stressin vastetta (katso kuvio 3).

(A) Western blot -analyysi havaita IRE -1α, PERK, pS51-eIF2α, CHOP, kaspaasi 3, PARP, BiP, ja GAPDH (kuormituksen valvonta) TIG-1, LNCaP, DU-145, ja PC-3-solujen 4, 8, ja 24 h kuluttua 4 uM WA hoito. NT: ei-käsitelty. (B) Kaaviokuva analysoitiin proteiinien apoptoottisen reitin aiheuttama ER stressiä. (C) tyypillisiä fluoresenssi kuvia TIG-1 (i), LNCaP (ii), PC-3 (iii), ja DU-145 (iv), joita oli käsitelty 4 uM WA: ssa 24 tuntia ja sen jälkeen käsiteltiin ROS detektioreagensseja käyttäen Image-se elää Green ROS Detection Kit. Sulautuneen kuvia näytetään sytoplasmisen ROS signaaleja (vihreät) ja tuman DNA signaaleja värjättiin Hoechst33342 (sininen). Green bar, 100 pm. Musta palkki, 10 um.

Ashwagandha

lehtien uute, joka sisältää WA aiheuttaa rintasyöpäsoluissa tuottaa ROS, joka on stressin vastaus aloitettu mitokondrioiden [29]. Tutkimme, jos potilaalle WA indusoi myös ROS sukupolvi eturauhasen syöpäsolujen ja normaalien fibroblastien jonka fluoresenssi koetin menetelmää. Olemme ensimmäinen vahvistettu havaitaan ROS-signaaleja, kun soluja käsiteltiin

tert

butyyli (TBHP), indusoija ROS: n syntyminen. Kaikki testatut solut osoittivat sytoplasmista signaaleja (vihreät) johdettu ROS tuotanto (S7A kuvio). Käsittelyllä 4 uM WA 24 tunnin, vain alhainen sytoplasman ROS havaittiin TIG-1 (kuvio 4B-i) ja KD (S7b kuvio), joka on samanlainen havainto aiemman raportin, TIG-3 tuottavat vähän ROS jälkeen WA hoidon [29]. Sitä vastoin, vahva ROS signaalit havaittiin LNCaP, PC-3, ja DU-145 (kuvio 4C-ii, -III, ja-iv). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TIG-1 ja KD, toisin kuin LNCaP, PC-3, ja DU-145, ei ole kertynyt ROS jälkeen WA hoidon, joka saattaa selittää sen, miksi TIG-1 ja KD ovat vastustuskykyisiä WA.

WA indusoi BAG3 välittämää autophagy PC-3-solujen

WA indusoi autophagy rintasyöpäsoluissa, mutta niiden yksityiskohtainen mekanismi on edelleen heikko [30]. Meidän DNA-siru data (S1 taulukko) osoitti, että mRNA-tasolla Bcl-2-liittyvä athanogene 3 (BAG3), jäsen BAG yhteistyössä kaperoni- perheen sekaantunut autophagy [31], on säädelty jälkeen WA hoidon. Siten, tutkimme WA aiheuttama autophagy PC-3 ilmaisemalla EGFP-tagged mikrohaaroihin liittyvä proteiini kevyt ketju 3 (LC3), joka on autophagy merkkiaine, joka nimenomaan etiketit autophagosomal kalvot [32]. Todellakin, EGFP-LC3 puncta esiintyi sen jälkeen, kun 2 uM tai 4 uM WA jälkeen (kuvio 5A) taajuudella samanlainen kuin seerumin puutteessa-soluissa (kuvio 5B).

A) tarkkailu EGFP ja EGFP-LC3 signaalit immunofluoresenssimikroskopialla. Bar, 10 pm. (B) Bar kaavioita solujen prosenttiosuutta, jotka sisältävät pistemäisiä EGFP-LC3; nuolet osoittavat, että arvot asteittain alla ilmoitettu olosuhteissa. Data esitetään keinona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta; Vihreät nuolet osoittavat tilastollisesti merkitsevää (**,

P

0,01). (C) Western blot analyysi havaitsemiseksi LC-3 ja GAPDH (kuormituksen valvonta) PC-3 mukaisesti ilmoitettu olosuhteissa. (D) Bar kaavioita solujen elinkelpoisuuden (%) alla esitettyjen tilojen. (E) Western blot -analyysi havaitsemiseksi BAG3, LC-3, ja GAPDH (kuormituksen valvonta) PC-3-solut, kun läsnä on ilmoitettua olosuhteissa siBAG3 tai siGL2 (negatiivinen kontrolli). (F) Bar kaavioita solujen elinkelpoisuuden (%) on ilmoitettu olosuhteissa. (D, F) Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen; punaiset nuolet osoittavat tilastollisesti merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden (**,

P

0,01). (A-F) Näytteitä kerättiin 4 tunnin kuluttua WA hoidon. (G) Expression profiilit autophagy liittyvien proteiinien BAG3 ja LC3 PC-3-solujen 4, 8, ja 24 tuntia hoidon jälkeen ja 4 uM WA. NT: ei käsitelty.

Voit selvittää WA välittämä autophagy vaikuttaa solujen elinkykyä, lisäsimme farmakologinen inhibiittorit luokan III fosfatidyyli 3-kinaasien, 3-metyyliadeniinin (3-MA) ​​tai wortmanniini, joka tukahduttaa kanoninen autophagy, PC-3-solujen läsnä ollessa (+) tai puuttumista (-) 4 uM WA hoitoon. Western-analyysi osoitti, että WA aiheuttama LC3 ilmaus riippumatta läsnäolon 3-MA tai wortmanniini (kuvio 5C). Lisäksi kumpikaan lääke tukahdutti väheneminen solujen elinkelpoisuuden (kuvio 5D).

Koska BAG3 aktivoi noncanonical autophagy aikaansaama proteasomiestäjät kuten MG132 [33], me tutkimme, siRNA-välitteisen knockdovvn BAG3 vaikuttaisi PC- 3 solujen elinkykyä. siBAG3 onnistuneesti tukahdutti BAG3 ilmaisu verrattuna siGL2, negatiivinen kontrolli (yläpaneelissa Kuva 5E). Kuten odotettua, LC3 ilmentyminen vaimeni siBAG3 jälkeen joko hoidon DMSO, 2 uM MG132, 20 uM MG132 tai 4 uM WA (keskimmäinen paneeli kuviossa 5E). Lisäksi solujen elinkelpoisuus väheni siBAG3 seuraavat WA jälkeen (kuvio 5F), mikä todennäköisesti johtuu inhibition anti-apoptoottisen aktiivisuuden BAG3. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että WA aiheuttama BAG3 välittää noncanonical autophagy, joka suojaa PC-3-solujen solukuolemaa vastaan.

Western blot-analyysi osoitti, että intensiteetti ~ 70 kDa: n vyöhyke BAG3 (nuoli kuviossa 5G) aleni TIG-1 24 tunnin kuluttua WA hoidon (kuvio 5G, kaista 4), kun taas sen taso oli jo korkea (kaistat 9 ja 13) ja muuttumaton jälkeen WA hoidon PC-3 (kaistat 10-12) ja DU-145 (kaistat 14-16). Lisäksi ~ 62 kDa bändi BAG3 (oletetun prosessoidun muodon BAG3) oli näkyvästi lisääntynyt PC-3 ja DU-145 (nuolenkärki kuvassa 5G); se on edelleen heikko, jos 62 kDa BAG3 on aktiivisempi kuin 70 kDa BAG3 tai ei ole käytössä. Nämä tulokset osoittavat, että BAG3 proteiini taso on korkeampi PC-3 ja DU-145 kuin TIG-1 ja LNCaP. Tästä huolimatta LC3 taso oli alhainen PC-3 ja DU-145 (keskimmäinen paneeli kuviossa 5G), mikä viittaa siihen, että sääntelyn mekanismi, joka liittää BAG3 aktiivisuutta ja LC3-II tuotanto muuttui näissä soluissa. Itse asiassa äskettäin raportti osoitti, että DU-145 voi tuottaa LC3-II johtuu geneettisestä heikentyvän autophagy koulutusjakson [34]. Sen sijaan LC3 ilme oli korkea TIG-1 ja LNCaP (keskimmäinen paneeli kuvassa 5G). On vielä tarkasteltava, jos nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä solut ovat jotenkin suojattu WA-solukuolema samanlainen suojaa Caco-2-soluja oksaliplatiinia solukuolema [35].

TIG-1 ja PC-3 näytteille erillisiä malleja subsellulaarinen vimentiinista lokalisointi seuraavat WA hoidon

WA kumppaniaan vimentiinista ja aiheuttaa nopean uudelleenjärjestely vimentiinista välikokoinen säie (VIF) otetaan perinuclear aggregaatteja BJ-5ta ihmisen fibroblastit [12]. Vaikka mRNA tasot vimentiinista olivat korkeat ja muuttuneet annettaessa WA hoidon TIG-1, LNCaP, PC-3, ja DU-145 (mustat nuolet S1 kuvassa), western-analyysi osoitti, että vimentiinista proteiini tasot olivat koholla seuraavat WA hoidon PC- 3 (kuvio 6A). Sen sijaan vimentiinistä taso oli jo korkea ennen WA hoitoa, ja pysyi korkeana, DU-145 (kuvio 6A). TIG-1 vimentiinistä taso aleni, pilkkominen tuotteiden vimentiinista [10] ilmeistä 24 h (nuolenpäitä kuvio 6A), kun taas mitään vimentiinistä detektoitiin LNCaP (kuvio 6A). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​sen kanssa, että PC-3, mutta ei LNCaP, koki EMT hankkia vimentiinista ilmaisua.

(A) Western blot analyysi havaitsemiseksi vimentiinista ja aktiini TIG-1, LNCaP, PC 3, ja DU-145 4, 8, ja 24 tuntia hoidon jälkeen 2 uM tai 4 uM WA. NT: ei-käsitelty. (B) Tyypillinen kuvia TIG-1 (i) ja PC-3 (ii) on värjätty anti-vimentiinista vasta-phalloidin (F-aktiini) ja Hoechst 33342 (DNA) 2, 4 ja 6 (h ) jälkeen WA hoidon. NT: ei-käsitelty. Pinkki ja keltainen nuolten colocalized vimentiinista ja F-aktiini aggregaatteja. Sulautuneen kuvat näkyvät alarivissä. Bar, 10 pm. (C) Osuus kaikista havaittu sisältävien solujen pisteiden yhdistettyjä tai ei-yhteen vimentiinista näkyvät TIG-1 (i) ja PC-3 (ii). Solut, yli 10 vimentiinista aggregaatteja pisteytettiin ”yhteen”, kun taas solujen ei-yhteen vimentiinista pisteytettiin ”ei-yhteen”. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen; tähdellä osoittavat tilastollisesti merkittäviä muutoksia solujen elinkelpoisuuden (**,

P

0,01; ***,

P

0,001). (D) Jasplakinoloide (JSP) eivät vaikuttaneet PC-3 solujen elinkykyä. (I) Kaavio koesuunnitelmasta. (Ii) Bar kaavioita solujen elinkelpoisuuden (%), kun läsnä (+) tai puuttumista (-) 4 uM WA tai Jasp 8 h lisäämisen jälkeen WA. NT: ei-käsitelty. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pinkki, sininen ja vihreä nuolet osoittavat tilastollisesti merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden (*,

P

0,05; **,

P

0,01).

Immunovärjäys 2, 4 ja 8 h kuluttua 4 uM WA hoito aiheutti vimentiinista aggregaatiota ympärillä solukalvon TIG-1 (vaaleanpunainen nuolet, kuvio 6B-i). Sen sijaan, PC-3 näytteillä homogeeninen jakautuminen vimentiinista, joilla ei ole tällaista aggregaatteja (kuvio 6B-i ja 6B-ii); Tämä viittaa siihen, että vimentiinista ilmaisi jälkeen EMT PC-3 palvelee eri funktio kuin se mesenkyymisolujen. Huomattavaa on, että sytoplasminen tilavuus PC-3 on pienempi kuin TIG-1. Prosenttiosuus -solut näiden aggregaattien kasvoi näkyvästi TIG-1 (kuvio 6C-i) suhteessa PC-3 (kuvio 6C-ii).

Immuno-elektronimikroskopiaa paljasti vimentiinista signaalit sijoitusrahastojen sytoplasmaan puuttuminen WA hoidon (S8A kuvio), vahvistaa mesenkymaaliset alkuperää TIG-1. Erityisesti, monet vimentiinistä signaalit siirretään reuna-alueelle sytoplasmassa lähellä solukalvon, on kuvio, joka näkyy, kun läsnä on edellä mainittujen vimentiinista aggregaatteja (katso kuvio 6B-i), sen jälkeen 4 h 4 uM WA hoitoon (S8B kuvio) . Sitä vastoin, vain harva vimentiinistä signaalit havaittiin PC-3 ilman WA hoidon (S8C kuvio);