Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on jäsen ErbB perheen reseptorityrosiinikinaasit. EGFR aktivoidaan sitoutuessaan esim. epidermaalinen kasvutekijä (EGF), mikä johtaa solun selviytymisen, proliferaatio ja migraatio. EGFR yliaktivoituminen liittyy syövän etenemiseen. Olemme aiemmin osoittaneet, että pieni annos UVB valaistus syöpäsolujen yli-ilmentävät EGFR ennen lisäämistä EGF pysähtyi EGFR signalointireitin. Olemme tässä osoittavat, että UVB valaistuksen solunulkoisen domeenin EGFR (sEGFR) indusoi proteiinia konformaatiomuutoksia, disulfidisilta rikkoutuminen ja muodostumista tryptofaanin ja tyrosiinin valolle, kuten dityrosine, N-formylkynurenine ja kynureniini. Fluoresenssispekroskopian, ympyrädikroismilla ja terminen tutkimukset vahvistavat esiintyminen konformaatiomuutoksia. Immunomääritystä on vahvistanut, että UVB valo aiheuttaa rakenteellisia muutoksia EGR sitoutumiskohdassa. Monoklonaalinen vasta-aine, joka kilpailee EGF sitoutumisesta sEGFR käytettiin. Me raportoimme selkeää näyttöä siitä, että UVB valo aiheuttaa rakenteellisia muutoksia EGFR, joka haittaa oikea sitoutumisen EGFR spesifistä vasta-ainetta, joka kilpailee EGF sitoutumisesta EGFR, joka vahvistaa, että 3D-rakenne EGFR sitova domeeni kärsi konformaatiomuutoksia UV valaistus. Säteilyn käytetty on samaa suuruusluokkaa kuin integroitu intensiteetti auringon UVB-alueella. Uuden fotoni teknologia poistaa avain-reseptorin ja on todennäköisesti sovellettavissa hoidettaessa erilaisia ​​syöpätyyppejä, yksin tai yhdistelmänä muiden hoitojen kanssa.

Citation: Correia M, Thiagarajan V, Coutinho I, Gajula GP, Petersen SB, Neves-Petersen MT (2014) Modulointi rakenne EGFR UV Light: New mahdollisuuksia Cancer Therapy. PLoS ONE 9 (11): e111617. doi: 10,1371 /journal.pone.0111617

Editor: Federico Quaini, University-sairaala Parma, Italia

vastaanotettu: toukokuu 18, 2014; Hyväksytty: 06 lokakuu 2014; Julkaistu: 11 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Correia ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: MC myöntää tukea ”Fundaço para a Ciência e Tecnologia” (FCT) varten PhD apurahan (SFRH /BD /61012/2009) tukevat ”Programa Operacional Potencial Humano ”(POPH) puitteissa” Quadro de referencia Estratégica Nacional ”(QREN) ja osarahoittaa Euroopan sosiaalirahastosta (” Fundo Social Europeu ”, FSE). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erbB reseptorin (RTK: t) on keskeinen rooli säätelyssä normaalissa solun prosesseissa, kuten solujen selviytymistä, proliferaatiota ja muuttoliike [1], [2] ja on ratkaiseva rooli kehityksessä ja etenemisessä syövät [3]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR; erbb1) on tämän perheen jäsen [4]. EGFR sitoutuminen ligandeihin, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF) tai transformoiva kasvutekijä alfa (TGF-α) johtaa reseptorin dimerisaatiota ja aktivointi solunsisäisen tyrosiinikinaasidomeeni [1], [2]. Solunulkoista domeenia EGFR (sEGFR, liukoinen solunulkoinen alue EGFR) käsittää 4 aliverkkotunnuksissa: 2 isoa homologisia sitovat domeenit (I ja III), ja 2 homologisia furiinin kaltaista kysteiinirikasta domeenia (II ja IV). Verkkotunnukset I, II ja III on todettu olevan suoraan osallisena ligandin sitoutumisen ja dimeerimuodostus jotka edeltävät mekanismi signaalitransduktion RTK [1], [5], [6]. Syövän etenemisessä on korreloitu kasvu määrä EGFR-molekyylien solun pinnalla [7]. Korkea ilmentyminen EGFR liittyy yleensä invaasio, etäpesäkkeitä, myöhäisvaiheen tauti, kemoterapia vastus, hormonihoito kestävyys ja huono yleiskunto hoitotulokseen. EGFR yli-ilmentyminen on havaittu olevan vahva prognostinen indikaattori pään ja kaulan, munasarjan, kohdunkaulan, virtsarakon ja ruokatorven syöpiä, vaatimaton prognostinen indikaattori rinta-, peräsuolen, maha- ja kohdun limakalvon syöpä ja heikko prognostinen indikaattori ei-pienisoluisen keuhkosyövän syöpä [7]. EGFR on tavoite monien kemoterapeuttiset lähestymistapoja koska EGFR aktivaatio johtaa solun signa- jotka edistävät kasvaimen kasvua. EGFR-toiminto on sen vuoksi järkevä hoito lähestymistapa. Tyypillisiä kemoterapeuttiset aineet ovat EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit, jotka kilpailevat ATP: n solunsisäisen tyrosiinikinaasidomeeni, ja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), jotka estävät ligandi-sitoutumisen tai reseptorin dimerisaatio. Tukkiminen EGF: n sitoutumista EGFR voi poistaa syövän leviämisen, invaasio, etäpesäke, angiogeneesi ja apoptoosin estämisestä [8].

Olemme aiemmin raportoitu, että UVB valaistus (280 nm, 0,35 W /m

2 30 min) syöpäsolujen yli-ilmentävät EGFR johti pidätykseen EGFR signalointireitin [9]. Proof-of-concept on dokumentoitu Solulinjoihin A431 (ihmisen epidermoidikarsinooman solut) ja Cal39 (johdettu ihmisen häpy levyepiteelisyöpä soluja). Säteilyn käytettiin alhaisempi kuin yhteen UVB auringon irradianssin [10]. UVB estää EGF indusoimaa aktivoitumista EGFR, poistaa fosforylaatio EGFR solunsisäisen domeenin ja muiden keskeisten alavirran signalointia proteiinit, kuten AKT (Protein Kinase B) ja mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasien (ERK1 ja 2). AKT: lla on keskeinen rooli esimerkiksi glukoosiaineenvaihduntaan, apoptoosin, soluproliferaatiota, transkription ja solujen vaeltamiseen. AKT on mukana solun eloonjäämisen reitit estämällä apoptoottisia prosesseja [11] – [16]. ERK kinaasit toimivat signalointiryöpyn joka säätelee solujen prosessit, kuten proliferaatiota, erilaistumista, ja solusyklin etenemisen [17].

Yksi mahdollinen syy havaittu UV-valon aiheuttamaa pidätyksen EGFR signalointireitin on UVB aiheuttama valokemia, mikä konformaatiomuutoksia EGFR jotka todennäköisimmin estävät oikea sitoutuminen EGF. Meidän edellinen työ UVB indusoi fotokemian proteiineja (aallonpituuksilla käytetään 275-295 nm) [18] – [22] tukee tätä hypoteesia. UVB heräte aromaattiset tähteet proteiineissa johtaa häiriöihin disulfidisiltoja ja muodostumista valolle, kuten N-formylkynurenine (NFK), kynureniini (Kyn) [23], [24] ja dityrosine (DT) [25] – [27] (katso kuvio 1). Tällaiset reaktiot todennäköisesti aiheuttaa rakenteellisia muutoksia proteiineja, jotka voivat heikentää niiden toimintaa [22]. Proteiinit, jotka ovat runsaasti aromaattisia tähteitä ja disulfidisiltaa ovat todennäköisesti rakenteeltaan huomattavasti heikentynyt, kun pitkäaikainen UVB heräte. sEGFR on erittäin runsaasti disulfidisiltojen verrattuna luonnolliseen keskimääräinen runsaus disulfidisiltojen proteiinia rakenteissa koosta sEGFR, kuten näkyy tuloksissa osiossa. Että% disulfidisiltojen in sEGFR on noin 13 kertaa suurempi kuin odotettua proteiinia kokonsa. Odotettu keskimääräinen tulokset on aiemmin raportoitu ryhmämme kun kattava analyysit ominaisuuksia disulfidisiltojen läsnä 131 ei-homologisen yksiketjuinen proteiini rakenteita [28]. Lisäksi solunulkoinen domeeni sEGFR on 40 aromaattiset tähteet ja 25 disulfidisiltaa per monomeeri, ja monet aromaattiset tähteet ovat lähellä disulfidisiltoja (katso kuvio 2). Näin ollen on todennäköistä, että UV-valo tämän proteiinin johtaa disulfidisillan rikkoutuminen ja valolle. Tämä hypoteesi testataan tämänhetkiseen paperia.

(A) Crystal rakenne EGFR solunulkoisen alueen (1ivo.pdb, ketju A) [1]. Disulfi- sillat ja aromaattiset tähteet atomeja näytetään CPK: SS siltoja keltainen, Trp vihreä, Tyr violetilla (kokeile 246 ja Tyr 251 näkyvät vaaleanpunainen) ja Phe syaani. 18 yhteensä 25 SS siltoja, 5 out of 6 Trp jäämiä, 13 ulos 16 Tyr jäämiä ja 17 ulos 18 Phe jäämiä näkyvät koska jotkut tähteet puuttuvat ATE tiedosto. (B) Kiderakenne on 01:01 välisen kompleksin ihmisen EGF ja dimeerinen muoto EGFR solunulkoisen domeenin (1ivo.pdb, ketju A ja B ja 2 EGF-molekyylit [1]). EGF näkyy punaisena. (C) Zoom osaksi rajapinta-alueen läsnä dimeerisen EGFR (solunulkoisten domeenien). Etäisyydet joukossa joitakin aromaattiset tähteet ja lähellä disulfidisillat näkyvät myös. (D) Crystal rakenne 01:01 välisen kompleksin ihmisen EGF ja dimeerinen muoto EGFR solunulkoisen domeenin. (1ivo.pdb, ketju A ja B ja 2 EGF molekyylit [1]) EGF näkyy punaisena. Oikeanpuoleisessa paneelissa kaikki atomit näytetään CPK. EGF laiteliitännälle sEGFR sisältää kalliin ei-kovalenttisilla yhteyksiä.

katsoo vaaroista liialliselta auringonvalolta ovat hyvin tiedossa, vähemmän huomiota on kiinnitettävä terveyshyötyjä UV-altistuksen. Vaikutuksia UV-valon biomolekyylien, soluissa ja kudoksissa, riippuu syötetyn energian pinta-alayksikköä kohti. UVB (280-315 nm) säteily on osallistuu pääasiassa D-vitamiinin tuotantoa, joka on suojaava vaikutus paksusuolen, eturauhasen, ja rintasyövän [29], [30]. Altistuminen auringonvalolle pieninä annoksina on myös yhdistetty parannettu syövän eloonjäämisaste [31], [32]. UV-valoa on käytetty menestyksellisesti hoitaa riisitautia, psoriasis, lupus vulgaris, vitiligo, atooppinen ihottuma ja paikallinen skleroderma ja keltaisuus (World Health Organization. Tunnetut terveysvaikutukset UV.

Ultrav. Radiat. Intersun Program. – FAQ

at https://www.who.int/uv/faq/uvhealtfac/en/index1.html). Ei ole suoraa ja ratkaisevia todisteita siitä, lisääntynyt riski ihosyöpä UVB hoitoja psoriasis jos säteilyannoksia noudatetaan. UV-valo on parhaillaan käytetään hoitamaan ihon T-solulymfooman (American Cancer Society, 2011 at https://www.cancer.org). Tämä hoito on parannettu Food and Drug Administration (FDA, USA). Suojaavia vaikutuksia säännöllisesti viikonlopun auringolle altistumisen on raportoitu, erityisesti kun on kyse raajan kasvainten [33]. Melanooma esiintyy useammin ihmisiä, joilla on uima-ammateissa kuin ihmisten keskuudessa, joilla ulkoiluun (ilman auringonpolttama) kuten viljelijöiden, kalastajien ja lapset, jotka leikkivät ulkona [34], [35]. Ihosyöpä on yhä kasvussa, mutta tämä on seurausta altistumisesta UV-valon sekä akuutti yliannostus (aiheuttaa auringonpolttama) ja elinikäisen kumulatiivinen altistus [36]. Se on lähinnä UVB osa auringon säteily, joka antaa punoitus, melanogeneesiprosessin (melaniinin tuotantoa, joka toimii aurinkosuoja suojaavat DNA valon aiheuttaman vaurion ja punoitus), D-vitamiinin synteesin, ja ei-melanooma ihosyöpä, kun melanooma todennäköisesti aiheuttaa UVA [37]. Jones et al (1987) havaitsivat, että yksi UVA aallonpituuksilla, 365 nm oli korkein mutageeninen [38]. UVA sujuvuus hinnat ovat useita kertoja suuremmat solariumit kuin siinä tapauksessa suoran auringonsäteilyn [39]. Yllä olevat esimerkit dokumentoida että terveysvaikutukset UV-säteilyn ovat annoksesta ja riippuu aallonpituudesta.

tavoitteena nykyinen työ on tutkia, jos pienellä annoksella UVB valo voi aiheuttaa rakenteellisia muutoksia EGR sitoutumiskohdassa EGFR heikentävän oikea sitovia molekyylejä, kuten spesifisen vasta-aineen, joka on tunnettu kilpailla EGF EGFR sitoutumisen. Jos havaitaan, tämä antaa meille tietoa miksi UVB valaistus (280 nm) syöpäsolujen yli-ilmentävät EGFR johti pidätykseen EGFR signalointireitin [9]. UVB säteilyvoimakkuus käytetty on samaa suuruusluokkaa kuin koko säteilyvoimakkuus auringon UVB. Fluoresenssispekroskopian ja ympyrädikroismilla tehtiin tutkimuksia, jotta voidaan havaita UVB indusoi konformaatiomuutoksia. Terminen kehittymässä tutkimuksia on tehty, jotta voidaan määrittää sulamispistettä proteiinin ennen ja jälkeen valaistus. Valon aiheuttamia rikkoutuminen disulfidisiltoja on määrällisesti ja muodostumista Trp /Tyr valolle on havaittu. Sitova immunomääritys suoritettiin, jotta päätellä vaikutusten UVB valaistuksen rakenteesta EGR sitoutumiskohdan. Tutkimuksemme osoittaa, että matalan annoksen UVB (280 nm) valaisu sEGFR indusoi rakenteellisia muutoksia EGFR sitovan domeenin että heikentynyt sitoutuminen tietyn vasta-aineen tiedetään kilpailla EGF EGFR sitoutumisen kyseisen verkkotunnuksen. Me puuttua myönteisiä vaikutuksia UV-valon, sen läsnä soveltaminen sairauksien hoidossa ja potentiaalin otaksuttu uusi fotoni terapian paikallisten kasvainten liittyy yliekspressio UV herkkä solujen reseptoreita.

Tulokset

kolmiulotteisen rakenteen monomeerisen ja dimeerisen sEGFR

kuviossa 2A näytetään 3D-rakenne monomeeristen sEGFR (1ivo.pdb, ketju A) sitoutuu epidermaalisen kasvutekijän (EGF, punainen) . sEGFR sisältää 25 SS siltoja, 6 Trp jäämät, 16 Tyr jäämät, ja 18 Phe jäämiä, näytetään CPK: SS siltoja keltainen, Trp vihreä, Tyr violetilla (Tyr246 ja Tyr251 vaaleanpunainen) ja Phe syaani. 18 yhteensä 25 SS siltoja, 5 out of 6 Trp jäämiä, 13 ulos 16 Tyr jäämiä ja 17 ulos 18 Phe jäämiä näkyvät koska jotkut tähteet puuttuvat ATE tiedosto. Useat aromaattiset tähteet sijaitsevat lähellä sijainnin läheisyys SS joukkovelkakirjoja.

Kuviossa 2B näkyy 3D-rakennetta EGFR dimeerin (1ivo.pdb, ketjut A ja B) muodostuvat sitova EGF (punaisella). Dimeeri käyttöliittymä on runsaasti disulfidisiltoja ja aromaattiset tähteet (Fig. 2B). Jäännökset Tyr246 ja Tyr251 (kuvio 2B, vaaleanpunainen) yhdestä ketjun, kietoutuvat samoja jäämiä toisen ketjun. Zoomaus johonkin ketjujen näkyy kuvassa 2C ja etäisyydet aromaattiset tähteet ja disulfidisiltaa näkyvät. EGF laiteliitännälle EGFR näkyy kuvassa 2D (EGFR monomeeri). Vuorovaikutus EGFR ja EGF näyttää olevan voimakkaasti riippuvainen Van der Waalsin vuorovaikutukset. Jotkut ne yhteisvaikutukset ovat π-π vuorovaikutusta, kuten vuorovaikutusta Phe357 (syaani) on sEGFR ja Tyr13 (violetti) EGF (5 A).

Protein bioinformatiikan

kuviossa 3 näytetään osa disulfidisiltojen läsnä sEGFR ja riippuvuuden keskimääräisen osa disulfidisiltoja proteiinien ketjun pituus [28]. Odotettu keskimääräinen osa disulfidisiltojen proteiinien kanssa sekvenssin pituus on 600-650 jäämien on ~0.3%, kun taas sEGFR (622 aa) on ~ 4%, mikä vahvistaa, että tämä proteiini on erittäin runsaasti disulfidisiltoja. Odotettu keskimääräinen Tulokset on aikaisemmin raportoitu ryhmämme kun tekee kattavan analyysin ominaisuuksia disulfidisiltojen läsnä 131 ei-homologisen yksiketjuinen proteiini rakenteita [28].

osa disulfidisiltojen laskettiin koska määrä disulfidisiltoja löydetty proteiini jaettuna proteiinin sekvenssin pituus (aminohappojen lukumäärä) x 100. osa disulfidisiltoja läsnä monomeerinen solunulkoisen domeenin EGFR näytetään.

steady State fluoresenssi

fluoresenssiemissiovoimakkuudessa sEGFR 350 nm alenee kun jatkuva 280 nm: n virityksellä (kuvio 4A). Kineettinen jälki on parhaiten asentaa bieksponentiaalisen mallin (kuvio 4A ja menetelmät). Root mean square error R

2 oli 0,99774. Arvot talteen asentamisesta C1 ja C2 oli 367240,44 ± 1182,23 ja 208449,95 ± 1054,90, vastaavasti. Nopeusvakioihin fluoresenssiemissiovoimakkuudessa lasku K1 ja K2 varustettu arvot olivat 117,63 ± 0,71 min-1 ja 12.20 ± 0,10 min-1, vastaavasti.

(A) fluoresenssiemissiovoimakkuudessa kinetiikkaa 350 nm ihmisen solunulkoisen EGFR (sEGFR) näyte aikana 75 min UV valaistus 280 nm: ssä. (B) fluoresenssiemissiospektrit of sEGFR näytteiden jälkeen saatu 295 nm: n virityksellä jälkeen 280 nm: n valaistus 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min. (C) fluoresenssivirityk- spektrit sEGFR tallennetut näytteet päästöjä kiinteä 334 nm: n virityksellä jälkeen 280 nm: n valaistus 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min.

Emission Spectra (eksitaatio 280 nm ja 295 nm).

emissiospektrien sEGFR rekisteröitiin kun 280 nm: n virityksellä ennen ja jälkeen jatkuva 280 nm valaistus (15 min, 30 min, 45 min ja 75 min 2,5 W /m

2) (ei esitetty). Pieneneminen intensiteetti fluoresenssiemissio ~337 nm, jossa Trp ja Tyr päästävät, havaitaan koska jatkuva valaistus. Päästöjen intensiteetti 337 nm pienenee 43% ja 74% 15 minuutin kuluttua ja 75 min jatkuvan 280 nm valaistus, vastaavasti. Aallonpituus voimakkaimman piikin keskitetty 337 nm: ssä pysyy vakiona.

emissiospektrit sEGFR tallentaa ne 295 nm: n virityksellä ennen ja jälkeen jatkuvasti 280 nm: n valaistus (15 min, 30 min, 45 min ja 75 min ) on esitetty kuviossa 4B. Pieneneminen intensiteetti fluoresenssiemissio ~337 nm, jossa Trp lähettää, on havaittu. Päästöjen intensiteetti sEGFR at 337 nm pienenee 42% ja 77% 15 minuutin kuluttua ja 75 min jatkuvan 280 nm valaistus, vastaavasti. Aallonpituus voimakkaimman piikin keskitetty 337 nm havaitaan punaisen siirtyminen 343 nm jälkeen 75 min valaistuksen.

Viritysjärjestelmät Spectra (emissio 334 nm).

Kuvassa 4C on näytetään magnetointi spektrit sEGFR kanssa fluoresenssiemission vahvistetaan 334 nm, ennen ja jälkeen jatkuva 280 nm valaistus proteiinin eri aikaväleillä: 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min. Trp ja Tyr imeytymistä edistää tätä taajuuksia. Jatkuva 280 nm valaistuksen johtaa asteittainen lasku fluoresenssivirityk- intensiteettiä. 15 min kuluttua, ja 75 min valaistuksen, heräte intensiteetti 282 nm: ssä laskee 40% ja 71%, vastaavasti. Kirjeenvaihtaja normalisoitu heräte spektri (ei kuvassa) osoita mitään muutosta aallonpituudella maksimi viritysintensiteetissä (~282 nm).

Fluoresenssi pohjainen proteiini terminen kehittymässä tutkimuksia.

fluoresenssiemissiovoimakkuudessa 330 nm (ilman. 295 nm) tuoretta sEGFR näyte (ei illum.) ja valaistu sEGFR näyte (75 min 280 nm) seurattiin 4 ° C: sta 90 ° C: ssa ja 90 ° C: sta 4 ° C: ssa (ks kuva 5). Sekä näytteet fluoresenssiemissiovoimakkuudessa vähenee kuumennettaessa. Siirtyminen välillä 65-75 ° C on havaittu ei-valaistu sEGFR. Data on asennettu käyttämällä modifioitua Boltzmannin (katso menetelmät). Root mean square error asentamiseksi R

2 oli 0,99774. Arvot talteen istuva

1,

B

1,

2,

B

2 ja

dx

olivat 1,06202 ± 0,0014, 0,45482 ± 0,02255, -0,00426 ± 5.41E-04, -0,00296 ± 2.72E-04 ja 1,74 ± 0,17, tässä järjestyksessä. Talteen parametri

x

0 (69,7 ° ± 0,24 ° C C) vastaa puolivälissä siirtymisen, so sulamislämpötilan proteiinin. Tämä arvo on yhtä mieltä käännepiste arvoja toinen derivaatta sovitetun datan (ei esitetty). Toinen derivaatta on nolla (käännepiste) väliltä 68,3-69,2 ° C. Tällainen siirtymä ei havaittu valaistun näytteen. Lisäksi ei siirtymä havaitaan molempien näytteiden jäähtyessään proteiinia 90 ° C-4 ° C.

Non valaistut (non illum.) Ja UV valaistut (illum. 75 minuuttia) ihmisen solunulkoinen EGFR (sEGFR ) näytettä kuumennettiin 4 ° C: sta 90 ° C: ssa. Asennettu arvot (ei valaistu näyte) saatiin käyttämällä modifioitua Boltzmannin (katso tulokset jakso). Siirtyminen puolivälissä toipunut asentamisesta oli 69,72 ± 0,24 ° C.

Aika ratkaistu fluoresenssi.

hajoaminen kertaa (τ

i) ja pre-eksponentiaalinen tekijät (

f

i) toipunut aika ratkaista intensiteetti vaimenee torjunta- sEGFR näyte (75 min pimeässä, negatiivinen kontrolli, NC) ja valaistu sEGFR näyte (illum. 75 minuuttia 280 nm: ssä) pH-arvossa 7,5 on esitetty taulukossa 1. Kuvio 6 esittää kokeelliset tiedot, sopivuutta ja jäännökset olettaen kolme käyttöikä hajoaa varten sEGFR kontrollinäytteestä (NC). Arvo χ

2 laski huomattavasti, kun edeten yhden eliniän komponentin sovitus kaksi ja kolme komponenttia. Fluoresenssi keskimääräinen käyttöikä sEGFR on esitetty taulukossa 1. Ei-valaistu sEGFR näyttää kolme vaikutusajat: 1,04 ns, 2,74 ns ja 6,23 ns intensiteetillä jakeet 25,6%, 53,1% ja 21,1%, tässä järjestyksessä. Valaistuksessa osuus lyhin eli 1,04 ns lajeja nousi 25,6%: sta 30,6%, osuus on 2,74 ns laji pidettiin vakiona ja panosta enää elivät laji laski 21,1%: sta 16,4%. Lisäksi elinikä pidempi eli komponentti kasvoi 6,2 ns 7,0 ns kun elinikä muut kaksi komponenttia pysyi vakiona.

Aika-ratkaistu intensiteetin rappeutuminen tiedot, istuva käyrä ja jäännökset saadaan käyttämällä ISS rutiini ohjaus sEGFR näyte (säilytetään pimeässä 75 min, negatiivinen kontrolli, NC).

Viritysjärjestelmät Spectra (emissio 400 nm).

kuviossa 7A näytetään viritys- spektrit (emissio 400 nm) saatu ennen ja jälkeen jatkuva 280 nm valaistus (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 62 min ja 75 min). Spektrit rekisteröitiin varmistaakseen läsnäolon NFK, dityrosine ja Kyn (Fig. 1). Taulukossa 2 näytetään niiden absorbanssin ja fluoresenssiemissio ominaisuuksia. Ajankohtana 0 minuuttia, yksi heräte huippu havaitaan keskitetty ~281 nm. Sen voimakkuus vaimenee kun UV valaisu sEGFR, vähenee 52%, kun 75 min. Kuitenkin valaisu sEGFR johtaa kasvua fluoresenssivirityk- edellä 305 nm. 75 minuutin kuluttua, loisteputki viritysintensiteetissä kasvoi 115% 315 nm, jossa dityrosine maksimaalisesti absorboi (Abs

max 316 nm, [40], katso taulukko 2), 149%: iin 322 nm, jossa NFK maksimaalisesti absorboi (Abs

max 321 nm, [23], katso taulukko 2) ja 173% 360 nm: ssä, jossa Kyn maksimaalisesti absorboi (Abs

max 360 nm, [23], katso taulukko 2).

(A) fluoresenssiemissiospektrit ihmisen solunulkoisen EGFR (sEGFR) tallennetut näytteet upon 320 nm: n virityksellä jälkeen 280 nm: n valaistus 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min. (B) fluoresenssiemissiospektrit of sEGFR tallentaa ne 360 ​​nm: n virityksellä jälkeen 280 nm: n valaistus 0 min, 15 min, 30 min, 45 min ja 75 min. (C) fluoresenssivirityk- spektrit sEGFR saatu Fluoresenssiemission kiinnitys 400 nm sen jälkeen 280 nm: n valaistus 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min.

emission Spectra (viritys 320 nm).

sen tarkistamiseksi muodostumisen dityrosine (DT) ja NFK, emissio spektrit saatiin kun 320 nm: n virityksellä ennen ja jälkeen 280 nm valaistus (Fig. 7B). Nostamalla fluoresenssiemissiovoimakkuudessa at 400-405 nm (exc. ​​320 nm) havaitaan. Fluoresenssin emission maksimi on keskitetty ~400 nm, joka vastaa päästöjen enintään DT (Em

max 400-409 nm, [25], [40], katso taulukko 2) ja spkektraalialueessa jossa NFK voi myös päästävät (for NFK, Em

max at 400-440 nm [23], taulukko 2). 75 minuutin kuluttua, fluoresenssiemissiovoimakkuudessa 400 nm: ssä nousee 129%. Pieni emission huippu ~368 nm havaitaan spektrien saatu 0 min ja 15 min valaistuksen vuoksi Raman osuus vettä. Raman spektrin korjauksia ei täysin poista tämä huippu.

Emission Spectra (viritys 360 nm).

Jotta voidaan tarkistaa läsnäolon kynurenine (Kyn) (Abs

max 360 nm [23], taulukko 2) on sEGFR, emissio spektrit saatiin kun 360 nm: n virityksellä ennen ja jälkeen 15 min, 30 min, 45 min, 60 min ja 75 min 280 nm valaistuksen (Fig. 7C). Kyn absorboi maksimaalisesti 360-365 nm ja fluoresoi maksimaalisesti ~434-480 nm ([23], taulukko 2). Jatkuva UVB valaisu sEGFR lisäisi fluoresenssin keskitetty ~430-435 nm. Fluoresenssin intensiteetti 430 nm kasvoi 53% ja 172 jälkeen 15 min ja 75 min valaistus, vastaavasti.

tioliryhmä n kvantifiointiin

Sen varmistamiseksi, että UV-valaisua sEGFR on johtanut SS häiriöitä pitoisuus liuottimelle tioliryhmiä on määritetty kanssa Ellmanin määrityksen valvonta sEGFR näyte pidettiin pimeässä 75 min (negatiivinen kontrolli, NC) ja näytteen aikaisemmin valaistaan ​​280 nm: ssä 75 min. Havaittu pitoisuus vapaiden tioliryhmien on 2,9 kertaa suurempi valaistu näytteessä (Fig. 8). Vapaa tioliryhmien valaistu sEGFR on ~ 1 uM.

tarkastusnäytteen sEGFR pidettiin pimeässä 75 min (negatiivinen kontrolli, NC). Vapaa tioliryhmät on havaittu käyttäen Ellmann n määrityksessä.

Sirkulaaridikroismispektrejä tutkimukset

Kuviossa 9A näytetään CD-spektrit tuoreen sEGFR (non-illum.) Ja valaistu sEGFR ( 75 min 280 nm: ssä). Pitkälle UV-CD-spektri ei-valaistu sEGFR näyttää joitakin klassisen kauko-UV-ominaisuudet proteiinin sekundaarisen rakenteen, jossa läsnä on kaksinkertainen minimi 208-210 nm ja 220-222 nm, mikä on tunnusomaista α-kierteisen sisältöä . p-arkki rakenteellisia sisältöä (ominaisuus minimi ~218 nm) voivat myös vaikuttaa toisen minimi 220-222 nm [41]. Pitkittynyt virittämisen UVB valoa johtaa lasku elliptisyydessä intensiteetti 205-225 nm ja spektrinen muutos. Elliptisyydessä at 207,5 nm: ssä ja 220 nm: ssä laski 9% ja 20%, tässä järjestyksessä. Lisäksi ensimmäinen negatiivinen huippu on siirtynyt 207,5 nm 203 nm.

(A) Far UV-CD-spektrit rekisteröitiin tuoretta sEGFR liuosta (ei illum.) Ja sEGFR näyte, joka oli aiemmin valaistu 280 nm (Illum. 75 minuuttia). (B) Circular dichroim terminen piirtyy käyrät tuoreen sEGFR (ei illum.) Ja UVB valaistut sEGFR (illum. 75 min) saatiin kuumennettaessa 4 ° C: sta 90 ° C (1 ° C.min

– 1). Elliptisyydessä signaali valvottiin jatkuvasti 220 nm: ssä. Sulamislämpötilan ei valaistu sEGFR, mikä vastaa siirtymistä puolivälissä käyrän, saatiin talteen sovittamalla käyrä, jossa on Boltzmannin (katso menetelmät).

Sirkulaaridikroismispektrejä pohjainen proteiini terminen piirtyy tutkimuksissa.

elliptisyys intensiteetti 220 nm: ssä tuoretta sEGFR (ei illum.) ja valaistu sEGFR (75 min 280 nm) seurattiin jatkuvasti 4 ° C: sta 90 ° C (Fig. 9B). Sekä näytteet elliptisyydessä intensiteetti 220 nm: ssä vähenee kuumennettaessa. Siirtyminen jossa puolivälissä välillä 60-70 ° C on havaittu ei-valaistu sEGFR näyte. Data on sovitettu jonka Boltzmannin (katso menetelmät). Root mean square error asentamiseksi R

2 oli 0,99921. Arvot talteen istuva

1,

2 ja

dx

oli -0,96 ± 9.97E-4, -0,83 ± 0,002 ja 2,59 ± 0,08 vastaavasti. Lämpötilan puolivälissä siirtymä

x

0 asennettu arvo oli 64,70 ± 0,07 ° C, mikä vastaa sulamislämpötila proteiinin. Tämä arvo on yhtäpitävä arvo talteen fluoresenssispekroskopian näkyy kuvassa 5. Tällainen siirtymä ei havaittu valaistun näytteen.

EGFR sitova immunoassay

Sitova immunomääritys käytettiin epäsuorasti pääsy vaikutuksia UV valaistuksen rakenteesta sEGFR sitoutumiskohdan EGF /TGF-α. Tulokset näkyvät kuvassa 10 osoittavat, että ei-valaistu sEGFR sitoo LA1 anti-EGFR (kaistat ”No-UV”, tuore näyte, ja ”NC”, negatiivinen kontrolli, näyte pidetään pimeässä 75 minuuttia). sEGFR näyte valaistaan ​​280 nm valoa 75 min enää sitoo LA1 EGFR, vahvisti täydellisen katoamisen sEGFR kaistan (kuvio 10, kaistat ”UV”). Kahdet päällekkäistä näytettä analysoitiin. Signaalin voimakkuus profiilit pitkin proteiinin bändit näkyvät. Intensiteetti havaittu alueilla, joilla valaistaan ​​sEGFR oli läsnä ( ”UV” kaistat) on sisällä havaittu melutaso (melu intensiteetti ~0.02 0,2).

Jokaisessa hyvin, tasan 1,4 ug ei valaistut ( ”No-UV”), UV valaistiin 75 min ( ”UV”) ja negatiivinen kontrolli ( ”NC”) sEGFR näytteitä oli ladattu. Näytteet ladattiin hyvin 1-3 kaksoiskappaleita näytteiden 4-6, mutta hoidettiin itsenäisesti jälkeen UV valaistus. Intensiteetti profiilin pitkin kaivot osoittaa, että signaali on havaittu kuopissa ei-valaistu proteiinia, mutta signaalia ei ole läsnä kuoppiin, jotka sisältävät UV valaistu proteiinia näytteistä.

Keskustelu

UVB magnetointi aromaattiset tähteet johtaa muodostumiseen valolle. Tryptofaani voivat muodostaa tryptofanyyli kationiradikaaliksi, N-formylkynurenine (NKF) ja kynurenine (Kyn) (Fig. 1). NFK ja Kyn ovat erityisen tärkeitä, koska ne ovat photosensitizers joka voi tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), kun UV-absorption [42], edelleen edistää proteiinin rakenteellisia vaurioita. Tyrosiinitähde tiedetään muunnetaan esim. tyrosil radikaalit, dityrosine, trityrosine ja pulcherosine (Fig. 1). Nämä reaktiot ovat todennäköisesti johtaa muutoksiin tai täydellinen menetys proteiinien rakenteen ja toiminnan [22], [43]. UVB heräte johtaa myös elektroni heitetyksi pois sivuketjujen aromaattiset tähteet [20], [24], [44] – [46]. Elektroneja voidaan kerätä disulfidisiltoja, mikä johtaa muodostumista ohimenevä rikkihiiltä elektronin addukti RSSR

• – (ks järjestelmiä 1-8, [49]), joka erottamisen jälkeen muodostaa vapaan tiolin ryhmät (kaavio 9, [ ,,,0],47]). Nature on pitänyt aromaattiset tähteet paikkatietoja lähellä disulfidisiltojen (SS) proteiineissa [19], [28], jolloin häiriintyminen SS todennäköinen tapahtuma kun UV eksitaatio. Alla olevissa kaavioissa on yhteenveto joistakin valolle on muodostettu, jotka edistävät SS häiriöitä, mikä johtaa konformaation muutoksiin, jotka voivat johtaa menetykseen proteiinin toiminnan. Lisätietoja löytyy viitattu kirjallisuudessa [21], [22], [24]. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) B

proteiinit runsaasti aromaattisia tähteitä ja disulfidisiltaa ovat kaikkein alttiimpia valokemiassa ja vaurioita. sEGFR on sellainen proteiini. Se on yhteensä 6 Trp, 16 Tyr, 18 Phe jäämiä ja 25 disulfidisiltaa (kuvio 2A). Mielenkiintoista, aromaattiset tähteet ja disulfidisiltojen on ratkaiseva rakenteellinen rooli dimeerin rajapinnan (kuviot 2B, 2C ja 2D), joka ilmaisee, että UVB indusoi valokemiassa todennäköisesti heikentää EGFR dimerointi. Läheisyys välillä aromaattiset tähteet ja disulfidisiltaa (kuvio 2C) edistää elektronin siirto aromaattiset tähteet ja siltoja, mikä johtaa niiden häiriöitä. UV aiheuttama proteiinin inaktivaatiota liittyy nopea ja lyhyen kantaman elektronin kuljetus photoexcited aromaattiset tähteet ja lähellä disulfidisiltaa [20], [44], [45], [48]. Zhi Li et ai. [49] osoitti, että nopea elektronin siirto on sopusoinnussa suora elektronin kuljetus kolmikon tryptofaania ja läheisen disulfidisillan, mikä RSSR

• – ja todennäköisesti silta rikkoutuminen (järjestelmiä 8 ja 9). Kuten näytetään kuviossa 3, proteiinien yhtä suuri kuin sEGFR (600-650 aa) on havaittu olevan keskimäärin osa disulfidisiltojen ole suurempi kuin ~0.3%. Tämä johtuu luultavasti vakauttava vaikutus suuren hydrofobisen ytimen.