Krooninen sairaus

tiivistelmä

tarkoitus Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää

in vitro

ja

in vivo

syövän vastaista aktiivisuutta ja farmakologisista ominaisuuksista 3,4-dimethoxy-

N

-[(2,2-dimethyl-

2H

-chromen-6-yl)methyl]-

N

-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet

in vitro

aktiivisuus KCN1 soluproliferaatioon ja solusyklin jakautumisen haimasyövän soluja, käyttäen MTT: n ja BrdUrd määrityksissä, ja virtaussytometria.

in vivo

syöpälääkkeen vaikutuksia KCN1 arvioitiin kahdessa erillisessä ksenograftimalleja haimasyöpä. Olemme myös kehittäneet HPLC menetelmä kvantitoimiseksi yhdisteen, ja tutkitaan sen vakautta hiiren plasmassa, plasman proteiineihin sitoutumista, ja hajoaminen hiirellä S9 mikrosomaalisia entsyymejä. Lisäksi tutkimme farmakokinetiikkaa KCN1 laskimonsisäisen tai vatsaonteloon hiirillä. Tulokset osoittivat, että annoksesta riippuvalla tavalla, KCN1 esti solujen kasvuun ja indusoi solukierron pysähtymisen ihmisen haimasyövän soluja

in vitro

, ja osoitti

in vivo

syövänvastainen teho hiirillä Pancin -1 tai Mia Paca-2 tuumoriksenograftien. HPLC-menetelmä edellyttäen lineaarinen havaitseminen KCN1 kaikissa matriisien välillä 0,1 100gM, ja oli pienempi havaitsemisraja 0,085 uM hiiren plasmassa. KCN1 oli erittäin vakaa hiiren plasmassa, laajasti plasman sidottu, ja metaboloivat S9 mikrosomaalisia entsyymejä. Farmakokineettiset tutkimukset osoittivat, että KCN1 voitiin havaita kaikissa tutkituissa kudoksissa, kaikkein vähintään 24 tuntia. Lopuksi todettakoon, että prekliiniset tiedot osoittavat, että KCN1 on potentiaalinen terapeuttinen aine haimasyövän, tarjoamalla perustan sen tulevan kehityksen.

Citation: Wang W, Ao L, Rayburn ER, Xu H, Zhang X, Zhang X, et ai. (2012) KCN1, uusi synteettinen Sulfonamidia syöpälääkettä:

In vitro

ja

In vivo

Anti-Haimasyöpä Toiminta ja Prekliiniset farmakologian. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10,1371 /journal.pone.0044883

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 elokuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health avustuksen R01 CA116804 (ja EGVM). RZ tuki myös National Institutes of Health myöntää R01 CA112029 ja R01 CA121211. EGVM tuki myös EmTechBio, University Research komitean Emory University, aivokasvain Foundation for Children, ja V Foundation for Cancer Research. HW tukivat Sata Talents Program, Kiinan tiedeakatemia, avustusta National Nature Science Foundation (30870513, 31070680, 91029715 ja 81025017) ja Ministry of Science and Technology of China (2007CB947100), National Science and Technology Major Project Key Uusi Drug Creation and Manufacturing Program 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW tukivat National Institutes of Health avustuksen R01 CA91980. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti. On yhä prekliinisen ja kliinisen keksintöjä, jotka ovat paransi ennustetta potilaille diagnosoitu syöpiä, erityisesti rinta- ja eturauhasen syöpiä. Sen sijaan on ollut vain vähän parannuksia tuloksista potilaille, joilla on haimasyöpä. Haimasyöpä on ominaista sen invasiivisia luonteeltaan, kyky kiertää aggressiivinen hoito, ja usein myöhäisessä vaiheessa diagnoosi [1]. Kuolleisuus haimasyövän pysyy korkeana, joiden keskimääräinen eloonjääminen vain 10 kuukautta diagnoosin jälkeen [1] – [4]. On kiireesti kehittää uusia tehokkaita ja turvallisia aineina haimasyövän.

Olemme olleet kiinnostuneita kehittämään uusia syövän terapeuttisia aineita ihmisen syövissä, joilla ei ole nykyisen tehokasta hoitoa, kuten aivokasvain ja haimasyöpä. Ainutlaatuinen piirre kiinteiden syöpien on, että niiden nopea kasvu johtaa usein alentuneeseen hapen saatavuuden takia muodostumista riittämätöntä tai poikkeavien verisuoniston [5]. Hypoksia osa kiinteiden kasvainten kestää sädehoidon [6] ja tavanomaisen kemoterapian [7] – [10], ja hypoksia korreloi huonon hoitotulokseen [7], [8], [11], [12]. Molekyylitasolla, transkriptiotekijä hypoksian indusoima tekijä-1 (HIF-1) on todettu olevan avain orchestrator biologisen vasteen hypoksia, koska sen transaktivaatiota geenejä, jotka osallistuvat monin tavoin pahanlaatuinen kasvain kasvun solujen eloonjäämistä ja aineenvaihdunta angiogeneesiin ja hyökkäys [13] – [16]. Yli-ilmentyminen HIF-1 tuloksia konstitutiivisen aktivaation sen tavoite polkuja [13] – [18]. HIF-1 on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka koostuu kahdesta alayksiköstä, HIF-1α, joka on happi-säännelty, ja HIF-1β, joka ilmentyy konstitutiivisesti. Useat estäjät kohdistaminen HIF-1α ilmentymisen tai sen toiminta on suunniteltu syöpien hoitoon; kuitenkin, mikään näistä yhdisteistä ei ole vielä ollut menestyksekäs, koska yhdisteen myrkyllisyys, rajoitettu aktiivisuus, tai huono farmakologisia ominaisuuksia [18] – [25]. Olemme viime aikoina kehitetty uusi synteettinen aryyli sulfonamidi, kutsutaan KCN1 (Fig. 1A), joka oli alun perin ajateltu kohdistaa HIF-1α-reitin. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset, KCN1 on osoitettu saavan aikaan sen syövän toimien sekä normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa ihmisen gliooma syöpäsolulinjoissa [26] – [31]. Meidän myöhemmät mekaaniset tutkimukset ovat osoittaneet, että KCN1 on merkittävä HIF-1α-riippumaton sytostaatit toimintaa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää

in vitro

ja

in vivo

syövän vastaista aktiivisuutta KCN1 haimasyövän ja sen farmakologisia ominaisuuksia.

(A) kemiallinen rakenne ja KCN1. (B) Solujen kasvua estävä aktiivisuus KCN1 ihmisen haimasyövän soluja. Solut altistettiin eri pitoisuuksia KCN1 72 tuntia, minkä jälkeen MTT-määritys. (C) Cell kasvua estävä aktiivisuus KCN1 on ajasta riippuva tavalla. Solut altistettiin KCN1 eri ajankohtina, sen jälkeen MTT-määritys. (D) inhibitio kiinnittymisestä riippumattoman kasvun KCN1 haiman syöpäsoluissa. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla KCN1 pehmeässä agarissa. Viljelmiä pidettiin inkubaattorissa kaksi viikkoa, sitten solujen pesäkkeet havaittiin, ja sijoitettiin mikroskoopilla. (E) Anti-proliferatiivinen vaikutus KCN1 ihmisen haimasyövän soluja. Solut altistettiin eri pitoisuuksia KCN1 24 tuntia, minkä jälkeen mittaus soluproliferaation avulla BrdUrd määritystä. Lisääntyminen indeksi laskettiin vastaan ​​käsittelemätön kontrolli soluja. (F) apoptoottinen vaikutus KCN1 ihmisen haimasyövän soluja. Solut altistettiin eri pitoisuuksia KCN1 48 tuntia, minkä jälkeen mittaus apoptoosin anneksiini V-määrityksellä. Apoptoottiset indeksi laskettiin vastaan ​​käsittelemätön kontrolli soluja. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. (

# p 0,05, * p 0,01).

Koska jakelun ja sijoitus asiamiehen elimessä on tärkeää määritettäessä sen tehokkuus ja toksisuus, varhainen farmakokineettisiä tutkimuksia on suuri merkitys lääkekehityksen [32], [33]. Tällaiset tutkimukset voivat antaa tietoa tehokkain reitti ja antotiheys sekä osoitus siitä, miten tehokkaasti aineen tulee vastaan ​​kasvaimia eri kohtiin kehossa. Ne voivat myös ilmoittaa mahdollisia sivustoja lääkkeen kertymisestä ja /tai myrkyllisyyden [32], [33]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme yrittäneet luonnehtia farmakologisista ominaisuuksista KCN1 Prekliinisissä ympäristössä, jossa huomioon plasma vakautta, plasman proteiineihin sitoutumista, hyötyosuus ja jakelu systeemisen annostelun jälkeen hiirillä. Nämä tulokset osoittavat antituumoritehoon ja suotuisat farmakologiset ominaisuudet tämän uuden aineen, joka tukee sen kehittämiseen kohti klinikalle tutkimuksiin.

Tulokset

KCN1 on

in vitro

Anti syöpä Activity Against haimasyövän soluja

inhibitio syöpäsolujen kasvua.

in vitro

syövän vastaista aktiivisuutta ja KCN1 arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Neljä ihmisen haimasyövän solulinjoissa (LVI, Panc-1, BxPC3 ja Mia Paca-2) viljeltiin yhdisteen eri konsentraatioissa 0-100 uM 72 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin. Estovaikutukset yhdisteen solun kasvuun oli kuviossa. 1B. KCN1 inhiboi syöpäsolujen kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä on 83% (P 0,01), 53% (P 0,01), 81% (P 0,01) ja 61% (P 0,01) eston 100 pM LVI, Panc-1, BxPC3 ja Mia Paca-2-soluissa, vastaavasti. Panc-1-solulinja on tunnettu ilmaista Multidrug Resistance-Associated Protein 1 (MRP1) ja sen tiedetään vastustuskykyisiä useita syövän lääkeaineet. Tämä saattaa olla syy ne olivat vastustuskykyisempiä KCN1 hoitoon verrattuna muihin soluihin. Kuva. 1C osoitti ajan kuluessa kasvun inhibition KCN1 hoidon kaikki neljä solulinjoissa, mikä viittaa siihen, vastaavat herkkyys yhdistettä BxPC3 LVI Mia Paca-2 Pancin-1. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, LVI ja Panc-1cells suspendoitiin pehmeä agar ja pesäkkeet laskettiin 14 päivän jälkeen inkuboinnin KCN1. KCN1 vähensi muodostuneiden pesäkkeiden LVI-ja Panc-1-soluja 4- ja 3-kertaiseksi.

inhibitio syöpäsolujen lisääntymistä.

annoksesta riippuva vaikutus KCN1 on soluproliferaatiota tutkittiin kanssa BrdUrd sisällyttäminen määritystä (Fig. 1 E). Anti-proliferatiiviset vaikutukset nähtiin kaikissa neljässä solulinjoissa. Pitoisuutena 50 uM, KCN1 inhiboi proliferaatiota noin 80% (P 0,01), 56% (P 0,01), 88% (P 0,01) ja 60% (P 0,01) LVI, Panc- 1, BxPC3, ja Mia Paca-2-soluissa, vastaavasti. BxPC3 solut olivat herkempiä KCN1 hoito on suurin pitoisuus kuin muut kolme solulinjat.

Vaikutus apoptoosin.

myös examinedwhetherKCN1 ollut vaikutusta solujen apoptoosin haimasyövän soluja (kuvio . 1F). Jälkeen 48 tunnin hoito, KCN1 osoitti vähäistä tai heikkoa apoptoottisia vaikutuksia altistumisen jälkeen 50 uM yhdisteen pitoisuus. KCN1 kykeni indusoimaan apoptoosin ainoastaan ​​LVI soluissa (apoptoottiset index: 1,4-kertainen). Lääkkeen ei osoittanut havaittavaa apoptoottista aktiivisuutta kolmessa muussa solulinjat. Nämä tulokset osoittivat, että apoptoosin induktio voi olla merkittävä syövän mekanismeja KCN1.

solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa.

neljä eri haimasyövän solulinjoissa, 24 tunnin kuluttua hoidon KCN1 merkitsevästi aiheuttama solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa annoksesta riippuvaisella tavalla, jossa ensimmäiset vaikutukset alkaa 5 uM LVI (P 0,01), BxPC3 (P 0,01), ja Mia Paca-2 (P 0,01 -solut), ja 12,5 uM Panc-1 (P 0,01) soluja (taulukko 1). Nämä tulokset osoittivat, että solusyklin pidätyksen voi olla merkittävä syövän vastainen mekanismi KCN1.

KCN1 moduloi Expression of Cell Cycle liittyvien proteiinit

tutkineet mahdollisia mekanismeja vastuussa antiproliferatiivisia ja solusyklin sääntelyn vaikutuksia KCN1 arvioimalla sen vaikutuksia ekspressiotaso eri proteiineja, jotka liittyvät säätelyyn solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen (Fig. 2). Kaikilla neljällä solulinjoissa, käsittely KCN1 (12 h ja 24 h) johti eri tasoilla, vähentyneen ilmentämisen solujen lukiertosäätelijöistä E2F1, Cdk2, Cdk4, Cdk6, Cdc25c, sykliini-D1, ja sykliini E. Sen sijaan altistuminen KCN1 lisäsi ilmentymistä p21 ja p27 kaikissa neljässä solulinjoissa. Nämä proteiinit muodostuvat lähinnä solusyklin etenemisen ja check-pisteen ohjaus. Nämä tulokset osoittavat lisäksi, että KCN1 kykenee sen syövän vastaista aktiivisuutta läpi solusyklin pysähtymisen.

LVI, Panc-1, Mia Paca-2 ja BxPC3 haimasyövän soluja altistettiin useille yhdisteen konsentraatioilla 12 tai 24 h, ja sitten proteiinien kohdentamiseksi liittyvät solusyklin etenemisen tutkittiin Western-blottauksella.

KCN1 estää niiden kasvun ksenograftikasvaimissa

onko yhdiste tehoaa

in vivo

kasvaimia, arvioimme kasvaimen vastainen vaikutus systeemisessä annostelussa KCN1 vastaan ​​Panc-1 ja Mia Paca-2 ihonalainen ksenograftimalleissa on

nu /nu

hiirissä. Systeeminen vatsaonteloon (i.p.) käsittely KCN1 (30 tai 60 mg /kg, 01:01 Cremophor: etanoliformulaatiossa, 5 päivää /viikko) sai alkunsa heti kasvaimen määrä oli -100 mm

3

. Yhdiste vähensi kasvua haiman ksenograftikasvaimina annoksesta riippuvalla tavalla. Vuonna Panc-1 ksenograftimallissa, kasvaimen kasvun inhibitiota noin 46% (P 0,01) havaittiin 30 mg /kg: n annos ja 61% (P 0,01) on 60 mg /kg: n annos päivänä 21 (kuvio . 3A1). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Mia Paca-2 ksenograftimallissa. Tämä malli tuntui olevan lähes samalla tavalla herkkä lääkkeen, jolla on pienen annoksen (30 mg /kg), ja suuren annoksen (60 mg /kg) pienenee kasvaimen kasvua noin 43% (P 0,01) ja 57% (P 0,01 ), vastaavasti (Fig. 3B1). Lisäksi ei ollut merkittäviä eroja painon välillä valvonnan ja käsiteltyjen eläinten KCN1 molemmissa ksenograftimalleissa (kuviot. 3A2 ja B2), joka osoittaa mitään selvää toksisuutta isännälle terapeuttisilla annoksilla KCN1.

KCN1 annettiin by ip injektio kantavissa nude-hiirissä Panc-1 (A1) tai Mia Paca-2 (B1) ksenograftikasvaimissa. KCN1 annettiin i.p. injektio annoksilla 30 ja 60 mg /kg /vrk, 5 päivää /viikko 3 viikkoa Pancin-1 ksenograftimallia ja 6 viikkoa Mia Paca-2 ksenograftimallissa, vastaavasti. Ohjaus ryhmät saivat ajoneuvon vain. Kasvaimet tilavuudet mitattiin joka kolmas päivä. Eläimiä seurattiin myös muutoksia kehon painoa korvikemarkkerina myrkyllisyyden, kun se annettiin kantavissa nude (A2) Pancin-1 tai (B2) Mia Paca-2 ksenograftikasvaimissa.

HPLC menetelmä KCN-1-analyysi on kehitetty ja validoitu

HPLC menetelmällä saatiin lineaarinen kalibrointikäyrä hiiren plasmassa tutkitun pitoisuusalueella 0,1-100 uM. Keskimääräinen korrelaatiokerroin (

r

2) päivittäiseen kalibrointikäyrät oli = 1,000. Kalibrointikäyrät tuotettiin myös homogenaateissa hiiren eri kudoksissa, mukaan lukien aivoissa, luustolihaksessa, munuaisissa, keuhkoissa, pernassa, ja sydän, joka oli korrelaatiokertoimet vähintään 0,992 saman pitoisuuksina. Tarkkuus, täsmällisyys, päivän sisäinen ja välinen päivä vaihtelut olivat hyväksyttäviä, variaatiokertoimella (CV) välillä 4,25% ja 12,62%, ja alempi havaitsemisraja (LOD) plasmassa oli 0,085 uM. Elpyminen yhdisteen eri matriisien vaihteli -96%: sta ~107%. Edustavia kromatogrammit tyhjiä hiiren plasma, ohjaus hiiren plasma piikkeinä 1, 5, 25, ja 50 uM KCN1 esitetään kuvioissa. 4A-E. Samanlaisia ​​kromatogrammit saatiin muiden tutkituissa kudoksissa (tuloksia ei ole esitetty). Spesifisyys osoitettiin puuttuessa endogeenisen häiriöitä biologisten näytteiden retentioajan piikit KCN1.

(A) KCN1 valvonta (huumeeton) hiiri plasma ja hiiri plasma piikki sisältävän 1, 5, 25, ja 50 uM KCN1; Tyhjä hiiri plasma näytteen ja hiiren plasma näyte piikkeinä 1 uM (B), 5 uM (C), 25 uM (D), ja 50 uM (E) KCN1.

KCN1 on stabiili hiiren plasman eri lämpötiloissa laajennetun kestoajat

KCN1 oli stabiili hiiren plasmassa 37 ° C: ssa, yli 80% yhdistettä jälkeen jäljellä 8 tunnin inkuboinnin sekä matalan (1 uM) ja korkea ( 10 uM) pitoisuuksia. Olemme myös havainneet, että KCN1 voidaan säilyttää 4 ° C: ssa vähintään 24 tunnin ajan, joissa on enemmän kuin 90% yhdistettä jäljellä (Fig. 5A1), tai 37 ° C: ssa vähintään 8 tuntia, yli 85% yhdistettä loput (Fig. 5A2) tai -80 ° C: ssa enintään 4 viikkoa yli 92% yhdistettä jäljellä (Kuva. 5A3).

pysyvyys KCN1 hiiren plasmassa 37 ° C: ssa ( A1), 4 ° C (A2), ja -80 ° C (A3). (B) hajoaminen KCN1 isoloituna hiiren S9 maksan jakeet.

KCN1 sitoutuvan Plasmaproteiinin Laajasti

KCN1 sitoutuneet laajasti proteiineihin hiiren plasmassa, jossa alhainen (1,0 uM) ja korkea (10,0 uM) pitoisuudet osoittavat 90,96% ja 99,32% yhdistettä sitoutuminen plasman proteiineihin.

KCN-1 metaboloituu S9 Entsyymit (vaihe I) B

Koska KCN1 ilmestyi voidaan metaboloituu tai hajoaa hiiren plasmassa, teimme alustavan tutkimuksen mahdollisista mekanismi (t), johon KCN1 metaboloituu käyttäen S9 määritystä. Tätä määritystä voidaan käyttää määrittämään onko yhdiste metaboloituu

kautta

vaiheen I (NADPH-regeneroituvia järjestelmiä) tai vaiheen (UDPGA ja PAPS) entsyymit on uutettu hiiren mikrosomeissa. S9 tutkimukset osoittivat, että KCN1 on suhteellisen pitkä puoliintumisaika, kun läsnä on vaiheen II (konjugaatio) mikrosomaalisia entsyymejä. Kuitenkin, oli enemmän kuin 60%: n lasku määrän KCN1 havaittiin, kun sitä inkuboitiin hiiren vaiheen I (hapetus) entsyymit (Fig. 5B), mikä viittaa siihen, että se on todennäköisesti metaboloituu vaiheen I entsyymi (t).

KCN1 on pitkä puoliintumisaika ja Wide Kudosiakautuminen hiirillä laskimoon ja vatsaonteloon hallintojen

analyysi kerätyistä plasmanäytteistä hiirille, joille annetaan KCN1 (35 mg /kg) osoitti, että plasmassa yhdiste oli vielä havaittavissa molempien kantojen vähintään 6 tuntia laskimoon (IV) injektioita, ja olivat havaittavissa vielä 24 tuntia intraperitoneaalisen (IP) annon (Fig. 6A ja 6B). Sen jälkeen bolus i.v. antoa, pitoisuudet plasmassa olivat suurempia kuin 5 ug /ml 5 minuuttia sekä CD-1 (9,98 ug /ml) ja nude-hiirissä (5,19 ug /ml). Nämä tasot laskivat 0,3 mikrog /ml 6 tunnin kuluttua annostelusta molemmissa kannoissa. Jälkeen I.P. annostelu, plasmatasot saavuttivat maksiminsa 30 minuuttia CD-1 hiirissä ja 2 h nude-hiirissä. Kaiken I.V. hallinto antoi suuremmat plasman AUC ja C

max arvot, mutta pienempi T

1/2 arvot verrattuna I.P. antoreitti (taulukko 2).

plasmakonsentraatio-aika käyrät KCN1 seuraavat (A) IV ja (B) IP-injektion 35 mg /kg CD-1 ja nude (nu /nu) hiirissä. Aikariippuvainen jakelu KCN1 eri kudoksissa seuraavasti (C) IV annon tai (D) IP antaminen 35 mg /kg yhdistettä. Sarakkeet edustavat nude-hiiriin, kun taas pyramidit ovat CD-1-hiirissä.

etua, KCN1 voitiin havaita useimmissa otokseen kudoksissa (sydän, keuhkot, maksa, perna, munuaiset , ja luustolihasten, Fig. 6C ja 6D) molempien kantojen vähintään 24 tuntia annon jälkeen joko reittiä. Kuitenkin yhdiste ei voitu havaita 6 tunnin jälkeen aivoissa kummankaan hiirikanta seuraavista joko antoreitistä. Farmakokineettiset parametrit laskettiin plasma ja eri kudoksissa (taulukko 2). Korkeimmat AUC-arvot sekä nude ja CD-1 hiirissä I.V. injektio olivat keuhkojen, maksan ja pernan ja kudoksiin pienin AUC-arvot seuraavat I.V. injektio olivat plasma, aivot ja luustolihasten. Korkea pitoisuus havaittiin keuhkoissa jälkeen I.V. injektio johtui todennäköisesti kertyminen saostuneen lääkkeen, vaikka sitä ei kokeellisesti varmistettu. Molemmissa hiirikannoilla, perna oli korkein AUC i.p. injektio, jonka jälkeen maksassa. Plasman ja aivot oli alhaisin AUC-arvot sekä kannoista i.p. injektio.

35 mg /kg KCN1 annetaan laskimoon, vähemmän kuin 1% koko KCN1 annos otettiin talteen vanhempien KCN1 virtsasta sekä CD-1 ja nude-hiirissä ensimmäisten 24 tunnin , joissa on alle 0,5% on toipunut molemmat kannoista seuraavaa IP injektio. Noin 1% alkuperäisestä annoksesta on vanhemman yhdiste talteen ulosteet hiirten vatsaonteloon injektio, ja vähemmän kuin 1% otettiin talteen seuraavat I.V. injektiona (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

HIF-reitin inhibiittorit edustavat uutta kohdennettua terapeuttista ainetta. Vaikka menestys on nähty käyttäen aineita kohdistamista yksittäisten molekyylien (esim. Herceptin, Gleevec), nämä aineet ovat tyypillisesti rajoitettu osalta syöpätyyppeihin, sekä alaluokkien sisällä syöpätyyppien, jotka voidaan hoitaa. Koska KCN1 estää fysiologisen toiminnon (hypoksiaa), joka on luonnostaan ​​kasvainten muodostumisen sijaan syövän tyyppi asetettu tavoite, aine voidaan mahdollisesti käyttää hoitamaan erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien ne, joille ei tällä hetkellä ole tehokasta hoitoja, erityisesti haimasyövän.

testiyhdiste KCN1 alun perin suunniteltu niin HIF-1α-estäjä, mutta sen inhiboivia vaikutuksia soluproliferaatioon ja kasvuun johtivat meidät spekuloida, onko se saattaisi olla vaikutusta alle normoxic kunnossa. HIF-1α on myös tärkeä rooli sääntelyn solusykliä. Hypoksisissa olosuhteissa, se vakiintuu johtavat kasvaimen selviytymisen

kautta

lisääntynyt angiogeneesiä ja anaerobinen Glykolyysivaiheen. Yllättäen HIF-1α myös up-regulation geenejä, jotka edistävät solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin, kuten p21, p27, p53 [34], [35]. Ottaen huomioon tämän, hyödyt HIF-1α esto syövän hoidossa ilmeisesti kyseenalaista, koska se voi kumota solukierron pysähtymisen hypoksisissa olosuhteissa ja estää solukuolemaa. Nämä ristiriitaiset vaikutukset voivat rajoittaa syövän vastaisen vaikutuksen ja HIF-1α-inhibiittorit [34], [35]. Jos HIF-1α-inhibiittorit ovat lisävaikutusta indusoimiseksi solusyklin pysähtymisen tai solukuoleman, ne on ehkä parempi ehdotuksia kuin syöpälääkkeet. Näin ollen on välttämätöntä kehittää samalla HIF-1α-inhibiittorit kuten syöpälääkkeet toimien vaikutusten arvioimiseksi solusyklin ja solukuoleman.

Nykyinen tutkimus on ensimmäinen, joka systemaattisesti tutkia

in vitro

ja

in vivo

anti-kasvain vaikutuksia KCN1 haiman syöpäsoluissa HIF-1α-riippumattomalla tavalla. Havaitsimme, että KCN1 merkittävästi vähentynyt haiman syöpäsolujen kasvua ja lisääntymistä, ja johti solukierron pysähtymisen alle normoxic (20% O

2) viljelyolosuhteet. Arvioituaan yhdisteen vaikutukset on

in vitro

leviämisen, solusyklin etenemistä ja apoptoosin, päättelimme, että solukierron pysähtymisen oli tärkein mekanismi, jolla yhdiste kykenee sen solunsalpaajavaikutus soluviljelmässä. Solusyklin pysähtymisen on yksi tehokkaimmista tuumorikasvun estämiseksi [36]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että KCN1-välitteistä solusyklin pysähtymisen saavutettiin

kautta

modulaatio sykliini estäjät (CKI) – cyclin- sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) koneet toimivat G1 vaiheeseen solusyklin. Perhe proteiinikinaasi komplekseja orchestrates solusyklin etenemisen eukaryooteissa [37]. Kukin kompleksi koostuu minimaalisesti katalyyttisen alayksikön, CDK, ja sen keskeiset aktivoiva kumppani, sykliini. Erilaisia ​​yhdistelmiä Sykliinien ja cdk: t ohjaavat solusyklin eri vaiheissa [37]. Esimerkiksi sykliini E ilmentyy väliaikaisesti aikana G1 /S siirtymä ja hajoaa nopeasti sen jälkeen, kun solu siirtyy S-vaiheeseen [38]. Sykliini E säätelee Cdk2 taas sykliini D1 säätelee Cdk4 ja Cdk6 [38]. Nämä kompleksit aktivoituvat eri tarkastuspisteissä jälkeen tietyin väliajoin solusyklin aikana, mutta voi myös indusoida ja säätelevät ulkoiset tekijät [37] – [39]. CDK: t altistetaan inhibitiolle sitoutumisen CKI, kuten CIP /KIP (p21, p27) ja INK4 perheille proteiinien [37] – [39]. Geenien transkriptiota tarvitaan G1 /S siirtymä, kuten sykliini E ja sykliini D1 aloitetaan E2F1, joka on valvonnassa Rb tuumorisuppressorin [37] – [39]. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutusta KCN1 ilmenemistä useiden proteiinien tiedetään osallistuvan näihin prosesseihin. Kaikissa neljässä haimasyövän solulinjoissa testattu, löysimme vähentynyt ilmentyminen solun cycleproteins, kuten E2F1, sykliini D1, sykliini E, Cdk2-, Cdk4 ja Cdk6, ja lisääntynyt ilmentyminen p21 ja p27. Vaikka KCN1 aiheuttama solukierron pysähtymisen haimasyövän solulinjoissa, se oli vähän sytostaattinen vaikutus glioomasoluihin ja kuolemattomaksi fibroblastit, mikä viittaa siihen, että sen vaikutukset saattavat olla riippuvaista solutyypistä [31]. Vahvista terapeuttinen teho yhdisteen, tutkittiin myös varten

in vivo

vaikutuksia. KCN1 vähensi kasvua sekä Pancin-1 ja Mia Paca-2 ksenograftikasvaimissa.

Koska ei ole julkaistu raportteja farmakokinetiikkaa, myrkyllisyys, tai hyötyosuus KCN1, me suorittamansa arvioinnin näiden farmakologisia ominaisuuksia. Kehitimme sopiva HPLC menetelmä havaitsemiseksi KCN1 eri biologisten matriisien, ja osoitti, että KCN1 on stabiili hiiren plasmassa (Kuva. 5A1-A3), että se sitoutuu voimakkaasti plasman proteiineihin, että se on todennäköisesti metaboloituu vaiheen I entsyymi (t) (Fig. 5B), ja että se on jaettu eri hiiren kudoksissa sekä IV ja I.P. annon (Fig. 6 ja taulukko 2). Meidän alustava farmakologian tutkimukset nousi esiin useita mielenkiintoisia ominaisuuksia noin KCN1. Ensimmäinen oli laaja yhdisteen kertymiseen keuhkoihin hiiristä I.V. injektio, ja pernassa ja maksassa hiirten vatsaonteloon injektio. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan määrittämään mekanismeja ainutlaatuisen jakautumiskuvion tätä lääkettä. Se annettiin intraperitoneaalisesti annoksena 60 mg /kg vuorokaudessa on Cremophor: etanoli formulaatio jopa 12 viikkoa, ja tämä hoito oli hyvin siedetty eläimissä. Ei ollut mitään ilmeistä merkkejä myrkyllisyydestä näissä eläimissä, ja niiden käyttäytyminen ja ulkonäkö olivat erottaa ohjaus eläimistä. Alustavat analyysit osoittivat, että arvot veren solupopulaatioiden ja veren kemia olivat normaaleissa rajoissa (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, patologinen tutkimus tärkeimpien elinten ruumiinavauksessa ei osoittanut erittäin rakenteellisia muutoksia aivoissa, munuaisissa, maha-suolikanavan tai keuhkoissa (tuloksia ei esitetty). Maksa on ainoa elin, jossa hoitoon liittyvää muutosta ei havaittu. Turvotusta havaittiin maksa eläinten ruumiinavauksessa, kudoksen turvotus kanssa sappitiehyen pysähtymiseen oli merkitty patologiset tutkimukset, mutta ilman näyttöä hepatosyyttien kuolema. Havaittu turvotus maksan kääntyi hiirillä 2-3 viikon kuluttua hoidon lopettamisen, ja saattaa on aiheutunut kremoforin: etanoliformulaatiossa, joka voi häiritä maksan verenkierron [40] – [42].

toinen kiinnostava on ollut eroja farmakokinetiikassa KCN1 välillä CD-1 ja nude-hiiriin. Vaikka jotkut näistä eroista voi johtua normaalin vaihtelut hiiret, erot aikaan vuodesta (kausi), kun tutkimukset tehtiin, ja erot johtuvat lähde hiiriä (Harlan vs. Frederick), jotkut kantojen väliset erot hiiriä vielä syytä huomata. Esimerkiksi CD-1-hiiret osoittivat paljon suurempi pitoisuus keuhkoihin kuin nude-hiirissä, vaikka sai saman annoksen. Kuitenkin useimmissa tapauksissa nude-hiiriin oli suurempi otto aineen eri kudoksissa tutkittiin (maksa, munuaiset, perna, sydän, luustolihas, ja aivot). Siellä oli myös eroja vatsaonteloon hyötyosuus KCN1, yhdisteen kanssa imeytyy paremmin intraperitoneaalisen injektion nude-hiirissä verrattuna CD-1 hiirissä. Tämä lisääntynyt hyötyosuus todennäköisesti oli vastuussa korkeamman sisäänottoa kudoksissa. Jos samanlaisia ​​tuloksia löytyy toistuvia tutkimuksia, on tarpeen selvittämiseksi mekanismi (t) taustalla näitä eroja kertymä- sen määrittämiseksi, ovatko tällaiset tekijät vaikuttavat todennäköisesti farmakokinetiikkaa KCN1 muissa lajeissa, mukaan lukien ihmiset. Lisäksi, kun taas CD-1-hiiriä käytetään usein farmakokinetiikkaa arvioitiin uusien yhdisteiden nude-hiiret ovat yleisimmin käytetty hiiren kanta anti-cancer tehon tutkimista varten. Erot farmakokinetiikan kantojen välillä voi johtaa yli- tai aliarviointiin tehoa tai toksisuutta yhdisteen.

totesi myös, että KCN1 ilmeisesti käy läpi enterohepaattisen kierron. Ei vain ollut yhdistettä vielä esiintyy monissa kudoksissa, mutta joissakin tapauksissa se oli suurempi 24 tunnin kuin 4 tai 6 h (esim. Maksa ja perna). Lisäksi, KCN1 oli vielä havaittavissa alhaisella tasolla vähintään viiden päivän kuluttua vatsaonteloon annon (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että voi olla mahdollista antaa KCN1 suhteellisen harvoin, koska yhdiste voi jäädä kohdekudokseen useita päiviä. Kuitenkin, on tarpeen varmistaa, että yhdiste ei aiheuta toksisia vaikutuksia maksassa, sappirakon tai muissa kudoksissa alttiiksi korkeille yhdisteen pitoisuus pitkiä aikoja.

Lisäksi muutokset taajuuden annostelun tehon tutkimista varten, muuttamalla formulaatio voi myös parantaa yhdisteen aktiivisuutta. Vaikka yhdiste oli tehokas, kun sitä annetaan i.p. kremofori: etanoli, formulaatio ei ole ihanteellinen. Vielä tärkeämpää on, kun taas KCN1 itse ei näytä aiheuttavan mitään suuria myrkyllisyys, ajoneuvon johti maksan turvotusta useiden viikkojen kuluttua annostelun valvonnassa eläimillä. Niinpä muuttamalla muotoilu voisi pienentää yhdisteen myrkyllisyyttä, ja on mahdollista, että optimoimalla muotoilussa ja yhdisteen anto lisäisi myös sen syöpälääkkeen vaikutuksia.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että KCN1 voi kohdistamaan voimakas sytotoksisuus ja soluproliferaation eston vaikutuksia kohti haimasyöpäsoluissa, ja johti alas-säätely tärkeitä onkogeenisten ja kasvua edistävän /pro-leviämisen proteiineja. Olemme esittäneet validi menetelmä havaitsemiseksi ja kvantifioimiseksi KCN1 eri matriiseja. Meillä on myös esittänyt alustavan farmakokineettisiä tietoja yhdiste, joka osoittaa, että se on hyvin jakautunut, vakaa, ja havaittavissa eri kudoksissa suhteellisen pitkän ajan kuluessa. Tuottama tieto tässä tutkimuksessa on hyötyä edelleen kehittämiseen yhdisteen.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

KCN1 syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten aiemmin raportoitu [ ,,,0],29], [43] – [44], ja sen rakenne varmistettiin UV, IR, MS, ja NMR-spektroskopialla. Puhtaus yhdisteen määritettiin olevan yli 99%.

Kaikki kemikaalit ja liuottimet, joita käytetään näytteen valmistamiseksi ja korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) analyysi olivat analyyttistä laatua. Metanoli (HPLC-laatu) ostettiin Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) ja trietyyliamiinia ostettiin Sigma (St. Louis, MO). Heparinisoituun hiiri (ei-sveitsiläinen albiino) plasma hankittiin Lampire Biological Laboratories (Pipersville, PA).