Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Verenkierron verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on laajalti käytetty biomarkkerina angiogeneesikohtia aktiivisuuden syövän. Tätä tarkoitusta varten ei-standardoituja mittauksiin plasmassa ja seerumissa käytettiin ilman korjausta keinotekoisia VEGF vapautumista verihiutaleet aktivoitu

ex vivo

. Oletamme, että ”tosi” kiertävän (c) VEGF tasolle useimmissa syöpäpotilailla ovat alhaiset ja liity syöpään kuorman tai kasvaimen angiogeneesiin.

Menetelmät

määritettiin VEGF tasot PECT, välineellä, joka sisältää verihiutaleaktiviteettia estäjät, sitraatti- plasma, ja eristetyissä verihiutaleiden 16 terveillä koehenkilöillä, 18 Metastasoivassa kuin munuaissyövän (non-RCC) ja 12 potilasta, joilla munuaissolukarsinooma (RCC). Ei-RCC potilaiden kiertävän plasman VEGF pitoisuudet olivat alhaiset ja vastaavat VEGF tasot kontrolleissa jos verihiutaleaktivaatiota minimoitiin sadonkorjuun menettelyn PECT välineellä. Vuonna sitraattiplasma, VEGF pitoisuudet olivat koholla kuin RCC potilaat, mutta tämä voidaan selittää yhdistelmä lisääntynyt verihiutaleiden aktivoitumisen aikana verta korjuu, ja kahden kertainen nousu VEGF sisällön yksittäisten verihiutaleet (valvonta: 3.4 IU /10

6, ei-RCC: 6,2 IU /10

6 verihiutaleita, p = 0,001). Sen sijaan cVEGF tasot RCC potilasta koholla (PECT plasma: 64 pg /ml vs. 21 pg /ml, RCC vs. ei-RCC, p 0,0001), ja jotka eivät liity verihiutaleiden VEGF keskittyminen.

päätelmät

tulokset viittaavat siihen, että ”tosi” vapaasti cVEGF tasot eivät ole koholla suurimmalle osalla syöpäpotilaita. Aikaisemmin raportoitu kohonneita plasman VEGF tasot syövän näyttäisi johtuvan keinotekoisiin vapautumista aktivoituneiden verihiutaleiden, mikä syöpä on lisääntynyt VEGF sisältöä aikana veri sadonkorjuun menettelyä. Vain potilailla, RCC, jolle on ominaista liiallinen VEGF tuotantoa johtuu geneettisen vika, oli cVEGF tasot koholla. Tämä havainto voi liittyä rajoitettu ja valikoiva menestys anti-VEGF-lääkeaineiden, kuten bevasitsumabi ja sorafenibia monoterapiana RCC verrattuna muihin syövän muotoja.

Citation: Niers TMH, Richel DJ, Meijers JCM, Schlingemann RO (2011) endoteelikasvutekijä verenkierrossa syöpäpotilailla ei voi olla merkitykselliset biomarkkereiden. PLoS ONE 6 (5): e19873. doi: 10,1371 /journal.pone.0019873

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 19 huhtikuu 2011; Julkaistu: 26 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Niers et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

endoteelikasvutekijä (VEGF) on ensisijainen säädin angiogeneesin kasvainten [1] – [3]. Se vapautuu syöpäsoluja, hypoksisia soluja ja aktivoitujen verihiutaleiden ja leukosyyttien [4] – [8]. Kohdesoluja VEGF ovat pääasiassa verisuonten endoteelisoluissa, johon se on voimakas mitogeeninen vaikutus kautta korkea affiniteetti reseptoreita Flt-1 ja KDR /Flk-1 [9], [10]. Koska VEGF on liukoinen diffundoituvan peptidi erittävät kasvaimet, sen tasot verenkierrossa ehdotettiin heijastamaan angiogeeninen aktiivisuus syöpäsairauksia. Niinpä viime vuosina, verenkierrossa VEGF ja muut angiogeenisten tekijöiden on tutkittu laajasti sijaismarkkereina angiogeenisten toiminnan ja ennusteen syöpäpotilailla, seurantaa hoitovasteen ja varhaisten uusiutumisen [11].

tätä tarkoitusta varten VEGF-tasot määritettiin seerumista tai plasmasta, käytettiin. Kuitenkin, seerumi sisältää suuria määriä VEGF johtuen vapauttaa aktivoidut verihiutaleet aikana hyytymistä [5] – [7]. Siksi VEGF seerumissa, joka korreloi voimakkaasti verihiutaleiden määrä [12], eivät heijasta todellista kiertävän VEGF: n pitoisuus vivo. Vuonna sitraattia tai EDTA plasma, jossa vähemmän verihiutaleiden aktivoitumisen ja sitä seuraavan VEGF julkaisu odotetaan kuin seerumissa, VEGF tasot havaittiin olevan edelleen suurempi syöpäpotilailla kuin verrokeilla ja tämä tulkittiin osoituksena korkeampi VEGF verenkierrossa ja korkeampi angiogeeninen aktiivisuus [13] – [15]. Mutta myös nämä kirjoittajat keinotekoiset vapautuminen VEGF verihiutaleista, tai muuttaa käyttäytymistä verihiutaleita syöpäpotilailla, ei suljettu pois lähteenä kasvoi VEGF tasot plasmanäytteiden.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mahdollisuus, että keinotekoinen VEGF vapauttaa verihiutaleet on tärkein VEGF plasmanäytteistä, ja että verenkierrossa VEGF syöpäpotilailla ovat alhaiset ja jopa liity syöpää kuorman tai angiogeenisen aktiivisuuden. Tätä varten määritimme plasmatasot VEGF tai ilman estää verihiutaleiden aktivaation, ja määrällisesti VEGF vapautuminen verihiutaleista in vitro, hallita henkilöitä ilman syövän, metastasoituneen ei-munuaissolukarsinooma ja potilailla, joilla oli metastaattinen munuaissolukarsinooma.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja vapaaehtoisten

Saimme laskimoverta 16 tervettä vapaaehtoista (valvonta) ja 30 syöpäpotilaiden erotettu kahdella potilaalla ryhmään: 18 potilasta, joilla metastasoivaa ei-RCC (non-RCC) ja 12 Metastasoivassa RCC (RCC). RCC: lle ominaista korkea sisäinen kasvain VEGF tuotantoa mutaatiot von Hippel-Lindaun tuumorisuppressorigeeniä on seurauksena rajoittamaton aktiivisuus hypoksian indusoima tekijä 1α (HIF1α) aiheuttaa korkeita VEGF transkriptio [16] – [20].

Tutkimme VEGF tasot sitraattiplasma, PECT plasma ja verihiutaleet. Ominaisuudet vapaaehtoisia ja potilaita ovat seuraavat: terveillä verrokeilla (valvonta) mediaani-ikä, 53 [48-60]; syöpäpotilailla (Non-RCC-ryhmä); mediaani-ikä, 62 [57-72]; syöpä haima (7), cholangio (3), Papilli ja vettä (2), ruokatorven (1), paksusuolen ja peräsuolen (2), melanooma (1), munasarjojen (1), rinta (1). RCC (RCC-ryhmä) iän mediaani, 60 [56-65]; seuraavat ennustetekijöiden ryhmistä: 5 huono riskin, 5 väli riski ja 2 suotuisa riski, mukaan Motzer [21]. Kaikille syöpäpotilaille oli etäpesäkkeitä. Erotella in vivo verihiutaleiden aktivoitumista ja keinotekoinen in vitro verihiutaleiden aktivaation aikana plasman sadonkorjuun, β-TG ja PF4 mitattiin kaikista näytteistä. Verinäytteet Tässä tutkimuksessa käytetyt olivat peräisin RCC potilaiden mukana BAYER 43-9006 tutkimuksessa (hyväksymä Medical eettisen komitean (METC 05-262), Academic Medical Center, Amsterdamin yliopisto), ei-RCC potilaat eivät sisälly tutkimuksessa, ja vapaaehtoisia. Kaikista vapaaehtoisilla ja potilailla erillinen kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin verinäytteen satoa ja angiogeneesiä biomarkkereiden määrityksiin.

Plasma valmisteiden

Vertailun standardin sitraattiplasma kokoelma, käytimme menetelmää (maksimaalisesti) vältettäisiin keinotekoinen ex vivo verihiutaleiden aktivaation verinäytteen ilman puristusside, ja sato alustassa, joka sisältää seosta, antikoagulantteja johon prostaglandiini E

1 ja teofylliinin lisättiin (PECT medium). Lisäksi käytimme tärkeä väline syrjiä in vivo verihiutaleiden aktivoitumista ja keinotekoinen in vitro verihiutaleiden aktivaation, eli mittaukset β-tromboglobuliinin (β-TG) ja verihiutaleiden tekijä 4 (PF4) tasot. Kokoelma PECT plasmassa ja samanaikaista käyttöä markkereita verihiutaleiden aktivaation olisi annettava tarkka arvio verenkierrossa VEGF in vivo.

Vuodesta jokaisen potilaan tai vapaaehtoisesti laskimoverta otettiin joiden microperfuser (läpimitta 1 mm, Microflex , Vycon, Ecouen, Ranska) ja jaettu eri putkiin. Muovi (polypropeeni) veriputkea täytettiin 400 ui liuosta, joka sisälsi: prostaglandiini E

1 (94 nM), Na

2CO

3 (0,63 mM), EDTA (90 mM) ja theophylin ( 10 mM) (PECT-väliaine). Verinäytteet (4 ml) kerättiin näissä PECT putkissa avoimessa järjestelmässä tipoittain käyttämättä kiristysside (maksimaalisesti) välttää verihiutaleaktivaatiota ex vivo. Veri kerätään PECT putket pantiin välittömästi jäille (toisin sitraatin ja EDTA verinäytteestä, jotka pidettiin huoneen lämpötilassa). Verihiutaleiden vaje PECT plasma valmistettiin spinning 60 minuutin ajan 1700 g: llä 4 ° C: ssa 1 tunnin keräämisen jälkeen.

Verta kerättiin myös putkiin täynnä sitraatti ja putkissa täynnä EDTA käyttämällä puristusside ( Becton Dickinson vacutainers Systems, Breda, Alankomaat). Sitraatti Verinäytteitä sentrifugoitiin 30 minuutin kuluessa 15 minuutin ajan 1000 g, jolloin saatiin plasma. EDTA verta samalla tavalla käytettiin mittaamaan kokonaismäärä verihiutaleita. Mitata VEGF, PF4 ja β-TG sisällä verihiutaleiden, EDTA verta käytettiin johon verihiutaleet tuhosi yhdistelmällä Triton (2% Triton X-100), ultraäänikäsittelyllä aikana 15 sekunnin ajan jäillä (mikrokärjellä, Branson, amplitudi 50% ) ja sentrifugoimalla 5 minuutin aikana on 14,000 rpm mikro-sentrifugissa. Verihiutaleita köyhdytettyä PECT plasmaa käytettiin mittaamaan VEGF: n, PF4 ja β-TG-tason. Sitraattiplasmakontrolli käytettiin mittaamaan VEGF ja PF4 tasolla.

mittaukset verihiutaleiden aktivoitumisen merkkejä ja VEGF

PF4 ja β-TG pitoisuuksilla verihiutaleet ovat samanlaisia ​​ja kun verihiutaleiden aktivaation ne vapautuvat samankaltaisissa määrinä [22], [23]. Koska PF4 puhdistuma plasmasta on paljon nopeampi kuin P-TG välys (t ½ PF4 on useita minuutteja ja β-TG 100 minuuttia) [22], [23] normaali tai vain hieman koholla PF4 tason ja korkean β-TG taso ehdottaa in vivo verihiutaleiden aktivaation, kun taas korkea β-TG tasolla yhdessä korkean PF4 tasolla viittaa in vitro (ex vivo) verihiutaleaktivaatiota. Kaikki näytteet testattiin tämän vuoksi VEGF, β-TG ja PF4 käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia sandwich entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA: t) Roche (Asserachrom β-TG ja Asserachrom PF4, Roche, Mannheim, Saksa) ja R R Genentech, South San Francisco, CA) vasta-aineen, joka sitoutuu kaikkiin isoformeja inhimillisen cVEGF [32] tuotti merkitsevästi pidempi kuin aika taudin etenemiseen verrattuna lumelääkkeeseen potilailla, joilla on RCC [33]. Näin ei tapahdu useimpien muissa elimissä, joissa bevasitsumabi on joko toimi tai oli vain merkittävästi tuumorin vastaista tehokkuutta, kun sitä käytetään yhdessä kemoterapian sijaan monoterapiana (ennemminkin kuin kemoterapia-tehostajana) [34]. Suoraviivainen selitys Kliinisesti merkittävää bevasitsumabi monoterapiana RCC voi olla erityiset roolit virheellisten hypoksinen signalointi ja VEGF yli-ilmentyminen synnyssä näistä kasvaimista.

Havaitsimme, että in vitro verihiutaleiden aktivaation aikana keräämisen menettely omiaan nostamaan sitraattiplasma VEGF tasot. Tämä osoitettiin korkean vapautuminen PF4 verihiutaleista sitraatti- verrattuna PECT plasma, ja merkittävä positiivinen korrelaatio PF4 ja VEGF-määrät yksittäisissä sitraattiplasma näytteitä. Kaksitahoinen korkeampaa PF4 vuonna PECT plasmassa syöpäpotilailla verrokkeihin verrattuna viittaa siihen, että myös optimaalinen keräystavalla jotkut verihiutaleaktiviteettia ilmenee yhä, mutta vielä tärkeämpää tämä osoittaa, että verihiutaleet syöpäpotilailla tullut helpommin aktivoitu kuin verihiutaleet terveiden verrokkien .

linjassa muiden tutkimusten osoitimme, että verihiutaleiden VEGF pitoisuus on suurempi syöpäpotilailla [26], [27], [35]. Ottaen huomioon meidän havaintojen PECT plasmassa, tämä viittaa siihen, että ex vivo vapautuminen VEGF verihiutaleiden muutetaan syöpäpotilailla, johtuen sekä kasvusta verihiutaleiden VEGF sisältöön sekä korkeampaan activatibility verihiutaleiden syöpäpotilailla. Korkeampi verihiutaleiden VEGF sisältö voi olla peräisin kasvaneen kuormituksen luuytimessä tai johtua VEGF huuhteluilman funktio verihiutaleiden [6], [35], [36]. Tällainen puhdistusjärjestelmä toiminto toimisi liika VEGF, tuottaa paikallisesti kasvaimen kudoksissa, verenkierrosta. On merkittävää, että meidän molempien potilasryhmissä lisääntyminen verihiutaleiden VEGF-pitoisuus oli noin kaksinkertaiseksi verrattuna kontrolleihin, vaikka paljon suurempi VEGF tasot PECT plasmassa RCC potilaista. Siksi, jos verihiutaleet on todella huuhteluilman toiminto VEGF, RCC tässä puhdistusjärjestelmä toiminto näyttää epäonnistua liian suuren VEGF tuotantoa, mikä johtaa verenkierrossa VEGF. Lisäksi, toisin kuin verenkierrossa vapaan VEGF, VEGF-sisältöjä verihiutaleiden voi olla mielekästä kiinnostavia mahdollisuuksia biomarkkeri VEGF: n ja /tai angiogeneesin aktiivisuus syöpäpotilailla, joka tarvitsee lisätutkimuksia.

Lopuksi, vapaa VEGF-määrät ovat alhainen tai poissa verenkierrossa useimmilla syöpäpotilailla, lukuun ottamatta RCC, syövän tyyppi liiallisella VEGF tuotannon takia tiettyä geenivirhe. Sitraatti VEGF tasot eivät vastaa todellisia kiertävän VEGF tasoilla, mutta ovat seurausta ex vivo verihiutaleiden aktivoitumista ja myöhemmin VEGF vapautuminen verihiutaleista, joilla on lisääntynyt VEGF pitoisuus syöpäpotilailla. Kohonnut sitraatti VEGF-määrät syöpäpotilailla, joita on käytetty laajalti biomarkkerina kasvaimen angiogeneesin, jotka johtuvat esineitä ja muuttaa verihiutaleiden toimintaa, joka liittyy systeeminen sairaus.

Tiedoksi

Olemme velassa rouva MA Weijne ja Mrs WF Kopatz apua ja yhteistyötä; Professori H. R. Buller kriittisesti käsittelyssä tämän käsikirjoituksen ennen jättämistä, ja potilaille ja vapaaehtoisille mukana tutkimuksessa luottamuksesta ja tuesta.