Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhasen liikakasvu (BPH) ja eturauhasen karsinooma (CAP) liittyvät ikääntymiseen ja androgeenien läsnäolon, mikä viittaa siihen, että androgeenireseptorin geenien merkittävä rooli näissä yleisiä sairauksia. N androgeenisäätely eturauhasen kasvu ja kehitys riippuu läsnä ehjä epiteelin-strooman vuorovaikutusta. Lisäksi eturauhasen strooman on sekaantunut BPH. Tämä viittaa siihen, että epiteelisolujen linjat ovat riittämättömiä tunnistaa androgeenireseptorin geenien, jotka voisivat edistää BPH ja korkki ja joka voisi toimia potentiaalista kliinistä biomarkkereita. Tässä tutkimuksessa käytimme ihmisen eturauhasen ksenograftimallia määritellä profiilin geenejä säädellään

in vivo

by androgeenien, painottaen tunnistamista ehdokas biomarkkereita. Hyvänlaatuinen siirtyminen vyöhyke (TZ) ihmisen eturauhasen kudosta radikaalien prostatectomies oli oksastettu Saharan munuaisten kapseli site koskemattomien tai kastroitu uros immuunivajausta hiiriä, jonka jälkeen poistamalla tai lisäämällä androgeenien, vastaavasti. Microarray-analyysi RNA näiden kudosten käytettiin geenien tunnistamiseksi, jotka olivat; 1) erittäin ilmaistaan ​​eturauhasessa, 2) oli merkittäviä ilmentyminen muuttuu vastauksena androgeenien, ja, 3) koodaavat solunulkoisia proteiineja. Kaikkiaan 95 geenien jotka täyttävät nämä kriteerit valittiin analyysiin ja validointi ilmentymisen potilaan eturauhaskudoksiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR. Ilmentymistasoja näistä geeneistä mitattiin yhdistettiin RNA: t ihmisen eturauhasen kudoksia lievempiä BPH patologisten muutosten ja korkki vaihtelevia Gleason. Useita androgen säännelty geenejä tunnistettiin. Lisäksi joissakin näistä geeneistä oli yli-ilmentynyt RNA kliinisen BPH kudoksista, ja tasot monia havaittiin korreloivan taudin tilasta. Tuloksemme osoittavat toteutettavuus, ja joitakin ongelmia, käyttää hiiren ksenograftimallia luonnehtia androgeenireseptorin säännelty ilmaisun profiileja ehjä ihmisen eturauhasen kudosten.

Citation: Love HD, Booton SE, Boone BE, Breyer JP , Koyama T, Revelo MP, et al. (2009) Androgeenien geenien in Human eturauhasen hiirissä: Suhde BPH ja eturauhasen syöpä. PLoS ONE 4 (12): e8384. doi: 10,1371 /journal.pone.0008384

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 elokuu 2009; Hyväksytty: 18 marraskuu 2009; Julkaistu: 21 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Rakkaus et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisteri (NIDDK) MPSA Consortium apurahan UO1-DK63587, National Institutes of Health (NIH) avustus DK067049 ja Vanderbilt Microarray resurssin, jota Vanderbilt Ingram Cancer Center, avustus P30 CA68485, ja Vanderbilt Digestive Disease Center, myöntää P30 DK58404, ja Vanderbilt Vision Center, myöntää P30 EY08126. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhasen liikakasvu (BPH) on erittäin yleinen ikääntyminen miehiä, edistää rakenteessa sairastuvuus kutsutaan alempien virtsateiden oireet (LUTS) ja tuloksena vuosittain merkittäviä terveydenhuollon kustannukset [1]. Saatavuudesta huolimatta lääketieteellisiä ja kirurgisia hoitoja BPH on vielä riittämätöntä ymmärrystä prosessien hyvänlaatuista patologinen kasvua ihmisen eturauhasen

in vivo

[2]. Tällainen tieto voisi palvella paremmin ennustaa, mitkä potilaat voivat hyötyä nykyisen lääketieteellisen hoidon tai todennäköisemmin edetä tarvitsi kirurgista hoitoa, sekä huomioon valittaessa uuden lääketieteellisen lähestymistapoja kohdistaminen novel polkuja.

BPH esiintyy miehillä ikä, ja androgeenien tarvitaan kehittämiseen sillä edellytyksellä, [3], [4]. BPH on ominaista patologisesti rauhas ja strooman hyperplasiaa eturauhasen siirtyminen vyöhyke (TZ) [5]. Heräämistä alkion induktiivinen potentiaali eturauhasen strooman on ehdotettu aiheuttaa BPH [3], [5], [6], [7]. Tämä perustuu siihen ajatukseen, että eturauhasen kasvu johtuu paikallisesta vuorovaikutus kasvutekijöiden välillä epiteelin ja strooman elementtejä elimen vaikutuksen alaisena kivesten androgeenien, mikä viittaa siihen, että androgeenireseptorin geenien merkittävä rooli taudin. Tätä hypoteesia tukee huomattavasti kokeellista näyttöä erityisesti kudoksesta rekombinaation mallit [8], [9], [10].

eturauhasen tulehdus on myös patogeneesiin BPH [11], [12] [13], [14]. Tulehdus liittyy vakavuus BPH, ja MTOPS (Medical Therapy of Eturauhasen oireet) tutkimus osoittaa, että riski BPH etenemisen ja akuutti virtsaumpi on suurempi miehillä, joilla eturauhasen tulehdus [13], [15]. Lisääntynyt eturauhasen tulehdus voi myös johtaa häiriintymisen epiteelin rakenteen ja arkkitehtuuria, mikä lisää seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA).

Eturauhasen kasvuun, erilaistumiseen ja aikuisten toiminta riippuvat androgeenien läsnäolon. Se on vakiintunut, että androgeenien ohjaus kasvua ja erilaistumista kautta mesenkymaalisten-epiteelin vuorovaikutusta. Aikuisen eturauhasen, androgeenien uskotaan toimivan läpi strooman androgeenireseptorin (AR) ylläpitää kasvua lepotilassa rauhanen [16], [17], ja sen kautta epiteelin AR saamaan aikaan sekretorisen eriytetty toiminto eturauhasen epiteelin [18] . Toisin kuin normaalin kasvun-liikkumattomuus, hyperplastisessa kasvu rauhasepiteeliin ja strooman sisällä siirtymävyöhykettä BPH edustaa muutoksia tasapaino solunjakautumisen ja kuolema. BPH voi siten epäasianmukaisesti kerrata keskeisiä tapahtumia eturauhasen kehitysbiologian. Mesenkymaaliset ja epiteelin geenit säätelevät androgeenien jotka ovat tärkeitä epänormaalia eturauhasen kasvun BPH ovat vielä määritelty kokonaan. Tutkimukset käyttäen suuren suoritustehon cDNA mikrosiruja androgeenin stimuloidaan sinoomasolulinjoja eivät todennäköisesti ole merkitystä joko eturauhasen kehittämiseen tai BPH. Transformoidut epiteelisolujen kulttuuri on selvästi erilainen fenotyyppi, ja liittyy Proteome, niiden

in vivo

kollegansa. Lisäksi tällaiset lähestymistavat eivät salli samanaikaista havaitsemista keskeisten stroomasolulinja geenejä tai geenejä, voidaan moduloida seurauksena ratkaiseva epiteelin-strooman vuorovaikutuksia.

Lisää biologisesti relevantteja tehtyjen tutkimusten cDNA microarray analyysi BPH kudosten on on raportoitu. Luo, et ai. analysoi ilmentyminen 6500 ihmisen geenien eturauhassyövän ja BPH kudoksia potilailta, joille suoritetaan eturauhasen tai höyläysleikkaus eturauhasen (TURP) [19], [20]. Useita geenejä havaittiin johdonmukaisesti yliaktiivista BPH verrattuna normaaliin eturauhaseen. Näihin sisältyvät

IGF1-

,

IGF2

,

TGFB3

,

BMP5

,

MMP2

,

COX2

, ja

GSTM5

. Nämä tutkimukset käytetään kudosten rikastettiin epiteelisolujen. Tämän seurauksena analyysit olisi jäänyt mahdollisesti ratkaiseva geenit ilmaistaan ​​pääasiassa stroomasoluissa. Näissä tutkimuksissa ei käsitellä, onko potilaista oli tehty ennen androgeenin Ablaatiohoitoa. Lähestymistavat perustuvat RNA uutetaan kudoksista ei myöskään salli manipulointi hormonistimulaatioon, rajoittaa mahdollisuuksia suoremmin havaita geenejä säätelee androgeenien, joita voitaisiin käyttää ennustavia vastauksena hoitojen kohdistamista androgeeni stimulaation tai uusina tavoitteita vaihtoehtoista lääkehoitoa tässä androgeenisesti ajettu sairaudesta.

toisessa asiaankuuluva tutkimus, geeniekspressioprofiilien eturauhasen stroomasoluissa eri eturauhasen vyöhykkeillä analysoitiin vertaamalla normaaleissa ja sairaissa kudoksissa [21]. Useita geenejä havaittiin ilmentyä erilailla välillä BPH strooman ja normaalin siirtymävyöhyke (TZ) strooman. Vaikka monet mahdollisesti tärkeä strooman geenejä tunnistettiin, jotka voivat olla rooli BPH, näissä tutkimuksissa käytetyt eristetyt stromasoluja viljelty

in vitro

, mikä johtaisi todennäköisesti muuttuneeseen geeniekspressiomalleja niistä, jotka nähtäisiin

in vivo

.

Tässä tutkimuksessa käytimme oligonukleotidigeenisirumenetelmää ekspression tutkimiseksi androgen geenien hyvänlaatuisia ihmisen eturauhasen kudosta kasvaa vierassiirrännäiset severe combined immuunivajausta (SCID) hiiriä [22]. Tämä lähestymistapa säilytetään biologisesti merkittäviä yhteisvaikutuksia epiteelin ja strooman kuten tapahtuu

in vivo

ja mahdollistaa suoran manipuloinnin androgeenien, joko kastraatio tai hormonaalisen täydentämistä isännän. Saatu data set analysoitiin sitten tunnistaa suhteellisen voimakkaasti ilmentyvien geenien jotka androgen säännelty. Kun pyritään tunnistamaan mahdolliset biomarkkerit mukautuvia tulevia veren testaus, painotettiin geenejä, joiden tuotteet tunnetaan tai ennustetaan olevan solunulkoiseen. Näiden geenien ilmentymistä analysoitiin sitten käyttäen qRT-PCR cDNA: saatu kudoksista potilailta pienellä, lievä, keskivaikea ja vaikea BPH patologisten muutoksien, tai korkki, onko lauseke korreloivat sairauden tila.

materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

De-tunnistettu ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä saatiin Vanderbilt Tissue Acquisition Core kautta patologian osaston mukaisesti Vanderbilt IRB protokollia. Kaikki potilaat allekirjoitti tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin määrittelemättömistä tutkimustarkoituksiin. Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä mukaisesti toteutettiin eläinsuojelulaissa ja hyväksynyt Vanderbilt Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Eläinten hoito /hyvinvointi ja eläimille valvonnasta saatiin Vanderbilt Divison Animal Care.

histopatologinen analyysi ja Sample Selection

määrittämiseksi vakavuus BPH patologian muutosten tapauksissa käytetään RNA, TZ alueet vaikuttavat rauhas ja strooman hyperplasiaa linjattiin kokonaan vuorella osastoja eturauhasen (HE) saatuja näytteitä kautta patologian osaston mukaisesti Vanderbilt IRB protokollia. TZ tilavuudet määritettiin planimetry kanssa digitoitu piirtopöydän, tavalla identtinen rutiinia määrittämiseen kasvaimen kokonaistilavuus in RP [23], [24], [25]. Etusijalle asetettiin tapauksissa pienet reuna-alue (PZ) kasvaimia, jotta mahdolliset yleistä eturauhasen laajentuminen johtua TZ laajentumisesta ja vähentää todennäköisyyttä, että hormonimetabolian mahdollisesti merkityksellisiä BPH olisi muuttaa suuri määrä eturauhasen syöpä [26] . BPH luokiteltiin 37 tapausta minimaalinen (min), lievä, keskivaikea tai vaikea, perustuu seuraaviin kriteereihin. Min /ohjaus: TZ tilavuus 4,5 cm

3, eturauhasen paino 34 g, ei BPH kyhmyt; Lievä BPH: TZ volyymi 4,5-8,99 cm

3 tai eturauhasen paino 34-44,99 g tai BPH kyhmyt; Kohtalainen BPH: TZ volyymi 9-16,99 cm

3 tai eturauhasen paino 45-59,99 g ja BPH kyhmyt; Vaikea BPH: TZ volyymi ≥17 cm

3 tai eturauhasen paino ≥60 g ja BPH kyhmyt. Eturauhassyöpäkudoksille luokiteltiin kohtalaisen eriytetty (Gleason pisteet 5-6) tai heikosti eriytetty (Gleason pisteet 8-9). Pikajäädytettii tuoreesta kudoksesta ytimet hankitaan alla kuvatut käsiteltiin RNA ja histologia [27].

Sub-Munuaisten ksenografti Fresh Human TZ Näytteet ja Hormonaaliset Ablaatio strategiat

De-tunnistettu ihmisen eturauhasessa näytteet saatiin Vanderbilt Tissue Acquisition Core kautta patologian osaston mukaisesti Vanderbilt IRB protokollia. 6 mm halkaisijaltaan saadut ytimet leikkauksen tuoreista RP yksilöt hankittiin oikean ja vasemman TZ ja PZ puolivälistä pohja ja puolivälistä kärjestä kuvatulla [27] ja histologinen analyysi tehtiin jääleikkeillä koko paksuudeltaan poikkileikkauksia. Ytimet määritettiin sisältävän normaalin TZ kudos leikattiin paloiksi noin 2-3 mm paksu ja 4-6 kappaletta sitten ksenosiirrettyjä alle munuaiskotelo täysikasvuisten urospuolisten sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriä [CB-17 /IcrHsd-SCID-hiirten ( Harlan, Indianapolis, IN)]. TZ kudokset jokaisesta kuudesta potilasta ksenosiirrettyjä osaksi sarjaa 10 kastroitu SCID joidenkin ryhmien saavien hiirten kudoksen kahdesta eri potilaille, kun käytettävissä, varttaa contralateral munuaisiin. Viisi hiirtä kustakin ryhmästä annettiin ihonalaista implantit, joka koostuu 2,5 cm: n pituus silastinen letku (ID 1,98 mm x OD 3,18 mm, Dow Corning, Midland, MI), joka sisälsi 25 mg testosteronia (PCCA, Houston, TX). Päät Silastic letkun suljettiin silikoni-tyypin lääketieteellinen liima (Dow Corning). Pieni määrä maissiöljy lisättiin ennen sulkemista letku liukenemisen helpottamiseksi testosteroni. Sen jälkeen kun ksenograftit perustaa yhden kuukauden, implantit poistettiin testosteroni täydentää hiiret, ja 25 mg testosteronia pellettejä (tuotettu Parr Pellet Press, malli 2816, jossa 4,5 mm kuolla, Parr Instrument Company, Moline, IL) istutettiin ihonalaisesti hiirissä, jotka eivät olleet saaneet testosteronia. Ohjaus hiiret tapettiin ajankohtana androgeenin lisäämällä tai poistamalla, ja loput hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin 1, 3, 7, ja 14 päivää seuraavan androgen lisäämällä tai poistamalla. Hakkuut -ksenografteja nopeasti leikeltiin suurennettuna ja jäädytettiin nestetypessä. Jäädytetyt kudokset varastoitiin -80 ° C: ssa.

RNA Extraction ja cDNA mikrosirut

RNA uuttamalla pikajäädytettiin TZ kudosten ja korjataan ksenografteissa suoritettiin käyttämällä muunnelmaa aiemmin kuvattu menetelmiä [27] , [28]. Lyhyesti, RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), jota seurasi toinen RNA: n eristämistä käyttämällä RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA), jossa DNaasikäsittelyä. RNA-näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa. RNA laatu analysoitiin Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) käyttäen spektrofotometrisesti (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ja Bioanalysis (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA näytteitä -ksenografteja toimitettiin VMSR monistamista (NuGen Systems, Inc., Traverse City, MI) ja merkinnät, sen jälkeen hybridisoimalla microarray tulostettu Human Release 2.0 OligoLibrary, (Compugen, San Jose, CA), joka sisälsi 28830 ainutlaatuisia geenejä yhteensä 29134 oligojen. Viittaus RNA luodaan yhdistämällä RNA näytteitä sekä kastraatiotason ja androgeenien käsitelty kudoksissa päivästä nolla verrokkihiirten.

Tilastollinen analyysi Microarray Data

Koska huomattavaa vaihtelua luonnostaan ​​yksittäisillä potilailla ajan 0 kudos- näytettä käytettiin kontrollina tai viittaus näytteen sijaan referenssi näytteen koko kokeen. Data normalisoitiin Lowess käyttämällä GeneTraffic ohjelmistoa (Iobion Informatics, La Hoya, CA) ja tuodaan GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) myöhempää analysointia. Aluksi vain päivinä 0 ja 14 ajankohtina katsottiin, joissa geenit, jotka oli vähintään 1,5-kertaiseksi säätelyyn ylöspäin päivällä 14 näytettä vs. päivä 0 valitaan, mikä tuotti 5679 geenejä /antureista. ANOVA-analyysiä käytettiin geenien tunnistamiseen on merkittäviä eroja eri ilmaisua, jossa on

P

-arvo katkeaminen 0,05, mikä osoittaa 284 odotettavissa vääriä positiivisia geenejä. Welch t-testiä käytettiin sitten tunnistamaan geenejä merkittäviä eroja (

P

-arvo alle 0,05) ilmentymisen välillä päivinä 0 ja 14 kaikissa kudosnäytteistä. Tämä luettelo suodatetaan sitten signaalin ilmaisun arvo, säilyttäen top 95% signaalin dynaaminen alue, mikä tuotti 784 geenit /antureista. Tämä analyysimenetelmä oli itsenäisesti suoritettiin sekä kastraatiotasolle ja testosteroni täydentää aineistoja. Kaikki tilastolliset analyysit microarray tietoja suorittaman VMSR.

tunnistaminen Candidate biomarkkereiden Tavoitteiden

Mahdolliset kandidaattigeenit järjestelmällisesti valittu päällekkäisiä bioinformatiikan kriteerit, jotka käyttävät WebGestalt: 1) androgeenisäädellyn (1,5 kertainen tai

P

≤0.05 sisällä microarray data), 2) ilmaisi huomattavasti korkeammilla tasoilla eturauhasen suhteessa muihin kudoksiin (

P

≤0.05 by hypergeometrisen testi), ja 3) ekstrasellulaaritilan tai solun pinnalla (Gene ontogeny luokat). Nämä kriteerit tuottivat joukon geenejä, jotka sisältyvät aiemmin validoitu biomarkkereita, kuten

KLK3

,

ACPP

, ja

MSMB

. Useita muita geenejä tiedetään tai epäillään olevan osallisena BPH perustuvat aiemmin tutkimuksia ”manuaalisesti” mukana lisätutkimuksia:

IGF1-

,

IGF1 R

,

TGFB1

,

TGFB3

,

TGFBR1

, ja

TGFBR2

. Kaikkiaan 84 geenikohteet (ja

18S

rRNA siivous ohjaus geeni) valittiin vahvistusta ilmentymisen potilaan näytteitä, useita arvioitu tarpeeton koettimilla.

Real-Time qRT-PCR Vahvistus

TaqMan alhaisen tiheyden mikrofluidinen array kortti, muoto 96a (Applied Biosystems, Foster City, CA) suunniteltiin määrittämään kandidaattigeenit päässä mikrosiruanalyysi ja ohjaus geenit, yhteensä 96 tavoitteita. 1 ug kokonais-RNA käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNA käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems). CDNA-synteesin jälkeen RNA pilkottiin alkalisella hydrolyysillä, säädettiin neutraaliin pH-arvoon, ja cDNA puhdistettiin adsorptiolla silikageelillä (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen Inc.) ja eluoitiin 64 ul: aan 10 mmol /l Tris-HCI (pH 8,5) . cDNA määriä mitattiin spektrofotometrisesti (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). cDNA laimennettiin 0,25 ng /ul 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), ladataan -mikronestekorttia, suljettiin ja sentrifugoitiin. Kortit sitten aloiteta ABI Prism 7900HT järjestyksessä tunnistusjärjestelmä, ja tiedot analysoitiin SDS 2.1 -ohjelmisto (Applied Biosystems). Normalisoinnin jälkeen endogeeniseen ohjaus, 18S rRNA, tasot ilmaistiin suhteessa kontrolliin RNA allas calibrator (fold change). RNA: t valmistettiin kullekin BPH kudokset yhdistettiin 5-10 potilasta. Ohjaus RNA yhdistettiin potilaista, joilla ei ole merkittävää TZ laajentumista. Analyysin mukana neljä rinnakkaista varten lievä ja vakava BPH altaat, sekä kohtalaisen eriytetty ja huonosti eriytetty eturauhassyövän altaat, ja kahdeksan rinnakkaista valvonta- ja maltillinen BPH altaat.

immunohistokemiallinen värjäys

Ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä parafiiniin koko kohteen korttelin päässä 43 potilasta alunperin ominaista BPH patologian vakavuus ja hyödyntää vastaavien TZ RNA saatiin Vanderbilt Tissue Acquisition Core kautta Kliinisen patologian ja kudossiruina muodostettiin yksi kirjoittajat (MPR). Mikrosiruissa sisälsi kolme 0,6 mm kairausnäytteitä, kaksi TZ ja yksi PZ päässä syöpään mukana alueella. Värjäys kudosleikkeiden suoritettiin käyttäen aiemmin kuvattua protokollaa [29]. Osiot (5 um) leikattiin ja asennettiin veloitetaan lasilevyille. Jälkeen deparaffinization ja nesteytys, kudoksen leikkeet altistettiin antigeenille haku kuumentamalla mikroaaltouunissa 10 minuuttia Vector H-3300 antigeenin peittymisen liuosta (1:100, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Sitten aluslaseja inkuboitiin 0,3% vetyperoksidia metanolissa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT), jota seurasi 1 tunnin inkuboinnin 5% vuohen seerumilla PBS: ssä huoneenlämpötilassa. Laseja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa 5% vuohen seerumilla PBS: ssä. Vasta-aineita käytettiin hiiren monoklonaalisella vastaan ​​TIMP2 (1:300, sc-21735, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja kanin polyklonaalisten vasta-aineiden varalta FGF2 (1:500, sc-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja SMOC1 (1:100, Atlas Antibodies, Tukholma, Ruotsi). Objektilasit pestiin sitten ja niitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (kanin anti-hiiri- tai sian anti-kani, 1:300, DAKO, Carpinteria, CA) huoneenlämpötilassa 60 minuutin ajan, pestiin PBS: ssä laajasti, sitten niitä inkuboitiin ABC-HRP kompleksin (Vector Laboratories) 30 minuuttia. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin sitten inkuboimalla nestettä 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAKO). Sitten lasit huuhdottiin laajasti vesijohtovedellä, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja asennettu. Stained kudosleikkeet valokuvattiin ja prosessoidaan käyttäen Zeiss AX10 Imager.M1 mikroskoopilla ja AxioVision Release 4.6 ohjelmisto.

immunovärjättiin liukuu tarkisti patologi (MPR) sokaissut BPH patologian tapauksen vakavuudesta ja tulokset ilmaistiin puoliksi kvantitatiivisesti. Prosenttiosuus värjäys pisteytettiin asteikolla 0-4, jossa 0 = ei värjäytymistä, 1 = alle 25%, 2 = 25%: sta 50%, 3 = 50% 75%, ja 4 = 75% 100%. Värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin asteikolla 1-3, jossa 1 = lievä, 2 = kohtalainen, ja 3 = merkitty. Kun näyte saadaan mitään värjäytymistä, intensiteetti tilanne oli myös 0. Kun sekä strooman ja epiteelin värjäystä oli läsnä, pisteytys tehtiin erikseen. Laskea proteiinin ilmentymisen indeksin prosenttiluku oli summataan intensiteetti pisteet. Yhdistetyt tulokset esitettiin graafisesti kunkin BPH patologian luokan (minimaalinen, lievä, keskivaikea, vaikea BPH muutokset), ja Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertaamaan yhdistettyjen suhteiden eri sairauden vakavuudesta tila.

Tulokset

androgeenisäädellyn geeniekspressioprofiilien Human Prostate Transition Zone

profiloitu geeniekspressiomalleja ihmisen eturauhasen TZ ksenografteissa jälkeen lisäämällä tai vähentämällä testosteronin. Kuvio 1 esittää yleisen järjestelmän käytetään manipulointi androgeenitason SCID-hiirissä kätkeminen Saharan munuaisten kapseli eturauhasen ksenografteissa. Kokonais-RNA valmistettiin korjattu ksenografteja kanssa tai ilman altistumista testosteroni 0, 1, 3, 7, ja 14 päivää. Allas on valmistettu yhtä suuret määrät RNA päivästä 0 kastraatiotason ja ehjä hiiri ksenografteissa käytettiin standardireferenssiliuos. Kaikkiaan 58 disointeja päätökseen, joka sisälsi näytteet kuudesta potilaista. Alustava analyysi osoitti korkeaa (jopa 10-kertainen) potilaan-to-potilaiden vaihtelua ekspressiotasot tunnettu androgen geenien kuten

KLK3

(PSA). Jotta tähän arvioidaan biologisen vaihtelevuuden yksittäisten potilaiden kudosten, kunkin potilaan kudoksen RNA-näytteet uudelleen keskitetty kyseisen potilaan aika 0 valvontaa. Ensisijaisen analyysin kaksi ajankohtina tutkittiin päivinä 0 ja 14, jolloin saatiin 5679 geenien kanssa 1,5-kertainen tai suurempi nousu ilme. ANOVA-analyysi suoritettiin seuraavilla 5679 geenejä, joiden

P

-arvo cut-off 0,05, joka ennustaa 284 vääriä positiivisia. Geenit, jotka oli vähintään 1,5-kertainen nousu tai lasku ilmaisun päivällä 14 näytettä vs. päivä 0 sitten suodatetaan signaalin ilmaisun arvo, säilyttäen top 95% signaalin dynaaminen alue, mikä tuotti 784 geenejä. Microarray data on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus [30] ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE17862 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE17862) .

TZ kudosten kuudesta potilaat olivat ksenosiirrettyjä alla munuaiskotelo kuohittujen sonnien SCID hiiriin (10 hiirtä per potilas). Viisi hiirtä kustakin ryhmästä annettiin sen jälkeen ihonalaiseen implantteja, jotka sisältävät 25 mg testosteronia. Sen jälkeen kun xenographs luomaan yhden kuukauden, implantit poistettiin testosteronin täydentää hiiret, ja 25 mg testosteronia pelletit istutettiin hiirillä, jotka eivät olleet saaneet testosteronia. Ohjaus hiiret tapettiin ajankohtana androgeenin lisäämällä tai poistamalla, ja loput hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin 1, 3, 7, ja 14 päivää.

Genes Up-säätelemä Androgeenit Human TZ Ksenograftien

taulukossa 1 luetellaan alkuun 45 geenejä, jotka säädellään ylöspäin vasteena androgeenin, lajiteltu kertainen muutos (laskevassa järjestyksessä). Top kolme geeniä,

KLK3

(PSA),

MSMB

(beta-microseminoprotein), ja

TMEPAI

(transmembraaninen eturauhanen androgeenin indusoiman proteiinin) olivat kaikki aiemmin hyvin tunnettuja säänneltävä androgeenien ihmisen eturauhasen [31], [32], [33]. Useita muita geenejä tunnistettu säädellään ylöspäin ihmisen TZ ksenografteissa testosteroni on myös aiemmin osoitettu säänneltävä androgeenien. Näitä ovat

TRPM8

(ohimenevä reseptorin potentiaalia melastatin jäsen 8), oletetun ennustetekijöitä merkki ja terapeuttinen kohde eturauhassyövässä [34], [35],

ACPP

(eturauhasen hapan fosfataasi) [36 ],

SCGB1A1

(uteroglobin) [37],

NDRG1

(N-myc alavirtaan säännelty geeni 1) [38], ja

CREB3L4

(cAMP reagoiva elementti sitova proteiini 3 kaltainen 4) [39].

RNASEL

on raportoitu ehdokkaaksi perinnöllistä eturauhassyöpää geeni [40]. Muita geenejä tunnistettu jotka on ilmoitettu androgeenisäädellyn tai osallisena BPH tai eturauhasen syöpä mukana

PTGDS

(prostaglandiini D2 syntaasi),

FGFBP1

(fibroblastikasvutekijä sitovan proteiinin 1),

KLK11

(kallikreiini 11),

CXCL5

(kemokiini (CXC-motiivin) ligandi 5),

FKBP11

(FK506 sitovan proteiinin 11) ja

TIMP1

( kudos estäjä metalloproteinaasi 1).

TMEPAI

(transmembraaninen eturauhanen androgeenin indusoima proteiini) oli pisimmälle ilmaistu androgeenisäädellyn geeni tunnistettu. Muita erittäin ilmaisi, androgeenireseptorin geenien mukana

KLK3

(PSA),

MSMB

(beta-microseminoprotein),

ACPP

(eturauhasen hapan fosfataasi) ja

SCGB1A1

(uteroglobin).

geenit säädellään ylöspäin vastaus androgeenien peruuttaminen

taulukossa 2 luetellaan alkuun 45 geenejä, jotka olivat säädellään ylöspäin vasteena peruuttamiseen androgeenireseptorin 14 päivää , lajiteltu kertainen muutos (laskevassa järjestyksessä). Yksi geenien tunnistettu,

GLI1

on säädellään ylöspäin hiiren eturauhasen kastraation jälkeen [41]. Toinen geeni tunnistettu lisääntynyt ilmentyminen oli

ANNAT1

(anneksiini 1), joka on raportoitu laskevan androgeeni stimuloidut eturauhassyöpä verrattuna eturauhasen hyvänlaatuinen epiteeli [42].

kvantitatiivinen RT -PCR analyysi ihmisen eturauhasen RNA-altaat

tutkimiseksi edelleen ekspressiotasot androgen geenien tunnistetaan mikrosiruanalyysillä, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin valittu tavoitteet käyttäen RNA-altaat ovat peräisin ihmisen eturauhasen kudoksista. Merkittävä kliininen tarve on tunnistaa biomarkkerit, jotka tarjoavat prognostista tietoa BPH etenemistä tai joka voi ennustaa vastaus hoitoja, kuten 5-alfa-reduktaasin estäjät. Eritettyjä proteiineja, jotka voidaan mitata helposti veressä ovat erityisen houkuttelevia kliinisessä tavoitteita. Vuodesta geeniekspressioprofiilien hormonin manipuloitu TZ ksenografteja, potentiaali biomarkkerit järjestelmällisesti valittu päällekkäisiä bioinformatiikan kriteerit, jotka käyttävät WebGestalt. Geenikohteet valitut olivat 1) androgeenisäädellyn sisäpuolella microarray data, 2) ilmaisi huomattavasti korkeammilla tasoilla eturauhasen suhteessa muihin kudoksiin, ja 3) tunnettu tai ennustettu ilmaista erittyvän tai solunpintaproteiinit. Nämä kriteerit tuottivat joukon kandidaattigeenejä (taulukko 3), johon sisältyi joitakin aiemmin tunnettu biomarkkereita, kuten

KLK3

,

ACPP

, ja

MSMB

edelleen validointi meidän kokeellista lähestymistapaa . Muita kiinnostavia geenejä lisätty ”manuaalisesti” RT-PCR-analyysi oli

IGF1-

,

IGF1 R

,

TGFB1

,

TGFB3

,

TGFBR1

, ja

TGFBR2

. Ilmaisu määriä näitä kohdegeenien mitattiin RNA altaat valmistettu TZ kudoksista nimetty lievä, keskivaikea ja vaikea BPH muutokset sekä kohtalaisesti ja huonosti eriytetty eturauhassyöpää. RNA kullekin BPH tai eturauhasen syöpä kudoksiin yhdistettiin 5-10 potilaan näytteistä. Ohjaus RNA yhdistettiin TZ näytteistä potilailta, joilla ei ole merkittävää TZ laajennusta rauhas ja strooman hyperplasiaa.

tulokset qRT-PCR analyysejä on esitetty taulukossa 4. RNA ekspressiotasoja määritettiin 86 ehdokas biomarkkereiden geenejä. Näistä 72 geenit oli päättänyt olla suurempi kuin 6-kertainen korkeampi kuin normaali kontrolli altaan ainakin yhden BPH tai eturauhasen syöpä altaita. Vertailuryhmään nähden eturauhasen RNA-allas, keskimääräiset tasot BPH tai eturauhassyövän RNA allasta ekspressiotasot 1-kertainen, nimettiin ”matala”, 1- 6-kertaiseksi, nimettiin ”kohtalainen”, ja 6-kertainen, nimettiin ”high”. Näiden kriteerien perusteella, jokainen geeni siirrettiin johonkin kuuteen ryhmään (taulukko 4). Viisitoista geenit olivat korkealla sekä BPH ja eturauhasen syöpä, 41 geenit olivat suuret BPH ja maltillinen eturauhassyövässä, kaksi geeniä olivat suuret BPH ja alhainen eturauhasen syöpä, ja viisi geenit olivat maltillisia BPH ja korkea eturauhassyövässä. Ei geenejä havaittiin, että oli luokiteltavissa ”matala” BPH.

Candidate BPH biomarkkereiden Genes

Useat geenit oli ilmennystasoissa BPH altaat joka kasvoi sairauden vakavuuden . Jotkut geenit oli ekspressiotasot, jotka olivat erityisen koholla BPH, mutta suhteellisesti matalampi eturauhassyövän altaat. Nämä geenit odotettaisiin on paras potentiaali ehdokas BPH biomarkkereita, kuten spesifisyys verrattuna eturauhasen syöpä. Ne ilmaistaan ​​solun, niiden keskimääräinen ekspressiotaso vähintään kolme kertaa suurempi BPH RNA altaat kuin eturauhassyöpä RNA-allas sisältyvät:

CDH13

,

CHRNB1

,

COL4A5

,

EFEMP2

,

EMP3

,

F10

(16-kertainen),

FGF2

,

FGFBP1

(10-kertainen ),

IGF1-

,

IGF2

(18-kertainen),

LIPG

,

WR

,

SGCA

,

SGCD

,

TGFB1

,

TGFB3

(14-kertainen),

TGFBR2

ja

TIMP2

on ”korkea BPH, maltillinen eturauhassyöpä ”ryhmä;

SMOC1

(26-kertainen) ”korkea BPH, alhainen eturauhasen syöpä” ryhmä; ja

SCGB3A1

(15-kertainen) ja

SCGB1A1

(14-kertainen) ”kohtalainen BPH, alhainen eturauhasen syöpä” ryhmä.

Immunohistokemiallinen värjäys Select geenikohteet in Pathology-Ominaista BPH kudosten

Voit selvittää erot RNA ekspressiotasot havaitaan BPH kudoksissa olivat myös läsnä proteiinin tason ja edelleen luonnehtia epiteeli- ja /tai strooman lokalisointi mahdollisten lisääntyneen ilmentymisen teimme immunohistokemia (IHC) on BPH kudos microarray (TMA). Array sisälsi 129 kudososat 43 ainutlaatuinen potilaista, jotka sisältävät BPH kudoksiin patologioiden vaihtelevat vähän vakavaan määriteltyihin Materiaalit ja menetelmät.