Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

topoisomeraasi I (TOP1) on tavoite TOP1 estäjän kemoterapiaa.

TOP1

geeni, joka sijaitsee 20q12-q13.1, on usein havaittu korkeassa kopiomäärän peräsuolen syöpä (CRC). Tässä tutkimuksessa selvitetään mekanismi, taajuus sekä varoituksia vaikutus

TOP1

geeni poikkeavuuksia vaiheen III CRC ja miten niitä voidaan havaita fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH).

Methods

Yhdeksän CRC solulinjaa metafaasissa levitteet analysoitiin FISH kanssa

TOP1

anturi yhdistettynä viittauksella koetin kattaa joko sentromeerisen kromosomin alueen 20 (CEN-20) tai kromosomin 2 (CEN-2) . Kudososat 154 chemonaive vaiheen III CRC potilaita, aiemmin tutkittu

TOP1 /

CEN-20, analysoitiin

TOP1 /

CEN-2. Väliset suhteet biomarkkereiden tila ja yleinen (OS), aika uusiutumiseen (TTR) CRC ja aika paikallisen uusiutumisen (LR; peräsuolen syöpä vain) määritettiin.

Tulokset

TOP1

poikkeamia havaittiin neljässä solulinjassa metafaasien. Kaikissa solulinjoissa CEN-2 havaittiin heijastamaan kromosomi ploidia tasoa ja siksi

TOP1 Twitter /CEN-2 koetin yhdistelmä valittiin tunnistamaan

TOP1

geeni voitot

(TOP1 /

CEN-2≥1.5). Sata ja kolme potilasta (68,2%) oli

TOP1

voitto, joista 15 potilasta (14,6%) kanna vahvistinjärjestelmään (

TOP1 /

CEN-20≥2.0).

TOP1

geeni voitto ei ollut yhteyksiä kliinisiin muuttujiin, kun taas

TOP1

vahvistus osoitti ei-merkitsevä suuntaus enää TTR (monimuuttuja HR: 0,50, p = 0,08). Vahvistuksen jälkeen tapausta erillään muista tapauksista geenin voitto, ei-monistetun geenin kasvaa (

TOP1

/CEN-2≥1.5 ja TOP1 /CEN-20 2,0) osoitti suuntaus kohti lyhyempiä TTR (yhden muuttujan HR: 1,57, p = 0,07).

Johtopäätökset

TOP1

geenikopiomäärä kasvu esiintyy usein vaiheen III CRC mekanismi, joka sisältää usein CEN-20. Käyttämällä CEN-2 mittana kasvaimen ploidian tasoilla, pystyimme syrjiä eri mekanismeja geenien voiton, joka näytti eroavat prognostisten vaikutus.

TOP1

FISH ohjeet on päivitetty.

Citation: Smith DH, Christensen IJ, Jensen NF, Markussen B, Rømer MU, Nygård SB, et al. (2013) mekanismit topoisomeraasi I (

TOP1

) geenikopiomäärä lisäys on vaiheen III peräsuolen syövän Patient Kohortin. PLoS ONE 8 (4): e60613. doi: 10,1371 /journal.pone.0060613

Editor: Anthony WI. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 19 joulukuu 2012; Hyväksytty: 28 helmikuu 2013; Julkaistu: 05 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Smith et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Tanskan viraston tiede-, teknologia- ja innovaatio kautta Industrial PhD-ohjelman. Nils Brünner ja Hans Jørgen Nielsen tukivat Tanskan Neuvosto for Strategic Research, Simon Fougner Hartmanns Family Foundation, IMK Almene Foundation, Kathrine og Vigo Skovgaards Foundation, Tømrermester Johannes Fog Foundation, Fabrikant Einar Willumsenin Memorial Trust, Tanska Cancer Society, Tanskan Medical Research Council, The Hede Nielsen Foundation, johtaja Ib Henriksens Foundation, saha omistaja Jeppe Juhl ja vaimo Ovita Juhl Foundation, The Kornerup Fund, The Aase ja Ejnar Danielsen Fund ja The Aage ja Johanne Louis-Hansen Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: David Hersi Smith, Sven Müller ja Kirsten Vang Nielsen työskentelee Dako A /S . Nils Brünner on lääketieteellinen neuvonantaja Dako A /S. Ib Jarle Christensen on ulkoinen konsultti Dako A /S. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Vuonna 2011 CRC osuus arviolta yhdeksän prosenttia uusista syöpätapauksista sekä yhdeksän prosenttia syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Hoitoon kehittyneiden CRC (vaihe IV), kaksi kemoterapeuttiset vaihtoehtoa: 5-fluorourasiili (5-FU, kapesitabiini) yhdessä irinotekaanin (FOLFIRI) tai oksaliplatiinin (FOLFOX) plus biologisia tekijöitä. Useat tutkimukset raportoivat samanlaisen hoitovaste näiden kahden hoito ensilinjan hoitoon edenneen taudin [2] – [4], jossa on yksi tutkimus raportoi huomattavasti korkeampi vaste kanssa FOLFOX [5]. Kiinnostavaa, yksi näistä tutkimuksista raportoitu toinen rivi 6% tavoitteen vaste FOLFIRI hoitoon epäonnistuneen FOLFOX ja 21% tavoite vastauksena toisen linjan FOLFOX hoitoon epäonnistuneen FOLFIRI, osoittaa ei-ristiresistenssiä välillä irinotekaani ja oksaliplatiini [4]. Tämä havainto herättää kysymyksen, onko potilasalaryhmässä jotka saivat FOLFOX ensilinjan hoitoon olisi hyötynyt FOLFIRI ensimmäisen vaiheen hoidossa, tai päinvastoin. Olemme näin ollen, että suunnattuja löytö ennakoiva biomarkkereiden profiilin FOLFOX /FOLFIRI hoitotulokseen perusteltua.

Irinotekaani, aihiolääke SN-38, toimii estämällä entsyymin topoisomeraasi I (TOP1) [6]. Top1 olennainen rooli lievittämisessä topologinen rasitukset syntyä DNA: n replikaation ja transkription nirhaisemalla, rentouttava ja uudelleen liittämällä kaksijuosteisen DNA rakenne. SN-38 sitoutuu TOP1 ja vakauttaa väli DNA-TOP1 komplekseja. Myöhemmät uudelleen ligaatio estyy, mikä johtaa lopulta solukuoleman johtuu DNA vaurioita DNA: n replikaation tai transkriptio [6], [7]. Top1 on johtuen rooliaan kohteena SN-38 on ehdotettu mahdolliseksi ennakoivan biomarkkeri FOLFIRI hoitotulokseen. Kehittyneissä peräsuolen syövän, kaksi suurta takautuva joissa tutkitaan suhdetta TOP1 proteiinin tasojen ja irinotekaanin hoitotuloksia tuottavat ristiriitaisia ​​tuloksia [8], [9]. Vaikka nämä ponnistelut on suunnattu opiskelu TOP1 proteiinin tasot, tutkimus kromosomaaliseen muutoksia, joihin liittyy topoisomeraasi I-geenin (symboli:

TOP1

) ovat rajalliset. Sijaitsee 20q12-q13.1, osa usein sai 20q alue sekaantunut adenooma sinoomaan etenemistä [10] – [13],

TOP1

löytyy korkeissa kopiomäärän suuri osa vaiheen III CRC näytteitä havaita loisteputki in situ hybridisaatio (FISH) [14], [15],

meidän tutkimuksessa

TOP1

, olemme aiemmin osoittaneet, että vaiheessa III CRC chemonaive potilaan kohortissa (n = 154), lisääntynyt

TOP1

geenikopiomäärä oli merkitsevästi yhteydessä pidempi (OS) [15]. Mielenkiintoista, arviolta 71%: lla potilaista kanna

TOP1

geenikopiomäärä kasvu, kun taas vain 10% potilaista kanna

TOP1

vahvistus [

TOP1 Twitter /CEN-20 ( Sentromeeri 20) suhde ≥2.0] [15], mikä osoittaa, että geenien monistuminen ei ole yleisin mekanismi tuottaa ylimääräisiä kopioita

TOP1

. Vahva korrelaatio

TOP1

ja CEN-20 todettiin, paljastaen yhdistyksen välillä

TOP1

ja CEN-20 kopioluku kasvaa. Tämä viittaisi siihen, että geeni vahvistuksen mekanismit ovat mukana sekä

TOP1

rataa, ja kromosomi 20 sentromeerisen alueen tapahtua myös, mahdollisesti voitto koko 20q varteen esim isochromosome muodostuminen tai koko kromosomin 20 vahvistusta (aneusomy). Tämäntyyppinen geenikopiomäärä nousisivat mekanismit liittyvät kromosomiin missegregation eikä geenimonistuksen. Mittaus geenikopiomäärä muutoksiin FISH perinteisesti perustuu käytön samassa kromosomissa viittaus koetin, esim. käyttäen CEN-20 mittaamiseen geenien kromosomissa 20, me siis lähti kehittämään uutta FISH määritys erottaa kasvaimeen yksilöt

TOP1

kopioluvun suurenee monistukset niiltä, ​​joilla suurenee 20q voiton tai aneusomy by viitekoron koetin suunnattu liity kromosomissa.

tarkoitus nykyisen on selvittää taajuus

TOP1

muutoksia, kartta tahansa prognostisia vaikutuksia näillä geenin poikkeamia, tunnistaa cut-off jotka heijastavat taustalla geneettinen mekanismit

TOP1

kopioluvun muutoksia ja päivittää FISH pisteytys ohjeita vähentää tarkkailija työtaakkaa. Näiden tavoitteiden saavuttamiseksi, mekanismi

TOP1

geenikopiomäärä voitto tutkittiin paneelia CRC solulinjojen kanssa tarkoituksena on tunnistaa viittaus koetin joka todenmukainen ploidian tasoilla, jotta

TOP1

kopioluku kasvaa tulisi havaita suhteessa kokonaismäärään kromosomien (ploidia taso) ja tämä tapahtuu parhaiten käyttämällä geenin sentromeeri suhde. Romaani koetin yhdistelmä, joka koostuu

TOP1

ja sentromeeriantigeenin 2-spesifinen (CEN-2) koetin, levitettiin sitten aiemmin testattu vaiheen III CRC potilaan näytteitä syrjiä potilaille kätkeminen

TOP1

kopiomäärä kasvaa aiheuttamia mekanismeja kromosomijaksosta missegregation ja aiheuttamat geenimonistuman. Välinen suhde eri mekanismien

TOP1

kopioluvun lisääntyminen ja potilaiden ennusteeseen tutkittiin. Lisäksi perustuvat kaikkiin FISH tiedot, voisimme päivittää

TOP1

FISH pisteytys ohjeita.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Potilaat ja kliiniset Material

One sata viisikymmentäneljä CRC histologisesti varmistettu vaiheen III adenokarsinomia ja saatavissa FFPE kasvain näytteet valittiin aiemmin on kuvattu (ks. 1) [15]. Kaikilla potilailla oli kirurginen asemointia niiden CRC ja saanut adjuvanttia radio- ja /tai kemoterapiaa, koska tämä ei ollut osa standardin CRC hoitoa Tanskassa aikaan (huhtikuu 1991-elokuu 1993). Potilaat satunnaistettiin saamaan joko Ranitidiinilla tai lumelääkettä enintään viisi vuotta ilman vaikutusta ranitidiinin eloonjäämiseen raportoitu [16]. Osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja tutkimus tehtiin noudattaen Helsingin II julistuksen hyväksyntää Tanskan National Board of Health (2760-419-1989), Data Protection Agency (1991-1110-751) ja Keski kansallinen eettinen komitea ( KF 01-2045 /91). Hyväksyntä sisältyi kokoelma kudosnäytteiden myöhempää analyysia biologisten merkkiaineiden (KF 01-078 /93).

2.2 Valmistelu metafaasien Ei-katkaistu Interphase Nuclei

CRC solulinjoja Colo-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM12, ja SW620 saatiin NCI /Development Therapeutics Program, kun taas DLD -1, LoVo, ja LS-174T saatiin American Tissue Culture Collection. Solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 RPMI 1640 GlutaMAX ™ kasvualustaan ​​(Invitrogen, Carlsbad, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen). Kun viljelmät saavuttivat yhtymäkohdassa -70%, Colcemid (Invitrogen) lisättiin ja viljelmiä inkuboitiin 2 h ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut otettiin talteen, ja hypotoninen käsittely suoritettiin (0,075 M KCI), 10 minuutin ajan. Fiksaatio suoritettiin (fiksatiivi: 03:01 v /v absoluuttista metanolia ja jääetikkahappoa) ja tämä suspensio tiputettiin objektilaseille.

2.3 TOP1 /CEN-2 Probe Seos

TOP1

geenikoettimena on aiemmin kuvattu muualla [14]. CEN-2-spesifistä koetinta (Dako, Glostrup, Tanska), joka koostuu useista FITC-leimatun peptidi nukleiinihapon monomeerien suunnattu toistuvia α-satelliitti-sekvenssit, yhdistettiin Texas Red-leimattua DNA-geenin koettimeen IQFISH puskurissa [17] (Dako).

TOP1 Twitter /CEN-20 koetin yhdistelmä on aiemmin kuvattu [14].

2.4 FISH Menettely

FISH reagenssit olivat peräisin Sytologia FISH varustesetti (K5499) ja histologia FISH varustesetti (K5799) (Dako). Metaphase näytteet kiinnitettiin 3,7% formaldehydiä, pesty, kuivattu (70%: n, 85%, 96% etanolia sarja) ja kuivattiin ilmassa. FISH koetin ladattiin dia, denaturoitiin 82 ° C: ssa (

TOP1 Twitter /CEN-2:05 min,

TOP1 Twitter /CEN-20:10 min) ja hybridisoitiin (

TOP1 Twitter /CEN-02:01 h,

TOP1 Twitter /CEN-20: yön yli). Koetinylimäärä poistettiin pesemällä ankaruuden puskurissa (

TOP1 Twitter /CEN-2:63 ° C,

TOP1 Twitter /CEN-20:65 ° C). Levyjä pestiin, kuivattu, ilmakuivataan ja asennettu.

TOP1 Twitter /CEN-2 FISH hybridisoimalla FFPE yksilöt (paksuus: 3 um) suoritettiin valmistajan suositusten (Dako). Lyhyesti, objektilasit lämmön esikäsiteltiin (mikroaaltouunissa) ja pepsiiniä pilkottiin 37 ° C: ssa. Leikkeitä jälkeen denaturoitiin 66 ° C: ssa 10 minuuttia ja hybridisoitiin 45 ° C: ssa 1-2 tuntia ja sen jälkeen käsiteltiin kuten edellä on kuvattu.

2.4.1 Scoring.

FISH-signaalit olivat aluksi teki kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, signaalit laskettiin 60 asiaa ei-päällekkäisiä ytimet jos signaalit olivat vähintäänkin näkyvä 200 x suurennus asianmukaiseen suodatin. Pisteytys suoritettiin 1000 × suurennus Texas Red /FITC kaksinkertainen suodatin. Signaalin lukumäärät kirjoitetaan suoraan elektroniseen pisteytys levy (ystävällisesti A. Schönau, Dako, Glostrup, Tanska). Aluksi 60 ytimiä pisteytettiin kullekin näytteen seuraaviin

TOP2A

FISH pharmDx ™ ohjeiden (Code K5333, pakkausselosteessa, 1

st painos, 18.1.2008), jossa ydinten kätkeminen molemmat signaalit, sekä ytimet kätkeminen ainoa viittaus signaaleja pisteytettiin, mikä helpottaa havaitsemista geenin deleetioiden. Parantaa määrityksen herkkyyttä, vain ytimiä kätkeminen sekä geeni- ja ohjesignaalien olivat mukana lisäanalyysiä.

Voit selvittää mekanismi

TOP1

kopioluvun kasvu solulinjoissa, signaalin paikoissa ja numerot olivat totesi 50 metafaasien kunkin solulinjan. Kokonaismäärä kromosomeja jokaisen solulinjan määritettiin ottamalla digitaalisia kuvia kolmesta metafaasien kunkin solulinjan ja laskemalla kokonaismäärä kromosomien käsin.

määrittämiseksi haploid, diploidinen, triploideja ja tetraploidi vaihteluvälit CEN -2, 60 tumat laskettiin -tilan epiteelin vieressä kasvainkudoksen. Diploidinen alue määriteltiin seuraa 2n – (n /2) [min] ≤2n 2n + (n /2) [max], missä 2n yhtä kuin keskimääräinen CEN-2 iskuina tuman siinä (diploidi) ennallaan epiteelin. Triploideja ja tetraploidi alueet löytyivät käyttämällä 3n tai 4n sijasta 2n, vastaavasti. Haploidit ja korkea ploidia tasoalueilla määriteltiin alla diploidinen alue ja yläpuolella tetraploidinen vaihtelee vastaavasti. Määritelmä ploidia valikoimia on kuvattu aikaisemmin [18].

2.5 tilastolliset menetelmät

Kaikki kuvaileva ja selviytymisen analyysit suoritettiin käyttämällä SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, USA). R versio 2.15.1 käytettiin pisteytyksen menetelmässä optimointia.

2.5.1 Pisteytys menetelmiä.

Gene on Sentromeeri suhteet laskettiin myös joko ensimmäisen 10 tai 20 ytimet, määritetään

TOP1

tila ja vertaamalla tätä asemaa ottamalla huomioon kaikki asiaan ytimeksi. Concordance laskettiin käyttämällä Kendallin tau [tau = (samaa mieltä-eri mieltä) /(sopia + eri mieltä)]. Borderline välein lähellä raja-arvoja, joissa ylimääräisiä ytimiä on sisällytettävä (10 ytimet, vielä 10 ytimien jouduttiin teki; 20 ytimiä, ylimääräisen 20 ytimien jouduttiin sijoitettiin) määriteltiin suurempi tai yhtä suuri kuin 1,35 (min) ja vähemmän kuin 1,65 (max) sovellettuna cut-off oli 1,5. Käyttämällä HER2 /CEN-17 ohjeiden rajalinja aikaväli kattaa katkeamisen 2,0 määriteltiin suurempi tai yhtä suuri kuin 1,8 (min) ja alle 2,2 (max) [19]. Concordance ja keskimääräinen lukumäärä ytimien sijoitettiin laskettiin ja ilman rajaa välein.

2.5.2 Survival analyysi.

kolme päätepisteitä harkittiin: kokonaiselinaika (OS, aika kuolemaan tahansa syystä) , aika uusiutumiseen (TTR, aika joka tapauksessa liittyvät peräsuolen syöpä) ja aika paikallisen uusiutumisen peräsuolen syöpä (LR) (kuvattu yksityiskohtaisesti [15]). Kaplan-Meier-arvio todennäköisyydet esitetään binary muuttujia ja joitakin yhdistelmiä. Monimuuttujalähettimet analyysi tehtiin säätämällä sukupuolen, iän (per 10 vuotta ikäeroa) ja kasvainpaikantumisen (RC vs. CC). Cox regressioanalyysi käytettiin analyyseihin. Mallit todensi suhteellisuutta arvioitaessa oletus ja lineaarisuus jatkuvaan covariates työllistää Schönfeld ja Martingalen jäännöksiä.

TOP1

ja CEN-2 kopio numeroita, kun analysoidaan jatkuvana muuttujana log-muunnettiin (base 2) ja siksi heijastuu kaksinkertainen ero näiden vaihtelun todellinen suuruus. Tulokset esittämä hazard ratio (HR), jossa 95%: n luottamusväli (CI) ja p-arvot. Kaikki laskettu p-arvot olivat kaksipuolisia ja pidetään merkittävinä 0,05.

Tulokset

3.1 mekanismit TOP1 geenikopioluku- lisäys Cell Line Panel

Voit selvittää taustalla olevaa mekanismia (t)

TOP1

geenikopiomäärä lisäystä, metafaasissa leviää valmistettiin paneeli kymmenen CRC solulinjoissa. Metaphase valmiste oli menestyksekäs kaikkien paitsi yhden solulinjoista (LS-174T). Sen jälkeen myöhemmin hybridisoimalla

TOP1 Twitter /CEN-20 anturi, metafaasissa levitteitä analysoitiin suhteen kokonaismäärään kromosomien lukumäärä geeneihin ja sentromeeriantigeenin-signaaleja, sekä signaalin sijainti, jonka tulokset voidaan tarkastella taulukossa 1 ja kuviossa 2.

TOP1

geenikopiomäärä nousu oli neljä yhdeksästä solulinjoissa. Sekä Colo-205 ja SW620, geeni vahvistuksen näytti kytkeytynyt kromosomiin 20 aneusomy (Fig. 2A ja 2D, vastaavasti). HT-29 (Fig. 2B),

TOP1

geeni voitto esiintyi muoti viittaavia 20q isochromosome muodostumista. Vuonna KM12,

TOP1

voitto tapahtui riippumatta CEN-20 (Fig. 2C). Ei

TOP1

tiomonistukset havaittu. Kuten taulukosta 1, vain

TOP1

geeni voittoja, joihin ei liity CEN-20 (joka 1:01 tavalla) heijastuvat

TOP1 Twitter /CEN-20-suhde.

V: Colo-205, B: HT-29 (oikeassa alakulmassa: suurennetaan digitaalisesti isochromosome), C: KM12, D: SW620. Huom: Johtuen olemassa kaksi kromatidien kussakin metafaasissa kromosomi, todettu määrä geenin signaaleja on kaksinkertainen, mitä havaitaan interphase tumassa.

3.2 tunnistaminen New Reference Probe

tunnistamiseksi asiaa merkkiaine cellular ploidian eli kokonaismäärä kromosomien, NCI ja NCBI: n SKY /M-FISH ja CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky /skyweb.cgi) seulottiin. Kromosomi 2 näytti vähiten vaikuttaa riippumaton numeerisia poikkeamia, kuten koko kromosomin voitto, ja sen vuoksi valittiin tarkempaa analysointia solulinjassa metafaasissa paneeli. Kuten on esitetty taulukossa 1, triploideja solulinjoja (Colo-205 ja HT-29), havaittiin tuottavan kolme CEN-2-signaaleja, kun taas diploidit solulinjat tuottivat vain kaksi. Kaikki

TOP1

geenin kopio nousu näkyivät

TOP1 Twitter /CEN-2 suhde käyttäen cut-off-arvo 1,5, joka edustaa 3:02 välinen tilanne geenin ja sentromeerin ja heijastaa ylimääräinen

TOP1

kopioida joka diploidisolupopu-.

3,3 Stage III CRC Patient Materiaali

TOP1 Twitter /CEN-2 FISH hybridisaatio ja arviointi oli menestyksekäs 151 154 potilaan FFPE kasvainnäytteet (98%) (ks. 1). Jakauma

TOP1

ja CEN-2 signaalia oli homogeeninen kasvaimen yksilöitä. Parannella herkkyyttä havaita näytteet kätkeminen lisäkopioita

TOP1

, vain ytimet kätkeminen sekä

TOP1

ja CEN-2 signaalit sisällytetään seuraavaan analyysiin, joka johti mediaani 58 ytimien sijoitettiin kunkin tuumorinäytesylinterin (alue: 47-60). 50 satunnaisesti valittua näytettä, CEN-2 signaalit laskettiin -tilan paksusuolen limakalvon määrittämään keskimääräisen signaalien määrä (keskiarvo: 1,37, mediaani: 1,38, alue: 1,20-1,62). Nämä lukemat olivat käytetään määrittelemään diploidi (katso osa 2.4.1).

kasvain materiaali, CEN-2 vaihteli 1,19-2,52 kanssa mediaani 1,70. Vertaamalla keskimääräistä CEN-2 signaalit laskee kasvain ytimet ei-kasvain ytimet, suurin osa (97,4%) kasvaimen näytteet voidaan luokitella kätkeminen kaksi (disomic) tai kolme (trisomiseksi) kappaletta kromosomi 2 (taulukko 2) . Vuonna kasvain näytteissä,

TOP1

signaaleja vaihteli 1,33-6,72 per ydin mediaani 3,17 signaaleja, kun taas

TOP1 Twitter /CEN-2 suhde vaihteli 1,01-3,39 joiden mediaani 1,92 . Ei poistoja (

TOP1

/CEN-2 0.8) havaittiin.

3.3.1 määrittäminen

TOP1

tila.

Tunnistaa näytteiden kätkeminen

TOP1

geenikopiomäärä lisäys,

TOP1 Twitter /CEN-2 suhde cut-off 1,5 sovellettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3, näytteet tuottavat suhde on tai yläpuolelle cut-off sai

TOP1

tila ”Gain”, kun taas alle olivat kutsutaan ”

TOP1

Normaali. Aluksi 103 potilasta (68,2%) luokiteltiin ”Gain” käyttämisen cut-off.

Punainen viiva ilmaisee

TOP1

geenin signaali ja vihreä piste tarkoittaa sentromeerisen signaali. Esimerkit perustuvat CRC solulinja metafaasissa tulokset – trisomia (SW620), pentasomy (Colo-205), 20q isochromosome muodostuminen (HT-29) ja 20q vahvistus (KM12).

Kun kasvain näytteet kätkeminen lisäkappaletta

TOP1

tunnistettiin, tiedot

TOP1 Twitter /CEN-20 käytettiin selvittämään mekanismia

TOP1

geenin kopion lisäys. Soveltamalla

TOP1 Twitter /CEN-20 suhde cut-off 2,0 erottaa näytteiden jossa

TOP1

geeni vahvistus tapahtuu riippumatta CEN-20 (

TOP1

/CEN -20≥2.0) välillä, joissa geeni vahvistus tapahtuu johtuu aneusomies tai 20q isochromosome muodostuminen (

TOP1

/CEN-20 2.0), näytteet, joiden

TOP1

voitto voitaisiin kahtia osaksi vahvistetaan ja ei-monistettiin alaryhmiin. Siksi näytteet tuottavat

TOP1 Twitter /CEN-2 suhde yhtä suuri tai yli 1,5 ja

TOP1 Twitter /CEN-20-suhde yli tai yhtä suuri kuin 2,0 olivat kutsutaan ”

TOP1

Amplification ”, kun taas niille, alle 2,0 annettiin”

TOP1

Non-monistettiin Gain ”tila (ks. 3). Kuten taulukossa 3 on esitetty, suurin osa (58,4%) kasvaimen näytteet saivat

TOP1

Non-monistettiin Gain tila. Kaikki näytteet luokitellaan

TOP1

Amplification löydettiin myös tuottaa

TOP1 Twitter /CEN-2 suhde yli 2,0 (katso taulukko 3).

Voit tarkistaa luokittelun näytteiden alaryhmiin, keskimääräinen CEN-2 ja CEN-20 signaalit kasvaimen ytimet verrattiin niiden keinoin ennallaan paksusuolen limakalvolla, jonka tulokset on lueteltu taulukossa 2. näytteet keskiarvolla CEN-2 ja CEN-20 diploidinen alue kuului 21/34 (61,8%) tapauksista

TOP1

Normaali luokkaan. Near-triploideja ja CEN-20 aneusomic tapausta esiintyy eniten näytteistä luokiteltu

TOP1

Non-monistettiin Gain. CEN-2 aneusomy havaittiin 19 (12,6%) tapauksista.

3.3.2 Assosiaatio potilaiden hoitotuloksiin.

Suhde biomarkkereiden tila ja potilaiden hoitotuloksiin tutkittiin sekä yhden ja usean mallien . Tässä potilaan kohortissa oli 112 kuolemantapausta kaikkien syiden ja 88 uusiutumisen kuten syöpää erityisiä kuolemia viiden vuoden kuluessa [15].

TOP1

kopioiden määrä itsessään ei merkittävästi liittynyt OS, TTR tai LR (katso taulukko 4). Korkeampi CEN-2 kopio numerot olivat yhteydessä parempaan ennusteeseen OS kliinisen päätepisteen monimuuttujamenetelmin (HR: 0,38, 95% CI: +0,15-+0,98, p = 0,04), kun taas vain taipumus havaittiin yhden muuttujan analyysissä (HR : 0,49, taulukko 4).

Aluksi potilaiden kätkeminen

TOP1

kasvaa (

TOP1

Gain, ks. 3) verrattiin ilman (

TOP1

Normal). Gain

TOP1

ei merkittävästi liittynyt OS tai TTR sekä yhden ja usean analyysi (katso taulukko 4). Potilaat, joilla on

TOP1

monistuksissa (

TOP1

/CEN-20≥2.0) alun perin verrattuna ei-monistettiin tapauksissa (

TOP1

Normaali ja

TOP1

vahvistamattoman Gain alaryhmien yhdistetty). Monistaminen

TOP1

ei merkittävästi liittynyt OS tai TTR, vaikka lähestyi merkitys TTR että monimuuttujamenetelmin (HR: 0,50, 95% CI: 0,23-1,09, p = 0,08). Analyysi

TOP1

monistukset suhteessa LR epäonnistui hyvin rajoitettu määrä tapahtumia. Muita cut-off sekä koetin yhdistelmiä tutkittiin ja tulokset on esitetty taulukossa 4.

jälkeen ensisijainen tietojen analysointi, näytteiden stratifioitiin alaryhmissä riippuen läsnäolosta ja tyyppi

TOP1

lisäys (katso Fig. 3, jotka on lueteltu taulukossa 3). Kuten taulukossa 5, ei merkittävää eroa ei havaittu

TOP1

Normaali,

TOP1

Non-monistettiin Gain ja

TOP1

Amplification osaryhmään OS kuin päätepiste sekä yhden ja usean analyysi. TTR: n kanssa kuin kliininen päätepisteenä,

TOP1

vahvistamattoman voitot osoitti taipumusta lyhyempi TTR (HR: 1,57, 95% CI: 0,97-2,55, p = 0,07) että yhden muuttujan analyysiin, ja samanlainen, mutta heikompi, havaittu suuntaus monimuuttujamenetelmin (HR: 1,49).

TOP1

monistuksissa eivät osoittaneet mitään merkittävää suhdetta TTR verrattuna

TOP1

Normaali lähtötilanteessa alaryhmä. Kaplan-Meierin kuvaaja nämä suhteet voidaan tarkastella kuvassa. 4B.

A (vasen): OS, B (oikea): TTR.

3.4 TOP1 Pisteytys suuntaviivat

Mahdollisuus pisteytys vähemmän ytimiä määrittämisessä

TOP1

tila tarjoaa mahdollisuuden vähentää tarkkailija työmäärä. Sen määrittämiseksi, onko tämä mahdollista, tila

TOP1 Twitter /CEN-2 ja

TOP1 Twitter /CEN-20 määritettiin käyttäen 10 tai 20 ytimet ja verrataan suhde tila jälkeen sisällyttämistä kaikkiin asiaan ytimiä. Kuten taulukosta 6, pisteytys pienempi määrä ytimiä, kuten vain 10 tai 20 ytimet määrittää

TOP1 Twitter /CEN-2 tila (cut-off 1,5) luokiteltu näytteiden kohtalainen konkordanssin (0,76 ja 0,91, vastaavasti), jotka lisäsivät käyttöönoton rajatapaus välein, missä ylimääräisiä ytimiä on sijoitettiin (katso kohta 2.5.1). Havaitsemiseksi

TOP1

monistuksissa (cut-off: 2,0), concordance oli suhteellisen korkea (10 ytimet: 0,96, 20 ytimet: 0,99) ja ei ollut parantaa käyttämällä rajatapausten välein. Lisäksi vaihtoehto cut-off tutkittiin, jonka tulokset on lueteltu taulukossa 6.

Keskustelu

4,1 mekanismit TOP1 Copy Number Kasvata

Tässä tutkimuksen neljä eri mekanismit

TOP1

kopioluvun kasvua havaittu. Solulinjassa paneeli mekanismeja käsittäen

TOP1

ja CEN-20 (Colo-205, HT29 ja SW620) sekä mekanismi, jossa

TOP1

saavutettiin riippumatta CEN-20 (KM12) , ei havaittu. In Colo-205 ja SW620, kromosomi 20 aneusomy havaittiin, yhteisymmärryksessä NCI ja NCBI: n SKY /M-FISH ja CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi). Tämäntyyppinen kasvu ilmi johtuen missegregation kromosomien mitoosin aikana, jolloin epänormaali määrä kromosomeja; karyotyyppitutkiraus tila kutsutaan ”aneuploidia”.

HT29,

TOP1

voitto tapahtui tavalla viittaavia muodostumista isochromosome, linjassa muiden tuloksiin [20]. Tämä mekanismi

TOP1

geenin kopioluvun kasvua tapahtuu, koska on misdivision on sentromeerin (poikittainen rikkoutuminen, sen sijaan, että pitkittäin) aikana kromosomi erottelun tuloksena kromosomissa, jossa on kaksi identtistä kädet. Vuonna KM12 ylimääräinen

TOP1

signaali havaittiin kromosomissa joka ei satama CEN-20-signaalin. Vuonna NCI ja NCBI: n SKY /M-FISH ja CGH tietokanta, tämä solulinja näyttää satama fuusio kromosomissa 22q ja lisäkappaletta 20q, joissa CEN-20 (tai ainakin alfa-satelliitin sekvenssit saavuttamista CEN- 20 kohdalla) ei ollut saanut yhdessä muun 20q. Tämän tyyppinen vahvistus voi olla tuote kromosomin 20 aneusomy seuraa Robertsonin translokaatio tapahtuma.

Vaikka geenikopiomäärä lisääntyminen voi johtua tapahtumia, joihin suurempia kromosomaalisia alueita, kuten voitto kokonaisista kromosomeista tai kromosomi käsivarret se voi myös johtua geenien monistuminen. Geenimonistus on ehdotettu tapahtua useita mekanismeja, kuten virheitä DNA-replikaatioon ja toistuva rikkoutuminen-fuusio-silta syklit johtuvat kaksinkertaisen lohkon DNA tauko tai telomere toimintahäiriö [21] – [23]. Kromosomialueella ensisijaisesti kautta saatu vahvistus, kutsutaan ”amplikoni”, noin 0,5-10 Mb DNA-fragmentti pituus, ja yleensä sisältää geeni (t), jotka edistävät kasvaimen kasvua [24]. On huomattava, että koko kromosomi tai kromosomin varsi muutoksiin yleensä esiintyy useammin, mutta pienempi suuruusluokkaa, kuin pienempiin kromosomaalisia muutoksia [25].

Tässä tutkimuksessa,

TOP1

geenimonistuman määriteltiin

TOP1 Twitter /CEN-20-suhde tai yli 2,0. Tämä määritelmä merkitsee, että

TOP1

olemassa tasoilla kaksinkertainen sen isännän kromosomiin. Näin ollen, tämän tyyppinen geenin kopion lisäys johtuu todennäköisesti kopiomäärän kasvu amplikoni ei varren pituus kromosomaalisten alueiden, koska sen mekanismi kopioluvun kasvua on riippumaton CEN-20. Ei

TOP1

monistukset havaittiin yhdeksän solulinjoissa tutkittiin, mutta havaittiin 10% kasvaimen näytteistä. Tämä voidaan ymmärtää, että joko tämä mekanismi on potilaskohtaista tai että tämä mekanismi ei ollut läsnä meidän rajoitettu määrä solulinjoja tutkittu. Monistaminen

TOP1

geeni on myös raportoitu melanooma [26] ja mahasyövän [27].

Vaikka kunkin edellä mainitun mekanismien

TOP1

geenin kopioluku kasvavat esiintyä yksittäisinä tapahtumia solulinjoissa, tuloksemme osoittavat, että ne voivat tapahtua samanaikaisesti kasvaimen yksilöitä. In 4/15 (26,7%) tapauksista vahvistus (tietoja ei ole esitetty), CEN-20 aneusomy havaittiin, osoittaa monistustuotteen mekanismi, sekä yhden liittyy aneusomy tai isochromosome muodostumista. Näytteissä luokiteltu

TOP1

Non-monistettiin Gain, on mahdollista, että sekä 20q isokromosomit ja lisäksi kappaletta kromosomi 20 on läsnä. Kuitenkin se on vain mahdollista luokitella yksilöitä mukaan tärkein tapa.

4.2 rooli 20q

Gain kromosomin 20 tai 20q on laajasti raportoitu toistuvia kromosomipoikkeavuuden kolorektaalisyövässä [11 ], [28] – [33], joka tukee tiheä

TOP1

vahvistamattoman voittoja tässä tutkimuksessa havaitut. In vitro malleissa viittaavat siihen, että 20q voitto pelaa kausaalinen rooli kasvainten synnyssä, sekä lisäämään soluproliferaatiokokeessa hinnat [34]. Kolorektaalisyövässä, 20q uskotaan rooli suolen kasvainten sinoomaan etenemistä [10] – [13] ja on usein havaittu kasvaimia näytteille mikrosatelliittimerkki vakaa ja /tai kromosomi epävakaus fenotyyppejä [32], [35], [36 ].