Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuus, kun keuhkosyöpä, miehillä kehittyneistä maista. Sen alkuvaiheessa, primäärikasvain kasvu on riippuvainen androgeenit, mikä yleensä voidaan ohjata androgeenien puute hoitoa (ADT). Lopulta kuitenkin, tauti etenee kastraatio kestävät eturauhassyöpä (CRPC), tappava muoto tarvitsevat tehokkaampia hoitoja. G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) käsittävät suuren klaanin solupinnan proteiineja, jotka ovat osallisina terapeuttisia kohteita PCa kasvuun ja etenemiseen. Havainnot ilmoitetaan tässä tarjota kiehtova näyttöä rooli hiljattain tunnettu glutamaatin perheenjäsen GPR158 PCA kasvuun ja etenemiseen. Olemme havainneet, että GPR158 edistää PCa soluproliferaatiota riippumaton androgeenireseptorin (AR) toiminnallisuuden, ja että tämä edellyttää sen sijoittuu tumaan solun. Tämä viittaa siihen, että GPR158 toimii mekanismeilla eroaa muista GPCR: iä. GPR158 ilmentyminen stimuloi Androgeenit ja GPR158 stimuloi AR ilmaisua, mikä merkitsee potentiaalia herkistää kasvaimia alhaisen androgeenireseptorin testin aikana ADT kautta positiivista palautetta silmukka. Lisäksi löysimme GPR158 ilmaisu korreloi neuroendokriinisten (NE) eriyttäminen fenotyyppi ja edistää kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen mikä rooli GPR158 terapeuttisessa etenemistä ja kasvainten muodostumiseen. GPR158 ekspressio lisääntyi klo hyökkääviä edessä eturauhasen kasvaimia, jotka on muodostettu geneettisesti määritelty ehdollinen

PTEN

Knockout hiirimallissa, ja yhteistyö lokalisoitu koholla AR ilmentyminen solun tumassa. Kaplan-Meier-analyysi on aineisto päässä Memorial Sloan Kettering syövän genomin portaali osoitti, että lisääntynyt GPR158 ilmentyminen kasvaimissa liittyy alemman tautivapaan elinajan. Meidän tulokset viittaavat vahvasti siihen, että lääkkeet kohdistamista GPR158 toimintaan voisivat edustaa uutta ja innovatiivista lähestymistapaa ehkäisyyn ja hallintaan CRPC.

Citation: Patel N, Itakura T, Jeong S, Liao CP, Roy-Burman P, Zandi E, et ai. (2015) Expression ja toiminnallista roolia orporeseptoria GPR158 eturauhassyövässä Kasvu ja Progression. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10,1371 /journal.pone.0117758

Academic Editor: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 07 elokuu 2014; Hyväksytty: 23 joulukuu 2014; Julkaistu: 18 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Patel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health avustusten [R01-EY09828] ja MEF ja [R01-CA136924] GAC. Robert E. ja toukokuun R. Wright Foundation palkinnon NP ja MEF tuki myös suorittaa tämän tutkimuksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat kilpailevia intressejä. Nitin Patel ja M. Elizabeth Fini ovat keksijät väliaikaisesti US patenttihakemuksessa otsikolla ”GPR158 uutena kohteena eturauhassyövän hoidossa”, soveltama University of Southern California (USC). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) käsittävät suuren klaanin solunpintaproteiinit että suorittavat erilaisia ​​solutoiminnoille. GPCR: t aistia tietoa ympäristöstä ja tyypillisesti signaalin siirtämiseksi soluun sitomalla ja aktivaatio heterotrimeeristen G-proteiinien kun solunulkoinen ligandia sitova [1]. Jäsenet klaanin on laajasti hyödynnetty lääkekehityksen ja suuri osa nykyisin käytössä lääkkeiden markkinoilla tavoite GPCR: [2]. GPCR: t jaetaan seitsemään perheet kautta fylogeneettistä analyysi niiden ominaispiirteistä: seitsemän transmembraanisen (7TM) domain [1]. GPCR-glutamaatti perhe sisältää 7 orporeseptoreiksi, kolme kuuluvat gamma-aminovoihappo-reseptorin haara: GPR156, GPR158, ja GPR179 [3,4]. GPR179 äskettäin osoitettiin vaaditaan depolarisoivan kaksisuuntainen solujen toimintaa verkkokalvossa, ja mutaatiot aiheuttavat peittyvästi-resessiivinen täydellinen synnynnäinen paikallaan hämäräsokeus [5,6]. Kaksi erittäin äskettäisissä julkaisuissa on annettu ensimmäinen luonnehdinta GPR158 [7,8]. Ensimmäinen tunnistettu GPR158 ilmentymistä verkkokalvon kaksisuuntainen neuronien ja osoitti epätavallinen rooli solukalvon tukirakenne proteiinin toiminta estää signalointia GPCR että pariskunta estävää perheen Galpha proteiinien sitoutumalla Gbeta5 ja rekrytointi jäsenten R7 perheen GTPaasia aktivointi proteiinit (GAP) solukalvoon [7]. Toinen julkaisu oli meidän laboratorio [8]. Havaitsimme GPR158 ilmentymistä trabekkelikudoksessa (TBM) soluja silmän vesipitoiseen ulosvirtaus reittejä ja sen rooli sääntelyn solujen suojavaikutuksen, mahdollisesti edistää patofysiologiaan steroidien aiheuttaman silmän hypertensio ja glaukooma.

Etsii toista mahdollisia rooleja GPR158 tunnistimme julkaistun microarray tutkimuksen, jossa GPR158 yhtenä geeneistä yläreguloituja androgeeniablaatio kestävä etäpesäkekasvainten verrattuna ensisijainen eturauhasen kasvaimia [9]. Toinen geenien ilmentyminen mikrosirujen tutkimus osoitti alas-säätely GPR158 peruuttaminen estrogeenin ihmisen estrogeeniherkkä rintasyövän soluja, tai tamoksifeeni (anti-estrogeeni) hoito [10]. Ehkä ei sattumalta, molemmat syöpätyyppeihin joihin liittyvät muuttunut vastauksena steroidihormonien. Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta keuhkosyövän jälkeen miehillä kehittyneistä maista [11]. Aluksi leviämisen Eturauhassyövän soluja riippuu androgeenieritystä, mikä androgeenipuutteen terapia (ADT) on ensisijainen hoito potilailla, joilla on paikallisesti edennyt PCa. ADT tarjoaa peruuttamista taudin yli 90%: lla potilaista, mutta vasteen kesto on tyypillisesti 2-3 vuotta. Huolimatta ADT hoito, metastasoitunut PCa ja uusiutuva sairaus palaa epäonnistuttua lokalisoitu hoitojen [12], prosessi tunnetaan kastraatio kestävä PCa (CRPC). Kaiken metastaattinen CRPC potilailla on mediaani elinaika vain 16-18 kuukausi, ja taudin esiintyminen parantumaton [13].

On yleisesti tunnustettu, että CRPC kehittyy läpi useita mekanismeja kuten androgeenireseptorin (AR): sta riippuva reittejä kuten AR vahvistusta ja yli-ilmentyminen [14]; paikallinen androgeenisynteesin [15]; muuttunut ilmentyminen AR koaktivaattoria ja yhteistyötä repressoriproteiinit; ja AR-riippumattomia reittejä kuten vaihtoehtoiset eloonjäämisreittejä [16]. Kohdistaminen AR polku on osoitettu tarjota kaikkein toimiva ratkaisu Uusien terapeuttisten aineiden koska AR pysyy aktiivisena CRPC [17]. Toinen mahdollinen terapeuttinen fokus PCA hoito on neuroendokriinivasteen (NE) solun fenotyyppi. Tämä solutyyppi tapahtuu haja pesäkkeitä sisällä eturauhasen adenokarsinooma, samanlainen niiden hajaantumista ductal epiteelisolujen normaalin eturauhasen. Kuitenkin tiheys NE solujen on usein suurempi eturauhasen karsinoomien kuin normaalissa kudoksessa, ja tutkimukset ovat osoittaneet, että NE erilaistumiseen (NED) on rikastettu korkealaatuisesta ja korkea-vaiheessa kasvaimia, ja tiiviisti syntymistä CRPC [18 -20]. Eturauhasen epiteelisolut uskotaan transdifferentiate NE-solut, joiden on osoitettu olevan erilainen kuin vähäinen populaatio NE-solujen läsnä normaalissa eturauhasessa [18-20]. NE solut voivat edistää leviämisen vierekkäisten adenokarsinoomasolua androgeenista nälässä kunnossa, mikä CRPC [21], joka tukee havaintoja suurempi proliferatiivinen indeksi proksimaalisten PCa solujen NE soluihin verrattuna distaaliseen syöpäsoluja [22, 23]. Lisäksi soluviljelmätutkimukset ovat osoittaneet, että neurohormone- ja neuropeptides erittävät NE solut voivat tukea androgen riippumaton kasvu Eturauhassyövän soluja [24,25]. Kuitenkin tarkka alkuperä ja syiden selvittämiseksi NED ei vielä tunneta. Siksi tunnistaminen uusia geenejä ja molekyylitason mekanismeja yhdistävät nämä useita reittejä vastuussa synnyssä CRPC kriittisesti tarvitaan kehittämään uusia terapeuttisia lähestymistapoja.

PCa liittyy tyypillisesti geneettisiin muutoksiin liittyy androgeenireseptorin herkkyys ja AR [26] . Tässä raportissa selvitettiin ilmaisua, molekyyli sääntely, solunosasijaintia ja toiminnallista roolia GPR158 käyttämällä erilaisia ​​ihmisen neljän PCa solulinjoissa erilaisilla muutoksia AR johtaa eriasteisia androgeenista reagointikykyä, androgeeni-herkkyys ja AR ilme. Yhdistämme hiirellä PCa malli ja bioinformatiikan analyysi ihmisen PCa aineistoja. Tulosten perusteella näyttää, että nousu GPR158 ilme on tärkeä onkogeenisen tapahtuma, joka stimuloi PCa solujen lisääntymistä ja etenemiseen ja voi siten edustaa innovatiivista terapeuttinen kohde.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ensisijainen ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (PHPECs) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja ylläpidetään, kohti niiden ohjeiden, käyttäen eturauhasen epiteelisolujen ruselatusaineeseen sisältävien solujen kasvua kit. Ihmisen neljän PCa solulinjoja pidettiin yksi labs (Coetzee) käytettiin näissä tutkimuksissa: LNCaP, C4-2B, PC-3 ja DU145, kaikki on saatu alun perin ATCC. LNCaP ja C4-2B-soluja viljeltiin täydellisessä RPMI-liuoksessa, kun taas DU145 ja PC-3-soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (Gibco-BRL, Bethesda, MA), jotka molemmat sisältävät 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 5% CO

2 37 ° C: ssa. Solut jaettiin joka 3 päivä.

LNCaP-solulinja perustettiin ihmisen imusolmukkeesta metastaattisen vaurion eturauhasen adenokarsinooma. LNCaP-solut ilmentävät AR kuljettaa yhteisen T877A-mutaatio ligandia sitovan domeenin, luoda laaja steroidien sitovan spesifisyyden. Ne ovat androgen reagoivaa, näytetään kasvun kiihtyminen hoidetuilla androgeenien, ja ne ovat myös androgeeniriippuvaisissa, joille kasvun pysähtymisen vedettäessä androgeenien [27-29]. C4-2B solut olivat peräisin luun etäpesäke, joka kasvoi nude-hiirissä istuttamisen jälkeen LNCaP-johdettu, kastraatio kestävä C4-2 soluissa [30,31]. Kuten LNCaP, C4-2B solut androgen-reagoiva. Tämän mukaisesti ne säilyttävät toiminnallisen AR, vaikka se näyttää pienempi affiniteetti androgeenien kuin AR LNCaP-soluissa [32]. Toisin kuin LNCaP, C4-2B solut androgen-herkkä, koska vedettäessä Androgeenit eivät niiden kasvu pysähtyy [33]. PC-3 ja DU145 solulinjat perustettiin ihmisen eturauhasen adenokarsinooma, metastaattinen aivojen tai luun, vastaavasti. PC-3 ja DU145 solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on aiemmin tunnettu yksi labs (Coetzee) [34]. Molemmat linjat ovat androgen-nonresponsive ja androgeenin tunteeton. PC-3

AR + sub-line Tässä tutkimuksessa käytetyt ilmaisee alhainen AR mRNA ja proteiini. Vaikka tämä ei johda riittävän funktionaalisen proteiinin antamaan androgeenista reagointikykyä, kohdunulkoinen AR ilmaisu johdonmukaisesti herättänyt paljon suurempi transaktivaatiota vastaus tähän osa-linjan kuin PC-3

AR- sub-line. DU145 solut ovat AR negatiivisia. Suoritimme omaa western blot vahvistamiseksi puuttumiseen tai olemassaoloon AR proteiinin nämä kaksi riviä (S1 Kuva.).

Hoito PHPEC, LNCaP ja C4-2B solujen androgeenireseptorin, dihydrotestosteroniksi (DHT, 10 nM ), suoritettiin elatusaineissa, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua seerumia (CSS) heikentävistä androgeenien. Androgen nälkään tutkimuksia, LNCaP, PC-3, ja DU145-soluja kasvatettiin 10%: CSS.

Reagenssit ja Oligonukleotidialukkeet

reagenssit käytettiin tutkimuksessa ostettiin seuraavasti: lipofektamiinia LTX kanssa PLUS reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA); ensisijainen vasta-aineita AR, prostataspesifisen antigeenin (PSA), hermosoluspesifisen enolaasin (NSE), epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja transkriptiotekijä SP1, ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-solunsisäinen domeeni (ICD) ja anti-solunulkoisen domeenin (ECD) GPR158-vasta-aineiden ja anti-alfa-tubuliinin vasta-aineilla (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); anti-beeta-aktiini vasta-aineella (Abcam, Cambridge, UK); korkea-Fidelity DNA-polymeraasia, Phusion (Finnzymes Oy, Woburn, MA); oligonukleotidien (Valuegene INC, San Diego, CA); puuhiilellä puhdistettua naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals Inc., Lawrenceville, GA). Kaikki muut reagenssit hankittiin Sigmalta. Taulukossa 1 esitetään sekvenssit kaikkien oligonukleotidien, joita käytetään tässä tutkimuksessa. Sillä Knockdown kokeissa käytimme altaan kolme räätälöityä siRNA-oligonukleotidien (GenePharma Co Ltd, Shanghai, Kiina), jonka aktiivisuus me ominaista aikaisemmin [8].

Quantitative Real-Time Käänteinen transkriptio-PCR (qRT-PCR) B

eristetty kokonais-RNA PCa solulinjoissa Aurumista kokonais-RNA mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA) suoritettiin qRT-PCR-analyysi käyttäen iScript yksivaiheista RT- PCR kit SYBR Green (Bio-Rad) on CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad), mukaan valmistajan ohjeiden. Suhteellinen kvantifiointi arvot mielenkiinnon kohteena olevien geenien laskettiin 2

-ΔΔCt että vertailevan Ct menetelmä, jossa ΔΔCt = (Ct kohde-mRNA käsitellyn näytteenvastaanottopinnassa Ct viite geenin käsitellyn näytteen) – (Ct kohde-mRNA kontrollinäytteen-Ct viittaus geeni kontrollinäytteestä). Käytimme beeta-aktiini tai GAPDH viitteenä geeni. Käytetyt alukkeet estimointiin GPR158, AR, PSA: n ja NSE ilmentymistä on esitetty taulukossa 1.

Western blot -analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin käyttämällä radioimmunosaostuskokeella (RIPA) lyysipuskuria (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1% NP-40), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita 20 min, mitä seurasi sentrifugointi 10000 g 10 minuutin ajan. Supernatantit kerättiin ja proteiinit uutteet erotettiin SDS-PAGE ilman keittämällä näytteitä ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Kalvot koetettiin primaarisen vasta-aineen vastaan ​​kiinnostavaa proteiinia ja kehitettiin kemiluminesenssimittauksella reagensseilla Luminol tehostajana ratkaisu ja peroksidia ratkaisu (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK) ja kuvien otettiin kiinni kanssa Fujifilm kuvantamisjärjestelmä (LAS-4000, Fujifilm, Tokio, Japani). Proteiini lastaus seurattiin strippaus ja reprobing kalvon kanssa beeta-aktiini vasta-aine.

ekspressiorakenteiksi

kolme ekspressiorakenteiksi (GPR158-pcDNA 3.1 (+), GPR158-GFP ja GPR158-NLS -M1 + 2-GFP), jota käytetään näissä tutkimuksissa on kuvattu aikaisemmin [8]. Meillä on myös tuotettu toiseen GPR158-GFP -fuusiorakenteen, nimetty GPR158: ACk (AA 1-665), jossa koko ICD poistetaan käyttäen sopivia alukkeita lueteltu taulukossa 1.

Ohimenevä transfektio

ilmoitetaan solut transfektoitiin joko ekspressioplasmideilla tai siRNA-rakenteet tai promoottori reportteri plasmideja käyttäen Lipofectamine LTX reagenssia kohti toimittajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1-2 x 10

5 solua /kuoppa 2 ml täydellistä median ympättiin kuuden kuoppalevyille ja kasvatettiin, kunnes 70-80% konfluenssiin. DNA (2 ug) laimennettiin 500 ul: aan Opti-MEM I + PLUS-reagenssia (2 ui), inkuboitiin 5 min, Lipofectamine LTX (4,5 ui) lisättiin ja inkuboitiin 30 min. Solujen väliaine korvattiin tuoreella 2 ml antibiootteja väliaineessa ja seos lisättiin, ja inkuboitiin 6 tuntia. Inkuboinnin jälkeen kompleksit korvattiin täydellisen kasvualustan. Tällä 3 päivää transfektion jälkeen solut käsiteltiin joko qRT-PCR-analyysi tai western blotting tai solun laskentaan.

Lentivirus Production and Cell transduktio

GPR158: n cDNA subkloonattiin päässä pcDNA 3.1 (+), yllä kuvatulla ekspressiovektorilla, osaksi pSLIK lentiviraalinen ekspressiovektori (Addgene, Cambridge, MA). Lentivirus tuotanto ja infektio suoritettiin kuvatulla [35]. Lyhyesti, virus-pakkaus suoritettiin HEK 293T-soluissa kotransfektion jälkeen on pSLIK-GPR158, kaksi pakkaus plasmidit pMDLg /pRRE ja pRSVREV, ja VSV: n G kirjekuori plasmidi käyttämällä Lipofectamine 2000 virukset otettiin talteen 72 tuntia transfektion jälkeen, ja viruspartikkelit ovat keskittyneet. LNCaP-solut infektoitiin alhaisella MOI varmistaa 30% infektion taajuus ja vakaa solut (Lenti-GPR158) tuotettiin hygromysiinillä valinta 400 ug /ml 4-viikkoa. Induktiolle GPR158, vakaa LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ja 500 ng /ml doksisykliiniä (Dox) 72 tuntia. LNCaP-solut infektoitiin virus- partikkelien vain pSLIK vektorin (Lenti-vektori) käytettiin negatiivisena kontrollina. Seuraavat 3-päivän Dox induktion jälkeen solut altistettiin joko western blotting tai solujen laskentaa tai subsellulaarinen proteiinin fraktioimalla määrityksessä tai pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys.

Solunosafraktiointi

Solunosafraktiointi suoritettiin käyttämällä subsellulaarinen proteiinia fraktiointia kit mukaan valmistajien ohjeiden (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Tämä sarja on osoitettu eristää sytoplasman, kalvo, ydin- liukeneva, chromatin sidottu ja solun tukirangan jakeet riittävän puhdasta proteiinia lokalisointi ja uudelleenjako tutkimuksissa [36]. Lyhyesti, portaittain erottaminen solun osiin 3 x 10

6 osoitti solujen tehtiin soveltamisen jälkeen toimitetun sytoplasmisen, kalvo, ydin- liukeneva, chromatin-sidottu ja tukirangan proteiini uuttamalla puskureita. Proteiinipitoisuus kussakin fraktiossa arvioitiin käyttäen BCA-proteiinin arviointi kit (Thermo Scientific Inc.) ja ilmoitettu määrä proteiinia suoritettiin Western blot.

Colony muodostumisen määritys

lenti- GPR158 tai lenti vektori LNCaP solulinjoja käytettiin pesäkemuodostusta. Lyhyesti, solut maljattiin 12-kuoppalevylle (5000 solua /kuoppa). Solut suspendoitiin fenolipunaista RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja 0,48% agaria, ja päällekkäin päälle kiinteän kerroksen samaa alustaa, joka sisälsi 0,8% agaria. Solut joko indusoitiin edellä alustassa, joka sisältää 100 ng /ml Dox, tai jätettiin käsittelemättä, lempeä täydentäminen niiden media joka 3 päivä. Jälkeen 2 viikon inkubaation jälkeen levy värjättiin 0,005% kristalliviolettia (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ), väri poistettiin yli yön PBS: llä ja pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla ja valokuvattiin × 20 suurennus.

immunohistokemiallinen (IHC) Analysis ehdollinen

PTEN

Knockout Mouse

ehdollinen

PTEN

hiiressä luotiin yliopistossa Southern California kahden tutkimuksessa yhteistyössä laatijat tässä tutkimuksessa [37]. IHC analyysi GPR158 ja AR ilmentyminen toteutettiin kaikissa kolmessa (vatsa-, dorsolateral ja aikaisemmat) lohkoa johdettu eturauhasen 10-kuukautta vanha ehdollinen homotsygoottinen

PTEN

hiiressä (

PTEN

– /-) ja vastaava samanikäisiin ohjaus (

PTEN

+ /+

). Lyhyesti, eturauhaskudoksiin fiksoitiin 4% formaldehydiä ja näytettä lohkot leikattiin 5 um: n paksuisia leikkeitä, parafiini ksyleenillä, ja nesteytyksestä käyttäen vähentämällä etanolia kaltevuus jälkihuuhtelu kahdesti tislattua H

20. Noutaa antigeenisyys, laseja inkuboitiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0), pestiin 0,1 M fosfaattipuskurilla, blokattiin 0,3% vetyperoksidia metanolissa 15 minuutin ajan ja 5% vuohen seerumilla PBS: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Levyjä inkuboitiin anti-ICD GPR158-vasta-ainetta (1: 100) tai anti-AR-vasta-ainetta (1: 200) 1% vuohen seerumia 4 ° C: ssa yön yli jälkeen inkuboitiin biotinyloidulla anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Vector Laboratories, Burlingame , CA) 1 tunnin ajan ja piparjuuriperoksidaasiin streptavidiinia (Vector Laboratories) 30 minuutin ajan, ja sitten visualisoida DAB kit (Vector Laboratories). Objektilasit jälkeen vastavärjättiin 5% (w /v) Harris hematoksyliinillä. Kalvot, jotka sisältävät parafiinileikkeitä eturauhasen normaalien ja PCa koehenkilöillä oli toimittanut ydin ja käsitelty edellä mainitulla tavalla.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskimääräinen (sE) merkitys eroja keskiarvojen välillä käsittelemättömien ja käsiteltyjen näytteiden määritettiin Studentin t-testi, kun määritetään, että data sopivat normaalijakaumaa.

tulokset

GPR158 Effects Cell Proliferation

tutkimiseksi merkitys GPR158 ilmaisun PCA, teimme koesarjaa käyttäen ihmisen PCa solulinjoja eri muutoksia AR johtaa eriasteisia androgeenista reagointikykyä, androgeeni-herkkyys ja AR ilmaisu, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Ensin arvioidaan tasot endogeenisen GPR158-mRNA: n ja proteiinin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä ja western-blottauksella, vastaavasti. Nopeasti kasvava, androgeeni-herkkä linjat DU145 ja PC-3 (kahdentumisaika 1,5-2päivää) ilmaistuna korkeamman GPR158-mRNA: n (Fig. 1A) ja proteiini (Fig. 1 B) verrattuna hitaammin kasvavien solujen LNCaP linjan ja sen johdannainen C4-2B (kaksinkertaistui 2-3 päivää). GPR158-proteiinin tason nopeammin kasvavia soluja oli noin 2-3-kertaa korkeampi verrattuna hitaammin-solujen kasvuun.

(A) RT-PCR-analyysi GPR158-mRNA: n ekspression osoitettu PCa solulinjoissa (B) Western blot -analyysi havaitsemiseksi GPR158-proteiinin käyttäen anti-ICD GPR158-vasta-aineen kokosolulysaateista osoitettu PCa solulinjoissa. Sama membraani tutkittiin beta-aktiini, joka toimi latauskontrollina. Pystyviiva ilmaisee repositioned Geelikaistat samasta kalvo vastaamaan näytteen järjestyksessä kuvion. 1A. (C, D, E) Kaikki neljä osoitettu PCa solulinjat transfektoitiin 70% konfluenssiin joko GPR158-ekspressioplasmidin tai tyhjä pcDNA3.1 (+) -vektoriin (C ja D) tai joko GPR158 siRNA tai ohjaus salattu siRNA (E) ilmoitettava käyttämällä Lipofectamine LTX reagenssia ja inkuboitiin kasvatusväliaineessa 3 päivää on 6-kuoppaisille viljelylevyille. (C ja E) Kun 3 päivää, trypsinisoitiin solut laskettiin käyttäen trypaanisinivärin hemosytometriin kammiossa. (D) Western blot havaitsemiseksi GPR158 on kokosolulysaateista eristetty soluista, jotka on transfektoitu osoitettujen plasmidien käyttäen anti-ICD GPR158-vasta-ainetta. (F) Kokonais-RNA eristettiin DU145-solut, jotka oli transfektoitu ilmoitetun pitoisuuden joko GPR158 siRNA tai ohjaus salattu siRNA analysoimiseksi tasot GPR158-mRNA: n qRT-PCR: llä. GAPDH oli sisäinen viite valvontaa. (C, E, F) Tiedot osoittavat keskiarvo ± SE 3 riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kaksinkertaisina. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05; ns, p 0,05.

arvioimaan mahdollisia biologisen roolin GPR158 säätelyssä solujen lisääntymisen ihmisen PCa solujen, suoritimme lyhytaikaisissa transfektioissa kanssa GPR158 nisäkäsekspressiovektoriin aiemmin kuvattu [8]. Solulinjat, jotka on transfektoitu vain vektorilla, käytettiin kontrollina. Vaikutus solujen lisääntymistä kvantifioitiin jälkeen 3-päivän transfektion. Ohimenevä yli-ilmentyminen GPR158 soluissa LNCaP, C4-2B ja DU145 linjat johtivat huomattavasti korkeampaa soluproliferaation 3,88, 2,15 ja 2,77-kertaiseksi verrattuna transfektoitu tyhjällä vektorilla (Fig. 1 C ). Ohimenevä yli-ilmentyminen GPR158 osoitti vain marginaalista lisääntymistä leviämisen PC-3-solut, mutta tämä oli kaikkein nopeasti lisääntyvissä neljästä solulinjojen ilman GPR158 yli-ilmentyminen, nostaa mahdollisuus, että leviämisen nopeus saattaa jo olla maksimaalinen . Yli-ilmentyminen GPR158 3 vuorokautta transfektion vahvistettiin kokosolulysaateista western-blottauksella; selvään kasvuun GPR158 proteiinin tasot havaittiin kaikissa solulinjoissa (Fig. 1 D).

roolin arvioimiseksi endogeenisen GPR158 PCA soluproliferaatioon, suoritimme päinvastainen kokeilun alas-säätely GPR158 kautta siRNA lähestymistapaa. Olemme aiemmin raportoitu luonnehdinta altaan kolme siRNA-oligonukleotidien, jotka osoittavat 80-90% pudotus on GPR158-proteiinin ilmentymisen PC-3-soluja 100 nM, toistettavalla tavalla, [8]. Me transfektoitiin kunkin neljän PCa solulinjoja 100 nM tämän siRNA-allas. Jälkeen 3 päivää transfektion merkittävän kasvun inhibitio (noin 50%) havaittiin kaikkien neljän solulinjoista, verrattuna niiden sekoitetun siRNA transfektoiduista kontrolli-soluissa (kuvio. 1E). Olemme vahvisti annoksesta riippuvaa pudotus on GPR158-mRNA: n ekspression transfektoimalla siRNA-allas, jossa on noin 90%: n inhibition 100 nM siRNA DU145-soluissa (kuvio. 1 F) ja noin 75-90% toisessa solulinjoissa (tietoja ei esitetty).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentymistaso endogeenisen GPR158 proteiinin säätelee PCa solujen lisääntymistä, riippumatta androgeenista reagointikykyä, androgen-herkkyys tai AR-ilmentymistilanne ihmisen PCa solulinja käytetyt.

Effects androgeenin on GPR158 Expression

Voit löytää sääteleviä tekijöitä GPR158 ilmaisua, me etsinyt NextBio ”Farmako Atlas” hakemus [38], joka etsii yhdisteitä ja hoitoja merkittävästi korreloi geenin tuloksiin paremmuusjärjestykseen tilastollisen merkitsevyyden. Meidän haun käyttämällä ”GPR158”, kuten kyselyn tunnistettu androgeenin, DHT merkittävimpänä ja ensimmäinen luettelossa korreloi yhdisteitä. Tulokset paljastivat 7 riippumattomia tutkimuksia suoritetaan käyttäen LNCaP ja kaikki tutkimukset osoittivat lisääntynyt GPR158-mRNA-ilmentymisen DHT hoidon välillä 1,28-3,57-kertainen (S2 Kuva.).

Voit selvittää kokeellisesti, onko GPR158 on androgen reagoiva geenin, teimme DHT hoitoaika tietenkin kokeissa vertaamalla androgen reagoiva ja androgen-herkkien PHPECs ja LNCaP, ja androgen reagoiva, mutta androgeenin

tunteeton

C4-2B soluja. Edustavat tulokset on esitetty kuviossa. 2. PHPECs ja LNCaP-solut, GPR158-mRNA: n ja proteiinin tasot nousivat 3-4-kertaisesti DHT hoitoa 24 tuntia (Fig. 2, A, B, E ja F). Sen sijaan, DHT hoito ei ollut vaikutusta GPR158-mRNA: n ja proteiinin tasot C4-2B-soluissa (kuvio. 2, C ja G). Sekä mRNA ja proteiini tasot prostataspesifisen antigeenin (PSA), hyvin tutkittu AR kohdegeenin, kasvoi merkittävästi PHPEC, LNCaP ja C4-2B soluja käsiteltiin DHT. Samanlaisia ​​julkaistuissa raporteissa, myös havaittu AR proteiinin vakauttamista DHT stimuloiman LNCaP 12 tunnin sisään PHPEC ja LNCaP [39], mutta ei C4-2B soluissa (kuvio. 2, E, F ja G). Tärkeää on, olemme huomanneet, että AR-antagonisti, bikalutamidi esti DHT-välitteinen kasvu GPR158-mRNA: n ja proteiinin tasot ja meillä on myös havaittu täydellisen inhibition PSA ilmentymisen PHPEC (Fig. 2, D ja H). GPR158-mRNA ja proteiini pitoisuus väheni kun androgeenireseptorin nälkään inkuboimalla PHPEC väliaineessa, joka sisälsi 10% CSS yhdessä yössä. Näiden tulosten perusteella päättelemme, että GPR158 on androgen-reagoiva geenin.

(AC ja EG) solut osoitettujen linjojen inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi 10% CSS androgeenisäätelyn nälkään yli yön (0 ajankohtana), seuraa käsittely DHT (10 nM) osoitetun ajanjaksoja. Kokonais-RNA (A-C) tai solulysaateista (E-G), eristettiin ja altistettiin qRT-PCR: llä ja western-blottauksella, vastaavasti arvioida AR, PSA, GPR158 ja beeta-aktiinin ilmentymistä. (D ja H) PHPEC kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi 10% FCS tai 10% CSS, käsiteltiin DHT (10 nM) yksinään 24 tunnin ajan ja esi-inkuboitiin bikalutamidin (10 uM) 1 tunnin ennen DHT hoitoa väliaineessa, joka sisälsi 10 % CSS. Kokonais-RNA tai kokosolulysaateille eristettiin ja qRT-PCR: llä ja western-blottaus suoritettiin, vastaavasti havaita GPR158, AR, PSA: n ja beeta-aktiinin tasot (D) mRNA tasolla edellä mainittuihin geeneihin pidettiin 1 soluissa kasvatettu 10% FCS laskemiseksi suhteellisen kertainen ero näiden geenien muissa koeolosuhteissa. (AH) Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

GPR158 Vaikutukset AR Expression

LNCaP /C4-2B ihmisen PCa etenemisen malli näyttö- ominaisuudet siirtymistä androgen-riippuvuudesta androgeenireseptorin insensitiivisyys [32,40], ja AR on keskeinen rooli tässä prosessissa [41]. Kuva. Kuvio 3 esittää tulokset analyysimme GPR158 vaikutuksia AR ilmentymisen. Ohimenevä yli-ilmentyminen GPR158 LNCaP-solujen määrä nousi, ja hiljentäminen endogeenisen GPR158 vähennetään, mRNA AR, sekä PSA (Fig. 3A). Sekä LNCaP ja C4-2B-solujen yli-ilmentyminen GPR158 huomattavasti AR ja PSA-proteiinin tasot, kun taas knockdovvn GPR158 (90%: n vähennys) vähensi merkittävästi AR ja PSA-proteiinin tasot (Fig. 3, B ja C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GPR158 stimuloi AR ja PSA ilmaisun.

LNCaP (A, B, C) ja C4-2B (B ja C) transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Lipofectamine LTX reagenssia joko GPR158-ekspressioplasmidin tai vektorin (A ja B) tai joko GPR158 siRNA tai ohjaus salattu siRNA (A ja C). Jälkeen 3 päivää transfektion koko eristetty RNA: n ja proteiinin solulysaateista käytettiin qRT-PCR: llä (A) ja Western blotting (B ja C), vastaavasti ilmentymisen analyysi GPR158, AR, PSA: n ja β-aktiini-mRNA: n ja proteiinin. Tulokset edustavat kahden erillisen kokeen suoritettiin kaksinkertaisina.

annosriippuvaista vaikutukset GPR158

tutkimiseksi edelleen roolin GPR158 sääntelyssä solujen lisääntymisen ja AR-geenin ilmentyminen, loimme lenti-GPR158 LNCaP-solulinjasta. Tämä on alalinja LNCaP-solujen stabiilisti transformoitu lentivirus, joka ilmaisee GPR158 valvonnassa Dox. DOX-indusoituva lentivirus järjestelmä mahdollistaa tiukka säätely GPR158 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. LNCaP-solut valittiin tämän mallin, koska ne ilmaisevat alimman endogeenisen GPR158 tasoilla. Hiljattain osoitettiin, että Dox muuttaa metabolisen ja leviämisen profiilit LNCaP-soluja suurempina pitoisuuksina [42], vaikutus, että olemme vahvistaneet (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen kaikissa kokeissa tämän solulinjan, vertaamme tuloksia, jotka on saatu lenti-GPR158 LNCaP-solulinjasta, jotka on saatu käyttämällä rinnakkaisia ​​viljelmiä vanhempien LNCaP-soluja käsiteltiin samalla annokset Dox.

Fig. Kuvio 4 esittää edustavaa kokeiden tulokset käyttäen lenti-GPR158 LNCaP-solulinjasta. Hoito lenti-GPR158 LNCaP kanssa Dox ja 3 päivää indusoi GPR158 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 4A). Olemme johdonmukaisesti havaittu noin 3-kertaisesti ja 6-kertainen GPR158-proteiinin tasoa käsittelyn jälkeen, jossa Dox 100 ng /ml ja 500 ng /ml, vastaavasti, 3 päivää (Fig. 4A).