Krooninen sairaus

tiivistelmä

EGF-perheen tyrosiini–nikinaasireseptoreiden aktivoi sytoplasman reittejä mukana solujen lisääntymisen, vaeltamisen ja erilaistumisen vastauksena tiettyyn solunulkoisen ligandeihin. Näiden lisäksi kanoninen reittejä, ydinvoiman lokalisoinnin ErbB- reseptorien ensisijainen kasvaimia ja syövän solulinjat johti tutkimaan rooliaan transkription säätelijöinä syövän geenien. Ydin- paikallistaminen ErbB3 on raportoitu eri syövän kudoksissa ja solulinjoissa, mutta ydin- toimintoja ja oletetun korrelaatio kasvainprogression ja kestävyys hoito jää epäselväksi. Ensin arvioitiin ErbB3 ilmentymistä normaalissa ja kasvaimen eturauhaskudoksiin. Ydin- värjäytyminen johtui pääasiassa isoformi vastaavia C-terminaalissa domain täyspitkän ErbB3

185kDa reseptoriin. Tumavärjäystä myös rajoittuu syöpäsolujen ja nostettiin kehittyneissä kastraatio kestävä eturauhassyöpä verrattuna paikallisia kasvaimia, mikä viittaa siihen, se voisi olla mukana etenemisen eturauhassyöpä jopa terminaalin kastraatio kestävä vaiheessa. Chip-on-chip kokeet suoritettiin kuolemattomaksi ja kasvainsolulinjoihin valittu kun luonnehdinta endogeenisen ydin- ekspression ErbB3

80 kDa isoformin. Niistä 1840 tavoite promoottorit tunnistettu, 26 valittiin ennen ErbB3

80 kDa riippuvaa geeniekspressiota arvioitiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR, jotka osoittavat, että ErbB3

80 kDa kohdistuu transkriptionaalisen säätelyn näitä geenejä. Jotkut tavoitteet on jo tiedetään olevan osallisena eturauhassyövän etenemiseen vaikka minkäänlaista yhteyttä on aiemmin perustettu ErbB3 kalvo ja /tai ydin- signalointi. Monet muut, ei vielä liittynyt eturauhassyöpään, voisi tarjota uusia terapeuttisia mahdollisuuksia potilaille ilmaisemiseen ErbB3

80 kDa. Havaitsemiseksi ErbB3

80 kDa voi siten olla käyttökelpoinen merkkiaine ennustetta ja hoitovastetta.

Citation: El Maassarani M, Barbarin A, Fromont G, Kaissi O, Lebbe M, Vannier B, et al. (2016) Integroitu ja Functional Genomics Analysis Vahvistaa merkityksellisyys Nuclear Variant ErbB3

80 kDa eturauhassyövässä Progression. PLoS ONE 11 (5): e0155950. doi: 10,1371 /journal.pone.0155950

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 7. 2016 Julkaistu: toukokuu 18, 2016

Copyright: © 2016 El Maassarani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Microarray data ovat saatavilla osoitteessa ArrayExpress: E-MTAB-3499, E-MTAB-3504.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Ligue contre le syöpä, LCC PS /2012-13-14 PS; Groupe Pasteur Keskinäisyys ja AB; ja Ministère de l’Education nationale de la Recherche et des teknologioita 2010-2014 ja MEM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

EGF-reseptorien perheen koostuu neljästä tyrosiinikinaasi (TK) reseptorit (EGFR /erbb1, HER2 /ErbB2, HER3 /ErbB3 ja HER4 /ErbB4), jossa on solunulkoinen ligandia sitova domeeni, transmembraanidomeeni ja intracytoplasmic verkkotunnuksen. Kun ligandi sitova solun pinnalla, ErB reseptorit dimeroituvat ja laukaista solunsisäisiä reittejä mukana solujen lisääntymisen, vaeltamisen ja erilaistumisen [1]. Vapautuminen ErbB- loppupään polkuja, kolmen sähköverkosta mekanismien -Lisääntynyt reseptorin ilmentymisen, lisääntynyt ligandi ilme tai aktivoimalla mutaatio TK verkkotunnus- usein osallisena kasvainten synnyssä [2]. Lisäksi niiden sijaintia on solukalvon, ErbB-reseptoreita on myös kuvattu tumassa ja eri toimintoja on katsottu johtuvan kulkeutua ErB reseptorien joukossa ovat solujen proliferaatiota, DNA: n korjaukseen ja transkription valvonta [3-8]. Tässä suhteessa, täyspitkä erbb1 reseptorin tumaan liittyy lisääntyneen ilmentymisen proliferatiivisen ja metastaattisen geenit [9-11]. Ekspression pro-apoptoottisten ja pro-angiogeenisen COX-2-proteiinin on moduloitu, kun ErbB2-sitova

COX-2

promoottorin nisäkasvainsoluja [12]. ErbB2 toimii myös transkription koaktivaattoria että Stat3 proteiinin

CCND1

(sykliini D1) promoottori [13] ja tekee yhteistyötä erbb1 jopa säännellä

STAT1

geeniekspressiota [14] . Täyspitkä ErbB3

185kDa proteiinin tai lyhyen isoformien on kuvattu ytimen normaalin rintarauhasen epiteelisolujen [15] ja Schwannin solujen [16] sekä erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa: rinta (SKBr3, MCF-7 et BT474), keuhkojen (H226 et SCC6) pään ja kaulan (SCC6 et SCC1) ja paksusuolen (LoVo et Caco2) [15, 17-19]. In H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja SKBR3 rintasyövän solulinjoissa, ErbB3 on osoitettu saavan aikaan toimivat yhteistyössä transkription aktivaattori

CCND1

geenin ilmentymisen [17,19]. Vahva transaktivaatio potentiaalia ErbB3 lähes yksinomaan C-pään domeenin reseptorin [19].

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin urologisten maligniteetti ja toiseksi suurin syy syövän kuolemaan teollisuusmaissa . Kasvaimen uusiutumisen jälkeen kirurgisen ablaation tai sädehoitoon usein esiintyy merkittävä osa potilaista, jotka kehittävät levitetään aggressiivinen tauti. Kuten PCa solut luottaa androgeenireseptorin (AR) toimintaa ja kasvua androgeenireseptorin peruuttaminen hoito on hyväksynyt näissä kehittynyt tapauksissa [20]. Hyödylliset vaikutuksia havaitaan noin 24 kuukautta ennen potilaalle kehittyy kohtalokas kastraatio vastustuskykyisten-eturauhasen syövän (CRPC). Molecular mekanismeja terapiassa vastuksen edelleen epäselvä. Yksi selitys potilaan taudin uusiutumisen hoidon jälkeen voi tulla cross-talk välillä AR signalointi ja epiteelin kasvutekijän perheen reseptorien (EGFR) väyliä [21]. ErB ja niiden ligandien ilmentyvät normaalin aikuisen eturauhasen säilyttää homeostaasiin elimestä ja erbb1, ErbB2 ja ErbB3 usein kasvoivat PCa etenemisen [22]. Vuonna CRPC, lisääntynyt ErbB2-reseptoria ja /tai erbb1, ErbB2 tai ErbB3-ligandien ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen ja etäpesäkkeiden [23-25].

ohittavat resistenssimekanismeihin androgeenista hoidon erbb1 ja ErbB2 TK-inhibiittorit on testattu yhdessä hormoni perustuvaan hoitoon potilailla, joilla on korkea laatu, CRPC kasvaimia. Kuitenkin kokeet eivät olleet onnistuneita kuin kasvainsoluja kehittämä korvaavia reittejä säätelemällä ErbB3 ilmaisun ja lokalisointi [18,26]. Todellakin, useat tutkimukset ovat raportoineet ydinvoiman lokalisoinnin ErbB3 eturauhasessa kudoksissa ja PCa solulinjoissa mahdollisesti korreloivat sairauden eteneminen [18,27] kantavassa ydin- ErbB3-proteiini voisi siis keskeinen rooli PCA etenemistä ja hoito vastarintaa, mutta molekyylimekanismeja mukana edelleen tutkimaton.

nykyinen tutkimus osoittaa toiminnallinen merkitystä ErbB3 ydinvoiman lokalisointi PCA ja tarjoaa uusia vihjeitä ymmärtämiseksi polkuja liittyy syövän etenemiseen ja hoidon kesto.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat kudossiruina

Kirjallinen suostumukset saatiin potilailta vaatimusten mukaisesti institutionaalisten etiikkaa komitea Centre Hospitalo-Universitairessa Poitiers, joka hyväksyi tutkimuksen. 169 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut, arkistointia kudokset saaneilta potilailta on ”Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers” PCA, sisällytettiin. 137 kudosnäytteitä saatiin hormoni-herkkä (HS) potilailla, jotka tehtiin eturauhasen kliinisesti paikallinen syövän, yksikään näistä potilaista sai hormoni vajaushoidon ennen leikkausta. Näistä 97 oli vaiheessa pT2 ja 40 pT3. Gleason pisteytys oli vastaavasti 6 38 potilaasta 7 83 potilaasta, ja 8 tai enemmän 16 potilaalla. 32 kudosnäytteet saatiin trans-uretral resektio päässä CRPC potilaista. Normaali esiintyy eturauhasen kudosta 50 potilasta hoidetaan eturauhasen oli myös mukana. Immunovärjäys suoritettiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: ErbB3 C-ter (kanin polyklonaalista sc-285, Santa Cruz Biotechnology 1/200), ErbB3 N-ter (Mouse monoklonaalinen Ab-5 Clone H3.105.5, Neomarkers, 1/50), CCND1 (Rabbit monoklonaalinen, klooni EP12, DAKO, 1/50) ja Ki67 (hiiren monoklonaaliset, klooni MIB-1, DAKO, 1/100). Negatiiviset kontrollit saatiin käyttämällä irrelevanttia vasta-aineen. Kudos vaipan lymfooma käytettiin positiivisena kontrollina Ki67 ja CCND1. Objektilasit analysoitiin 2 tarkkailijoiden sokkotavalla. Sillä ErbB3C-ter, CCND1 ja Ki67-värjäys, kussakin kudoksessa ydin annettiin jatkuvana arvo edustaa tuumorisolujen prosenttiosuuteen, joilla tumavärjäystä. Jokaisen potilaan, ytimen prosentuaalisesti eniten valittiin.

Solulinjat

Ihmisen eturauhasen RWPE soluja (ATCC

® CRL11609 ™), normaali epiteelisolujen kuolemattomiksi HPV-18, pidettiin Keratinosyyttien Serum Free Medium, jota oli täydennetty naudan aivolisäkeuutetta (BPE, 0,05mg /ml) ja ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF, 5 ng /ml) (Invitrogen). Ihmisen eturauhasen LNCaP-solulinja (ATCC

® CRL1740 ™), jotka ovat peräisin imusolmukkeesta ja PC3 (ATCC

® CRL1435 ™) solulinja on peräisin luun etäpesäke, kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiini.

Western blotting

Proteiiniekstraktit ja western blot-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [17]. Ydin- ja ei-tumauutteita valmistettiin seuraavasti: solut suspendoitiin uudelleen Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCl 120 mM ja lyysattiin NP40 loppupitoisuuteen 0,3%. Sentrifugoinnin jälkeen 5 minuutin ajan 2500 g, supernatantit täydennetty EDTA 1 mM, DTT 1 mM, SDS 0,1%, PIC 1/50 ja PMSF 1/100 muodostavan kuin ydinenergian jae. Pelletti, joka vastaa ytimien pestiin kolme kertaa Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCl 120 mM, NP40 0,3% poistaa sytoplasminen tähteitä, sitten lyysattiin, kuten edellä.

ChIP-on-chip

Soluja käsiteltiin 1% formaldehydiä ja chromatin uuttaminen suoritettiin Simple ChIP entsymaattinen kromatiini IP kit (Cell Signaling Technology, CST) mukaan valmistajan suositusten. Talteen chromatin pilkottiin Micrococcal nukleaasin saada chromatin fragmenttien noin 500pb kokoa. Tässä vaiheessa, yhteensä DNA-näyte (Input) kerättiin myöhempää käyttöä varten. Immunosaostus suoritettiin käyttäen anti ErbB3 C-ter-aineita (sc-285 tai sc-7390, SCBT) tai anti-H3 (positiivinen kontrolli, Histone H3 vasta-ChIP muotoiltu # 2650, CST) ja inkuboida ei-asiaa normaalia kaniinin IgG (ChIP negatiivinen kontrolli). Yhteensä DNA ja siru-DNA monistettiin käyttämällä koko genomin -monistustarvikesarjaa (WGA-2, Sigma-Aldrich) ja vastaavasti merkitty Cy-3 tai Cy-5 fluorokromeista käyttäen BioPrime Array Genomic Labelling Kit (Invitrogen). Leimatut näytteet hybridisoitiin Human Promoottorit mikrosirut (Agilent Human promoottori Chip-on-Chip Microarray Set 244K, P /N G4489A) mukaan valmistajan suositusten.

normalisointi ja analyysi microarray tietojen

toimittamien tietojen Agilent korkearesoluutioisia DNA Microarray skanneri analysoitiin Feature Extraction 10,1 Software (Agilent Technologies). Fluoresenssin paikkoja, että ei läpäissyt laadunvalvontaa suljettiin pois. Signaalit rikastus suhteet (ChIP /Input) liittyvä yhdistettiin rinnakkaista laskettiin CoCAS ohjelmistojen [28]. ErbB3-rikastettu promoottorit kolmen erillisen kokeen eristettiin käyttäen huippuilmaisun algoritmi CoCAS seurasi rikastamiseen pisteet lasketaan mittaamalla tehollinen piikin pinta.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) analyysi

qPCR kokeet suoritettiin ErbB3-immunosaostettiin tai IgG-kontrolli-DNA käyttäen GoTaq qPCR Master Mix (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden 7500 Fast Real Time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). Suhteellinen rikastus arvioitiin jälkeen kvantifiointiin PCR signaali mittaamalla suhde IP ErbB3 /IgG. Luettelo ChIP-qPCR alukkeita esitetään taulukossa 1.

RNA: n eristys ja RT-qPCR

LNCaP ja PC3-solut transfektoitiin 20pmol valvonta- tai ErbB3-erityisiä siRNA: ita (Eurogentec ) ennen kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNAble (Eurobio). cDNA syntetisoitiin alkaen 2-6μg kokonais-RNA ja monistettiin qPCR kuten edellä on kuvattu. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoida geenin ilmentymistä. Luettelo cDNA RT-qPCR alukkeita esitetään taulukossa 2.

Tulokset

ErbB3 ilmaisun ja lokalisointi normaalissa ja kasvaimen eturauhaskudoksiin

137 HS, 32 CRPC ja 50 normaalisti esiintyvät kasvaimeen viereisiin kudoksiin analysoitiin immunohistokemiallisesti (kuvio 1). Kaikissa näytteissä, värjäys ErbB3 N-ter, kun niitä on läsnä, on sijoitettu pääasiassa kalvon, eikä tuman värjäytymisen ei havaittu (kuvio 1 A). Kaikki 169 näytteet näkyvät sytoplasminen värjäys ErbB3 C-ter. (Kuvio 1 B). Sen sijaan, tumavärjäystä havaittiin ErbB3 C-ter 60 ja 169 (35%) PCa näytteistä, mutta yksikään ei-kasvain näytteitä. Nuclear ErbB3 ilmentyminen useimmin havaittu CRPC (17/32, 53%) kuin HS kasvaimissa (43/137, 31%) (p = 0,03, Chi 2 testi). Lisäksi, kun niitä on läsnä, prosenttiosuus PCa ilmentävien ErbB3 tumaan oli korkeampi CRPC (mediaani 10%, välillä 2-95%) kuin HS-syövissä (mediaani 2%, 1-20%) (p = 0,007, Mann Whitneyn testi). Mediaani ilmentyminen CCND1 oli 15% HS eturauhasen syöpäsolujen (vaihteluväli 0-70%, ei esitetty) ja 20% syöpäsolujen CRPC kudoksissa (vaihteluväli 0-80%) (kuvio 1D ja 1G). Mediaani proliferaationopeus arvioi Ki67 värjäys oli 1% Eturauhassyövän soluja HS kudoksissa (alue 0-10%, ei esitetty) ja 17,5% vuonna CRPC näytteistä (kuvio 1 E ja 1 H). HS, ei merkittävää yhteyttä ei havaittu ydin- ErbB3, CCND1 (p = 0,09) ja proliferaationopeus (p = 0,1, Spearman testi). Vuonna CRPC, ydin- ilmaus ErbB3 oli merkitsevästi yhteydessä

CCND1

ilmaisu, jossa on positiivinen korrelaatio (p = 0,01, Spearman testi) (kuvio 1 C ja 1 D vs 1F ja 1G). Voit jatkaa, ydinvoiman ErbB3 on erittäin ja usein ilmaistu CRPC ja korreloi CCND1 ilme, kun taas mitään merkittävää korrelaatiota ei havaittu HS kasvaimissa.

Värjäys ErbB3 N-ter-vasta PCA kudoksissa sijaitsi kalvon, ilman ydin- lauseke (a). Ei ErbB3 C-ter tumavärjäystä havaittiin ”normaali” eturauhasen kudosten (b). Nuclear ErbB3 ilmentymistä havaittiin PCa soluissa, ja useammin CRPC kehittynyt kasvaimissa verrattuna kliinisesti lokalisoitu syöpiä. Vuonna CRPC, korkea tumavärjäystä liittyi korkea CCND1 ilme ja yleensä liittyä korkeampi leviämisen (Ki67) (CRPC 1, ce), kun taas useimmat kasvaimet ilman tumavärjäystä näkyy pieni CCND1 ilmaisun ja yleensä heikompi lisääntymistä (CRPC 2, fh).

ErbB3 ilmaisun ja lokalisointiin eturauhasen solulinjoissa

seuraava arvioitu endogeenisen ErbB3 ilmaisun ja lokalisointiin eturauhasen solulinjoissa käyttäen ErbB3 C-ter-aineita. Epäsuoralla immunofluoresenssilla, ErbB3 värjäytyminen oli pääasiassa läsnä solukalvon ja sytoplasmassa RWPE soluissa, kun taas korkean tumavärjäystä havaittiin kasvainsolulinjoissa (kuvio 2A). Western blot-analyysi kokonaisproteiinia uutteet osoitti, että kolme solulinjat ilmensivät samalla tasolla täyspitkän ErbB3

185kDa proteiinia. Ylimääräinen 80 kDa proteiini spesifisesti havaittu hormonin herkkä (LNCaP) ja hormoni-resistenttejä (PC3) kasvainsolulinjoja (kuvio 2B). Seuraavaksi western blotting suoritettiin kuin ydinenergian vs tumaproteiini jakeet. Laatu otteet validoitiin erityiseen havaitseminen sytosolin PAK1 proteiinia kuin ydinenergian otteita ja C23 (nukleoliinin) proteiinia tumauutteiden. Kuten on esitetty, ErbB3

185kDa lähinnä ilmaistu kuin ydinalan jakeet ja oli poissa tai hieman havaittavissa ydin- murto kaikissa solutyypeissä. Sen sijaan 80 kDa proteiini lähes yksinomaan havaittiin ydin- murto LNCaP ja PC3-soluissa (kuvio 2C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ydinvoima proteiini havaitaan PCa solut voitaisiin vastaavat pääosin ErbB3

80 kDa ydin- isoformi on aiemmin kuvattu keuhkosyövän solulinjoissa [17].

(A) Sekä RWPE ja PC3-soluissa näyttää sytoplasmista ja kalvo ErbB3 lokalisointi. Lisäksi natiivi PC3 soluilla vahvan ydinvoiman lokalisointi havaita ErbB3 C-ter-ainetta (sc-285, Santa-Cruz Biotechnology). (B) yhteensä proteiinin uutteita, ErbB3 C-ter-vasta tunnistaa täyspitkä ErbB3

185kDa proteiinia kaikissa solulinjoissa ja 80 kDa proteiinin LNCaP ja PC3 kasvainsolulinjoissa. (C) Täyspitkä ErbB3

185kDa proteiini lähes ainoastaan ​​havaittu kuin ydinalan jakeet, jotka sisältävät solukalvon ja sytoplasman proteiineja taas vahvan 80 kDa signaali havaitaan ydinvoiman jakeet tuumorilinjoja. (D) 719 bp: n monistustuotteen havaitaan kolmen solulinjoissa alukkeita suunniteltiin monistamaan sekä täyspitkän mRNA: n (NM_001982.3) ja AK300909.1 variantti (PCR1), kun taas PCR2 ja PCR3 spesifisiä alukkeita ja AK124710. 1 ja AK1250281 vastaavasti, ei monistaa missä tahansa järjestyksessä. (E) kvantitatiivinen analyysi, jossa alukkeina ErbB3 transkriptien osoittavat, että NM_001982.3 ja AK300909.1 ilmaistaan ​​samalla tasolla LNCaP ja PC3 solulinjoissa taas AK300909.1 on hieman havaittavissa RWPE soluissa.

joukossa otaksuttu variantit raportoitu julkisista tietokannoista, joita voidaan transkriboidaan

ErbB3

geeni, vain kolme voi vastata ydinvoiman ErbB3

80 kDa proteiinia. Ne puuttuvat 5 ’, joka koodaa ligandia sitovaa ja transmembraanidomeeni reseptorin ja niillä ennustetaan ydinvoiman lokalisointi signaaleja (NLS) [29]. Erotella näiden variantit, teimme RT-PCR: llä alukkeilla ympäri ATG aloituskodonista mRNA: iden. Kolmen solulinjoissa, joka on 719 bp: n PCR-tuote havaittiin alukkeiden parin (PCR1), jotka mahdollistavat vahvistus sekä täyspitkän NM_001982.3 ja muunnelma AK300909.1 transkriptien, jotka jakavat saman nukleotidisekvenssin. Tämä koe johti meidät poistamaan AK124710.1 ja AK1250281 ja keskittyä AK300909.1 transkripti (kuvio 2D). Tämä vaihtoehto on ennustetaan koodaavan 699aa proteiinia, jonka sekvenssi on täysin identtinen solunsisäiseen domeeniin ErbB3

185kDa. Erotella NM_001982.3 ja AK300909.1 ilmentyminen solulinjoissa, RT-qPCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka monistavat molemmat kopiot tai spesifisten alukkeiden 5′-koodaussekvenssi NM_001982.3 (kuvio 2E). Kuten on esitetty, molemmat kopiot ilmaistiin samalla tasolla LNCaP ja PC3-soluja, kun taas AK300909.1 oli tuskin havaittavissa RWPE-soluissa (kuvio 2E).

Näin ollen, LNCaP ja PC3 eturauhasen kasvainsolulinjoissa koodaavat kahta eri proteiini-isoformit ErbB3

185kDa ja ErbB3

80 kDa, joka vastaa NM_001982.3 ja AK300909.1 mRNA-transkriptien vastaavasti.

genominlaajuiset analyysi ErbB3-kohde promoottorit eturauhassyöpäsoluissa

tunnistamiseksi ErbB3-kohdegeenien, me seuraavaksi suoritetaan chip-on-chip, joissa käytetään chip validoitu ErbB3 C-ter vasta [17] mukaan työnkulun kuvattu (kuvio 3A). ErbB3-sidottu genomialuetta ensin tutkittiin käyttäen itsenäistä CoCAS V2,4 ohjelmistojen [28]. Esikäsittelyn jälkeen vaiheessa huippu algoritmin havaittu korkea koetin vastaavia signaaleja merkittäviä muutoksia Cy3 /Cy5 suhde rikastetun genomialueiden. Kaikkiaan 68% ErbB3-kohde koettimet sijaitsevat ytimeen promoottorit, kun taas 30% oli sisällä geenejä ja 2% alavirtaan transkription aloituskohdasta (TSS). Merkittävästi rikastettua Koettimet tunnistettiin kynnysarvoa säädetty 0,998, mikä johtaa lopulta tunnistaa 1840 ErbB3-kohde promoottorit jaetaan seuraavasti: 317 promoottoreita RWPE, 606 LNCaP ja 1297 PC3-soluissa, joista 8 löytyivät 3 solulinjoissa ja 361 oli yhteinen LNCaP ja PC3 solulinjoissa (kuvio 3B). Tiedot varmistettiin vielä kanssa Agilent Workbench 7.0 ohjelmisto. Jakelun signaalin pitkin promoottoreita käytettiin suunnittelemaan ChIP-qPCR alukkeita alueilla, jotka näytetään korkein pitoisuus ErbB3-koettimien kanssa, on korkein log-suhde (kuvio 3C). Kohdennettujen promoottoreita oli merkitsevästi korkeampi hormoni vastustuskykyisten PC3 soluissa kuin hormoniherkän LNCaP, mikä viittaa osallistuminen ErbB3

80 kDa PCA etenemistä ja aggressiivisuus, mukaisesti saatuja tietoja potilaista (kuvio 1). Gene luettelot johdettu Chip-on-chip kokeet edelleen analysoitiin DAVID (Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery) [30]. Toiminnallinen merkintä vahvisti osallistumisen ErbB3

80 kDa tavoitteet soluprosesseissa erittäin vapautettiin kasvaimen mekanismien (kuvio 3D). Huomattava määrä ErbB3

80 kDa tavoitteet PC3 tai PC3 ja LNCaP kasvainsolulinjat jo tiedetään liittyvän PCA, tai muita kiinteitä kasvaimia, mikä viittaa siihen, että ErbB3

80 kDa voisi säännellä yleisemmin mekanismeihin kasvaimen etenemistä (kuvio 3D).

(A) Kromatiini immunosaostus kohdistetaan endogeeniseen olosuhteissa. Nuclear lysaatit valmistettiin natiivi soluista kasvatettiin täydellisessä väliaineessa ja ilman androgen. ChIP-DNA ja kokonais-DNA (Input) leimattu Cy5 ja Cy3 fluoroforit vastaavasti, co-hybridisoitiin on Agilent promoottorit tilling taulukot. (B) Tietojen analysointi kanssa CoCAS ohjelmisto johti valita 1840 ErbB3-tavoite promoottorit kolmessa solulinjoissa. (C) Agilent Worbench 7,0 ohjelmisto-analyysi havainnollistaa jakelu positiivisen koettimien (ErbB3-sidottu DNA /punaisia ​​pisteitä) ja negatiivisen koettimia (Input /vihreä pistettä) koko geenien sekvenssin (X-akseli). Signaali-intensiteetti on esitetty y-akselilla.

CCND1

ja

MMP7

vastaavat positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti. (D) Gene ontologia analyysi ErbB3-tavoitteensa DAVID.

chip qPCR validointi ydin- ErbB3 tavoite promoottorit eturauhassyöpäsoluissa

Niistä 1840 tavoitteet, 26 geenejä valittiin siru-qPCR validointi (kuvio 4). Neljä ei-rikastettu promoottorit (

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

ja

MMP7

) käytettiin negatiivisina kontrolleina ja ei ollut mitään merkittävää vahvistusta, kun taas

CCND1

promoottori näytetään 7-12 rikastamiseen kertaiseksi LNCaP ja PC3-soluissa, vastaavasti (kuvio 4). 3 LNCaP-erityisiä tavoitteita näytteillä merkittävää rikastumista kertaiseksi LNCaP eikä PC3-soluissa, kun taas vahva ja erityinen rikastus havaittiin 6 PC3-erityisiä tavoitteita PC3-solulinjassa (kuvio 4A vs 4B). Rikastamiseen kertainen havaittu jaetun promoottorit vaihdella riippuen kohteen ja solulinjaa, mutta oli aina suurempi hormoni vastustuskykyisten PC3 soluissa kuin LNCaP.

perusteella biocomputing tietojen, 16 satunnaisesti valittua ErbB3-kohde promoottorit LNCaP-soluja (A) ja 19 satunnaisesti valittua ErbB3-kohde-promoottorit PC3-solujen (B) testattiin. Kaikki osoittivat merkittävää ErbB3 rikastamiseen verrattuna negatiiviseen kontrolliin ChIP-IgG (arvo normalisoitu 1).

CCND1

promoottori käytettiin positiivisena kontrollina kun taas ei-rikastettu promoottorit

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

, ja

MMP7

käytettiin negatiivisina kontrolleina. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta ja ovat keinoja kolmesta näytteestä. * P 0,05, ** P 0,01, ns = ei-merkitsevä, Opiskelijan

t

testiä.

transkription säätelyyn ErbB3-riippuvaisen kohdegeenien

Ottaen huomioon rakenteen AK300909.1 transkriptin, ei siRNA: t erityisesti tätä muunnos voidaan suunnitella. Niin, käsittelimme transkription vaikutuksia ErbB3

80 kDa subtraktiivisen analyysi: kaksi siRNA: iden käytettiin kohdistaminen joko 5 ’koodaava sekvenssi NM_001982.3

ErbB3

transkripti (siErbB3A) tai 3 ”koodaussekvenssin sekä NM_001982.3 ja AK300909.1

ErbB3

selostukset (siErbB3B) osoittamiin Kuva 5A. SiRNA: t todensi RT-qPCR (ei esitetty) ja Western blotting-analyysi: ErbB3

185kDa ilmentyminen estyi molemmat siRNA: t, kun taas ErbB3

80 kDa ilmentyminen väheni vain siErbB3B LNCaP ja PC3 solulinjoissa (kuvio 5A ). Näissä olosuhteissa, seuraavan kerran analysoitiin ekspressiota 15 ErbB3

80 kDa-tavoitteet geenien (kuvio 5B). Kuten odotettua, ilmaus

CCND1

väheni merkittävästi LNCaP ja PC3-soluja, jotka on transfektoitu siErbB3B vs siErbB3A, jälkimmäinen ei ollut mitään eroa kontrolliin siRNA. Sama hakenut

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

ja

ErbB2

kahdessa solulinjoissa, ja

ARID1A

PC3-soluissa. Kääntäen, siErbB3B alulle korkeammat lauseke

PPIG

ja

MXI1

kahdessa solulinjoissa ja

ID3

ja PC3-vasta tavoitteiden PC3-soluissa (kuvio 5B). Yksinkertaistaa data-analyysi, prosenttiosuus ilmaisun kertainen muutos, joka voidaan spesifisesti johtuvan ydin- isoformin laskettiin kaavan (suhteellinen geenin ilmentymisen, kun siErbB3B hoito) /(suhteellinen geenin ilmentymisen, kun siErbB3A hoito) kohde-geeni (kuvio 5C) . Kuten on esitetty, ErbB3

80 kDa kopiointia aktivoi

CCND1

,

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

ja estää

PPIG

MXI1

sekä LNCaP ja PC3-soluissa, kun taas se estää

TBCC

,

SIN3A

,

ACE

,

ID3

,

RAD52

,

CXCR3

PC3-soluissa vain. Western blot-analyysi suoritettiin ErbB3

80 kDa, tavoitteet vahvisti transkription vaikutuksia ydin- ErbB3 isomuodon proteiinin tason (S1 kuvio).

(A) Kaksi siRNA: ita käytettiin inhiboivat spesifisesti NM_001982.3 transkripti (siErbB3A) tai sekä NM_001982.3 ja AK300909.1 selostukset (siErbB3B) ja vahvistanut western blottauksella käyttämällä ErbB3 C-ter-aine. (B) LNCaP ja PC3-solut transfektoitiin ohimenevästi siErbB3A tai siErbB3B ennen mRNA: t saatiin käänteistranskriptio ja monistettiin. RT-qPCR suoritettiin valikoima ErbB3-kohdegeenien. Expression kertaluokkamuutos normalisoitiin hallita siRNA transfektoitujen näytteitä. Transfektiot tehdään kolmena kappaleena, ja RT-qPCR raportoidut tulokset ovat vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) Expression kertamuutos peräkkäistä inhibition ErbB3

80 kDa isoformi kustakin solulinjasta ja kunkin kohdegeenin lasketaan suhde (suhteellinen geenin ilmentymisen, kun siErbB3B hoito) /(suhteellinen geenin ilmentymisen, kun siErbB3A hoito). ErbB3

80 kDa riippuvaisen transkription aktivoituminen

GATA2

,

RUNX2

,

MAP3K14

,

ErbB2

ja

CCND1

ja inaktivointi

PPIG

, MXI1 olivat samanlaiset LNCaP ja PC3 taas

ARID1A

,

TBCC

,

FYN

,

SIN3A

,

TOR3A

,

ACE

,

RAD52

,

CXCR3A

näytti säädellään eri tavalla kahdessa solulinjoissa. * P 0,05, ** P 0,01, ns = ei-merkitsevä, Opiskelijan

t

testiä.

Tässä esitetyt tiedot voidaan integroida ehdottamaan malliin ydinvoiman ErbB3

80 kDa toimintoja eturauhassyövän etenemisen (kuvio 6).

esto RA-riippuvaisen signaloinnin androgeenien peruuttamisen terapia (AWT) ensimmäinen kasvaimen kasvu estyy, mutta pian vaihtoehtoisia proliferatiivinen väyliä aktivoidaan asiakkuutta syövän etenemiseen. Lisääntynyt ErbB3 ilmaisun ja myöhemmin aktivoituminen PI3K reitin vastauksena AWT on merkittävä kasvainten vastarintaa. Vaihtoehtoisesti raportoimme tässä tumakertymään ErbB3

80 kDa, variantti, jolta puuttuu ligandia sitovan ja transmembraanidomeeni ErbB3

180kDa, kehittyneissä PCa resistenttejä (CRPC). Koska co-säädin varten transkriptio liittyvien geenien soluproliferaatiota, erilaistuminen, apoptoosi, oncogenesis, ErbB3

80 kDa todennäköisesti vahvasti mukana terapiassa kestävyys ja eteneminen kohtalokas PCa.

DHT

:

dihydrotestosteroni; AR

:

androgeenireseptorin; OVAT

:

androgeeniresponsiivinen elementtejä

.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tuoda esille molekyyli reittejä, joihin ErbB3 kasvaimen etenemisen ja metastaattinen leviäminen jotta luonnehtia uusia potentiaalisia terapeuttisia kohteita eturauhassyöpää. Viimeaikaiset hoitoja hyväksytty toistuvia eturauhassyöpää viive metastasointiin ja laajentaa kokonaiselossaolo, mutta vieläkään estää kasvaimen etenemiseen kohtalokas CRPC. Sopimaton ilmaisun ja /tai aktivaatio ErB perheen tyrosiinikinaasin reseptorit on raportoitu kehittyneen PCa, mikä harkita erbb1, ErbB2 ja ErbB3 mahdollisina ja ennustavia markkereita [22,31]. Siten lisääntynyt ErbB3 ilme on raportoitu androgeeniriippuvaisissa PCa hoitaa androgeeni- peruuttamisen ja sen yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tämä yli-ilmentyminen korreloi solusyklin etenemisen ja uudelleen transkriptionaalista aktiivisuutta AR puuttuessa androgeenien [26]. Lisäksi ydinvoiman lokerointi ErbB3 on ehdotettu olevan rooli PCA etenemisen mutta vaikutusmekanismeista vielä tunneta [18,27,32].

Ensin tutkittiin ilmaus ErbB3 normaali tai kasvain eturauhasen kudoksia. Värjäys ErbB3 N-ter oli suunnattu kalvon, ilman ydin- ilmaisua. Käyttämällä ErbB3 C-ter vasta-aineen tumavärjäystä havaitsimme rajoittui PCa soluihin ja se nostettiin kehittyneissä kastraatio kestävä eturauhassyöpä verrattuna lokalisoitu kasvaimia. Nämä tiedot vahvistavat osallistumista ydinvoiman ErbB3-proteiini PCA eteneminen jopa terminaaliin kastraatio kestävät vaiheessa [18]. Kuten emme onnistuneet havaitsemaan tumavärjäystä in CRPC anti ErbB3 N-ter vasta, oletimme, että ydinvoiman ErbB3-proteiini voi olla variantti, jonka mallina aikaisemmin kuvatun ErbB3

80 kDa tai ErbB3

50 kDa isoformeja [16 17]. ErbB3-proteiinin ilmentyminen arvioidaan normaalin ja kasvaimen eturauhasen solulinjoissa vahvisti hypoteesia, jossa täyspitkä reseptorin ErbB3

185kDa lähinnä ilmaistu kuin ydinenergian proteiinin osa kaikissa solulinjoissa sekä ErbB3

80 kDa isoformi pääasiassa havaittu ydin- proteiinin osa kasvainsolulinjojen. Tähän mennessä ainoastaan ​​täyspitkän ErbB3

185kDa proteiinia raportoitu tumassa eturauhasen kasvaimia ja solulinjoissa [15,19]. Mekanismit tumaanohjaussignaali analysoitu toistaiseksi mukana reititys endosomeista ja /tai kalvo pilkkominen seuraavan reseptorin aktivaation [5-7, 32-36]. Koska ErbB3

185kDa on tyrosiinikinaasi puutteellinen, sen fosforylaatio tapahtuu kun dimerisaatio muiden jäsenten kanssa ErbB- perheen [37].