PLoS ONE: peräsuolen syövän kantasoluja Rikastettu ksenogeenisissä Kasvaimet kemoterapian jälkeen
tiivistelmä
Background
Potilaat yleensä kuolee syöpään epäonnistumisen jälkeen nykyisten hoitomuotojen poistaa jäljellä tauti. Alapopulaatio kasvainsolujen, joita kutsutaan syövän kantasoluja (CSC), ei näytä olevan erikoisesti pystyy polttoaineen kasvua fenotyyppisesti ja histologisesti erilaisten kasvainten. On ehdotettu, siksi, että epäonnistuminen tehokkaasti syövän hoitoon voi osittain johtua suosivista vastus näiden CSC kemoterapia-aineiden. Alaryhmästä Ihmisen kolorektaalisyöpäkasvainsoluja kanssa ESA
+ CD44
+ fenotyyppi ovat ainutlaatuisen vastaavat kasvaimien synnyn ja on kyky tuottaa heterogeeninen kasvaimia vierassiirrännänmallissa ympäristössä (
ts.
CoCSC). Oletimme, että jos ei-tuumorigeeniset solut ovat alttiimpia kemoterapia-aineiden, niin jäljellä kasvaimet voidaan odottaa sisältävän korkeamman taajuuden CoCSC.
menetelmät ja havainnot
Ksenogeeniset kasvaimia aloitetaan CoCSC olivat lämmetä ~400 mm
3, jossa vaiheessa hiiret satunnaistettiin ja kemoterapeuttisten hoito koostuu syklofosfamidin tai Irinotecan aloitettiin. Tiedot yksittäisistä kasvain fenotyyppianalyysillä ja sarja elinsiirtojen esiintynyt rajoittavan laimennuksen osoittavat, että jäljellä oleva kasvaimia rikastetaan soluja kanssa CoCSC fenotyyppi ja ne ovat lisänneet tuumorigeenisia solun taajuuden. Lisäksi luontainen kyky jäljellä CoCSC tuottaa kasvaimia vaikuttaa säilynyt. Aldehydidehydrogenaasille 1-geenin ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuuden ovat koholla CoCSC ja käyttämällä
in vitro
kulttuuri järjestelmä, joka ylläpitää CoCSC osoituksena sarja- elinsiirtoja ja lentiviraalinen merkintä yhden soluperäisissä klooneista, me osoittavat lisäksi, että ALDH1 entsyymiaktiivisuus on tärkeä välittäjäaine resistenssi syklofosfamidia: klassisen kemoterapeuttista ainetta.
Johtopäätökset
CoCSC rikastuvat koolontuumoreissa kemoterapian jälkeen ja edelleen kyettävä nopeasti regeneroimaan kasvaimia, joista ne ovat peräisin. Keskittymällä biologiaan CoCSC, suuria resistenssimekanismit tiettyjä kemoterapeuttisia aineita voidaan kohdistaa erityisiä geenejä, mikä viittaa siihen, keinoja parantaa syövän hoidossa.
Citation: Dylla SJ, Beviglia L, Park IK, Chartier C, raval J, Ngan L, et ai. (2008) peräsuolen syövän kantasoluja Rikastettu ksenogeenisissä Kasvaimet kemoterapian jälkeen. PLoS ONE 3 (6): e2428. doi: 10,1371 /journal.pone.0002428
Editor: D. Gary Gilliland, Brigham ja naisten sairaala, Yhdysvallat
vastaanotettu: 29 marraskuu 2007; Hyväksytty: 08 toukokuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008
Copyright: © 2008 Dylla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: MFC perustajajäsen ja jäsen maksetun neuvottelukunnan OncoMed Pharmaceuticals Inc., ja on oman pääoman asema yrityksessä. Kaikki muut kirjoittajat ovat työntekijöitä OncoMed Pharmaceuticals Inc., bioteknologiayritys keskittynyt terapeuttista kohdentamiseen Cancer Stem Cells, joka on hakenut patenttia liittyvät tähän tutkimukseen. Rahoitus Näissä tutkimuksissa saatiin kautta yksityistä rahoitusta; kuitenkin, nämä osapuolilla ei ollut roolia Päätös suorittaa, analysoida tai julkaista tulokset.
Kilpailevat edut: MFC on perustaja ja jäsen maksetun neuvottelukunnan OncoMed Pharmaceuticals Inc., ja on pääoman asema yhtiössä. Kaikki muut kirjoittajat ovat työntekijöitä OncoMed Pharmaceuticals Inc., biotekniikan yritys, joka on hakenut patenttia liittyvät tähän tutkimukseen.
Johdanto
Läsnäolo monipuolinen solupopulaatioiden normaalissa ja kasvainkudoksessa on pitkä tunnustettu. Kun taas normaali kudos rakenne ja toiminta on helpottaa erilaisia solutyyppejä, syntyy kehityksen aikana ja jatkuvasti vaihdettava säilyttää homeostaasiin, syöpä on yleensä ominaista sekavaa liiallinen proliferaatio. Koska geneettinen materiaali etenee yli pitkiä aikoja, koska itseuudistumisen ominaisuudet kantasoluja, sekoitusvaihe mutaatiot tarvittavat kasvaimien synnyn on oletettu kertyvän näitä harvinaisia soluissa eikä niiden monilukuisempia jälkeläisiä, joilla on rajallinen elinikä kerran sitoutunut erilaistumista. Kuten normaali kudos asuva kantasoluja, jotka tukevat solun hierarkia, joka käsittää tiettyyn kudokseen elinkaaren aikana yksittäisen, syövän kantasoluja (CSC) määritellään niiden kyky itse uudistaa loputtomiin, säilyttäen niiden kyky tuottaa sekä tuumorigeeninen (TG ) ja ei-tuumorigeeniset (NTG) solut [1]. Toisin kuin normaalin kehityksen kuitenkin neoplastisia progenitorisolupopulaatioilla voi saada itseuudistumisen ominaisuuksia, jolloin myös täyttää määritelmän CSC [2], [3]. Viime kädessä osoitus itseuudistumisen ja erilaistumista ominaisuudet, jotka määrittävät kantasolujen, sekä normaali ja neoplastisia, voidaan vahvistaa sarja elinsiirtoa tutkimuksia, jotka mahdollistavat syrjintä solujen joilla itseuudistumisen kyky verrattuna niihin, jotka kykenevät lukuisia, vaikkakin rajallinen, ei itse -renewing solunjakautuminen [4].
CSC paradigma nojaa perustan, joka kasvain heterogeenisuus voidaan tuottaa yhdellä CSC. Koska perinteinen solulinjat ja ksenografteissa eivät kerrata matkapuhelinverkon ja morfologiset heterogeenisuus havaittiin ksenografteissa johtuvat istuttaminen kasvainsolujen otettu suoraan potilailta eikä siirrostettiin
in vitro
CSC biologia riippuu jälkimmäisen muodon ksenograftien. Vaikka relevanssia, ja kaikki, ksenografteissa potilaan kasvaimissa on kyseenalaistettu [5] – [7], Ihmiskudosten solujen hiiriin on ainoa malli, joka ei altista ihmisen soluja kohteena on aphysiological
ex vivo
ympäristö koostuu kudosviljelymuoviin ja viljelyväliaine ja jotka voivat kerrata solu heterogeenisyys primaarikasvain
in vivo
. Toinen aihe kiistaa on perusta CSC hypoteesi on ehdotus, että täydellinen heterogeenisyys kasvaimen voi johtua yhdestä solusta [8], [9]. Piittaamatta strooman, endoteelin, ja hematopoieettiset tekijät palvelukseen ja osaksi kasvain, on ehdotettu, että TG ja NTG populaatiot syntyvät eri soluista eikä yhdestä CSC [9]. Jos CSC voi todellakin tuottaa matkapuhelinverkon heterogeenisyys havaittiin potilaan kasvaimissa, ja hiiri ksenografteissa koostuvat soluista tiukasti kuljetettiin
in vivo
parhaiten säilyttää ominaisuudet kasvaimia potilailla, niin painopiste ponnisteluja syövän biologian alan pitäisi olla suoraan näissä soluissa ja niiden microenvironmental kapealla.
kemoterapeuttisia strategioita tähtäävää nopeasti jakautuvia soluja on pääasiallisesti käytetty hoitoon on epiteelialkuperää olevia tuumoreita. Vaikka usein tehokas rajaamisvai- kasvain massa, nämä aineet ovat pitkälti epäonnistuneet hävittämään taudin [10]. Syy usein syynä tähän epäonnistumiseen on, että osajoukot solut saavat vastustuskykyä terapian kautta geneettinen mutaatio ja luonnonvalinta. Vaikka tämä otaksuma voi pitää paikkansa erityisesti asetus Pitkäaikaisessa hoidossa, yksi teemassa ”syöpä kantasolu hypoteesi” arvelee, että solut vastaava kasvaimen uusiutumisen voi luonnostaan olla vastustuskykyisiä kasvain debulking aineiden kautta tahansa useista mekanismeista ; mikä selittää tulenkestävä kasvaimen kasvua näiden olosuhteiden jälkeen [11]. Tukemiseksi tämän hypoteesin, kestävyys säteily voi aiheuttaa kohonnutta ilmentymistä DNA-vaurion muuniresponssigeeneinä, kuten on asianlaita CD133
+ glioblastoma kantasoluja [12]. Analogisesti hematopoieettiset kantasolut, kiinteä kasvain CSC on ehdotettu omaavan korkean tason ekspression monilääke kuljettajan perheen geenejä, kuten ABCG2 ja ABCB5, joka todennäköisesti johtaa tehokkaampaan ulosvirtaus kemoterapeuttisten [13] – [15]. CSC voi myös tulla solusyklin harvemmin, jotta he voivat vastustaa myrkyllisyyttä lääkkeet, jotka kohdistuvat erittäin lisääntyvät solut. Todisteita chemoresistance by kantasolujen kaltaisia soluja epiteelisolujen linjojen ja ksenogeeniset kasvain peräisin olevat solut on esitetty [16] – [19]; mutta nämä tutkimukset ovat joko käyttää solulinjoja sovitettu kudosviljelmän ja /tai eivät arvioi muuttunut kasvainta aloittamista solun taajuus
in vivo
kemoterapian jälkeen. Määritelmän, kasvaimen aloittamista solut on lueteltu jälkikäteen, siis muuttaa CSC taajuudet hoidon jälkeen parhaiten osoitettu sarjasiirteillä.
Syklofosfamidi (CPA) ja irinotekaanin ovat aineita, jotka kohdistuvat lisääntyvät solut ja niitä käytetään yleisesti kemoterapeuttisten aineiden hoito kiinteitä kasvaimia. Erilaisten mekanismien kautta, molemmat toimivat estää DNA: n replikaatiota tuloksena hidastumisen tai esto solunjakautumisen ja tuloksena apoptoosin. Kestävyys CPA on ehdotettu johtuvan korkeista sytoplasman aldehydistä (ALDH) entsyymin aktiivisuus: erityisesti, kun ALDH1 ja ALDH3 [20], [21], joka hapettaa ja inaktivoida bioaktiiviset metabolinen sivutuote CPA, aldophosphamide /4-hydroxycyclophosphamide ( 4-HC) [22], [23]. ALDH1, erityisesti, voi olla merkittävä rooli CPA vastuksen, koska se on
K
m
CPA on ~52 uM, kun taas muiden ALDH perheenjäsenten kanssa CPA catabolic aktiivisuutta, ALDH3 (
ALDH3A1
) ja SSDH (
ALDH5A1
), ovat 10 kertaa pienempi (
K
m
520 uM) [24]. Vaikka monet kudokset ovat suhteellisen joustavaa vanavedessä CPA hoito [25], vain hematopoieettisen ja hermoston kantasoluja on osoitettu sisältävän korkea ALDH aktiivisuus tekijöiden uudelleen elinsiirron tutkimuksissa eristyksen jälkeen näistä solupopulaatioiden [26] – [28]. Koska peräsuolen syövän todennäköisesti syntyy paksusuolen kanta- tai progenitorisolujen, on houkuttelevaa oletuksen, että vastaavia mekanismeja voidaan tehdä CoCSC vastustuskykyisiä CPA.
Syöpä kantasolukkoa on nyt takautuvasti tunnistettu eri kasvainten epiteelin alkuperä, mukaan lukien rinta-, paksusuolen ja eturauhasen [19], [29] – [33]. Kaikissa Kolorektaalituumorien olemme tutkineet tähän mennessä kasvaimet voidaan onnistuneesti siirtää käyttämällä pieniä määriä (
esim
1,000) solujen fenotyyppisesti positiivisia sekä epiteelin antigeenin (
eli
ESA tai EpCAM) ja CD44 [30]. Joissakin kasvaimia, eristäminen positiivisten solujen CD166, lisäksi ESA ja CD44, rikastuttaa ja peräsuolen syövän kantasoluja (CoCSC), joka mahdollistaa tehokkaan kasvaimien synnyn liittyi vain 200 ESA
+ CD44
+ CD166
+ soluihin [30]. Paitsi että tämä fenotyyppi tunnistaa CoCSC ksenograftikasvaimissa, mutta kasvaimen kehittymisen voidaan käynnistää primäärikasvain näytteiden pieni määrä ESA
+ CD44
+ CD166
+ soluja. Toistettavan tunnistaminen CoCSC käyttää ESA ja CD44 ei helpota ainoastaan terapeuttista tehoa koskevia tutkimuksia kaikissa potilaasta johdettujen ksenografteissa tutkittu tähän mennessä, mutta myös helpottaa leikkelyn molekyylitason reittejä kasvaimien syntyyn liittyvien ja kestävyys terapia.
Tässä osoitamme että ihmisen ESA
+ CD44
+ CoCSC tuottaa adenokarsinooman muistuttavia vanhempien kasvaimia sekä fenotyyppiään ja histologia kun sarja siirto on ksenograftin ympäristössä ja rikastetaan kasvaimissa seuraavissa klassisen solunsalpaajahoitojen tarkoitus kutistaa kasvaimia. Olemme edelleen osoittavat molemmat
in vitro
ja
in vivo
että vastustuskyky CPA välittyy ainakin osittain ALDH1 entsyymin aktiivisuus ja että vastustuskyvyn muiden kemoterapia-aineiden (
esim
Irinotekaanin) ei todennäköisesti syynä tähän mekanismiin. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen toimiva osoitus siitä, että ihmisen epiteelin CSC väestön määritellyn sarjasiirteillä, rikastetaan jäljellä kiinteiden kasvainten kemoterapian jälkeen. Olemme osoittavat lisäksi, että kasvaimen heterogeenisuus kompleksin muodossa adenokarsinooma koostuu TG ja NTG populaatioita voidaan muodostaa yhden solun. Lopuksi kokeelliset menetelmät tässä tarjota puitteet tehon arvioimiseksi uusien aineiden kohdistaminen kiinteän kasvaimen kantasoluihin.
Tulokset
CoCSC rikastuvat jäljellä kasvaimissa seuraavissa CPA annon
Early passage ihmisen ksenograftikasvaimissa tuotetaan soluista koskaan laajennettu
in vitro
näyttävät muistuttavat läheisesti potilaiden ja voi siten olla erinomainen malli, jonka avulla voidaan tutkia syöpään. Olemme viime aikoina osoittaneet, että alaryhmästä ihmisen kolorektaalisyöpäkasvainsoluja kanssa ESA
+ CD44
+ fenotyyppi on ainutlaatuisesti tuottamisesta vastuussa heterogeeninen adenokarsinooman vierassiirrännänmallissa ympäristössä (kuvio 1A B) [30]. Ihmisen ESA
+ CD44
+ soluja ksenogeeniset Kolorektaalituumorien voidaan edelleen jakaa perustuu CD166 ilmentyminen, jolloin rikastamiseen tuumorigeenisia (TG) solujen joukossa CD166
+ väestöstä. Sen sijaan, kaikki jäljellä olevat syöpäsolut ihmisperäisiä näyttävät pysty aloittamaan kasvaimen kasvua, ja niitä kutsutaan ei-tuumorigeenisiä (NTG). Ottaa tunnistettu kolorektaalisyöpä kantasolut (CoCSC) kykenee ruokkii ksenogeenisten kasvaimen kasvua, pyrimme käsittelemään viipyvä kysymys alalla siitä, onko CSC ovat ensisijaisesti resistenttejä kemoterapeuttisten.
) fenotyyppinen profiili UM-C4 Kolorektaalituumorien ESA, CD44 ja CD166, seuraava poissulkeminen mlin
– soluja.
B
) Formaliini, parafiiniin upotettuja kasvaimen osastoja CPA- tai ajoneuvon-käsiteltyihin kontrollihiiriin värjättiin hematoksyliinillä Eosiini (H UM-C6) ja saavuttaessaan ~400 mm
3, hiiret satunnaistettiin saamaan joko ajoneuvoon tai 38 mg /kg CPA, kahdesti viikossa. 15 päivän kuluessa satunnaistamisen ja hallinnon, kasvaimen kasvu oli selvästi hidastunut CPA-käsiteltyjen eläinten (kuviot 1C ja kuvio S1A). Sen jälkeen euthanization, kasvaimet poistettiin histologista ja fenotyyppinen analyysi. Vaikka prosenttiosuus lisääntyvien kasvainsolujen (
eli
Ki-67
+) ei näyttänyt muuttunut, oli huomattavasti enemmän solukuolemaa (ts TUNEL
+ soluja, kuvio 1 B) ja ESA
+ CD44
+ soluista esiintyi useammin kasvaimia CPA-käsiteltyjen hiirten (kuvio 1 D). Suuntaus kohti useammin ESA
+ CD44
+ solujen CPA-käsiteltyjen kasvainten yleisesti pätenyt riippumaton kasvaimen ja oli korkeampi korkeampi CPA annoksilla (
esim
38 mg /kg versus 25 mg /kg; tuloksia ei ole esitetty). Rikastaminen ESA
+ CD44
+ CD166
+ solujen aikana vielä nopeammin ja erityisen ilmeiset CD166 ilmentyminen analysoitiin jäljellä ihmisen ESA
+ CD44
+ solujen (kuviot 1E, S1B 2,2-kertainen useammin CPA saaneilla kasvaimia kuin hiirissä annettiin ajoneuvoon (
P
= 0,0016; taulukko 1 kuvio 2A) . Tärkeää on, että solun fenotyyppi näiden sarjaan siirrettyjen sekundaarikasvaimia olivat identtisiä vanhempien kasvainsolujen käytetään aloittamaan tutkimuksen (kuvio 2B), mikä osoittaa, että välissä hoitoon ja sarjasiirteillä solujen rajoittavan laimennuksen ei muuttanut joko Tuumorigeenisuustutkimuksissa CoCSC eikä niiden kyky tuottaa heterogeeninen kasvaimia sisältää pääasiallisesti ei-tuumorigeenisiä (
eli
CD44
-) soluja.
A) rajoittaminen laimennus analyysi fraktioimatonta UM-C4 kasvainsolujen avulla laskettiin TG solun taajuus
Poisson
jakelu tilastoja (± 95% luotettavuustasolla *
P
= 0,0016).
B
) Prosenttia ihmisen ESA
+ CD44
+ ja ESA
+ CD44
+ CD166
+ solujen sekundaarikasvaimia johtuvat jäljellä tuumorigeenisia soluista istutetut sarjatuotantona rajoittamisessa laimennus seuraava ajoneuvo tai CPA hoito-ohjelmille.
Koska TG solut useammin ja kasvainsolupopulaatioissa hankintakohtaisesta hoidetuista eläimistä rikastettiin fenotyyppien liittyy CoCSC, me seuraavaksi eristetty CoCSC fenotyypin soluja UM-C4 kasvaimet ajoneuvo- versus CPA-käsitellyistä hiiristä ja kysyttiin, ovatko nämä solut luonnostaan erosivat toisistaan kyky tuottaa sekundaarikasvaimia. Sarjasiirteillä 50 ESA
+ CD44
+ tai ESA
+ CD44
+ CD166
+ soluja kasvaimia CPA- verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään hiirille aiheutti sekundaarikasvaimia kanssa suunnilleen sama taajuus (taulukko 1), joka silloin, kun sitä tarkastellaan yhdessä aiempien havainnot viittaavat siihen, että CoCSC useammin kasvaimiin alttiina CPA solunsalpaajahoitojen ja eivät vaikuta niiden kykyyn polttoaineen kasvaimen kasvua.
CoCSC on korkea ilmaus
ALDH1A1
Etsiessään ylimääräisiä CoCSC markkereita, olemme aiemmin käytetty työkalu, joka voi tunnistaa hematopoieettiset ja hermoston kantasolujen populaatioiden: ALDH entsyymin aktiivisuus [30]. Käyttäen Aldefluor ™ reagenssia, joka käy läpi muutosta fluoresenssin seuraavissa entsymaattisen pilkkomisen ALDH entsyymien ja ALDH1-spesifinen estäjä diethylaminobenzaldehyde (DEAB) [34], suuri alapopulaatio ESA
+ CD44
+ solut molemmista UM-C4 ja UM-C6 tuumorilinjoja määritettiin olevan korkea ALDH aktiivisuutta (kuvio 3A) [30]. Samanlaisia havaintoja on tehty myös muissa potilaasta johdettujen vierassiirrettä peräsuolen tuumorilinjoja (kuva S2). Lisäksi kun ESA
+ CD44
+ solut jakautuvat perustuvat ALDH toimintaa ja eristettiin FACS, ALDH
+ soluja tuumorigeenisia kaikissa tapauksissa tutkittu [30]. Huomattavaa on, että tuumorigeenisuus tiukasti myönnetty ESA
+ CD44
+ ALDH
+ solujen UM-C4 peräsuolen kasvain linjan (kuvio 3B). Vaikka kasvaimet voivat syntyä ESA
+ CD44
+ ALDH
– soluja otettu UM-C6, OMP-C5 ja OMP-C8 tuumorilinjoja [30], joka on ALDH
+ osajoukko TG ESA
+ CD44
+ soluja ei ole kaikissa ksenogeneeisissä peräsuolen tuumorilinjoja tutkittu tähän mennessä (n = 6). Sen sijaan alapopulaatio CD44
– soluja korkea ALDH aktiivisuus esiintyy myös kaikissa tuumorilinjoja, mutta nämä solut eivät tuottaa kasvaimia transplantaation.
) fenotyyppinen profiilia ihmisen ESA
+ UM-C4 kasvainsolut ALDH1 entsyymiaktiivisuus. Gates rajattava kasvain osapopulaatioiden eristettiin FACS tuumoreita tutkimuksiin, jossa
B
) kasvukinetiikat CD44
+ ALDH
+ (punaiset ympyrät), CD44
+ ALDH
– (oranssi laatikot) ja CD44
-ALDH
+ (vihreä kolmiot) populaatiot piirretään. Mittaukset heijastavat vain hiiriä kouraantuntuva kasvaimia. Dataa, joka edustaa n = 3 riippumattoman kokeen.
C
) Taqman qRT-PCR data näytetään suhteellinen ilmentyminen
ALDH1A1
(
1A1
),
ALDH3A1
(
3A1
)
ja ALDH5A1
(
5A1
) kasvaimia tuottavassa (TG; musta) vs. ei-tuumorigeenisiä (NTG, valkoinen) soluja (n≥2) 2 potilaasta johdettujen ksenogeneeisissä peräsuolen tuumorilinjoja (UM C4 UM-C6). Tiedot kuvaavat keskiarvo ± SEM, on normalisoitu versus
GUSB
ja näytetään suhteessa UM-C4 NTG ilmentymisen kunkin geenin.
osajoukko ALDH entsyymit voivat hapettua, ja täten inaktivoivat, sytotoksiset CPA metaboliitti 4-HC /aldophosphamide [23], [35]. Läsnäolo sytoplasman ALDH1 ja ALDH3 erityisesti on liittynyt CPA vastus A549 keuhkosyövän solulinjassa [20], [21]. ALDH1 (koodaama
ALDH1A1
) on suurempi kuin 10-kertaisesti tehokkaampi catabolizing 4-HC /aldophosphamide kuin siihen liittyvät perheenjäsenten ALDH3 ja SSDH: koodaama
ALDH3A1
ja
ALDH5A1
geenit, vastaavasti [24]. Vuonna Taqman ™ qRT-PCR-analyysi UM-C4 ja UM-C6 kasvaimia,
ALDH1A1
ilmaistaan yleisesti korkeammalla tasolla kuin
ALDH3A1
ja
ALDH5A1
.
ALDH1A1
geenin ilmentyminen on 2,8 kertaa suurempi CoCSC kuin NTG soluissa, ja vaikka lievää
ALDH3A1
ilmaisun CoCSC versus NTG populaatioiden (kuvio 3C), sen sanoma on tuskin detectible vuonna joko kasvain linja. Lisäksi, kun taas
ALDH5A1
on hieman koholla TG versus NTG soluja UM-C4 kasvaimet (~1.5-kertainen), sen ilme on samanlainen näistä väestöä UM-C6 kasvaimet (kuvio 3C). Ensisijaisen ilmaus
ALDH1A1
TG soluissa tukee havaittu entsyymiaktiivisuus mittauksia joukossa ihmisen ESA
+ CD44
+ subpopulaatio, jossa suurin osa näistä soluista on korkea DEAB-herkkä, ALDH1 aktiivisuutta. Kun tarkastellaan yhdessä 10-kertainen taitoa ALDH1 vs. ALDH3 ja SSDH inaktivoimaan CPA välituotteita [24], voisi tulkita nämä tulokset viittaavat siihen, että CoCSC vastustuskykyä CPA voi olla pääasiallisesti välittämää ALDH1 entsyymiaktiivisuus.
ALDH1A1
,
MYC
, ja
MYB
rikastuvat jäljellä TG-soluissa CPA terapia
Koska
ALDH1A1
geeni ilmentyminen on kohonnut TG versus NTG soluja, ALDH1 entsyymiaktiivisuus on suhteettoman suuri solujen CoCSC fenotyyppi, ja tämä aktiivisuus voi välittää resistenssiä CPA, me seuraavaksi kysytään taajuus ESA
+ CD44
+ ALDH
+ solujen kohosi UM-C4, UM-C6 ja OMP-C8 kasvaimia hiiristä sai CPA versus ne annostellaan ajoneuvoon. Kuten havaitaan fenotyyppiset kasvu CD166
+ solujen (kuviot 1E, S1B S1C), ALDH
+ alaryhmästä ESA
+ CD44
+ soluja oli johdonmukaisesti korkeampi CPA- versus ajoneuvo- käsiteltyihin kontrollihiiriin (67,6 ± 6,3% vs. 56,8 ± 6,8%, vastaavasti; n = 5,
P
0,012 pariksi
t
-testi) (kuvio 4A).
) suhde ALDH
+ kasvainsoluja joukossa ihmisen ESA
+ CD44
+ väestöstä kasvaimia apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään tai CPA-käsiteltyjen hiirten. Tiedot heijastaa pariksi keskiarvo 5 itsenäisen kokeen käyttäen 3 erilaista ksenogeneeisissä peräsuolen kasvain linjat (UM-C4, UM-C6 OMP-C8) ja n≥5 hiirillä koetta kohti.
B
) Taqman qRT-PCR tiedot merkitään geenien avulla TG ja NTG populaatioiden eristetty (V) ja ajoneuvon tai CPA-käsitellyn UM-C4 kasvaimia. Data edustaa keskiarvo ± SEM (n≥2).
C
) Immunofluoresenssi tai immunoperoksidaasivärjäystä jäädytettyjen tai formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin kasvaimista ALDH1 tai c-Myc, vastaavasti, ajoneuvo- ja CPA-käsitellyillä hiirillä. Musta palkki = 100 um.
Useat geenituotteiden on katsottu kriittinen normaalin paksusuolen kehitykseen ja ovat laajalti ilmaistaan Kolorektaalituumorien [36] – [39]. Eristämisen jälkeen TG versus NTG väestöä sekä ajoneuvo- ja CPA-käsitellyn UM-C4 kasvaimista 99% puhtaus, ilmaus lukuisia geenejä ehdotti siteet peräsuolen syöpä määritettiin Taqman ™ qRT-PCR. Nämä ekspressoituu differentiaalisesti TG versus NTG solut sisältyvät ei ainoastaan
ALDH1A1
, kuten edellä on kuvattu (kuvio 3C), mutta myös c-Myb (
MYB
) ja c-Myc (
MYC
; kuvio 4B). Sen sijaan, geenejä, jotka liittyvät erilaistumiseen ja mesenkymaaliset fenotyypin [40], [41], kuten vimentiinistä (
VIM
), oli enemmän ilmentyy suuresti NTG-soluissa.
Yhdenmukainen koholla taajuus jäljellä ilmentävien kasvainsolujen korkea kasvaimien liittyvän markkereita, kuten CD166, suhteellinen ilmentyminen CoCSC liittyvän versus NTG-liittyvä-transkriptien, kuten
ALDH1A1
ja
VIM
, vastaavasti, oli edelleen erilaisia in CPA- verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään UM-C4 kasvaimia (kuvio 4B). Yhdenmukainen hypoteesia, että ALDH1 voi olla rooli välittäjänä vastustuskykyä CPA,
ALDH1A1
geenien ilmentyminen oli lisäksi kohonnut vuonna jäljellä solujen CoCSC fenotyyppi, mutta
ALDH3A1
ja
ALDH5A1
eivät olleet (kuviot 4B S3). Lisäksi geenit aiemmin tunnistettu erittäin ilmaistaan epiteelin kantasolujen /esisolujen lokero juuressa paksusuolen kryptojen ja kasvainkudoksessa (
esim MYB
MYC
) on korkeammin ilmaistiin in jäljelle jääneiden kasvainsolujen CoCSC kuin NTG solujen populaatio, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen, mutta jotka syntyvät CoCSC ja näyttävät alttiimpia CPA-indusoidun sytotoksisuuden. Samanlaisia ekspressiokuvioiden havaittiin myös muissa ksenogeeniset tuumorilinjoja seuraavat CPA-hoidon, mukaan lukien UM-C6 (kuvio S3).
Lisäksi geeni-ilmentymisen eroja CPA- verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään kasvaimia edelleen korreloivat proteiinin ilmaisun immunofluoresenssilla ja IHC. Solunsisäisiä tasoja ALDH1 ja ydin- c-Myc, esimerkiksi, olivat yleisempiä CPA-käsitellyt tuumorit (kuvio 4C). Mielenkiintoista, ALDH1 värjäytymistä CPA-käsiteltyjen kasvainten näytti paikallistaa ja apikaalisella pinnalle, jossa sitä voidaan arveltu siepata CPA aineenvaihduntatuotteiden astuessaan soluun. Sitä vastoin ALDH1 proteiini tasot olivat alhaisemmat ja hajanaisempi hallinnassa kasvaimia. Samoin, c-Myc oli huomattavasti enemmän keskittynyt tumassa kolorektaalisyöpäkasvainsoluja CPA-käsiteltyjen hiirten, sopusoinnussa useammin TG solujen ja kohonnut
MYC
ilmaisu tämän kimmoisa väestöstä.
CoCSC vastustuskyky kemoterapia ei liity pelkästään CPA
Voit selvittää CoCSC myös resistenttejä muita tärkeitä kemoterapia-aineiden, tutkimme vaikutus Irinotekaani (
aka
SN-38) on CoCSC taajuudella . Kokeet aloitettiin jolloin kasvain hiirille sai injektio viikossa 15 mg /kg irinotekaania. Pienen viiveen jälkeen noin 1 viikko, kasvaimen kasvua pysähtyi Irinotekaani (kuvio 5A). Kun kasvain sadonkorjuun kahden viikon kuluttua aloittamisesta kemoterapian, prosentteina jäljellä CoCSC arvioitiin virtaussytometrialla. In Irinotecan-käsitellyt tuumorit, prosenttiosuus irtotavarana kasvainsolujen kanssa CoCSC fenotyyppi nostettiin 61%: lla kontrolliryhmään verrattuna hiirillä, joille annettiin vehikkeliä (kuvio 5B). Seuraavaksi luontainen tuumorigeenisyyteen ESA
+ CD44
+ CD166
+ soluja ajoneuvo- tai Irinotecan-käsiteltyjen hiirten testattiin sarja elinsiirtoa asettamalla verrattuna niihin soluihin, jotka eivät fenotyypiltään luokitella CoCSC. Samanlaisia take hinnat havaittiin CoCSC peräisin ohjaus- tai Irinotecan saaneista kasvaimia näissä elinsiirrot, ja solut fenotyypiltään luokiteltu ”muu” ei aloittanut kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Tihennetystä CoCSC fenotyypin soluja jäljellä kasvaimia hiirissä Irinotekaani ja kyvyttömyys solujen muiden fenotyyppejä elinsiirtoa sairaus, yhdessä viittaavat siihen, että CoCSC ovat myös edullisesti vastustuskykyisiä Irinotecan.
) kun satunnaistamista normalisoida hoitoryhmään 400 mm
3 päivänä 43, kerran viikossa vehikkelin (vihreät laatikot) tai 15 mg /kg Irinotekaani (punainen kolmio) aloitettiin ja kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa. Kasvukäyrät, jotka edustavat keskiarvona ± SEM on esitetty. B) Prosenttia ihmisen ESA
+ CD44
+ CD166
+ CoCSC fenotyypin solujen jäljellä kasvaimissa on esitetty. Tiedot kuvaavat n≥4 hiirtä hoitoryhmän.
CPA vastustuskyky on erityinen soluihin suurella ALDH1 aktiivisuus
Koska niin ESA
+ CD44
+ tuumorisoluil- korkea ALDH aktiivisuus, taajuus ESA
+ CD44
+ ALDH
+ -solujen lisääntynyt kasvaimia hiirille on CPA, ja
ALDH1A1
geenin ilmentyminen on kohonnut CPA kestävä CoCSC sen vuoksi olemme pyrkineet onko vastustuskyvyn CPA välittämä ALDH1 entsyymin aktiivisuutta. Koska ALDH1 erityinen estäjä DEAB on erittäin epävakaa
in vivo
[42],
in vitro
viljelyolosuhteissa, jotka tukevat TG peräsuolen kasvainten solujen laajentamiseen perustettiin. Huomattavaa on, että solun fenotyypin soluja parhaiten pystyy perustamaan siirtokuntia
in vitro
oli ESA
+ CD44
+ CD166
+ (myös sen CoCSC), kun taas FACS puhdistettua CD44
– solut eivät kyenneet tekemään niin (data nyt esitetty). Validoida että tämä kulttuuri järjestelmä tukee huolto TG soluja, me lajitellaan ESA
+ CD44
+ CD166
+ CoCSC rajoittamisessa laimentamalla levyillä, jotka sisälsivät mitomysiini C-käsitelty 3T3 tai MEF tukisoluja tueksi, riippuen kasvain rivi käyttää: UM-C4 tai UM-C6, vastaavasti. Pesäkkeenmuodostus taajuus CoCSC näissä olosuhteissa oli suunnilleen samanlainen kuin TG solun taajuuden, joka havaittiin transplantaation (~1:86 ± 33, n = 7 UM-C4 ja 01:52 ± 5; n = 3 UM-C6). Pesäkkeet kasvatettiin 14 päivää ilman viemällä ennen takaisinistutusta hiiriin. Ei ainoastaan soluja ylläpitää ESA, CD44 ja CD166 ilmaisun aikana
in vitro
kulttuuri (kuviot 6A B), mutta kyky tuottaa heterogeenisiä kasvaimet muistuttavat vanhempien kasvainten säilytettiin samoin (kuvio 6C). Vahvistaa, että kasvaimen-aloitetaan oleviin soluihin, jotka ovat peräisin yhden
in vitro
pesäkkeet sekä muistuttivat vanhemmais- kasvaimia ja olivat peräisin yhdestä solusta, UM-C4-solut transdusoitiin lentiviruksesta kuljettaa GFP-Luciferase, kasvaimia tuotettiin , ja yksittäisiä pesäkkeitä saatu ESA
+ CD44
+ CD166
+ solut istutetaan hiiriin. Kun sato näiden kasvainten peräisin yksi pesäke, joko solut, joilla on CoCSC fenotyypin tai kaikkien muiden kasvainsolujen, joilla on erilaiset fenotyypit eristettiin FACS: lla, ja tuumorigeenisyystesti ja klonaalisuuden tutkimukset suoritettiin.