Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fulvestrantin (ICI-182780) on viime aikoina osoitettu tehokkaasti tukahduttaa eturauhasen syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Mutta on epäselvää MikroRNA osansa säätelyssä onkogeenin ilmentyminen fulvestrantin saaneilla eturauhassyövän. Täällä, tämä tutkimusraportit

HSA-miR-765

ensimmäisenä fulvestrantti-odotuksiin, ER-säännelty miRNA joilla merkittävä tuumorisuppressoriproteiinia toimintaa, kuten fulvestrantti, vastaan ​​eturauhasen syöpäsolun kasvua kautta tukkeutumisen solusyklin etenemisen G2 /M siirtymä, ja solujen maahanmuuton ja invaasiota mahdollisesti pelkistämällä filopodia /voimakas stressi-kuitua muodostumista. Fulvestrantti osoitettiin upregulate

HSA-miR-765

ilmaisun rekrytointi ER 5′-sääntelyyn-alueella

HSA-miR-765

. HMGA1, onkogeenisen proteiinin eturauhassyövän, tunnistettiin alavirran kohde

HSA-miR-765

ja fulvestrantin solupohjaisia ​​kokeita ja kliinisessä tutkimuksessa. Sekä antiestrogeeni ja

HSA-miR-765

jäljittele tukahdutetaan HMGA1 proteiinin ilmentymisen. Neo-adjuvantti tutkimuksessa tasot

HSA-miR-765

lisättiin ja HMGA1 ilmentyminen lähes täysin menetetty eturauhassyövän yksilöitä saaneilta potilailta yhden annoksen (250 mg) fulvestranttia 28 päivää ennen eturauhasen . Nämä havainnot paljastavat uutta fulvestrantti signalointiryöpyn liittyy ER-välitteisen transkription säätelyä

HSA-miR-765

joka estää HMGA1 proteiinin ilmentyminen osana mekanismia taustalla tuumorisuppressorigeenin toiminta fulvestrantin eturauhassyövässä.

Citation: Leung YK, Chan QK-Y, Ng CF, Ma FM-T, Tse HM, To KF, et al. (2014) Hsa-miRNA-765 on keskeinen sovittelijan kasvun estämiseen, Migration and Invasion fulvestrantin-Treated Eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10,1371 /journal.pone.0098037

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2014; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 16, 2014

Copyright: © 2014 Leung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Hongkongin yliopiston Grant neuvoston General Research Fund (M469107 KML) ja Kiinan University of Hong Kong Suora tutkimusapurahoja (CU2041252 ja CU2041563 KML), sotaveteraanien tunnustuspalkinto (I01BX000675 ja SMH) ja avustukset National Institutes of Health (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 että SMH) ja apurahan tutkija-Sponsored Study Program AstraZenecan (JM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Jodi Maranchie sai tutkija-Sponsored Study Program AstraZenecan. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

normaalia kehitystä ja pahanlaatuisen kasvun eturauhasen säätelevät paitsi androgeenien lisäksi myös estrogeeni [1]. Estrogeenireseptori (ER) β on pääasiallinen reseptori ilmaistaan ​​eturauhasen epiteelin ja useassa vaiheessa eturauhassyövän (PCA), mukaan lukien luun etäpesäkkeitä [2], [3]. Synteettinen estrogeeni dietyylistilbestroli (DES), kautta androgeenipuutteen toiminta, oli kerran etulinjan hoito metastasoituneen PCa [1], [4]. DES lopulta menetti hyväksi, koska sen korkea sydän- myrkyllisyys ja tromboembolisia riski [5], [6], parenteraalisen estradioli-17β (E2) saamassa suosion terapiana metastasoineeseen, kastraatio kestävä PCa (CRPC) [7], [ ,,,0],8], koska sen alhaisen sydän- toksisuus ja suojaava vaikutus vastaan ​​osteoporoosi [9]. Muita selektiivisiä ER modulaattorit (esimerkiksi tamoksifeeni, toremifeeni, ja reloxifene) on tutkittu kliinisissä tutkimuksissa, mutta todettiin rajoitettu tehoa verrattuna DES [10] – [13]. Suostumuksella 2005 fulvestranttia (ICI 182,780), puhdas estrogeenireseptorin antagonisti, jolla ei ole tunnettujen agonistivaikutus, hoitoon reseptoriin positiivisten metastasoitunut rintasyöpä, kiinnostus sen käyttö CRPC on syntynyt.

prekliinisissä malleja, fulvestrantti on osoittanut piirteitä lupaava hoito PCA. Vuonna estrogeenin aiheuttama PCa malli [14] – [17], fulvestrantin esti kehitystä syövän esiasteita, päinvastaiseksi E2 aiheuttama transcriptome [16], [17], ja aiheuttama oma geeni allekirjoitusta [16]. Vuonna DU145, ihmisen PCa solulinjaa, joka ilmentää ER eikä ERa, fulvestrantille tukahdutti solujen kasvua kautta reseptorin [18], ja sitä ainutlaatuinen joukko geenejä, mahdollisesti cross-talk välillä ER ja NFKB [19]. Lisäksi fulvestrantille tukahdutti kasvua DU145 ja PC-3 ksenografteissa kautta ER-välitteisen KLF5 signalointireitistä [20] ja esti myös LNCaP solukasvua vähen- tämisessä androgeenireseptorin [21].

Ainoassa vaiheessa II tutkimuksessa fulvestrantin toistaiseksi suoritettu [22], 20 CRPC potilasta sai lastaus-annostus (500 mg päivänä 0 ja sen jälkeen 250 mg päivänä 14, päivänä 28, ja sen jälkeen kuukausittain). Kuuden kuukauden hoidon jälkeen fulvestrantti oli hyvin siedetty, vaikka mitään suotuisa kliinisiä tai PSA vaste havaittiin [22]. Kuitenkin lisäämällä kyllästysannoksella ensimmäisen kuukauden (500 mg 14 vuorokauden välein), PSA taso oli vähentää tehokkaammin 40-99% kuluessa ,27-2,67kuukausi kuudessa seitsemästä erittäin esikäsiteltyjä CRPC potilaisiin ilman mitään ilmeistä toksisuutta [23 ]. Tämä jälkimmäinen havainto antaa tukea suorittaa lisää tutkimusta annoksen optimointia ja perusteellisia mekaaniset tutkimukset fulvestrantin terapiana PCA.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä (17-25 nukleotidia) ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät posttranskriptionaalisen geeniekspressiota. Jokainen miRNA voivat sitoutua yhden tai useamman kohde- sekvenssien 3′–alue sen tavoite selostukset ja saada mRNA: n hajoaminen tai poistaminen proteiini käännös, riippuen asteesta täydentävien emäspariutumisesta [24]. Yksi miRNA normaalisti säätelee ilmentymistä suuri määrä transkriptien [25] – [27]. Poikkeava spesifisten miRNA koituu kasvun etua syöpäsolujen yli normaalien solujen häiritsemällä useita onkogeeninen /kasvaimen-vaimennin reittejä. PCa-erityisiä miRNA on tunnistettu [28] – [30], ja jotkut ovat androgen liittyviä [31]. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole yksittäinen miRNA on yhdistetty estrogeenit tai antiestrogeenit PCA.

Täällä tutkimme rooli miRNA välittämisessä toiminnan fulvestrantin PCA. Global profiloinnin miRNA ilmentymisen DU145 soluissa tunnistettu

HSA-miR-765

kuin fulvestrantti-säännelty miRNA. Promoottori analyysit määritelty minimaalinen sekvenssin 5′-säätelyalue on

HSA-miR-765

joka rekrytoi ER ja joka on kriittinen fulvestrantti sääntelyä. Vaikutukset miRNA on PCa solujen kasvuun, muuttoliike, ja invaasio verrattiin Fulvestrantin. Riippuvuus Fulvestrantin toimia ER osoitettiin knockdown kokeita. Muutos ilmaus

HSA-miR-765

ja sen loppupään onkogeeniset proteiinia, korkean liikkuvuusryhmän AT-hook 1 (HMGA1), arvioitiin prostatektomia näytteet saatiin potilailta sen jälkeen, kun ne oli käsitelty fulvestrantilla varten yksi kuukausi.

Materiaalit ja menetelmät

Fulvestrantin hoito

DU145 ja PC3 solulinjoja ostettiin ATCC (Manassas, VA). DU145-soluja (ATCC) pidettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [18]. PC3 (ATCC) viljeltiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (hiFBS). Jokaisen kyseessä solulinjan on äskettäin todistettu oikeaksi ATCC käyttämällä lyhyitä tandem-toisto profiloinnin menetelmällä. Kaikki soluja ylläpidettiin 5% hiilellä erotettua hiFBS väliaineessa 24 h ennen lääkehoitoa. Solut käsiteltiin joko 10

-6 M fulvestranttia 0,1% tai 0,1% etanolia. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin vehikkelillä vain.

Mirna ja geenien ilmentymisen

miRNA profiloinnin koko RNA: t uutetaan ja merkitty suoraan käyttämällä NCode Rapid merkintäjärjestelmä (Invitrogen, Grand Island, NY) ja puettu NCode Human miRNA Microarray V3 (Invitrogen).

Tissue ilmentymistä miRNA tutkittiin uuttamalla koko RNA: iden kryoleikkeet (5-10 um) käyttäen RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), poly (A) häntäinen ja käänteistranskriptio universaali RT pohjamaali käyttäen NCode microRNA ensimmäisen juosteen cDNA (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) käyttämällä joko

HSA-miR-765

erityisiä tai spliceosomal U6 pieni ydin- RNA (RNU6) erityinen qRT eteenpäin aluketta (taulukko S2) ja universal reverse qPCR aluketta (Invitrogen).

Yhteensä RNA: t valmistettiin random hexamer (Invitrogen). Ribosomaalinen proteiini 3 (RPS3, taulukko S2) käytettiin housekeeping-ohjaus. Suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin ΔΔC

T-menetelmä [32].

Kliiniset näytteet

Potilaat, joilla on histologisesti varmennettu, kliinisesti paikallinen PCa annettiin yksi injektio lihakseen 250 mg fulvestranttia 28 päivää ennen ennalta radikaalin retropubic eturauhasen. Potilaat suljettiin pois, jos heillä oli valkoinen verenkuvan 3000 /ul, verihiutalemäärä 100000 /ul, hemoglobiini 11 g /dl, INR 1,6 tai bilirubiini ASAT tai kreatiniinipitoisuus 1,5 kertaa ylempi viitearvon. Myös potilaat suljettiin pois, jos ne tarvitsevat kortikosteroideja hoidettaessa muita systeemisiä sairauksia tai oli ollut sydämen vajaatoimintaa, aktiivinen angina, infektio tai aktiivinen toisen syövän. Kaikki potilaat oli lopullinen Gleason summa 6 tai 7 at eturauhasen. Näytteitä hoitamattomat potilaat, joilla on samanlainen Gleason summa ja kaikki näytteet fulvestranttia saaneista potilaista saatiin University of Massachusetts Medical School (umms) alle protokolla (PI. Dr. Maranchie) hyväksymä komitean koehenkilöiden suojelemiseen tutkimuksen ja Institutional Review Board klo umms. Kaikki koehenkilöt edellyttäen kirjallinen lupa osallistua tähän tutkimukseen ja ne tunnistamattomiksi.

knockdovvn ER

siRNA varten ER tai scramble siRNA (Invitrogen) transfektoitiin DU145 soluihin (2 x 10

5) käyttäen X-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). SiRNA-käsitellyt solut käsiteltiin joko fulvestranttia tai etanolin vielä 2-4 päivää, ja sen jälkeen suoritettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä, promoottorin aktiivisuuden analyysi, solukasvumäärityksessä, ja F-aktiini värjäystä.

5 ”sääntelyvälineitä alue analyysit

5 ’ylävirtaan genomiset alueet

HSA-miR-765

esiaste (chr1: 156,906,923-156,906,036 Liittyminen ei. NC_000001.10) -3208-100 oli monistettiin ja kloonattiin pGL3-basic (Promega, Madison, WI), kuten

pGL3-HSA-miR-765

. Serial deleetiot 5’kloonattu sekvenssi vektorissa tehtiin pGL3-miR-765-Δ1192 bp (DNA-sekvenssi -2016-100), pGL3-miR-765-Δ1766 bp (DNA-sekvenssin – 1442-100), pGL3-miR-765-Δ2414 bp (DNA-sekvenssi, -792-100), pGL3-miR-765-Δ2618 bp (DNA-sekvenssi, -590-100), pGL3-miR-765 Δ2972 bp (DNA-sekvenssi, -236-100) ja pGL3-miR-765-Δ3113 bp (DNA-sekvenssi -95-100). Reportteri toiminta muiden katkaistun tai mutantit vektorit DU145 soluissa määritettiin kanssa tai ilman fulvestranttia ja /tai ER siRNA pudotus käyttäen dual lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega).

Mirna kohdistaminen reportterianalyysi

DU145-solut transfektoitiin lusiferaasireportteri- vektori pMIR-miR-765, joka kloonattiin komplementaarisen sekvenssin HSA-miR-765 niin täydellinen miR-765 kohde ja käsiteltiin sitten joko HSA-miR-765 matkivat tai negatiivinen-ohjaus matkivat. Lysaatit alistettiin dual lusiferaasireportterigeenin määritys. 3′-translationaalinen alue

korkean liikkuvuusryhmän AT-hook 1

(

HMGA1

) geenin (+ 8026- + 9332) muodostettiin PCR: (alukkeet taulukossa S2) ja kloonattu osaksi pMIR-SELVITYS (Invitrogen), kuten

pMIR-HMGA1-3UTR

.

HSA-miR-765

matkivat (sekvenssi taulukossa S2) kloonattiin pMIR kuin

pMIR-miR-765

. Vaikutus

HSA-miR-765

jäljittelevät lusife- ilmentyminen määritettiin lusiferaasin määritys (Promega), jossa

pMIR tyhjä

sisällytettiin kontrolliksi.

Kromatiini immuunisaostustesti

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritykset suoritettiin julkaistujen menetelmien mukaisesti [19]. Lyhyesti, DU145-soluja käsiteltiin fulvestranttia tai ohjaus 45 min. DNA-proteiini-kompleksit silloitettu 1% formaldehydiä. Nuclear komplekseja sonikoitiin (250-500 bp). Viisi mikrogrammaa hiiren IgG: tä (Millipore, Billerica, MA), anti-RNA-polymeraasi II (Millipore) tai anti-ERβ1 (Serotec, Raleigh, NC) vasta-aineita haettiin yön immunosaostus. DNA-proteiini-kompleksit pestiin ja eluoitiin. Immunosaostettiin DNA: t puhdistaa, kääntää-silloitettu, ja puhdistettu. PCR ja reaaliaikainen PCR paljasti rekrytointi ER sekvenssiin 5′-säätelyalue on

HSA-miR765

(alukkeet lueteltu taulukossa S2).

0N

promoottori ER [33] käytettiin ei-ER sitova ohjaus tätä koetta.

Solun kasvun määritys

Effects fulvestranttia tai

HSA-miR-765

-mimic hoidon DU145 tai PC3: solukasvun määritettiin CellTiter 96 Ei-radioaktiivinen Cell Proliferation Assay (Promega). Sillä HMGA1 ektooppinen ilmentyminen kokeessa koko pituudelta HMGA1 (pCMV6-AC-HMGA1, Origene, Rockville, MD) tai negatiivisen kontrolli (pCMV6-AC) transfektoitiin DU145-soluissa. Transfektoidut solut rikastuneet G418-täydennetty väliaine viikon. Suhteellinen kasvu, DU145-solujen yhteistyötä käsiteltiin fulvestrantti ja 4 päivää ja joko HMGA1 ilmentymistä tai tyhjän vektorin suhteessa kontrollisoluihin käsiteltiin etanolilla ja tyhjän vektorin verrattiin.

Virtaussytometria analysoi

DU145 soluja käsiteltiin fulvestranttia /etanoli tai

HSA-miR-765

matkivat /negatiivinen kontrolli matkivat ja 2 päivää. Käsitellyt solut analysoitiin julkaistujen menetelmien mukaisesti [32].

Western blot -analyysit

Viisi mikrogrammaa proteiinia solulysaattia elektroforeesilla 10-12,5% SDS-PAGE: lla ja alistettiin Western blot analyysi. Ensisijainen vasta taulukossa S3 käytettiin havaitsemaan proteiinipitoisuuden.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

DU145 tai PC3-soluja käsiteltiin fulvestranttia tai

HSA-miR-765

matkivat ja niiden ohjauslaitteet 2 päivää. Haavan paranemista määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [34]. DU145 solut esikäsiteltiin fulvestranttia tai etanolilla 5 h ennen siirtoa ja invaasiota määritykset suoritettiin [34].

Filamenttihemagglutiniini-aktiini (F-aktiini) värjäys

F-aktiini in fulvestrant- tai etanoli-käsitelty DU145 viljelmät altistettiin RNAi-välitteinen knockdovvn ER,

HSA-miR-765

-mimic transfektion tai kontrollikäsittely visualisoitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti fulvestrant- ja etanolin hoidettuun kontrolliryhmään DU145-soluja joko ER siRNA tai negatiivisen kontrolli siRNA värjättiin TRITC-konjugoidun -falloidiinia ja Fluoresenssikuvat otettiin kiinni.

Computational ennustaminen miRNA tavoitteiden

Miranda /mirSVR [35] (https://www.microrna.org), TargetScan r5.2 [36] (https://www.targetscan.org), RNAhybrid [37], ja EIMMo2 [38 ] käytettiin ennustamaan oletetun tavoitteet

HSA-miR-765

. Genominen linjaukset, BLAT (https://www.ensembl.org), käytettiin ylimääräisen ennustettujen sivustoja.

immunoväriäys HMGA1 ja AR

jääleikkeille (5 pm) Eturauhassyövän yksilöt hoidetuista potilaista tai ei käsitelty fulvestrantilla ennen eturauhasen kiinnitettiin 3% formaldehydiä huoneenlämpötilassa ja sitten metanolilla -20 ° C: ssa. HMGA1 ja AR immunodetektoitiin kanssa 1:100 anti-HMGA1 vasta-ainetta (sc 8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja anti-AR vastaavasti (sc 816, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) julkaistujen menetelmien mukaisesti [39 ]. Immunopositivity määritettiin prosentteina positiivinen signaali (ydin- tai sytoplasmista) in Gleason grade 3/4 pesäkkeitä.

Tulokset

. Fulvestrantin estää solujen kasvua, solusyklin etenemisen, muuttoliike, ja invaasion käytettäessä ER-riippuvaisella tavalla

fulvestrantilla esti kasvua DU145 solujen 40% ja PC-3-soluista 30% läpi ER-riippuvaisen reitin (Kuva 1A, kuviossa S1A) ja pidätti solunjakautumisen G2 /M vaiheessa, kuten on osoitettu merkittävä lasku G0 /G1 solupopulaation ja kertyminen G2 /M-soluissa (kuvio 1 B). Häiriintyminen solusyklin etenemisen mukana oli tehostettu ilmentyminen G2 /M markkereita sykliini A (G2), sykliini B (M), ja fosforyloitu cdc2 (G2), mutta ei S-faasin merkkiaineita sykliini E ja cdc25C (kuva 1C).

(A) Fulvestrantin indusoi kasvun esto DU145 solujen kautta ER-riippuvaisen mekanismin. Kasvu fulvestrantin käsiteltyjen DU145-solujen kanssa tai ilman ER siRNA pudotus ja 4 päivää suhteessa etanoli-käsiteltyjen kontrollisolujen negatiivisen-ohjaus siRNA esitetään ja verrataan (n = 8). ER ilmentyminen myös pudotettiin toinen siRNA (siRNA # 2) ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin (kuva S5). (B) Fulvestrantin indusoi DU145 solusyklin pidätyksen G2 /M vaiheessa. Edustava DNA histogrammit 48 tuntia fulvestrantti-tai etanoli (kontrolli) käsiteltyjä soluja ja prosenttiosuus jakaumat solut G0 /G1 ja G2 /M-vaihetta (n = 3) esitetään ja verrataan. (C) Fulvestrantti indusoi ilmentymisen G2 /M-markkereita. DU145-soluja käsiteltiin fulvestranttia tai etanolia 2 päivää (kontrolli) ja solukierron markkereita määritettiin Western blot -analyysillä. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin ja yksi edustaviin tietoihin esitettiin. (D) Fulvestrantin tukahduttaa solumigraation. Haava-paranemista määritys suoritettiin fulvestrant- ja etanoli (EtOH) hoidettujen DU145-soluja (n = 3). Edustavia mikrokuvat fulvestrant- ja etanoli saaneista soluviljelmistä naarmuja 0 h ja sen jälkeen 16 h on esitetty. Haava on merkitty katkoviivoin. (E) Fulvestrantin estää transwell muuttoliike (vasen paneeli) ja invaasiota (oikea paneeli) in DU145 soluissa (n = 3) jälkeen 5 tuntia Fulvestrantin hoitoa. (F) alentuneet filopodial solujen tai solujen kovaa rasitusta kuituja fulvestranttia (käsitelty 48 tuntia) kautta ER-riippuvaisen mekanismin. Edustavia micrographs ja prosenttiosuudet solujen kovaa rasitusta kuituja ja filopodial soluja (n = 3) esitetään. Studentin t-testi suoritettiin sen määrittämiseksi merkitys, joiden cutoff p-arvo on 0,05. ** P 0,01; baareja = SD

Fulvestrantin esti soluvaelluksen arpeutumisprosessit määrityksessä (kuvio 1 D), ja transwell muuttoliike (kuvio 1 E, vasen paneeli) ja solujen invasiivisuuden in Transvvell- invaasiomääritys (kuvio 1E, oikea paneeli) mukaan -40% (

p

0,01, n = 3) in DU145 soluissa (kuvio 1 E) sekä PC-3-solut (kuva S2). Hoito fulvestrantilla vähensi merkittävästi prosenttiosuus filopodial solujen 90,1%: sta 55,9% (

p

0,005, n = 5) ja solujen intensiivistä stressi kuitu 96,4%: sta 64,2% (

p

0,001, n = 5) (kuvio 1 F). RNAi-välitteinen knockdovvn ER tehokkaasti päinvastaiseksi fulvestrantin inhiboivan (kuvio 1 F).

B. Fulvestrantin ylössäätelee

HSA-miR-765

ilmentymistä PCA soluissa

Niistä 211 havaittavissa miRNA, 6 erittäin runsas miRNA lukien HSA-miR-185, HSA-let-7b, HSA-asennuspalveli- 765, HSA-let-7a, HSA-miR-601, ja HSA-miR-768-5p ( 300 suhteellinen normalisoitu signaalin intensiteettiä) on voimistunut jälkeen fulvestrantti-hoidon ( 2-kertainen;

p

0,005) (kuvio 2A).

Hsa-miR-765

oli yksi Mirs joka osoitti suurimman suhteellinen kasvu (3,8-kertainen) ja suurin absoluuttinen taso ilmentymisen fulvestrantin käsiteltyjen DU145 soluissa (taulukko S1). Fulvestrantti indusoi myös merkittävän kasvun ilmaisua tämän miR PC3-soluista ER-riippuvaisella tavalla (kuvio 2B, kuvio S1B).

(A)

Hsa-miR-765

on erittäin ilmaistu fulvestrantin saaneilla DU145 soluissa. Yhteensä RNA: t käsiteltyjen solut leimattiin suoraan ja puettu NCode Human miRNA Microarray. Median- ja lineaarinen regressio-normalisoitu data esitetään scatterplot. (B)

Hsa-miR-765

indusoi fulvestranttia kaksi eturauhassyövän solulinjoissa. HSA-miR-765 on fulvestrant- ja etanoli hoidettuun kontrolliryhmään DU145 ja PC-3-solujen kvantifioitiin miRNA qRT-PCR-analyysillä. Suhteellinen kertaiseksi muutoksia välillä ilmaus

HSA-miR-765

että fulvestrantin käsiteltyjen ja kontrolli solut on esitetty. Studentin t-testi suoritettiin sen määrittämiseksi niiden merkitys käyttäen cutoff p-arvo 0,05 (n = 3). ** P 0,01; baareja = S.D.

C.

Hsa-miR-765

estää solujen kasvua, solusyklin etenemisen, muuttoliike ja invaasio

HSA-miR-765

jäljittelevät tai negatiivisen kontrolli ilmentyi DU145-solut kantavat lusiferaasireportteri- vektori

pMIR-miR-765

. Ektooppinen ilmentyminen

HSA-miR-765

matkivat, mutta ei negatiivinen kontrolli, ehkäistä tehokkaasti lusiferaasiaktiivisuutta 70%: DU145-soluissa (kuvio 3A). Yliekspressio

HSA-miR-765

matkivat in DU145-soluissa indusoi solujen kasvun esto (40%; kuvio 3B), ja solusyklin pysähtymisen G2 /M (G0 /G1-G2 /M-suhde laski 3.5 ± 0,26-2,7 ± 0,10,

p

= 0,0074) (kuvio 3C) ja voimistunut ilmentyminen sykliini A, sykliini B, ja fosforyloitu-cdc2 mutta ei sykliini E tai cdc25C (kuvio 3D). Lopuksi se laski solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus (-80%, kuvio 3E), ja muodostumista filopodia /voimakas stressi kuitu (kuvio 3F) pitoisuudeltaan yli tai ovat verrattavissa niihin aiheuttamien fulvestranttia (katso kuviot 1 C 1D). Kaiken kaikkiaan toimet on

HSA-miR-765

in DU145 solut ovat hyvin samanlaisia ​​kuin fulvestrantti. Lisäksi DU145-soluja inhiboiva vaikutus on-miR-765 matkivat havaittiin myös PC-3-soluja (kuvio S3).

(A)

Hsa-miR-765

matkivat tehokkaasti tunnistaa reportteri täydentävillä sekvenssin

HSA-miR-765

in DU145 soluissa. Kertamuutoksia lusiferaasin toiminnan

HSA-miR-765

jäljittele käsitellyissä soluissa suhteessa soluihin käsitelty negatiivisen kontrolli jäljittele on esitetty (n = 3). Transfektio reagensseja käytettiin kontrollina. (B)

Hsa-miR-765

matkivat vähentää DU145 solujen kasvua. MTS-määritys suoritettiin soluissa, joita käsiteltiin

HSA-miR-765

matkivat tai negatiivisen kontrolli matkivat tai transfektion kontrollina 4 päivää (n = 8). (C)

Hsa-miR-765

matkivat merkittävästi vähentää G0 /G1-G2 /M-suhde DU145. Edustava DNA histogrammit (n = 3) esitetään. (D)

Hsa-miR-765

matkivat hoito aiheuttaa ylössäätöä sykliini A, sykliini B, ja fosforyloitu-cdc2 ilmentymistä DU145 soluissa. Proteiinin ekspressiotasoja solusyklin säädin proteiineja määritettiin Western blot-analyysit. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin ja yksi edustaviin tietoihin esitettiin. (E)

Hsa-miR-765

matkivat tukahduttaa DU145 solumigraatioon ja invaasiota esitetyn transwell migraatiokokeessa (ylhäällä vasemmalla) ja invaasiomääritys (ylhäällä oikealla), tässä järjestyksessä. Edustavia micrographs soluista jälkeen transwell muuttoliike (ylhäällä vasemmalla) tai invaasiomääritys (ylhäällä oikealla) on esitetty. Kertamuutoksia muuttoliikkeen (alhaalla vasemmalla) ja invaasiota (alhaalla oikealla) DU145 solujen joko

HSA-miR-765

matkivat tai negatiivisen kontrolli matkivat vertailuryhmään nähden solujen negatiivisen kontrolli jäljittele esitetään (n = 3). (F)

Hsa-miR-765

jäljittele merkittävästi vähentää stressiä kuituja ja filopodia muodostumat DU145 soluissa. Edustavia micrographs ja prosenttiosuudet solujen kovaa rasitusta kuituja ja filopodial soluja (n = 3) esitetään. Studentin t-testiä käytettiin vertailut, joissa sulku p-arvo on 0,05. ** P 0,01; bar = S.D.

D. Fulvestrantti indusoi säätelyä

HSA-miR-765

ilmentymisen kautta rekrytointi ER oletetulle säätelyelementtiin

DU145 solut altistettiin siRNA-välitteisen knockdovvn ER ennen fulvestrantti hoitoa. SiRNA tehokkaasti pudotti ER lauseke (kuva S4). Tämä Knockdown täysin tukossa fulvestrantti aiheuttama tehostaminen

HSA-miR-765

ilmaisu (kuvio 4A) ja poisti transaktivaatio toimintaa Fulvestrantin 5′-säätelysekvenssi

HSA-miR-765

(välillä -3208 ja +100, 3,3 kb) (kuvio 4B). Serial poisto analyysi tunnisti 141 ep: n sekvenssi (välillä -236 ja -95) sisällä 3,3-kb 5′-säätelysekvenssi olennaisina välittämisessä stimuloiva vaikutus Fulvestrantin

HSA-miR-765

transkriptio. ChIP analyysit osoittivat edelleen, rekrytointi ER tähän lyhyt järjestyksessä seuraavat fulvestranttia stimulaation (kuvio 4D). Nämä tulokset tukevat roolin ER välittämisessä fulvestrantin aiheuttama

HSA-miR-765

säätelyä.

(A) ER siRNA Knockdown lohkot fulvestrantti aiheuttama säätelyä

HSA-asennuspalveli- 765

ilmentymistä DU145 soluissa. Ekspressiotasot

HSA-miR-765

määritetään qRT-PCR analyysi fulvestrantin-käsiteltyjen solujen ER-siRNA (siERβ) tai muokkaamaan negatiivisen kontrolli (siNeg) verrattiin (n = 3). (B) siRNA knockdovvn ER lohkojen fulvestrantti-indusoidun transaktivaation 5 ’ylävirran säätelyaluetta

HSA-miR-765

in DU145-soluissa. 5 ’ylävirtaan säätelyaluetta

HSA-miR-765

kloonattiin sivektorissa. Reportteri toimintaa ER-taintumisen (siERβ) tai scramble negatiivisen kontrolli (siNeg) läsnäollessa fulvestrantin verrattiin (n = 3). (C) poisto kartoituksen analyysi määrittelee fulvestrantti reagoivan segmentti

HSA-miR-765

säätelyalueen sisään DU145 soluissa. 5 ’ylävirtaan DNA-sekvenssi

HSA-miR-765

nt. -3208-100 Analysoitiin lusiferaasireportterisysteemillä. Serial deleetiot 5’kloonattu sekvenssi vektorissa tehtiin. Reporter, verrattiin välillä fulvestranttia-käsitelty (fulvestrantti) ja ohjaus (ETOH) soluja kustakin reportteri-vektoriin (n = 3). (D) Fulvestrantti-indusoi rekrytointi ER päälle oletetun

HSA-miR-765

säätelyalueen. Kromatiinin immunosaostus paljasti rekrytointi ER sekvenssiin 5′-säätelyalue on

HSA-miR765

. Hiiren IgG ja RNA-polymeraasi II toimivat negatiivisena ja positiivisena kontrollina, vastaavasti. Fulvestrantin aiheuttama 17 kertainen nousu ER rekrytointi verrattuna ei-ER sitova alue (jäljempänä 0N promoottori ER [33], [41]). Studentin t-testi suoritettiin sen määrittämiseksi merkitys ryhmien välillä käyttäen cutoff p-arvo on 0,05. ** P 0,01; bar = S.D.

E. HMGA1 on tavoite

HSA-miR-765

bioinformatiikka- analysoi useita miRNA tavoite ennustusohjelmia ehdotti HMGA1 tavoitteeksi asetettiin

HSA-miR-765

; konservoitunut tunnistuskohta osoitteessa 8982-9002 kanssa -22,6 kcal /mol pienin vapaa energia ennustettiin (kuvio 5A, taulukko S4). Reportteri analyysit osoittivat, että transfektio

HSA-miR-765

matkivat, mutta ei negatiivinen-ohjaus matkivat, merkittävästi vähentynyt

HMGA1 3 ’UTR

-riippuvaista lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 5B); tällaista eroa ei havaittu DU145 kantavien solujen pMIR-tyhjän vektorin. Tärkeää on, transfektoimalla

HSA-miR-765

jäljittele täysin tukossa ilmentymistä HMGA1 proteiinin (kuvio 5C ylempi paneeli), sekä vähentynyt hieman mRNA tasolla (kuvio 5C, alempi paneeli). Kiinnostaa, hoito fulvestrantilla myös tehokkaasti sammuttaa ilmentymistä HMGA1 proteiinin (kuvio 5D). Nämä tulokset tukevat estävä rooli

HSA-miR-765

HMGA1 ilmaisun proteiinitasolla ja välittäjänä rooli fulvestrantin toimia PCa soluissa. Lopuksi ektooppinen ilmentyminen HMGA1 vähensi tehokkaasti estävän vaikutuksen Fulvestrantin DU145 soluissa (kuvio 5E), toteaminen yhtäpitävä raportoidun onkogeenisia toimintaa HMGA1 eturauhasen [40].

(A) 3 ’UTR

HMGA1

8910-8929 on ennustettu olevan

HSA-miR-765

sitoutumiskohdan. (B)

Hsa-miR-765

vuorovaikutuksessa 3’UTR

HMGA1

on kohdistettu reportterianalyysi. DU145-solut transfektoitiin joko pMIR tyhjä tai pMIR-HMGA1-3UTR, jossa 3 ’UTR:

HMGA1

(+ 8026- + 9332) kloonattiin 3′-päähän lusiferaasin. Reporter toimintaa pMIR-HMGA1-3UTR transfektoituja soluja käsiteltiin

HSA-miR-765

matkivat tai negatiivisen kontrolli jäljittele verrataan (n = 3). (C)

Hsa-miR-765

jäljittele pienentää HMGA1 proteiinin ilmentymistä DU145 soluissa. Proteiini ja mRNA tasot HMGA1

HSA-miR-765

mimic- ja negatiivinen kontrolli matkivat käsiteltyjä soluja määritettiin Western blot-analyysi (ylempi) ja reaaliaikainen RT-PCR-analyysi (alempi), vastaavasti. Tulokset

miR-765

matkivat vs negatiivinen kontrolli jäljittele verrataan (n = 3). (D) Fulvestrantin vähentää HMGA1 proteiinin ilmentymistä DU145 soluissa. Proteiini taso HMGA1 ja β-aktiini on fulvestrantin-käsiteltyjen ja etanoli-hoidettuun kontrolliryhmään (CTL-soluja) määritettiin Western blot -analyysillä. (E) ektooppinen ilmentyminen HMGA1 lohkojen fulvestrantti-indusoidun DU145 solujen kasvun esto. Suhteellinen solujen kasvuun määritettiin 4 päivän kuluttua hoidon fulvestranttia tai etanolilla jälkeen vakaa transfektion

HMGA1

(tai tyhjän vektorin valvonnasta) viikon. Proteiini tasot HMGA1 olivat kuvassa S6. Solujen kasvun fulvestrantti-käsiteltyjen solujen HMGA1 yliekspressioon vs tyhjän vektorin verrataan (n = 8). Studentin t-testi suoritettiin sen määrittämiseksi merkitys ryhmien välillä käyttäen cutoff p-arvo on 0,05. ** P 0,01; bar = S.D.

F.

Hsa-miR-765

on kohonnut, mutta HMGA1 proteiini vähentää fulvestrantin-käsitelty PCa näytteet

prostatektomia kudokset saatiin potilaista, joilla oli paikallisia PCa, jotka saivat tai eivät saaneet fulvestranttia hoitoa (250 mg, im 28 päivää ennen eturauhasen). Reaaliaikainen RT-PCR-analyysit osoittivat säätelyä

HSA-miR-765

mRNA (2,7-kertainen,

p

0,05, n = 7) PCA yksilöt fulvestranttia saaneista potilaista verrattuna niillä, käsittelemättömien kontrollien (n = 7) (kuvio 6A). Sen sijaan immunohistologisilla analyysit paljastivat selvä vähentäminen HMGA1 immunopositivity yksilöiden välillä fulvestrantin saaneilla potilailla (kuvio 6B). HMGA1 paikallistettiin pääasiassa tumissa Eturauhassyövän soluja syövän pesäkkeitä, joissa vain heikko sytoplasmista värjäytymistä stroomasoluissa. Immunovärjäys vähäinen fulvestrantin saaneilla yksilöitä lähes kaikissa syövän pesäkkeitä (kuvio 6C,

p

0,01, n = 5). Androgeenireseptorin osoitettiin aikaisemmin vaimentua jonka fulvestranttia jyrsijän [41] ja solun malli [21]. Täällä, osoitimme AR merkittävästi myös vaimentua meidän kliinisessä tutkimuksessa (kuvio 6B ja C). * P 0,05;