Krooninen sairaus

tiivistelmä

WNT5A, jäsen WNT perheen erittyvän lipidejä modifioitu glykoproteiineja, on kriittinen säätelijä lukuisia kehitys- prosesseja, kuten raajojen muodostumiseen, keuhko- morphogenesis, suoliston venymään ja maitorauhasen kehitykseen. Altered WNT5A ilmentyminen on liittynyt useita syöpiä. Mielenkiintoista on, että tiettyjen syöpien, kuten hematologiset maligniteetit ja peräsuolen karsinooma, WNT5A on passiivinen ja kohdistaa tuumoria tukahduttavan funktion, kun taas muissa syövissä, kuten melanooman ja mahalaukun karsinooma, WNT5A on yli-ilmentynyt ja edistää kasvaimen etenemiseen. Mekanismi, jolla WNT5A saavutetaan erillisen toiminnan syövissä on huonosti ymmärretty. Täällä osoittaa, että

WNT5A

geeni tuottaa kaksi proteiini-WNT5A pitkä (WNT5A-L) ja WNT5A-lyhyet (WNT5A-S). Aminoterminaalinen sekvensointi ja WNT5A-L spesifisen vasta-aineen osoittamiseksi, että kypsät ja erittävät isoformit ovat erillisiä, ja WNT5A-L kuljettaa vielä 18 N-terminaalista aminohappoa. Biokemiallinen analyysi osoittaa, että sekä puhdistettu proteiinit ovat samankaltaisia ​​suhteessa niiden vakautta, hydrofobisuus ja WNT /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta. Kuitenkin, modulaatio näiden kahden

WNT5A

isoformeja, joko ektooppinen ilmentyminen tai pudotus, osoittaa, että ne kohdistavat erillisen toiminnan syöpäsolulinjoissa: kun WNT5A-L inhiboi proliferaatiota kasvainsolulinjoissa, WNT5A-S edistää niiden kasvua . Lopuksi käy ilmi, että ilmentyminen näiden kahden WNT5A isoformien muutetaan rinta- ja kohdunkaulan karsinoomat, samoin kuin kaikkein aggressiivinen neuroblastoomakasvainten. Näissä syövissä, WNT5A-L on usein alassäädetty, kun taas WNT5A-S on löydetty yli-ilmennetään huomattava osa kasvaimia. Kaikkiaan Tutkimuksemme antaa näyttöä siitä, että erilliset toiminta WNT5A syövässä voidaan katsoa johtuvan tuotannon kaksi

WNT5A

isoformeja.

Citation: Bauer M, Bénard J, Gaasterland T, Willert K, Cappellen D (2013)

WNT5A

Koodaa kaksi isoformia kanssa Distinct Toiminnot Syövät. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10,1371 /journal.pone.0080526

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2013 mennessä; Hyväksytty: 14 lokakuu 2013; Julkaistu: 18 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Bauer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia yhdistyksen pour la Recherche sur le Cancer (DC), Institut National du Cancer (JB), Société Française des Syövät de l’Enfant (JB), Euroopan sidekudos Cancer Network (DC ja MB) ja jota California Institute regeneratiivisen hoidon (CIRM, RB1-01406, KW). MB sai apurahoja Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ja CIRM (TG2-01154). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

WNT5A

geeni koodaa yksi 19 WNT ligandin perheenjäseniä. Sitoutumalla FZD (Frizzled) [1], ROR1 /2 (Receptor tyrosiinikinaasi-like Orphan reseptorit) [2,3] tai RYK (Receptor kaltainen tyrosiinikinaasi) [4], reseptoreita ja LRP5: stä /6 (Low density lipoprotein-reseptorin -aiheiset proteiini) koreseptorit [5,6], WNT proteiinit moduloivat kanoninen WNT /β-kateniinin signalointireitin, sekä useita ei-kanoninen β-kateniinin riippumaton reittejä [7,8]. WNT väyliä tärkeitä rooleja alkionkehityksen aikana ja aikuisen kudoksissa homeostaasin säätelemällä solujen kasvua, lisääntymistä, eloonjääntiä, tarttuvuus ja muuttoliike. Muutoksia WNT signalointi usein liittyy oncogenesis [7-9]. Erityisesti, poikkeava ekspressio tiettyjen WNTs, inaktivoivat mutaatiot APC ja ak- siini tuumorisuppressoreita ja onkogeenisia aktivoivia mutaatioita β-kateniinin (CTNNB1) on osoitettu edistävät solujen transformaatio vapauttaminen geenien, kuten

c-MYC

ja

CCND1

(sykliini D1). Epigeneettiset hiljentäminen koodaavien geenien WNT antagonistit, kuten liukoinen houkutuslintuna reseptoreiden SFRP (Eritettyä Frizzled Related Protein) tai DKK, johtaa myös sääntelyn purkaminen reitin ja on havaittu useissa syövissä [7]. Tuoreessa kattavan tutkimuksen kolorektaalisyövissä todettiin, että yli 94% syövistä mutaatioita yhdessä tai useammassa WNT signalointi komponentteja [10].

joukossa WNT signalointi komponenttien osallisena onkogeneesissä, WNT5A on erityisen mielenkiintoinen: se toimii sekä onkoproteiini ja kasvainsuppressorigeenin. Melanoomissa ja mahalaukun ja haiman karsinoomat,

WNT5A

on toistuvasti ilmentynyt ja kykenee pro-kasvaimia synnyttävän toiminnon edistämällä lisääntyminen ja /tai hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden [11-16]. Sen sijaan

Wnt5a

heterotsygoottista hiiret ovat alttiita kehittämään B-solulymfooma menetyksen kautta Wnt5a toiminto, ja

WNT5A

geenin toiminnan lopettamisesta somaattisten poistot tai hypermetylaation on usein ihmisen leukemia, lymfooma ja peräsuolen syöpä [17-20]. Lisäksi WNT5A estää leviämisen leukemia, lymfooma ja kolorektaalisyövän soluissa, mikä osoittaa sen tuumoria tukahduttavan funktion näistä syövistä [17,19,20]. Lopuksi, me ja muut ovat osoittaneet, että

WNT5A

ilmentyminen säätyy alas ihmisen rintakarsinoomissa ja pelaa tuumorisuppressorina rooli estämällä lisääntyminen ja /tai etäpesäkkeiden [21-24]. Erot WNT reseptorin ohjelmistoon, ja siten signalointireittien laukaisi WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], voisi selittää nämä vastakkaiset toimintaa WNT5A syövässä. Täällä, selvitimme vaihtoehtoista mekanismi, jonka WNT5A voivat käyttää erillisen toiminnan, eli ilmaisun kautta ja tuotanto erillisiä WNT5A isoformeja. Erityisesti olemme huomanneet, että amino-terminaalisesti katkaistun WNT5A isoformi näytteille kasvain edistävää toimintaa, kun taas täyspitkä WNT5A proteiini osoittaa kasvaimen suppressoiva toiminta.

Tulokset

WNT5A

geeni koodaa kahta proteiinia isoformia

Voit selvittää

WNT5A

koodaa useita proteiini-analysoimme sekvenssit talletetaan tietokantoihin ja etsitään mahdollisia vaihtoehtoisia selostukset. Löysimme

WNT5A

geeni tuottaa vähintään 3 mahdollisimman

WNT5A

selostukset vaihtoehtoisista transkription aloitus- sivustoja. Yksi transkripti aloittaa on eksonissa 1 [19,20,28], ja sen ennustetaan koodaavan 380 aminohapon WNT5A proteiinin esiaste, tästä lähin kutsutaan WNT5A-L (Long) (kuviot 1A, B, kuviot S1A ja S1B). Kaksi muuta transkriptien aloittaa 718 ja 578 nukleotidin ylävirtaan eksonin 2, ja vaihtoehtoinen eksoni 1β (kuvio 1A, kuviot S1A ja S1B). Sekä eksoni 1β-aloitetaan transkriptien ennustetaan koodaavan 365 tai 360 aminohapon (riippuen käytöstä start-kodonilla asemassa 16 tai 21 suhteessa aloituskodoni WNT5A-L) esiasteproteiini, kutsutaan WNT5A-S (Short), ja puuttuu ensimmäiset 15 tai 20 N-terminaalista aminohappoa verrattuna WNT5A-L esiaste ([29], kuvioissa 1A, B, kuviot S1A ja S1B).

. Rakenne ihmisen

WNT5A

geeniä ja vaihtoehtoinen selostukset. Numeroidut laatikot osoittavat eksonit, 5 ’ja 3′(UTR) alueet harmaana ja koodaavat alueet mustana. nt: nukleotidin kb: kiloemäspariin. Sininen ja punaiset nuolet ja pisteviivat osoittavat vastaavasti kannat eri transkriptionaloituskohdat eksonissa 1 ja eksonin 1β ja silmukoinnin eksonin 1 ja eksonin 1β-aloitettu selostukset. Sininen ja punainen tähdet osoittavat translaation aloituksen kodonit WNT5A-L ja WNT5A-S isoformit sijaitsee eksonissa 1 ja eksonin 2, vastaavasti. Sininen ja punainen salama nuolet osoittavat aseman kohdesekvenssien on

WNT5A-L

ja

WNT5A-S

erityinen lyhyt häiritsevä RNA (siRNA). B. Useita aminohapposekvenssin rinnastus N-päähän WNT5A prekursoriproteiinien. Sininen M merkitsee todennäköisimmin aloituskodonin WNT5A-L kun taas punainen Ms tarkoittavat todennäköisin alkavat kodonia WNT5A-S. Harmaat nuolet osoittavat kantojen signaalipeptidin pilkkominen sivustoja sekä isoformeja ennustuksen mukaisesti SignalP 4,1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Sininen ja punainen nuolet osoittavat aseman havaittu ensimmäisen aminohapot kypsän WNT5A-L ja WNT5A-S-proteiineja, vastaavasti, ja siten kanta havaitun signaalipeptidin katkaisukohdan kunkin isoformin. C. Detection puhdistettua WNT5A isoformeja. Vasen paneeli: Immuno-blot varten WNT5A osoittaa, että molemmat isomuodot ovat samanlaisia ​​molekyylipainon (

≈43kDa). Oikea paneeli: Coomassie värjätty geeli osoittaa, että puhdistettu WNT5A valmistelut ovat puhtaita kanssa pitkälti havaittavissa kontaminanttiproteiinit. D. Anti-hiiri Wnt5a vasta-havaitsee molemmat isomuodot (vasen paneeli), kun taas anti-kani WNT5A-L spesifistä vasta-ainetta (oikea paneeli) havaitsee WNT5A-L muttei WNT5A-S-isoformia.

E. Triton

X-114 faasin erotus osoittaa, että molemmat WNT5A isoformit osio hydrofobinen /orgaaninen faasi. WNT5A proteiinit havaittiin immuno-blot-analyysillä anti-Wnt5a vasta-aine. F. inkubointi puhdistettua WNT5A isoformien 37 ° C: ssa osoitetut ajat osoittavat, että niiden

vitro

vakaus on samanlainen. WNT5A proteiinit havaittiin kuten E ja kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

yleinen eksoni-introni rakenne ihmisen

WNT5A

geeni on erittäin konservoitunut muissa selkärankaisissa, mukaan lukien hiiri, kana ja seeprakala (kuvio S2A).

WNT5A

geeni on jaettu 5 säilyneitä eksonia. Pituus, sekvenssi, ja silmukointikohdissa kodoneissa poikki eksonien 2-5 ovat erittäin konservoituneita. Transloidun alueen eksoni 1 on enemmän erosivat, mutta silmukoitumiskohta säilyy. Tämä eksoni-introni järjestely on myös konservoitunut läheistä sukua

WNT5B

geeni, kuten selityksin nisäkkään genomeja. Mielenkiintoista on, että vaihtoehtoinen eksoni 1β, joka on upotettu ensimmäisen intronin, on myös läsnä näissä selkärankaisille. Hiirillä eksoni 1β havaitaan vaihtoehtoisia Wnt5a selostukset ja osakkeiden merkittävä homologia ihmisen sekvenssin. Vuonna pareittain linjaus, elementti käsittää ylävirran säätelyalueen ja eksonin 1 β ovat 95% konservoitunut ihmisen ja hiiren (kuvio S2B). Lintujen (kana ja seeprapeippo), tämä vaihtoehtoinen eksoni ei ole selityksin, mutta kun läsnä on erittäin konservoitunut sekvenssi silmukointidonoripaikan 3’lopussa osoittaa, että eksoni 1β on läsnä. Pareittain välinen kohdistus kanaa ja seeprapeippo tämän -elementissä 96% säilyttäminen. Lisäksi kaksi lyhyttä sekvenssien nämä elementit ovat hyvin säilyneitä nisäkkäiden (hiiren ja ihmisen) ja linnut (kana ja seeprapeippo) (kuvio 2B). Kalat (seeprakala ja kolmipiikki) sisältävät myös erittäin konservoitunut osa tällä alueella. Vaikka tämä elementti ei ole annotoitu eksonista tahansa tietokantaan, kohonnut säilyttäminen (74%) viittaa läsnä ylimääräisen eksonin kalan (kuvio 2B). Yhdessä havaittu korkea genomisen sekvenssin säilyttämisen viittaa siihen, että vaihtoehtoisen Wnt5a transkriptit, samanlaisia ​​kuin tässä kuvatut, ovat läsnä useita selkärankaislajien. Lopuksi, linjaus aminopään aminohappoa ihmisen, hiiren ja kananpojan Wnt5a osoittaa, että aloituskodoni M21 (asema suhteessa aloituskodoni WNT5A-L) on täysin konservoitunut (kuvio 1 B), mikä viittaa siihen, että WNT5A-S aloittaa tässä asemassa.

Molemmat WNT5A proteiinit estävät Wnt3a-aktivaatio β-kateniinin /TCF-ajettu transkriptionaalista aktiivisuutta HEK 293 (TOP-lusiferaasi, A.) ja MDA-MB-231 (TOP-GFP toimittaja, B.). Soluja käsiteltiin puhdistetulla Wnt3a ja kasvava pitoisuus WNT5A 24 tunnin ajan (A) tai 48 tuntia (B). C. Kun transfektio, molemmat WNT5A isoformeja häiritä endogeenisia (MDA-MB-231, vasen paneeli) ja WNT1 aiheuttama (HeLa, oikea paneeli) β-kateniinin /TCF-ajettu transkriptio in MDA-MB-231 (vasen paneeli) ja HeLa-soluja (oikea paneeli). Solut transfektoitiin kontrolli, WNT5A-L tai WNT5A-S ekspressiovektorit yksin tai yhdessä WNT1 ekspressiovektoriin ja määritettiin β-kateniinin /TCF-ajettu TOP-lusiferaasireporttiterilla aktiivisuutta. Ekspressiovektori, joka koodaa dominoiva negatiivinen muoto TCF4 (ΔNTCF4) käytettiin häiritä endogeenisen reportteri aktiivisuus MDA-MB-231-soluja. D. Molemmat WNT5A isoformit edistää DVL fosforylaatiota. L-solut (vasen paneeli) ja C2C12-solut (oikea paneeli) käsiteltiin WNT5A isoformit (10 nM, 2 tuntia) ja kokosolulysaateille immuno-blotattiin mainituilla vasta-aineilla. Molemmat WNT5A isoformien sekä Wnt3a (10 nM, 2 tuntia), johti liikkuvuuden muutos Dvl1 ja Dvl2 proteiineja, viittaa siihen, että DVL proteiinit ovat posttranslationaalisesti modifioitu fosforylaation vastauksena sekä kanoninen (Wnt3a) ja ei-kanoninen Wnt (WNT5A) signalointi. Vain Wnt3a indusoi kertyminen β-kateniinin proteiinia. Huom: p-kateniinin kerääntyminen vastauksena Wnt3a in C2C12 soluissa ei ole havaittavissa näissä kokosolulysaateista koska nämä solut sisältävät runsaasti kalvo /vyöliitos liittyy β-kateniinin.

Samoin kuin useimmat eritettyjä proteiineja, Wnt esiasteita lohkaistaan ​​aminopäässä poistaa signaalisekvenssi jolloin saadaan kypsä polypeptidi. Signaalipeptidi pilkkominen ennustusalgoritmi (

SignalP 4,1

– https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) ennustaa, että molemmat WNT5A esiasteita tuottaa proteiineja joko 343 aminohaposta (aloita QVVIEA … ) tai 338 aminohapon (aloita ANSWWS …). Jälkimmäinen ennustettu katkaisukohta on suurin pilkkominen pistemäärä (Y-pisteet 0,625 varten WNT5A-S [alkavat M21] ja 0,246 varten WNT5A-L). Kuitenkin aminoterminaalinen sekvensointi Hiiren Wnt5a osoitti, että signaalisekvenssi lohkaisu tapahtui asemassa 24 tähdettä alavirtaan ennustettu sivustolla [3]. Lisäksi, koska 15 aminohappo ero N-terminaalinen sekvenssi WNT5A-L ja WNT5A-S esiasteiden voi vaikuttaa asemaan signaalipeptidin pilkkominen, olemme kokeellisesti määritetty identiteetti aminopäät kypsät proteiinit.

tunnistaa aseman signaalipeptidin lohkominen ja ensimmäisen aminohapon kypsän proteiinien, me puhdistettiin molemmat WNT5A isoformeja. Käyttämällä aiemmin kehitetty CHO-ekspressiovekto- järjestelmän [30], me itsenäisesti yli-ilmentää kunkin WNT5A isoformi ja puhdistettiin ne elatusaineesta (CM), julkaistujen menetelmien mukaisesti [3,31]. Molemmat WNT5A isoformit eritetään CM tasaisin tasoilla (tuloksia ei ole esitetty), ja ne puhdistettiin lähes homogeeniseksi (~ 95%, kuten arvioitiin Coomassie-värjäyksellä, kuvio 1C). Amino-terminaalinen sekvensointi osoitti, että puhdistettu WNT5A-L-proteiinia ja käynnistää yksi aminohappo alavirtaan ennustetun signaalipeptidin pilkkomiskohdan, mikä tuottaa 337 aminohapon proteiinia, joka alkaa sekvenssin NSWWS … (kuvio 1 B, kuvio S1B ja S1C). Eritetty WNT5A-S-proteiinia puuttui ylimääräinen aminoterminaalisen 18 aminohapon tuottaa proteiinia 319 aminohapon alkaen sekvenssin IIGAQ … (kuvio 1 B, kuvio S1B ja S1C). Näin ollen kaksi isoformia tuottaa proteiineja, joilla on erilliset aminopään sekvenssit. WNT5A-S aminopäässä on sama kuin hiiren Wnt5a, joka oli aikaisemmin tunnistettiin amino-terminaalinen peptidi sekvensointi [3]. Mielenkiintoista, signaalipeptidin pilkkominen algoritmi ei ennustanut tätä asemaa todennäköisesti sivusto signaalisekvenssin pilkkomisen joko WNT5A-L tai WNT5A-S (Y-pisteet 0,16 WNT5A-S ja 0,113 varten WNT5A-L).

vahvista erilliset aminoterminaalisen koostumus sekä kehittyneitä WNT5A isoformeja, me tuotettu vasta-aine suunnattu WNT5A-L-spesifisen 18 aminohappoa (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). In immuno-blotit, The WNT5A-L-spesifistä vasta-ainetta ainoastaan ​​tunnustettu WNT5A-L eikä WNT5A-S (kuvio 1 D). Tämä osoittaa, että eksoni 1 ja eksonin 1β-aloitetaan

WNT5A

transkriptien tuottamiseksi erillisiä WNT5A proteiineja, jotka eroavat amino- päissä. Mekanismi, jolla nämä kaksi esiastetta differentiaalisesti käsitellään, jolloin saadaan erillisiä kypsät proteiinit on tällä hetkellä epäselvä, mutta me spekuloida, että erot aminopäät vaikuttaa valintaan koneet lohkaista proteiineja erilaista kantaa. Lisätutkimuksia tarvitaan näiden kysymysten.

WNT proteiinit ovat erittäin hydrofobisia, kiinteistön opetetaan kovalenttisesti ainakin yhden lipidimolekyyli ja konservoituneen jäännöksen [31,32]. Tämä muutos on tärkeää oikea käsittely ja eritystä [32,33]. Lisäksi, kuten kävi ilmi, että Wnt-FZD co-kiderakenne, lipidiosa on kriittinen reseptorin sitoutumiselle [34]. Puuttumaan, ovatko nämä kaksi WNT5A isoformia erosivat toisistaan ​​hydrofobisia ominaisuuksia, ja siten niiden lipidien muutokset, käytimme faasinerotuksesta omaisuutta pesuaineen Triton X-114. Olemme havainneet eroa kaksi isoformia, koska ne molemmat jaettiin yhtä orgaaniseen faasiin (kuvio 1 E), mikä viittaa siihen, että molemmat isoformit vastaavasti muutettu. Sen testaamiseksi, kaksi isoformia eroavat niiden vakautta, inkuboimme kukin proteiini 37 ° C: ssa korkeintaan 60 tuntia. Immuno-blot havaitseminen osoitti, että molemmat proteiinit hajonnut tasaisin hinnat (kuvio 1 F). Tämän vuoksi nämä kaksi WNT5A isoformia käyttäytyvät samalla suhteen niiden

in vitro

vakautta ja hydrofobisuus. On kuitenkin mahdollista, että jokainen isoformi on selvä biokemialliset ominaisuudet käytettäessä

in vivo

ympäristössä, mahdollisuus emme ole käsitelty.

Effects of WNT5A-L ja WNT5A-S isoformit signaaliajan väyliä

Useat WNT signalointipolkujen on kuvattu ja ehdotettu. Yleisimmin tutkittu ja parhaiten perustettu polku, jota usein kutsutaan kanoninen WNT reitissä käsittää β-kateniinin keskeisenä välittäjänä. Muut ei-kanoninen reittejä, jotka toimivat itsenäisesti β-kateniinin, tunnetaan huonosti. Aivan vähintään nämä kaksi väyliä arvellaan jakaa seuraavat komponentit: WNT ligandeja, FZD reseptoreita ja Dishevelled (DVL) signaalimuuntajia. Vaikka WNT5A on pääosin liittyy ei-kanoninen WNT signalointi, se on myös todettu aktivoida kanoninen β-kateniinin signalointi tietyissä olosuhteissa [3]. Tutkimme jos WNT5A isoformit differentiaalisesti vaikuttaa β-kateniinin /TCF signalointireitille. Tätä varten me syntyy kahta solulinjaa, HEK 293- ja MDA-MB-231, joka kantaa WNT /β-kateniinin erityisiä reportteri-järjestelmän. Tämä toimittaja järjestelmä koostuu WNT reagoivan elementin, joka koostuu 7 multimerisoitu TCF sitoutumiskohtia (kutsutaan TOP TCF Optimal Promoottori [35,36]), joka säätelee ilmentymistä reportterigeenin, joko Luciferase ja HEK 293-solut (HEK293- TOP-lusiferaasia, kuvio 2A, kuvio S3A) tai GFP MDA-MB-231-soluja (MDA-MB-231-TOP-GFP, kuvio 2B, kuvio S3B). Nämä toimittaja solut voimakkaasti aktivoidaan Wnt3a (kuvio 2A ja B), joka on WNT proteiinia yleisesti käytetään edistää kanoninen signalointireitille. Sen sijaan ei WNT5A isoformi aktivoida tai jatkuvasti moduloidaan pohjapinta aktiivisuuden näiden toimittajille (kuvio S3A ja S3B), mikä osoittaa, että nämä solukkojärjestelmissä eivät tarjoa asianmukaista miljöö yhteyden WNT5A signalointi kanoninen β-kateniinin reitin.

Sensitive ja vankka Soluperäisissä analyyseissä ei-kanoninen WNT signalointi ovat niukkoja. Ei-kanoninen WNT signalointi on osoitettu suututtaa WNT /β-kateniinin signalointi, toimintaa, joka voidaan määrittää käyttämällä TOP-reportteri-järjestelmän [3]. Olemme havainneet, että molemmat WNT5A isomuodot inhiboivat WNT3A aiheuttamaa toimittaja aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2 A ja B). Nämä tulokset osoittavat, että vaikka eroa niiden amino-päät, molemmat WNT5A proteiinit antagonisoivat Wnt /β-kateniinin signalointi. Variantit estäviä vaikutuksia WNT5A-L ja WNT5A-S-isoformeja on WNT /β-kateniinin perustuva reportteri havaittiin, kun solut transfektoitiin ekspressiovektoreilla (kuvio 2C) sen sijaan, että käsitelty puhdistetulla WNT5A-L ja WNT5A-S-proteiineja. Näin ollen, näissä määrityksissä WNT5A isoformit osoittavat samankaltaisia ​​biologisia vaikutuksia, kun toimitetaan puhdistettua proteiineja tai transfektoitu geenejä.

WNT signalointi, kanoninen ja ei-kanoninen, johtaa hyperfosforylaatiota DVL proteiinien, molekyylejä, jotka toimivat välittömästi alavirtaan FZD reseptoreihin. Tämä translaation jälkeinen muutos DVL proteiineja voidaan helposti havaita elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän [37-39]. Olemme havainneet, että hoito kahden solulinjan (hiiren L-solut ja hiiren myoblas- C2C12 solulinja) joko WNT5A isoformin, sekä WNT3A, indusoi liikkuvuuden muutos DVL proteiineja, kuten havaitaan immunoblottaus varten Dvl1 ja Dvl2 (kuvio 2D). Kuitenkin kanssa erillisten toimintojen WNT3A ja WNT5A isoformeja päälle WNT /β-kateniinin signalointia (kuviot 2A, 2B, kuvio S3A, S3B), vain Wnt3a, mutta ei WNT5A isoformien aiheuttama kertyminen β-kateniinin proteiinia, kuten osoituksena L-solut. Tämä β-kateniinin proteiinien kertymistä ei ilmeistä C2C12 soluja, jotka jo ilmentävät korkeita β-kateniinin (kuvio 2D). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että kaksi WNT5A isoformia osoittavat samanlaista biologista toimintaa perustettu soluihin perustuvissa WNT signalointi määrityksiä.

ilmentäminen WNT5A isoformien syöpäsolulinjoissa ja normaaleissa kudoksissa

Aiemmat tutkimukset WNT5A ilmaisu ei ole eroteltu kahden isoformien kuvata tässä. Siksi mittasimme opintosuoritusotteensa tasoilla syöpäsolulinjoissa ja normaaleissa kudoksissa suorittamalla kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) kanssa isoformi alukkeilla (katso taulukko S1 ja kuva S1). Tämä analyysi osoitti, että ilmentymistä näiden isomuotojen vaihtelee suuresti yksittäisten syöpäsolun linjat. Esimerkiksi, kun MDA-MB-231 (johdettu rintasyöpä) ja SH-SY5Y (peräisin neuroblastooma) esittää pääasiassa

WNT5A-L

, HeLa-soluja (jotka ovat peräisin kohdunkaulan karsinooma) esittää pääasiassa

WNT5A-S

(kuvio 3A). Muut solulinjat, kuten MCF-7 (johdettu rintasyöpä) tai IMR-32 (johdettu neuroblastooma) ilmaista erittäin vähäistä joko WNT5A isoformin (kuvio S4A). Vaikka vähemmän kvantitatiivinen, geeli analyysi päätepisteen RT-PCR saatujen tuotteiden edustavien solulinjoista vahvisti qRT-PCR data (kuva S4A). Me seuraavaksi analysoitu transkriptio tasot WNT5A isomuotojen normaaleissa aikuisen kudoksissa. Havaitsimme

WNT5A-L

ilmentyminen lähes kaikissa kudoksissa, paitsi rasvakudos. Sen sijaan havaitsimme

WNT5A-S

ilmentymisen ainoastaan ​​istukassa, ja vähäisemmässä määrin, henkitorven ja ohutsuolessa (kuvio S4b).

. WNT5A isoformi ilmentyminen kolmessa syöpäsolun riviä. Transcript tasot

WNT5A

isoformit määritettiin MDA-MB-231 (rintasyöpä), HeLa (kohdunkaula syöpä), ja SH-SY5Y (neuroblastooma) by qRT-PCR ja normalisoitu

EF1-α

mRNA (normalisoinnin by

GAPDH

mRNA ja

18S

rRNA tuotti samankaltaisia ​​tuloksia). Keskimääräiset suhteet (

WNT5A

isoformit /

EF 1-α

) ± SEM riippumatonta mittausta näytetään. B. Vaikutukset Kohdunulkoisten ilmentymisen WNT5A-L ja WNT5A-S isoformit jakautumiseen. Määritettyjä solulinjat transdusoitiin ekspressiovektoreilla, jotka koodaavat WNT5A-L (sininen viiva), WNT5A-S (punainen viiva) tai ei WNT (musta viiva) ja solumäärät määritettiin 3 ja 6 päivää. WNT5A-S kasvaa taas WNT5A-L pienenee proliferatiivisia hinnat. Data (keskiarvo ± SEM kolminkertaisten määritysten) edustavasta kokeesta on esitetty. Kukin koe suoritettiin vähintään kolme riippumatonta kertaa. C. isoformispesifisiä siRNA vähentää ilmentymistä kunkin WNT5A isoformin. Tehokkuus WNT5A-L ja WNT5A-S-isoformia pudotus (KD) arvioitiin MDA-MB-231, HeLa ja SH-SY5Y transfektoitu ohjaus siRNA ja

WNT5A

isoentsyymiselektiivisiä erityinen siRNA (KD).

WNT5A

isoformit transkriptipitoisuuksissa mitattiin kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR) ja normalisoitu

EF 1-α

mRNA (normalisoinnin by

GAPDH

mRNA ja

18S

rRNA tuotti samankaltaisia ​​tuloksia). D. Vaikutukset siRNA-välitteisen taintumisen (KD) on WNT5A-L ja WNT5A-S isoformit jakautumiseen. Solut transfektoitiin siRNA: t spesifinen WNT5A-L (sininen viiva) tai WNT5A-S (punainen viiva) ja solumäärät määritettiin 3 ja 6 päivää. Salatun siRNA toimi kontrollina (musta viiva). Co-solujen transduktio kanssa WNT5A-S-ekspressiovektoriin pelastaa vaikutus WNT5A-S-spesifisiä siRNA (punaisena katkoviivana). Data (keskiarvo ± SEM kolminkertaisten määritysten) edustavasta kokeesta on esitetty. Kukin koe suoritettiin vähintään kolme riippumatonta kertaa. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,005; ****

P

0,001. E. Differential sääntely

AXIN2

ja

CDK8

ilmentymisen isoentsyymiselektiivisiä erityisiä knockdovvn WNT5A. Transcript tasot

AXIN2

ja

CDK8

määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR-analyysi (normalisoitu

EF 1-α

mRNA) valvonta MDA-MB-231 (rintasyöpä ), HeLa (kohdunkaula syöpä) ja SH-SY5Y (neuroblastooma) soluja, ja vastauksena siRNA-välitteisen knock-down (KD) on WNT5A-L tai WNT5A-S. Tarkoittaa suhteet ± SEM riippumatonta mittausta on esitetty.

WNT5A-S edistää ja WNT5A-L estää syöpäsolujen kasvun solulinjojen

tutkimiseksi toimintoja WNT5A isoformien, me manipuloitu niiden ilmentymistä useissa solulinjoissa, mukaan lukien MDA-MB-231, HeLa ja SH-SY5Y, ja analysoitiin fenotyyppiset vaikutukset (kuvio 3B-D, kuvio S5). Koska signalointi toimintaa puhdistettua WNT proteiinit ovat lyhytikäisiä [30] ja biologisia määrityksiä vaativat yleensä pitkiä stimulaation, käytimme transfektio

WNT

geenien sijaan soveltamista puhdistettuja proteiineja. Ektooppinen ilmentyminen WNT5A-L olennaisesti vähentynyt solujen määrä näissä solulinjoissa (kuvio 3B). Ei ole todisteita lisääntynyt solukuolema havaittiin (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että WNT5A-L säädösten estävät solujen proliferaatiota. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen WNT5A-S edisti proliferaatiota MDA-MB-231, HeLa ja SH-SY5Y-soluja (kuvio 3B).

käyttäminen isoformi-spesifisten siRNA: iden (katso kuvio S1; Taulukko S2), me häiritsi ilmentymisen kunkin WNT5A isoformin (kuvio 3C). SiRNA pystyivät nimenomaan pudotus tavoitteensa jopa 80% määritettynä qRT-PCR (kuvio 3C). Mikä tärkeää, jokainen WNT5A isoformi selektiivisesti inhiboi vastaava siRNA vaikuttamatta tasoja toisen isoformin. Yhdenmukainen leviämisen edistävät vaikutukset WNT5A-S kohdunulkoinen ilme, knockdovvn WNT5A-S vähensi solujen lukumäärät (kuvio 3D). Jopa soluissa, jotka ilmentävät matalan WNT5A-S tasoilla, kuten MDA-MB-231 (kuvio 3A), pudotus ja WNT5A-S-isoformi on tuotettu voimakas estävä vaikutus (kuvio 3D). Solu esto johtuvat WNT5A-S siRNA pelastettiin kaikilla testatuilla solulinjoilla samanaikainen transduktion kanssa WNT5A-S vektori vailla siRNA kohdesekvenssin (kuvio 3D, KD WNT5A-S + pelastus). Nämä pelastamiseen tiedot osoittavat, että tämän vaikutukset siRNA johtuvat WNT5A-S knock-down sijaan epäspesifinen off-tavoite vaikutuksia. Lisäksi WNT5A-S Knockdown kasvoi solukuoleman kolmessa solulinjoissa (kuvio S5a) ja indusoi kaspaasiaktiivisuus MDA-MB-231 ja HeLa (kuvio S5B). Kuitenkin ≥3-kertainen pieneneminen solujen lukumäärän (kuvio 3D) ylitti havaittu vähäinen nousu solukuoleman (kuva S5a), mikä viittaa siihen, että WNT5A-S Knockdown lähinnä heikentynyt lisääntymistä. Sen sijaan, knockdovvn WNT5A-L ei ollut vaikutusta solujen lisääntymistä (kuvio 3D), solukuoleman tai kaspaasi aktiivisuutta 3 solulinjoissa (kuvio 3D, kuvio S5a, B). Yhdessä nämä kokeet osoittavat, että endogeenisesti ja ektooppisesti ilmaisi WNT5A isoformit käyttää erillisiä vaikutuksia rinta-, kohdunkaula ja neuroblastooma kasvainsolulinjoissa, jossa WNT5A-S edistävät ja WNT5A-L solun uudiskasvun estämiseksi. Koska emme noudata erillistä signalointia toimintaa WNT5A-L ja WNT5A-S WNT /β-kateniinin ja DVL fosforylaatiomääritykset (kuva 2), me spekuloida, että nämä kasvua edistäviä ja estäviä toimintaan WNT5A ovat riippumattomia kanoninen WNT signalointireittiin .

yritetään tunnistaa mekanismia, jolla WNT5A isoformit aiheuttavat ero vaikutuksia proliferaatioon, seuloimme ilmaus useista tunnetuista WNT säädeltyjen geenien. Olemme havainneet, että ilmentymisen kahta geeniä,

AXIN2

ja

CDK8

, jotka molemmat on liitetty eri näkökohtia WNT signaloinnin [7,40,41], ovat differentiaalisesti säännellään isoform- erityiset knockdovvn WNT5A. Knockdovvn WNT5A-L, mutta ei WNT5A-S, johti laskuun

AXIN2

ilmaus 3 testattu solulinjoissa (MDA-MB-231, HeLa ja SH-SY5Y, kuvio 3E). Sen sijaan, knockdovvn WNT5A-S, mutta ei WNT5A-L, johti lisääntymiseen

CDK8

ilmentymisen 2 ulos 3 solulinjojen (MDA-MB-231 ja HeLa) ja lasku SH- SY5Y (kuvio 3E). Tämä data tarjoaa mahdollisen molekyylitason yhteydestä havaitun ero vaikutuksia WNT5A isoformeja proliferaatioon ja geenisäätelyn ja osoittaa, että kukin WNT5A isoformi törmää geeniekspression erottui selkeästi. Edelleen tyhjentävä tutkimuksia, kuten transcriptome analyysi, tarvitaan tunnistaa ja määritellä reittejä, jotka välittävät näitä ero vaikutuksia.

Down-regulation of WNT5A-L ja yli-ilmentyminen WNT5A-S isoformi syövissä

Voit selvittää kunkin pro- ja anti-proliferatiivista toimintoja WNT5A-S ja WNT5A-L isoformit ovat merkityksellisiä onkogeneesille, analysoimme niiden ekspressiotasot by qRT-PCR primaarikasvaimen näytteissä rinta- ja kohdunkaulan karsinoomien ja neuroblastoomat. Verrattuna normaaliin rintakudosten,

WNT5A-L

oli alassäädetty ≥3-kertaiseksi 46% (14 30) rintakarsinoomista (

P

= 0,04) (kuvio 4A) .

WNT5A-S

oli havaittavissa normaalissa rinta- kudoksessa ja yli-ilmentynyt pienessä määrässä rintasyövistä (4 30, 13%, n. S.) (Kuvio 4A). Normaali kohdunkaulan epiteelin, sekä

WNT5A-L

ja

WNT5A-S

esitettiin,

WNT5A-L

on vallitseva isoformi (kuvio 4B). Verrattuna normaaliin kohdunkaula,

WNT5A-L

oli alassäädetty ≥3-kertaiseksi 53% (8 15) kohdunkaula karsinoomien (

P

= 0,047). Sen sijaan,

WNT5A-S

säädeltiin ≥4-kertaiseksi 40% (6 15) näiden kasvainten (

P

= 0,045) (kuvio 4B). Neuroblastoomat, pediatrinen syövät sympaattisen hermoston, voidaan jakaa matalan ja korkean riskin kasvainten 90% ja 30%, jotta selviäisi, vastaavasti. Puolet suuren riskin varhaishermosolukasvaimesta ovat kohtalokkaita 2 vuoden kuluessa diagnoosista [42]. Korkean riskin neuroblastoomat oli pieni

WNT5A-L

ilmaisu useammin kuin alhaisen riskin kasvain (55% -22 of 40- versus 21% -8 of 37-,

P

= 0,004), mikä viittaa siihen, että WNT5A-L alassäätöä korreloi korkean riskin neuroblastooma. Lisäksi kohonnut

WNT5A-S

ilmentyminen liittyi useammin korkea riski kuin alhaisen riskin varhaishermosolukasvaimesta (17% -7 40- vs. 5% -2 of 37-, n. S.) (Kuvio 4C). 0,01;