Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

olemassaolo syövän kantasoluja (CSCS) tai syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja kasvain massa uskotaan olevan vastuussa kasvaimen uusiutumisen vuoksi niiden ulkoisen ja sisäisen lääkeresistenssideterminantit ominaisuudet. Näin ollen, kohdennettua tappamista CSCS olisi uudempi strategia ehkäisemiseksi kasvaimen uusiutumisen ja /tai hoitoon voitetaan lääkeresistenssideterminantit. Olemme kehittäneet uuden synteettisen yhdisteen, CDF, joka osoitti suurempaa hyötyosuutta eläinten kudoksissa, kuten haimassa, ja aiheutti myös solujen kasvun esto ja apoptoosin, jota välittävät inaktivaatio NF-KB: n, COX-2, ja VEGF haimasyövän ( PC) soluja.

Menetelmät /Principal havainnot

nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, ensimmäistä kertaa, että CDF voisi merkittävästi estää palloja muodostavan kyky (pancreatospheres) PC-solujen yhdenmukainen lisääntynyt hajoaminen pancreatospheres, joka liittyy vaimennus CSC markkereita (CD44 ja EpCAM), erityisesti gemsitabiini-resistenttejä (MiaPaca-2) PC-solut, jotka sisältävät suuren osuuden CSCS sopusoinnussa lisääntynyt miR-21 ja väheni miR-200. Kun ksenografti hiirimallissa ihmisen PC, CDF hoito esti merkitsevästi tuumorin kasvua, joka liittyy pienentynyt NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus, COX-2, ja miR-21 ilmentyminen, ja lisääntynyt PTEN ja miR-200 ekspressio kasvaimen jäänteitä.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että kasvaimen vastainen aktiivisuus CDF liittyy esto CSC toiminnon kautta alas-säätely CSC liittyvien signalointireitteihin. Siksi CDF voisi olla hyötyä ehkäisyssä kasvaimen uusiutumisen ja /tai hoitoon PC parempia hoitotuloksia tulevaisuudessa.

Citation: Bao B, Ali S, Kong D, Sarkar SH, Wang Z, Banerjee S, et ai. (2011) antituumorivaikutuksen uuden yhdisteen-CDF välittyy Regulating miR-21, miR-200, ja PTEN in Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10,1371 /journal.pone.0017850

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 joulukuu 2010; Hyväksytty: 10 helmikuu 2011; Julkaistu 9 maaliskuuta 2011

Copyright: © 2011 Bao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Cancer Institute, NIH avustukset 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1, ja 5R01CA132794 (FH Sarkar). Kiitämme Puschelberg ja Guido perustan niiden antelias rahoitusosuudesta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on yksi kaikkein vaarallisin pahanlaatuisten sairauksien kanssa huonoin prognoosi, joka on rankattu neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, lukuisia on pyritty parantamaan hoitoon ja säilymiseen PC potilaiden mutta lopputulos on ollut pettymys. Tämä pettymys tulos johtuu monista tekijöistä, joista

de novo

vastus (sisäinen) ja hankittu (ulkoisten) vastustuskyvyn tavanomaisilla terapeuttisia (kemoterapiaa ja sädehoitoa) ja gemsitabiini yksin tai-yhdessä muiden sytotoksisten tai kohdennettuja aineiden . Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että vastus voi itse asiassa johtua rikastetun olemassaolo tuumorin aloittamista soluja, on luokiteltu myös syöpää kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSC) kasvaimen massan [2] – [6]. CSCS on kapasiteettia itseuudistumisen ja mahdollisuudet uudistua osaksi kaikentyyppisiin erilaistuneita soluja, jotka aiheuttavat heterogeeninen kasvainsolupopulaatioissa vuonna kasvain massa, joka osaltaan kasvaimen aggressiivisuus [2] – [6]. Siten epäonnistuminen poistaa näitä erityisiä soluja pidetään yhtenä syitä huono hoitotuloksia perinteisiin terapeuttisten, mikä viittaa siihen, että uudempi ja uusia terapeuttisia strategioita on kehitettävä kohdennettuja tappaminen lääkkeille vastustuskykyiset CSCS kitkemiseksi riskin kasvaimen uusiutumisen parantamiseksi potilaiden selviytymiseen diagnosoitu PC.

etsiessään uusia vielä myrkyttömiä aineita, huomio on keskittynyt luonnon aineita useita vuosia. Yksi tällainen aine on curcumin (diferuloylmethane), joka on peräisin laitoksesta Curcuma longa (Linn) kasvatettiin trooppisessa Kaakkois-Aasiassa [7] – [9]. Kurkumiini on osoitettu estävän kasvua erilaisten kasvainsolujen; kuitenkin huono hyötyosuus curcumin rajoittaa sen soveltaminen klinikalla. Viime aikoina olemme kehittäneet uuden synteettinen analogi curcumin, 3,4-difluori-bentso-curcumin [nimesimme sen Difluorinated-Curcumin tai lyhyt CDF [10], [11]], joka osoitti suurempaa hyötyosuutta haiman kudoksista, ja inhiboi myös solujen kasvua, DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: n, Akt, COX-2, ja PGE

2 ja VEGF, ja aiheutti induktio miR-200 ja inaktivointi miR-21 PC-soluissa [ ,,,0],12]. Koska miR-200 liittyy hankintaan epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on myös uskotaan olevan yhteydessä CSCS tai syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, tässä tutkimme vaikutuksia CDF CSC toiminto.

Kirjoittajat raportoivat, ensimmäistä kertaa, että CDF voisi inaktivoivat monia toimintoja CSCS lukien kyky uusiutua osoituksena esto palloja muodostavan (pancreatospheres) kyky lääkkeille vastustuskykyisten PC soluja, mikä oli sopusoinnussa inaktivointi CSC biomarkkerit kuten CD44 ja EpCAM. Osoitimme myös antituumorivaikutuksen CDF yksin ja-yhdistelmä gemsitabiinin kanssa, joka oli yhdenmukainen inaktivoitumisen miR-21, ja näin ollen lisääntyneen ekspression PTEN, vaimennus DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: n eston in ilmentymisen COX -2, ja aktivoinnin ilmaus miR-200 kasvaimen jäänteitä vierassiirrännänmallissa hiirimallissa ihmisen PC, jotka kaikki tarjoavat vakuuttavia

in vivo

aktiivisuus CDF joka on sopusoinnussa

in vitro

havaintoja.

tulokset

AsPc-1 ja MiaPaca-2 solulinjojen ja niiden kloonit valittiin tähän tutkimukseen, koska niiden suhteellisen resistenttejä luonne. CSC ominaisuuksista näistä solulinjoista käyttämällä kantasolujen markkereita ”Lin28B ja Nanog RT-PCR, ja EpCAM ja CD44 Western blot osoitti kasvua ekspressiotaso PC-GTR solulinjojen verrattuna niiden vanhempien solulinjoja (kuvio 1) . Siksi päätimme nämä testata hypoteesia, että CDF on tehokkaampi kuin curcumin jopa resistenttejä solulinjoja ja niiden resistenttien kloonien-GTR.

ominaisuudet CSCS varmistettiin vielä, että proteiinin ilmentymistä EpCAM ja CD44 ( C).

CDF voimakkaasti estää kyky muodostaa klooneja ja invaasion PC solujen verrattuna gemsitabiinin ja curcumin

Valitsimme pitoisuus 20 nmol /l gemsitabiinin ja 4 umol /l curcumin tai CDF suorittaa klonogeeniset määritystä seuraavat edellisessä julkaisussa [12]. Tulokset osoittivat, että oli merkittävä väheneminen kyky muodostaa klooneja AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut käsiteltiin curcumin ja CDF, mutta ei gemsitabiinin (kuvio 2A). Kuitenkin CDF hoito oli paljon suurempi ja merkittävä väheneminen pesäkkeiden muodostumisen verrattuna curcumin. AsPC-1-GTR ja MiaPaca-2-GTR-soluissa oli 80% vähennys kyky muodostaa klooneja kanssa CDF käsittelyyn, ja että vain 20-30% vähennys kyky muodostaa klooneja havaittiin gemsitabiinin tai curcumin käsittely (kuvio 2A). Kaiken CDF hoito osoitti merkittävää vähenemistä kyky muodostaa klooneja ihmisen PC soluja, mikä viittaa paremmuus CDF.

Fluoresenssi on hyökkäsi solujen luettiin käyttäen ULTRA Monitoiminen mikrolevylukijaa (TECAN) virityksellä /emissioaallonpituuksilla 530 /590 nm. Pohjapinta taso ABCG2 ilmentymisen osoittaa suhteellisesti suurempia ilmentymistä lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat (C).

CDF tai curcumin hoito vähentynyt PC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tulokset osoittivat, että 4 umol /l curcumin oli vähäinen esto invaasion taas samanlainen keskittyminen CDF osoitti merkittävää inhibitiota invaasion (kuvio 2B). Pohjapinta taso ABCG2 ekspressio havaittiin kantasolulinjoista (

de novo

lääkkeille vastustuskykyiset solut); kuitenkin, taso ilmentymisen ABCG2 edelleen lisääntynyt lääkkeille vastustuskykyiset (hankittu lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat) (kuvio 2C).

CDF esti elinkelpoisuutta ihmisen PC-solujen yli curcumin ja gemsitabiinin arvioituna MTT: llä

Aluksi MTT-määritystä suoritettiin tutkimaan eri konsentraatioiden vaikutusta gemsitabiinin (1-50 nmol /l), ja kurkumiini tai CDF (2-6 umol /l) solun eloonjääminen sen jälkeen, kun 72 tuntia hoidon jälkeen (tietoja ei ole esitetty). Myöhemmin 4 mikromol /l CDF tai curcumin, ja 20 nmol /l gemsitabiinin käytettiin kohdella yksilöllisesti sekä yhdessä gemsitabiinin 72h. Tulokset osoittivat, että CDF hoito yhdessä gemsitabiinin aiheutti huomattavaa vähentämistä solujen eloonjäämistä kaikissa neljässä solulinjoissa verrattuna curcumin ja gemsitabiinin yhdistelmähoitoa saaneilla (kuva 3). Lisäksi analyysi lääkkeen yhdistelmähoito osoitti, että yhdistelmä indeksi käsittelyn jälkeen CDF yhdessä gemsitabiinin oli alle 1,00 (kuva 3), mikä viittaa synergiavaikutuksesta CDF yhdistelmän. Sen sijaan yhdistelmä indeksi kurkumiinin ja gemsitabiinin oli enemmän kuin 1,00 (kuvio 3), joka osoittaa ei-synergistisen vaikutuksen. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että CDF aiheutti paljon merkittävämpi väheneminen solujen hengissä PC soluissa, verrattuna gemsitabiinin /curcumin yksin tai niiden yhdistelmät verrattuna CDF ja gemsitabiinin yhdistelmää.

MTT määritys suoritettiin kaikissa neljässä solussa linjat 72 h kuluttua hoidon CDF, curcumin tai sen yhdessä gemsitabiinin. Käsittelemätön kontrolli on annettu arvo 100%. P-arvo on esitetty edustaa vertailuja monoterapialla ja niiden yhdistelmien avulla pariksi t-testiä. Yhdistelmä Index (CI) 1 CDF ja Gemsitabiinin yhdistelmä osoittaa synergismiä.

CDF huomattavasti lisääntynyt pancreatosphere hajoamisen PC solujen

vaikutuksen tutkimiseksi hoitoja alalla muodostavan kyky PC-solujen (pancreatosphere) ja hajoamisen pancreatospheres, teimme alalla hajoamisen määritystä varten 10 päivää tuottaa muodostumista pancreatospheres, minkä jälkeen 5 päivää lääkehoidon. Tulokset osoittavat, että oli olemassa merkittävä kasvu alalla hajoamisen mukaan curcumin ja CDF hoitoa, eikä gemsitabiinihoidon (kuva 4). Kuitenkin suurin vaikutus hajoamisen havaittiin vasteena CDF hoitoon (kuvio 4), jälleen kerran, mikä viittaa siihen, että CDF on paljon parempi estämiseksi toimintoja syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

P-arvot laskettiin jonka pariksi

t

testiä.

CDF esti pancreatospheres muodostumista PC soluissa

vaikutuksen tutkimiseksi lääkeaineiden CSC kyky uusiutua PC-soluissa, teimme alalla muodostumisen määritys 1 viikko neljään viikkoon (kuvio 5A ja B). Tulokset osoittivat, että CDF yhdessä gemsitabiinin täysin eliminoitu pancreatospheres muodostumista neljän viikon hoidon verrattuna gemsitabiinin ja curcumin yhdistelmän PC soluissa jopa gemsitabiinin kestävä PC-soluissa, mikä viittaa siihen, että CDF voi aiheuttaa pancreatospheres herkempi gemsitabiinin kuin curcumin käsittely, ja voisi olla hyödyllistä kohdennettua tappamista CSCS. Kuvio 5C esittää vaikutuksen eri pitoisuuden Gemsitabiinin ja CDF 2

toinen kulkua pancreatospheres in esikäsitellyn ensisijainen pancreatospheres of AsPC-1-soluissa. CDF hoito estää huomattavasti 2

toinen kulkua pancreatospheres annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi CDF-esikäsitellyt solut osoittivat suurempi vaikutus kuin ei-CDF-esikäsiteltyjä soluja.

merkittävä väheneminen pancreatospheres havaittiin soluissa, joita käsiteltiin CDF esitetty tähdellä

CDF laski CD44 ja EpCAM ilmaisun pancreatospheres PC solujen

tutkittiin, mikä vaikutus lääkkeiden CSC biomarkkereita, CD44 ja EpCAM in pancreatospheres of AsPC-1 ja AsPC-1-GTR solujen konfokaalimikroskopiaa (kuva 6). Tulokset osoittavat, että CDF laski CD44 ja EpCAM ilmaisun pancreatospheres, mikä viittaa siihen, inhiboiva vaikutus CDF on pancreatosphere muodostumiseen voi liittyä inhibition CD44 ja EpCAM ilmaisun.

ilmentäminen pancreatospheres of AsPC-1 ja AsPC- 1-GTR-soluissa arvioitiin konfokaalimikroskopiaa (suurennus X250).

CDF yhdistettynä Gemsitabiini esti Haiman kasvaimen kasvua in vivo paljon enemmän kuin curcumin yhdistelmä

Olemme käyttäneet ihonalaisen ksenografti kasvainmuoto jossa kasvain indusoitiin MiaPaca-2 solujen CB17-SCID-hiirissä. CDF hoito yhdistelmänä gemsitabiinin merkittävästi esti kasvaimen kasvua MiaPaca-2 kasvaimia paljon enemmän kuin kurkuma ja gemsitabiinin yhdistelmä (kuvio 7A) sekä verrattuna joko käsittelemättömiin kontrolleihin tai niitä hoidettiin yhdellä huume. Hiiret eivät osoittaneet laihtuminen hoitojakson aikana (30 päivää), mikä viittaa siihen, että nämä hoito ei ollut merkittäviä kielteisiä vaikutuksia eläimiin.

Anti-kasvain aktiivisuus ja muutokset kasvaimen painoa kustakin ryhmästä eläinten ( A). Nuoli osoittaa alkamispäivä hoidon. NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta kasvaimen kudokset; ja NF-KB kilpailu verrokkitutkimus leimaamattoman NF-KB oligonukleotidi (B). Western blot-analyysi COX-2, PTEN ja β-aktiinin ilmentymistä kasvaimen jäänteitä (C); miR-21, miR-200b ja miR-200C ilmentyminen kasvaimen jäänteitä mitattuna reaaliaikaisella RT-PCR (D). P-arvot laskettiin pariksi

t

testiä.

CDF gemsitabiinihoito vähentynyt merkittävästi NF-KB aktivoituminen

in vivo

NF KB: n aktivaatio määritettiin CDF tai curcumin, ja /tai gemsitabiinia kasvaimen jäänteitä johdettu MiaPaca-2-solujen tuumoreita kuten yllä. CDF ja curcumin -monoterapiasta alassäädetty NF-KB: n aktivoitumisen taas gemsitabiinia aktivoitu NF-KB tason, joka kumottiin yhdistettynä hoidon CDF. Yhdistelmä hoito CDF gemsitabiinihoito osoitti merkittävää vähenemistä NF-KB tason verrattuna curcumin ja gemsitabiinihoidon (kuvio 7B), mikä viittaa siihen, että inaktivointi NF-KB voisi olla yksi molekyylitason mekanismeja, joilla CDF saa aikaan sen anti-kasvain aktiivisuutta PC kasvaimia.

CDF vaikutuksia proteiinin ilmentymiseen

in vivo

COX-2, PTEN, ja β-aktiini ilmentyminen määritettiin Western blot. Merkittävä alassäätöä ilmaus COX-2 havaittiin molemmissa yhdistelmä, mutta vaikutus oli huomattavampi CDF yhdistelmäryhmä. Ilmaus fosfataasin ja jännityksen homologi (PTEN), kasvainsuppressorigeenin havaittiin vähentynyt MiaPaca-2-soluissa; Ilmaisulla PTENin oli säädelty hoidetuilla CDF (kuvio 7C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CDF on paljon tehokkaampaa kuin curcumin. Koska PTEN on tunnettu kohde miR-21, jonka on raportoitu olevan säädellään ylöspäin PC [13] – [15], arvioimme ekspressiotasot miR-21 kasvaimen jäänteitä kuten alla.

Modulation ilmaus miR-21 ja miR-200 perhe

in vivo

Selvitimme ekspressiotasot miR-21, miR-200b ja miR-200c MiaPaca-2 kasvaimet reaaliaikaisella RT-PCR. Yli-ilmentyminen miR-21 havaittiin MiaPaca-2 kasvaimia taas löysimme merkittävä väheneminen ilmentymisen miR-21 kasvaimissa käsiteltiin joko CDF yksinään tai yhdessä CDF ja gemsitabiinin (kuvio 7D). Olemme edelleen määrittivät ekspressiotasot miRNA-200b ja miR-200c tuumorikudoksissa joiden tiedetään säätelijöinä EMT ja todettiin olevan huomattavasti alhainen MiaPaca-2-solut (kuvio 7D). Sen sijaan havaitsimme, että CDF hoidon kanssa tai ilman gemsitabiinin yhdistelmä osoitti lisääntyneen ekspression sekä miR-200b ja miR-200c, mutta vaikutus kurkumiinin kanssa tai sen yhdistelmä oli minimaalinen, mikä viittaa siihen, paremmuus CDF ilmentymisen estämiseksi miR -21, jolloin uudelleen ilmentymä PTEN, ja uudelleen ilmentäminen miR-200, joka voisi olla vastuussa käänteinen EMT fenotyypin käsitellyissä soluissa CDF. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmiasun MiaPaca-2 kasvaimet ovat yhdenmukaisia ​​rikastetun populaation CSCS ja EMT ominaisuuksista, ja nämä lääkkeille vastustuskykyiset solut voitaisiin tappaa joko CDF yksinään tai yhdessä gemsitabiinin.

Pancreatospheres tehostettu kasvaimen kasvua

in vivo

kyseessä on perinteinen koeolosuhteissa, normaalisti pistää miljoona solua arvioimiseksi kasvaimen kasvua; kuitenkin, tutkimiseksi suuremmat mahdollisuudet kasvaimen kasvua pancreatospheres, me pistetään vain 5000 solua hiirissä kuin proof-of-concept tutkimuksessa. Kasvain paino huomattavasti lisääntynyt päivinä edetessä (kuvio 8A). Taso miR-21 nostettiin välillä kasvainten istutettu miljoona vanhemmaissolujen verrattuna pancreatospheres (kuvio 8B). Eläin lopetettiin 30 päivän jälkeen, koska kasvaintaakkaa, ja brutto kasvaimia on esitetty kuvassa 8C osoittaa suurempaa kasvaimia sekä paikallista alueellista imusolmuke etäpesäke taas kasvaimia peräisin vanhempien soluista ei ilmennyt etäpesäkkeitä yli 30 päivän ajan. Kasvain- solut osoittivat merkittävää inhibitiota pancreatospheres kun käsiteltiin CDF (kuvio 8D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että CSCS (pancreatospheres) voidaan kasvattaa hiirissä ja CDF voisivat olla hyödyllisiä tappaminen näiden lääkkeille vastustuskykyiset solut (kuvio. 8).

(A). 5000 pancreatospheres ympättiin hiiriin käyttäen 01:01 matrigeeliä, progressiivinen kasvaimen kasvua yli 30 päivän ajan. Kohtalainen lisäys ilmentymisen miR-21 mitattuna reaaliaikaisella RT-PCR havaittiin kasvainten peräisin pancreatospheres verrattuna kasvaimia peräisin vanhempien soluista ruiskuttamalla miljoona solua ja kasvaimen arvioitiin samana ajan (B) . Valokuvia, jotka esittävät kasvaimen kasvun, nuoli osoittaa kasvaimen ja tähti (*) tarkoittaa loco alueen imusolmukkeen etäpesäke taas emme löytäneet etäpesäkkeitä, kun miljoona vanhempien solua injektoitiin (C). Kasvainsolut kerättiin kasvaimista peräisin pancreatospheres käsiteltiin CDF osoittivat merkittävää inhibitiota muodostumista pancreatospheres (D).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että synteettinen analogi curcumin, CDF, on huomattavasti tehokkaampi kuin curcumin menehtyi gemsitabiinin vastustuskykyisten haimasyöpä (PC) soluja, jotka muodostavat suuren osan solujen syövän kantasolut (CSCS) tai syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja ominaisuudet. Estyminen solun kasvu saattaa osittain johtua paremmin sisäänottoa soluihin, säilyttäminen ja vähentää metabolisen inaktivaation CDF PC soluja, mikä on johdonmukainen julkaisemat tulokset solu- ja eläinten farmakokineettiset tiedot [10], [11]. Aikaisemmat raportit osoittavat, että CDF estää NF-KB ja COX-2 aktiivisuutta PC soluissa

in vitro

[12]. Täällä vahvistaa nämä havainnot

in vivo

hiirellä ksenograftimallissa. Näin ollen, tappaminen gemsitabiinin kestävä PC-solujen CDF liittyy inaktivaatio NF-KB: n ja COX-2-signalointireitin, joka on erittäin tärkeää, koska näiden reittien tiedetään osaltaan lääkeaineen vastustuskykyyn PC-solujen kemoterapeuttisten aineiden [16] – [18].

CSCS käsittää vain hyvin pieni osa solujen kasvaimen massan ja omaavansa kyvyn itse uudistaa ja aiheuttaa eriytetty kasvainsoluihin [3] – [5], [19] . CSC: n teoria on perustavanlaatuinen kliinistä merkitystä erityisesti siksi, CSC on tunnistettu useissa pahanlaatuinen kasvain kudoksissa kuten haimasyöpä ja katsotaan olevan erittäin vastustuskykyisiä kemoterapian sädehoitoa kuin eriytetty tytärsoluksi [3] – [5], [20]; kuitenkin, CSCS eristää ihmisen kasvaimista ovat yleensä riittämättömiä edelleen mekaaniset tutkimukset. Olemassaolo CSCS tarjoaa selityksen kliininen havainto, että kasvaimen regressio yksinään ei korreloi elossaololuku [21], koska kasvaimen uusiutumisen, mikä johtuu osittain läsnäolo CSCS. Siksi kohdistaminen itseuudistumiseen reittejä ja tappaminen CSCS voisi tarjota tarkempia lähestymistapa poistaa solut, jotka ovat syynä kasvaimen uusiutumisen. Potentiaalinen haaste tässä suhteessa on kehittää hoitoja, jotka vaikuttavat selektiivisesti CSCS säästäen normaalia kantasoluja, jotka voivat luottaa samantasoisen mekanismit itseuudistumisen. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että CDF paitsi estävät solujen kasvua PC soluja, mutta myös estää CSC kyky uusiutua arvioimana pallo muodostuminen (pancreatospheres) määritykset. Siksi CDF voi olla suurempi kyky estää syövän kasvua dokumentoimat meidän ksenografti hiirimallissa gemsitabiinin resistenttien PC soluja, joka näyttää välittyvän eston CSC kyky uusiutua.

Kehittyvät todisteet viittaavat siihen rooliin of mikroRNA (miRNA) monissa biologisissa prosesseissa [22] – [25]. Monien miRNA, miR-21, jota yleisesti pidetään onkogeenin, on yli-ilmentynyt useissa kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien PC, ja sen on raportoitu liittyvän kasvaimen etenemiseen, huono säilyminen ja lääkeresistenssin [13], [14], [26 ], [27]. Meidän edellisessä raportissa, olemme osoittaneet, että ilmaus miR-21 on säädellään ylöspäin gemsitabiinin kestävä PC soluja ja että sen ilmentyminen voi olla merkittävästi alas-säädellä CDF käsittely

in vitro

[12]. Lisääntynyt ilmentyminen miR-21 tiedetään liittyvän inaktivoitumisen PTEN, joka on tietää tuumorisuppressorigeeni, jolloin aktivoituminen PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin, joka johtaa aggressiivinen kasvaimen kasvua [15], [28]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että CDF hoito voi johtaa alas-säätely miR-21, jolloin säätely ylöspäin PTEN

in vivo

, viittaa siihen, että kasvaimen vastainen aktiivisuus CDF liittyy ylössäätöä PTENin johtuvat inaktivaatio miR-21 ilme.

toisin miR-21, miR-200 perhe tunnetaan tuumorisuppressoriproteiinia ja ne ovat yleensä alassäädetty joissakin kasvaimissa kuten PC ja menetys ilmentymisen miR-200 perheen edistää hankintaan EMT fenotyypin ja lääkeresistenssin. Down-regulation miR-200 siRNA tekniikan on osoitettu olevan yhteydessä EMT fenotyypin, kun taas uudelleen ilmentäminen miR-200 voi johtaa käänteisen EMT fenotyypin [29], [30]. Edellisessä julkaisu [12], osoitimme, että CDF hoito voisi uudelleen ilmaista miR-200 PC-soluissa. Tässä osoitimme, ensimmäistä kertaa, että CDF voi säätää ylös miR-200B ja miR-200c kasvain jäänteitä

in vivo

, sopusoinnussa huomattavasti suurempi tuumorin kasvun ksenograftissa hiirimallissa, kun CDF oli käytetään yhdessä gemsitabiinin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvaimen vastainen aktiivisuus CDF välittyy kautta uudelleen ilmentymisen miR-200, joka voi mahdollisesti johtaa käänteinen EMT fenotyypin ja voisi myös johtaa voittaa lääkeresistenssin PC.

Yhteenvetona , CDF osoitti voimakkaammin kasvua estävä vaikutus, esti CSC itseuudistumisen sopusoinnussa inaktivaation CSC biomarkkereita (CD44 ja EpCAM) PC soluissa erityisesti gemsitabiinin kestävä PC soluja verrattuna curcumin. Vierassiirrekokeissa hiirimallissa ihmisen PC kasvainten aiheuttamaa MiaPaca-2-solut, CDF on anti-kasvain aktiivisuutta säätelemällä COX-2, PTEN, miR-21, miR-200, ja NF-KB: n

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että CDF voisi olla uusi aine hoitoon PC yleensä mutta gemsitabiinin kestävä PC erityisesti lieventävien käyttäytymistä CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Jos jonkin eläimen huomataan epäterveellistä tai sairaat nopeasti lopetettiin. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Wayne State University laitosasiakkailta Animal Care Committee (Luvan numero: A-03.10.08).

Soluviljely, Drugs ja reagenssit

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa AsPC-1, ja MiaPaca-2 hankittiin ATCC (Manassas, VA). Nämä kaksi solulinjaa AsPC-1 ja MiaPaca-2 altistettiin 200 nmol /l Gemsitabiinin ja 5 umol /l Tarceva (erlotinibin) joka toinen viikko noin 6 kuukautta luoda gemsitabiinin ja Tarceva kestävä (GTR) solulinjat, nimeltään kuten AsPC-1-GTR ja MiaPaca-2-GTR, vastaavasti. Tämän seurauksena AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaca-2, ja MiaPaca-2-GTR valittiin tässä tutkimuksessa perustuu niiden ero herkkyyttä gemsitabiinia. Kaikki solulinjat on todennettu (Applied Genomics Technology Center at Wayne State University) 13. maaliskuuta 2009, ja nämä todennettu solut pakastettiin myöhempää käyttöä varten. Menetelmää käytettiin testaamiseen oli lyhyt tandem-toisto profiloinnin avulla PowerPlex 16 System Promega. Gemsitabiini ja curcumin ostettiin Eli Lilly (Indianapolis, IN) ja Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), tässä järjestyksessä. CDF syntetisoitiin, kuten on kuvattu aikaisemmin julkaisussa [10], [11]. Gemsitabiini liuotettiin veteen, kun taas CDF ja curcumin liuotettiin DMSO loppupitoisuuteen 0,1% DMSO väliaineessa.

Vasta

Vasta-aineita ABCG2, ja PTEN ostettiin Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). Vasta-aine COX-2 ja β-aktiini hankittiin Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI), ja Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

klonogeeninen määritys

klonogeeninen määritys suoritettiin tutkia lääkeaineiden vaikutus solujen kasvuun PC-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [12]. 5 x 10

4 solua maljattiin kuuden kuoppalevylle. 72 h kuluttua altistumisesta 20 nmol /l gemsitabiinin, 4 umol /l CDF tai curcumin solut trypsinoitiin, ja 1000 yhdessä elävät solut maljattiin 100 mm: n petrimaljoille. Sitten soluja inkuboitiin 10-12 päivä 37 ° C: ssa 5% CO

2/5% O

2/90% N

2-inkubaattorissa. Pesäkkeet värjättiin 2% kristalliviolettia ja laskettiin.

Invasion määrityksessä

invasiiviset aktiivisuus solujen testattiin käyttämällä BD BioCoat Kasvaimen invaasio Assay System (BD Biosciences, Bedford, MA) mukaan valmistajan protokollan kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti 5 x 10

4 solut ympättiin seerumittomalla väliaineella täydennetty curcumin tai CDF saliin ja pohja kuopat täytettiin täydellisesti väliaineessa järjestelmässä. The, fluoresenssi luettiin käyttäen Microplate Reader (TECAN) at 530/590 nm ja valokuvattiin.

Solun eloonjääminen määritys

MTT määritys suoritettiin käyttäen AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaca-2, ja MiaPaca-2-GTR kuten aiemmin on kuvattu [12] 72 tunnin jälkeen hoidon. Yhdistelmä-indeksi ja Isobologrammi yhdistelmä- hoidossa laskettiin myös ja piirretään käyttäen CalcuSyn- ohjelmistoa (Biosoft, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta) määrittämään synergia perustuu menetelmä Chou ja Talalay [32].

Sphere muodostumista /hajoamiseen määrityksessä

Yksisolususpensiot soluja maljattiin ultra low kiinnittyvä kuoppiin 6-kuoppalevylle 1000 solua /kuoppa alalla muodostumiseen väliaineessa [33]. Jälkeen 7 päivää, pallot kutsutaan nimellä ”pancreatospheres” kerättiin sentrifugoimalla ja lasketaan [33]. Saat pallo hajoamisen määritystä, 1000 solua /kuoppa inkuboitiin 10 päivää sen jälkeen 5 päivää lääkehoidon, jossa tutkittiin vaikutusta lääkkeen hoidon hajoamisen pancreatospheres kuten aiemmin on kuvattu [33]. Pancreatospheres otettiin talteen sentrifugoimalla ja lasketaan mikroskoopilla.

Konfokaalimikroskopia

Yksisolususpensiot of AsPC-1 ja AsPC-1-GTR-solut maljattiin käyttäen ultra low tarttuva kuoppiin 6- kuoppalevylle 3000 solua /kuoppa alalla muodostumiseen väliaineessa. Jälkeen 7 päivää hoidon jälkeen pancreatospheres kerättiin sentrifugoimalla, pestiin 1x PBS: lla, ja kiinnitettiin 3,7% parformaldehyde. CD44 ja EpCAM-vasta-aineita käytettiin immunovärjäyksessä määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [29]. CD44 tai EpCAM-leimatun pancreatospheres valokuvattiin konfokaalimikroskopiaa (Leica TCS SP5) käyttäen ohjelmistoa LAS AF 1.2.0 Build 4316.

Proteiinin uutto ja Western blot-analyysi

Proteiinit poimittiin kaikki neljä solulinjojen ja myös eläinten kasvainkudoksista kuten aiemmin on kuvattu [12]. Suhteellinen taso ABCG2 arvioitiin kaikkien neljän solulinjoissa. Vaikutukset COX-2, PTEN ja β-aktiinin ilmentymistä arvioitiin kasvaimen kudokset Western blot -analyysillä. kuten aiemmin on kuvattu [12].

eläinkokeet

Eläin protokolla hyväksyttiin Animal Investigation komitean, Wayne State University, Detroit, MI. Nainen CB17 SCID 4 viikkoa vanha hankittiin Taconic Farms (Germantown, NY) ja ruokitaan Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). Pienet fragmentit MiaPaca-2 ksenografti istutettiin ihon alle ja kahdenvälisesti hiiriin lääkettä tehokkuuskokein. Kun hiirille kehittyi palpoitavissa kasvaimia, ne valittiin sattumanvaraisesti seuraaviin ryhmissä (n = 5 /ryhmä): (1) käsittelemätön kontrolli; (2) CDF (5 mg /hiiri /vrk), mahan kerran päivässä 12 päivää; (3) kurkumiini (5 mg /hiiri /vrk), mahan kerran päivässä 12 päivää; (4) gemsitabiini (1 mg /hiiri /vrk), laskimoon joka kolmas päivä yhteensä kolme annosta; (5) CDF ja gemsitabiinin käyttäen annoksia edellä esitettiin; (6) curcumin ja gemsitabiinin käyttäen annoksia kuten edellä. Kasvaimen mittauksen ja painon muutoksista tehtiin ja kudos varastoidaan -70 ° C: ssa RNA: n ja proteiinin uuttamalla.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) määritys arvioimiseksi DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: n

Nuclear proteiinit valmistettiin kasvaimia kudoksesta käyttäen Dounce-homogenisaattoria, jossa 400 ui jääkylmää lyysipuskuria uutetaan kuten aiemmin on kuvattu [34]. EMSA suoritettiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System NF-KB IRDye leimatun oligonukleotidin LI-COR, Inc. (Lincoln, NE). Kymmenen ug tumaproteiiniuutetta käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. NF-KB-kilpailun valvonnan tutkimus suoritettiin käyttäen leimaamatonta NF-KB konsensus oligonukleotidi. Näytteet ladattiin ja ajettiin 30 mA 1 tunnin ajan. Geeli skannattiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR, Inc.).

TaqMan miRNA Real-Time käänteiskopioijaentsyymi–polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Voit selvittää lauseke of miRNA (miRNA-200b miR-200c, ja miR-21) in MiaPaca-2 kasvaimia, käytimme TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems) noudattaen valmistajan protokollaa. 5 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio ja tosiaikaisen PCR: n reaktiot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30], käyttämällä Smart Cycler II (Cepheid).