Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

γ-säteily on tehokas hoito syöpä. On näyttöä siitä, että sädehoito tukee kasvaimen-spesifistä immuniteettia. Se oli kuvattu, että säteilytys indusoi de novo proteiinisynteesiä ja parantaa antigeenin esittelyä, me siis tutkimme, γ-säteily aiheuttaa lisääntynyt ilmentyminen syövän-kives (CT) antigeenejä ja MHC-I, mikä mahdollistaa tehokkaan immunologista säätelyä. Tällä on merkitystä, koska ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC-I tuumorisoluihin on usein heterogeeninen. Olemme havainneet, että aiheuttamien muutosten γ-säteily edistää immunologisen tunnustamista kasvain, joka on esitetty lisääntynyt tunkeutumisen lymfosyyttien sädehoidon jälkeen.

Methods /arviointi

verrattuna ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC-I erilaisissa syöpäsolulinjoissa ja raikas biopsiat ennen ja jälkeen

in vitro

säteilytys (20 Gy). Lisäksi vertasimme pariksi koepaloja jotka otettiin ennen ja jälkeen sädehoidon päässä sarkooma. Sen tutkimiseksi, vastaako muutettu ilmaus CT-antigeenejä ja MHC-I on spesifinen γ-säteilyä tai on osa yleisen stressin vastaus, olemme analysoineet vaikutusta hypoksia, hypertermia ja genotoksinen stressiä ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC- I.

In vitro

säteilytys syöpäsolulinjoista ja tuoreen tuumoribiopsioissa indusoi korkeamman tai de novo ilmentymisen eri CT-antigeenit ja korkeampi MHC-I: n aika- ja annoksesta riippuvalla tavalla. Tärkeää on, osoitamme, että säteilytys syöpäsolujen parantaa niiden tunnustamista kasvain-spesifisten CD8 + T-soluja. Analyysi pariksi koepaloja otettu kohortin sarkooma potilaiden ennen ja jälkeen sädehoidon vahvistivat tulokset ja sen lisäksi osoitti, että säteilytys johti korkeampiin tunkeutumisen lymfosyyttien. Muunlaisia ​​stressi ei ollut vaikutusta ilmentymisen CT-antigeenejä tai MHC-I.

Johtopäätökset

havainnot viittaavat siihen, että γ-säteily edistää immunologinen tunnustamista kasvain. Siksi ehdotamme, että yhdistämällä sädehoidon kanssa hoitoja, jotka tukevat kasvain immuniteetin voi suurentaa terapeuttisen tehon.

Citation: Sharma A, Bode B, Wenger RH, Lehmann K, Sartori AA, Moch H, et al. (2011) γ-säteily Edistää immunologisia kirjaaminen syöpäsolujen lisäämällä Expression of Cancer-kivesantigeenien

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10,1371 /journal.pone.0028217

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 toukokuu 2011; Hyväksytty: 03 marraskuu 2011; Julkaistu: 29 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Sharma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ludwig Institute for Cancer Research /Cancer Research Institute (Cancer antigeeni Discovery Collaborative), Atlantic Philanthropies, Cancer Research Institute, Hanne Liebermann Foundation, Hartmann Muller Foundation, Terry Fox Foundation ja Ellinger Foundation, Med Alumini University Zurich (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro A. Sartori tukee Vontobel-säätiö ja jota Ambizione apurahan Sveitsin National Science Foundation (SNSF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

γ-säteilyä tai sädehoidon on yksi laajimmin käytetyistä syövän hoitomuotoja [1]. Säteilytys aiheuttaa kuoleman syöpäsoluja [2], [3], mutta on kertynyt näyttöä siitä, että adaptiivinen immuniteetti edistää merkittävästi tehoa sädehoidon [4]. Esimerkiksi säteilytetty kasvaimia potilailla ja hiirillä useammin soluttautuneet leukosyyttien kuin säteilyttämätön kasvaimissa [5], [6], [7] ja aivan äskettäin tutkimusten prekliinisissä malleissa osoitti, että tehokkuus sädehoidon riippuu läsnäolo CD8

+ T-solujen [8]. Se, että kasvaimet ovat kohdennettuja ja ohjataan CD8

+ T-solut on ehdottanut lisääntyi kasvainvaikutuksen immunosuppressiopotilaita [9], [10], [11] ja se, että kasvain-immuniteetin voidaan havaita syöpäpotilailla [12], [13], [14], [15]. Koska tunnustamista syöpäsoluja CD8

+ T-solujen riippuu esittämiseen kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) yhteydessä MHC-I-molekyylit, usein-heterogeeninen ilmentymä TAA ja /tai MHC-I sisällä kasvain on kielteinen vaikutus tehoon kasvain-immuniteetin. Tässä tutkimuksessa pyysimme erityinen onko säteilytys indusoi tai ylös-säätelee ilmentymistä näkyvä ryhmä TAA: iden, ns CT-antigeenejä. CT-antigeenit muodostavat suurperhe on antigeenejä, jotka on ilmaistu monenlaisia ​​maligniteetteja, mutta ovat poissa tervettä kudosta paitsi kiveksissä ja istukassa [16], [17]. Syöpäpotilailla kehittyvät usein spontaaneja immuunivasteita kohti CT-antigeenit, jotka on esitetty niiden immunogeenisyys [18]. Koska niiden immunogeenisyyden ja rajoitettua kuvio ilmaisun, CT-antigeenejä pidetään lupaavia kohteita immuunihoidolle syöpäpotilailla [19], [20]. Havaitsimme, että säteilytys indusoi korkeamman tai

de novo

ilmentymistä eri CT-antigeenejä sekä ylössäätöä MHC-I ilmentymisen useissa syöpäsolulinjoissa ja tuoreen,

ex vivo

säteilytetty kasvainbiopsioissa. Tärkeää on, vertailu pariksi tuumorisektioiden saatu sarkooma potilaiden ennen ja jälkeen säteilytyksen ilmaantui säädelty tai

de novo

MHC-I ja CT-antigeenejä ja samanaikainen kasvu soluttautua CD8

+ T-solut , mikä viittaa siihen, että säteilytys mobilisoi paikallista, kasvain-spesifisen immuunivasteen. Lisäksi meidän tulokset osoittavat, että yhdistelmä sädehoidon ja aktiivisen immuniteetin asiaa CT-antigeenit voivat olla hoitomuoto on suurempi tehokkuus verrattuna kumpaankin hoito yksinään.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

eettisen komitean ”eettinen komitea otteesta” nimenomaisesti hyväksytty tämä tutkimus (tutkimus No: EK-1017).

Solut

Solulinjat.

MDA-MB-469, MDA-MB-231 ja MCF 7 (rintasyöpä solulinjat), MCF 10A (normaali rinta solulinjassa, ikuisti, ei-transformoidut), Saos, LM5, 143B, HOS, HU09, ja M132 (luusarkoomasolulinjoissa), A549, H460, Calu1 ja Calu3 (keuhkosyövän solulinjat), SK-MEL-37 (melanoomasolulinja) ja PC3 ja DU145 (eturauhassyöpäsolulinjoissa) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Luusarkoomasolulinjoissa olivat lahja tri Bruno Fuchs (Department of Orthopedics, University Clinic Balgrist, Zurich). Kaikki solulinjat ja biopsiat viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), L-glutamiinia ja antibiootteja. PC3 ja DU145 viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% FBS: ää, L-glutamiinia ja antibiootteja.

Ensisijainen ihmisen soluja.

Ihmisen esinahan keratinosyyteissä saatiin lahjana tri Onur Boyman (Department of Dermatology, University Hospital Zurich) ja viljeltiin Keratinosyyttien seerumivapaassa (K-SFM; Invitrogen), lisäravinteet (EGF Human Recombinant ja naudan aivolisäkeuutteella; Invitrogen), L-glutamiinia ja antibiootteja, kuten on kuvattu [21] . Normaali ihmisen ihon fibroblasteissa (NHDF) saatiin Promocell GmbH (Heidelberg, Saksa). Ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HMEC-1) saatiin lahjana tri Therese Resink (biolääketieteen laitoksen, yliopistollisen sairaalan Basel) ja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Invitrogen) täydennettynä 5% FBS (Sigma-Aldrich ) ja antibiootteja. Ihmisen keuhkojen fibroblastit (MRC-5) saatiin lahjana tri Giancarlo Marra (IMCR, Zurich) ja alun perin saatu Coriell Cell Repositories (Camden, NJ) ja viljeltiin MEM-väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 15% FBS: ää, L-glutamiinia ja antibiootteja. ZT-821-solut (ensisijainen munuaisten solut) perustettiin meidän lab yhdestä solususpensio terveen munuaisen kudosta. NHDF ja ZT-821-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% FBS: ää (Sigma-Aldrich), L-glutamiinia ja antibiootteja.

Solujen käsittely

Ionisoiva säteily.

Solut ja raikas kasvainbiopsioissa altistettiin y-säteilyä

60Co lähde. Annokset säteilytystä käyttää, on kuvattu kussakin kokeessa.

hypertermia.

Soluja inkuboitiin 42 ° C: ssa 1 h tai 5 h ja viljeltiin sen jälkeen 72 tuntia 37 ° C: ssa. Käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen soluja käsitellään tämän jälkeen analyysi RT-qPCR.

Hypoksia.

Soluja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2 tilavuus /tilavuus) in niukkahappiseen työasema (InVivoO

2-400, Ruskinn Technology, Leeds, UK) eri ajankohtina (8 h, 48 h tai 72 h). Käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen soluja käsitellään tämän jälkeen analyysi RT-qPCR.

Genotoksiset stressiä.

Soluja käsiteltiin 37 ° C: ssa 1 ug /ml sisplatiinia (Sigma-Aldrich Corp . St. Louis, MO), 24 h tai 15 uM etoposidi (Sigma-Aldrich) 1 h tai 150 uM bleomysiinin (Sigma-Aldrich) 1 tunnin ajan. Tämä ajankohta pidettiin T

0. Lopussa hoidon, väliaine korvattiin tuoreella viljelyalustalla ilman lääkettä. Sitten solut viljeltiin vielä 72 tuntia 37 ° C: ssa. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin samoissa koe- olosuhteissa ilman lääkettä.

Small-molekyylin proteiinikinaasi-inhibiittoreita.

varastossa pitoisuutena 10 mM 100% dimetyylisulfoksidiin (DMSO) erityisten estäjät ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM), KU 55933 (Tocris biotieteiden, Ellisville, MO) ja DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin katalyyttinen alayksikkö (DNA-PKcs), NU7441 (Tocris biotieteiden) laimennettiin toimivaan 10 uM 1% DMSO. Inhibiittorit lisättiin 1 h ennen säteilytystä, ja jätettiin viljelmän koko kokeen ajan. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin samoissa koe- olosuhteissa ilman lääkkeen ja 1% DMSO: ta.

tuumoribiopsioissa

Koepaloista saatu University Hospital Zurich. Kaikki potilaat leikattiin osana tavanomaista hoitoa ja allekirjoitti tietoisen suostumuksen. Eettisen komitean ”eettinen komitea otteesta” nimenomaisesti hyväksytty tämä tutkimus (tutkimus No: EK-1017). Heti resektio, koepalat leikattiin useita paloja 2-4 mm

3. Palat satunnaistettiin kahteen otteeseen ja otettu viljelyalustaan. Yksi erä säteilytettiin yhdellä annoksella 20 Gy, kun taas toinen erä toimi kontrollina. Kasvain kappaletta viljeltiin 72 tunnin ajan seuraaviin

ex vivo

säteilyä ja geenin ilmentyminen määritettiin RT-qPCR analyysi. Pariksi koepalat sarkooma ennen ja jälkeen säteilytystä kerättiin johonkin toiseen tarkoitukseen ja siksi ajankohtina keräys- sädehoidon jälkeen vaihteli 2-6 viikkoa. Kasvaimet säteilytettiin

in vivo

lineaarisen kiihdytin ja sai annoksen 50-64 Gy.

RNA ja valmistelu cDNA

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja sen jälkeen hajotettiin DNAasia I (Invitrogen). Pitoisuus ja puhtaus arvioitiin käyttämällä NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng RNA käänteiskopioitiin käyttäen suuren kapasiteetin cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosciences, Foster City, CA). CDNA joko käytettiin välittömästi RT-qPCR reaktioita tai varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki sarjat käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden.

RT-qPCR

ilmentyminen CT-antigeenejä ja MHC-I analysoitiin TaqMan geenin analyysi alukkeilla ja TaqMan 1x Universal Master Mix (Applied Biosystems) on RotoGene cycler (Corbett Research, Sydney, NSW). Reaktioseos (10 ui) sisälsi 1 ui cDNA, 3,5 ui vettä, 0,5 ui aluketta ja 5 ui TaqMan 1x universaali master mix. Seuraavan syklin olosuhteita käytettiin: 2 min 50 ° C: ssa, 10 min 95 ° C: ssa, 45 sykliä 15 s 95 ° C: ssa, 1 min 60 ° C: ssa. Muutos ekspressiotasot CT-antigeenien ja MHC-I annetaan kertaiseksi ekspression lisääntyminen vertaamalla delta-Ct-arvot on käsitelty, että ei-käsiteltyjen näytteiden normalisoinnin jälkeen on 18S rRNA. Ct-arvoja 38 sykliä tulkittiin siten, että geeni ei ilmenny ja kansi ilme 2 pidettiin ennallaan. Kukin rintasyövän ja luusarkoomasolulinjoissa testattiin kahdessa riippumattomassa kokeessa ja keuhkosyöpä ja eturauhassyöpä solulinjat yhdessä. Kukin näyte ladattiin kaksoiskappaleiden /kolmena rinnakkaisena kullekin RT-qPCR kokeissa.

Virtaussytometria

Solut värjättiin PE-leimatulla anti-HLA-A, B, C (klooni G46 -2,6, 1:100), FITC-leimattu anti-β2-mikroglobuliinin (klooni TU99, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, CA) ja propidiumjodidilla (PI, Sigma). Näytteet mitattiin FACS Calibur (BD) ja analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Treestar) jälkeen portittamisella live (PI-negatiivinen) soluja. Tarvittaessa isotyyppikontrolleja käytettiin.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotettujen pariksi kudosleikkeiden saatu sarkooma ennen ja jälkeen säteilytyksen värjättiin hiiren anti-humaani monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, CD4 (klooni 1F6, 01:30, ZYMED Laboratories Inc.), CD8 (klooni C8 /114B, 1:100, DAKO A /S, Carpinteria, CA), grantsyymi B (klooni Gr B-7, 01:25, DAKO A /S: ), MHC-I (klooni C21, 1:1000, TKI Research Diagnostics, Inc.), CT7 (klooni CT7-33, 1:80, DAKO A /S), CT10 (kanin polyklonaalinen, 1:500, ProteinTech Group, Inc.), NY-ESO-1 (klooni E978, 1:50, ZYMED) ja perforiinin (klooni 5B10, 1:20, Novocastra Laboratories Ltd). Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Kaikki leikkeet värjättiin joko Ventana Benchmark automatisoitu värjäys järjestelmä (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) käyttämällä Ventana reagenssit läpi koko menettely NY-ESO-1, CT7, grantsyymi B, CD4, CD8 ja Perforiinin ja BondMax (Vision BioSystems , Newcastle upon Tyne, UK) ja CT10 ja MHC-I. UView (Ventana) tai Tarkenna DAB (Vision BioSystems) käytettiin kromogeeneina vastaan ​​ensisijainen vasta-aineita. Kuvia värjättyä leikkeet hankittiin Zeiss-Axiovert 200 M (Carl Zeiss valomikroskopia Göttingen, Gearmany) käänteinen mikroskoopilla käyttäen Carl Zeiss Axiovision CD28 kuvantamisjärjestelmä. Värjäykset pisteytettiin asteikolla 0-5: n ilmentämiseen NY-ESO-1, MAGE-C1 /CT7, ja MAGE-C2 /CT10 prosentteina, joka perustuu useita positiivisia soluja, jotka ilmentävät antigeenin kokonais- solujen määrä on korkea teho kenttä (HPF) käyttäen 40X objektiivin linssin. Pisteytys MHC-I ekspressio suoritettiin perustuen värjäytymisen intensiteetti. Kasvain infiltraatteja laskettu määrä soluja, jotka ilmentävät CD4, CD8 ja grantsyymi per HPF käyttäen 40X tavoite. Kukin värjätty jakso arvioitiin viidessä eri alueilla (yksityiskohtainen luettelo tulokset katso taulukko S4). Kolme henkilöä suoritti pisteytys sokeasti ja itsenäisesti MHC-I värjäykset ja kaksi henkilöä suoritti pisteytys sokeasti muiden värjäykset.

Immunofluoresenssikoe

Solut (10’000-20’000 soluja 1 ml medium) maljattiin osastoitu kulttuuri dioja (BD Biosciences) kiinni yön yli. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen salvattiin 10% BSA /PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden NY-ESO-1 (klooni E978, 1:500, Invitrogen), tai MAGE-C1 /CT7 (klooni CT7-33, 1: 500, Dako) 10% BSA /PBS: ssä 1 h huoneenlämpötilassa pimeässä, jota seurasi inkubointi FITC leimatun sekundaarisen vasta-aineen vuohen anti-hiiri-lgG1 (Poly4053, 1:2000, Biolegend) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Objektilasit vastavärjättiin 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli-hydrokloridia (DAPI, 1:500) 2 minuutin ajan pimeässä ja tarkastetaan käyttäen Zeiss-Axiovert 200 M käänteistä mikroskooppia ja Carl Zeiss Axiovision CD28 kuvantamisjärjestelmä.

Western blot-analyysi

säteilytetyt ja ei-säteilytettyjä soluja tarkistetaan proteiinin ilmentymisen käyttäen monoklonaalisia hiiren vasta-aineita vastaan, NY-ESO-1 (klooni E978, 1:500, Invitrogen) tai MAGE- C1 /CT7 (klooni CT7-33, 1: 500, Dako) ja β-aktiinin (klooni 4i374, 1:8000,

Santa Cruz

Biotech, CA). Vaikutus genotoksinen aineiden ja DNA-PKcs ja ATM esto, on γ-säteilytys indusoi geenin ilmentymisen soluissa arvioitiin käyttämällä vasta-aineita pS2056-DNA- PKcs (kanin polyklonaalinen fosfo S2056-DNA- PKcs, 1:300, Abcam Inc, MA), SLL-D2 (klooni Fl17, 1:200,

Santa Cruz

Biotech, CA), pS1981-ATM (klooni EP1890Y, 1:5000, Eitomics, CA) ja PS15-p53 (klooni 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA). Jonka jälkeen inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen, vuohen polyklonaalista anti-hiiri-lgG1 HRP (Poly4053, 1:10000, Biolegend) tai polyklonaalisella vuohen anti-kani-HRP: tä (1:10000, Abcam). ECL-reagenssilla (Amersham, UK) käytettiin luminesenssin substraattina.

CD107a jyvästen häviämisen Pitoisuus

kirjaaminen ilmentävien solujen NY-ESO-1-säteilytyksen jälkeen, jonka antigeenispesifisen CD8

+ T-solut testattiin käyttäen CD107a: n jyvästen häviämisen määrityksen. Kolme x 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-spesifisiä kloonattuja CD8

+ T-solut (tuotettu, kuten on kuvattu [22]) inkuboitiin 10

6 CFSE- leimattua (1 uM) HLA-A2

+ MDA-MB-469-soluja -, jotka olivat tai eivät olleet säteilytettiin 20 Gy 72 tuntia aiemmin – 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn pyöreäpohjaiseen levy lopullisessa tilavuudessa 200 ui RPMI + 10 % FCS ja antibiootteja läsnä ollessa PE-leimattua anti-CD107a (01:20, BioLegend, SD, Kalifornia). Positiivisena kontrollina, MDA-MB-469-soluja ladattiin 10

-6 M NY-ESO-1

157-165 peptidi. Kaksi itsenäistä T-solukloonien (2A7 ja 2B5) on käytetty ja kaikissa kulttuureissa tehtiin kahtena kappaleena. Inkubaatio suoritettiin 37 ° C: ssa 4 h. Solut kerättiin ja pestiin 2 ml: ssa FACS-puskuria (FB), mitä seurasi värjäys Pacific Blue-leimattu anti-CD8 (BioLegend) 50 ui FB 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut pestiin kerran 2 ml: lla FB ja suspendoitiin uudelleen 200 ui FB. Näytteet mitattiin syaani ADP9 (Beckman Coulter Inc., Fl, USA) ja analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Treestar).

Tulokset

In vitro

γ-säteilyä ylä- säätelee selostukset CT-antigeenien ja MHC-I-molekyylit

Breast, osteosarkooma, keuhko- ja eturauhassyöpää ja normaaleja ensisijainen solut altistettiin kerta-annoksen säteilyä 20 Gy, jälkeen 72 h jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin ilmentämiseen CT-antigeenien ja MHC-I: n RT-qPCR. Useimmat näistä syövän solulinjat ilmensivät havaittavissa tai hyvin alhainen CT-antigeenien tavanomaisissa viljelyolosuhteissa. Sen sijaan, γ-säteilyteho solut osoittivat

de novo

tai sääteli ilmentyminen eri CT-antigeenit satunnaistetussa tavalla (kuvio 1A-D). Paneelissa neljän syövän solulinja tyyppejä, γ-säteily todettiin eniten syvällinen vaikutus rintasyövän ja luusarkoomasolulinjoissa ja ainakin eturauhassyövän solulinjoissa. Ylös-säätely MHC-I ja CT-antigeenejä upon γ-säteily näyttää olevan erityinen piirre pahanlaatuisia soluja, koska tämä ei havaittu missään tavanomaisessa ensiöparit testasimme täällä (ZT-812, ihmisen esinahan keratinosyyteissä , HMEC-1, MRC-5, NHDF ja MCF 10A, kuvio S1A, S1B). Melanoomasolulinjasta SK-MEL-37 tiedetään ilmaista kaikilla testatuilla CT-antigeenejä normaaleissa viljelyolosuhteissa ja sisältyy näin ollen positiivisena kontrollina. Säteilytys Tämän solulinjan johti selvästi lisäävä säätely kaikkien CT-antigeenejä ja MHC-I (tuloksia ei ole esitetty). Olemme havainneet lisääntynyttä ilmentymistä CT-antigeenejä ja MHC-I jo 24 tuntia säteilytyksen jälkeen joissakin tapauksissa ja tasainen kasvu geenien ilmentyminen havaittiin jopa 96 tuntia säteilytyksen jälkeen. Kuten havaitsimme merkittävän solukuoleman 96 h säteilytyksen jälkeen, teimme kaikki muut analyysit 72 tuntia säteilytyksen jälkeen. Sädehoidon voidaan antaa yhtenä suurena annoksena (20 Gy) tai fraktioitua annoksina, me säteilytetty valittu solu linjat (rintasyöpäsolulinjoissa MDA-MB-469 ja MCF7, sekä luusarkoomasolulinjoissa Saos, HOS, LM5 ja 143B, jossa on 2 Gy päivässä 10 peräkkäisen päivän ajan. Tätä protokollaa johti samanlainen muutos CT-antigeenin ja MHC-I ilmaisun havaittua kerta-annoksen 20 Gy (kuvio S2A, S2B). kerta-annos 20 Gy käytettiin kaikissa edelleen kokeita.

perustettu syöpäsolulinjat olivat altistuneet kerta-annoksen säteilyttämisen 20 Gy ja mRNA: n ilmentymisen CT-antigeenien ja MHC-I: tä määritettiin 72 tuntia myöhemmin RT-qPCR. (A ) rintasyövän solulinjat, (B) luusarkoomasolulinjoissa, (C) keuhkosyöpä solulinjat, (D) eturauhassyöpäsolulinjoissa. Kaikki Ct-arvoja on normalisoitu 18S rRNA ja tiedot on esitetty, koska kertainen ekspression säteilytettyjen verrattuna vastaavaan käsittelemättömän näytteen. Koska kertainen ilmaisua ei voida laskea geenejä, jotka

de novo

ilmaisi säteilytettäessä, laitamme symbolit tällaisissa tapauksissa edellä ohut vaakasuora viiva (A).

In vitro

γ-säteily up-regulation CT-antigeenejä ja MHC-I-molekyylit proteiinitasolla

vahvista säteilytys indusoima CT-antigeenejä proteiinin tasolla, me stained säteilytetty ja ei-säteilytetty MDA-MB-469-solujen kanssa vasta-aineiden NY-ESO-1 ja CT7 ja analysoitiin ilmentymistä CT7 ja NY-ESO-1 eri ajankohtina säteilytyksen jälkeen immunofluoresenssimikroskopialla ja Western blottauksella. Melanoomasolulinjan SK-MEL-37 ekspressoi konstitutiivisesti NY-ESO-1 ja CT7, ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina. Havaitsimme

de novo

ilmentymistä sekä CT-antigeenejä säteilytettäessä joka lisääntyi ajan (kuvio 2A, 2B), mikä vahvistaa tiedot saatiin RT-qPCR. Säteilytys normaalin rintakudoksen solulinja MCF10A ei johtanut lisääntyneeseen NY-ESO-1 tai CT7 proteiinin tasot (kuvio 2B). Tutkia vaikutuksen γ-säteilyn pinnalla MHC-I on proteiini tasolla, me säteilytettiin useita syöpäsolulinjoissa (rintasyövän ja osteosarkooma) ja normaalin ensisijainen solujen eri alkuperää, mitä seurasi virtaussytometria-havaitseminen pinnan MHC-I ja havaittiin, että säteilytys johti ajasta riippuva nousu MHC-I pinta ekspressio eri syöpäsolulinjoissa (kuvio 2C, 2D), mutta ei normaalissa ensisijaisen solut (kuvio S1B).

(A) immunofluoresenssi MDA-MB-469 ja SK-MEL-37-soluja altistettiin yhden annoksen säteilytys 20 Gy ja ne värjättiin vasta-aineiden NY-ESO-1 ja CT7 eri ajankohtina säteilytyksen jälkeen. (B) MDA-MB-469, SK-MEL-37 ja MCF 10A solulinjoja altistettiin kerta-annos 20 Gy ja ilmentymistä NY-ESO-1 ja CT7 analysoitiin Western-blottauksella 72 tuntia myöhemmin. (C) rintasyöpä ja (D) luusarkoomasolulinjoissa altistettiin kerta-annoksen säteilyttämisen 20 Gy ja HLA-ABC ja β

2microglobulin kvantitoitiin eri ajankohtina säteilytyksen jälkeen virtaussytometrialla. RAD: osoittaa γ-säteilyä.

säteilyttää syöpäsolujen tehostaa T-solun tunnustamisesta

in vitro

Sen määrittämiseksi, onko säteilytys-induced up-regulation of CT-antigeenejä ja MHC-I johtaa lisääntyneeseen tunnustamista antigeenispesifisen CD8

+ T-solut, mittasimme degranulaatio [23] – [24] NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2- erityisiä kloonattuja CD8

+ T-soluja, kun oli inkuboitu säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen HLA-A2

+ MDA-MB-469-rintasyöpäsoluissa. MDA-MB-469-solut ovat negatiivisia NY-ESO-1, mutta tullut positiivinen säteilytettäessä (kuvio 1A, 2A, 2B). Huomasimme, että vain säteilytetty MDA-MB-469-solujen indusoima degranulaation kahden itsenäisen NY-ESO-1

157-165 CD8

+ T-solukloonit (2A7, 2B5) (kuvio 3). Säteilytys ei lisätä jyvästen häviämistä, kun peptidi-ladattu MDA-MB-469-soluja käytettiin (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että ei ole määrä MHC-I, mutta määrä NY-ESO-1

157-165 esitteli MHC–I oli rajoittava tekijä säteilyttämätön MDA-MB-469-soluja, jotka sopivat siihen, että säteilytys indusoi

de novo

ilmentymisen NY-ESO-1 in MDA-MB-469-soluja (kuvio 1A, 2).

10

6 CFSE-leimatun HLA-A2 + MDA-MB-469 rintasyövän soluja säteilytetty tai yhdellä annoksella 20 Gy ja inkuboitiin 72 tuntia myöhemmin 3 x 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-spesifisiä CD8 + T-solukloonien (klooni 2A7 ja klooni 2B5), kun läsnä PE-leimattua anti-CD107a-PE 4 h 37 ° C: ssa. Sitten solut värjättiin Pacific Blue-leimattu anti-CD8 30 min ajan 4 ° C: ssa. Peptidi-ladattu MDA-MB-469-soluja käytettiin positiivisena kontrollina. Kaikki viljelmät suoritettiin kahtena kappaleena. Jyvästen häviämistä mitattiin prosentteina CD107a

+ soluja CD8

+ -soluissa, sen jälkeen portittamisella CFSE-negatiivisia soluja virtaussytometrialla.

Ex vivo

säteilytys tuoreen kasvainbiopsioissa indusoi säätely ylöspäin CT-antigeenejä ja MHC-I

laajentaa havaintonsa kliinisesti merkittävää aineistoa, keräsimme tuore kasvainbiopsioissa 23 eri syöpäpotilaiden, leikkaa ne ainakin 50 pieniksi paloiksi, ja satunnaistettiin ne kahteen koeryhmään. Me säteilytetty yksi ryhmä koepaloja 20 Gy, kun taas toiset toimi kontrollina, ja analysoitiin ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC-I 72 h myöhemmin RT-qPCR ja immunohistokemia. Nämä tulokset vahvistivat havainnot saimme syövän solulinjat, että γ-säteilyn usein indusoi lisääntyneen ekspression CT-antigeenien ja /tai MHC-I (kuvio 4A, 4B, taulukko S1). Tärkeää on, tulokset viittaavat siihen, että heterogeeninen ilmentyminen CT-antigeenejä ja /tai MHC-I voi tulla enemmän homogeeninen kun sädehoito, joka ilmeisesti tukee immunologista säätelyä kasvain.

tuore kasvain eksplanttien eri syöpäpotilailla (n = 23) oli säteilytetty tai yhden-annoksella 20 Gy. Diagnoosi Yksittäisten potilaiden esitetään täydentäviä taulukossa S1. (A) 72 tunnin kuluttua, säteilytettyjä ja ohjaus kudosviljelmiä analysoitiin ilmentymisen NY-ESO-1 ja MHC-I: n RT-qPCR. (B) edustaja kohdat (potilas numero 9 ja 20) kuvaava ilmaus NY-ESO-1 ja MHC-I immunohistokemia (20X suurennos). NR ilmaisee ei-säteilevän ja RAD osoittaa vastaava säteilytettyä kohdat.

In vivo

säteilytys ihmisen sarkooma johtaa lisääntyneeseen ekspressioon CT-antigeenejä ja MHC-I ja lymfosyyttien tunkeutumisen

Lopuksi vertasimme ilmentymisen CT-antigeenit, MHC-I: n ja tunkeutumisen lymfosyyttien 15 pariksi parafiiniin-osat on saatu sarkooma ennen ja jälkeen sädehoidon immunohistokemiallisesti. Huomasimme, että sädehoidon tuottanut huomattavaa ylössäätöä tai

de novo

ilmentymistä CT-antigeenejä ja /tai MHC-I-molekyylit, jotka oli liitetty lisääntynyt soluttautumista lymfosyyttien ja grantsyymi ilmaisun 7/15 ja 12 /15 näytettä, vastaavasti (kuvio 5A-D, taulukko S2, S3).

parafinoidut pariksi kudosleikkeiden saatu sarkooma potilaista (n = 15) ennen ja jälkeen säteilytyksen analysoitiin immunohistokemiallisesti varten (A) läsnäolon CD8

+, CD4

+ ja grantsyymi

+ solut, (B) ekspressio CT7, NY-ESO-1 ja CT10 ja (C) MHC-I ekspressiota. CT-antigeenit pisteytettiin keskimääräinen prosenttiosuus eläviä soluja, jotka ilmentävät antigeenin kokonaismäärä solujen viiden HPF (40X tavoite). Suodattuminen lymfosyytit otettiin keskiarvo laskemalla solujen määrä, jotka ilmentävät CD4, CD8 ja grantsyymi viidellä HPF, ja MHC-I: tä sijoitettiin perustuu Värjäytymisen intensiteetti. (D) edustaja kohdat, joissa esitetään CT-antigeenien ja MHC-I: n ja tunkeutumisen lymfosyyttien ennen ja jälkeen sädehoidon immunohistokemiallisesti. Esitetään: potilas F ilmaisua CT7, potilaan A CT10, potilaalle K NY-ESO-1, potilas D CD4 ja MHC-I ja potilas E CD8 ilme. NR ilmaisee ei-säteilevän ja RAD osoittaa vastaava säteilytettyä kohdat. Pt: ilmaisee potilaan numero. Potilaan tiedot on lueteltu täydentävän taulukossa S2.

Muunlaisia ​​stressi ei ole vaikutusta ilmentymisen CT-antigeenejä tai MHC-I

in vitro

stressi ja ympäristön muutoksiin aiheuttaa muutoksia transkription profiilin selviytyäkseen näiden hyökkäysten [25], [26], [27]. Koska säteilytys aiheuttaa DNA-vaurioita, tutkimme onko sääteli MHC-I ja CT-antigeenejä esiintyisi myös altistuksen jälkeen solulinjojen muihin hoitoihin, jotka aiheuttavat DNA vaurioita kuten sisplatiini, etoposidi ja radioaktiivisen säteilyn lääke bleomysiini. MDA-MB-469 ja SK-MEL-37-soluja käsiteltiin erikseen kuhunkin DNA: ta vaurioittavien aineiden ja RNA-tasot seurattiin eri ajankohtina hoidon jälkeen. Tuloksemme osoittavat, että mikään näistä aineiden sääteli ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC-I (kuva S3B-D). Kuitenkin tunnusmerkki geenit PS15-p53 ja SLL-D2 oli säädelty hoidon jälkeen, mikä osoittaa, että nämä aineet stressille käytetyn pitoisuuden (kuvio S3A). Lisäksi testasimme, onko muiden syöpien liittyvän stressin, kuten korkeissa lämpötiloissa tai alhainen happipitoisuus, indusoi lisääntyneen ekspression CT-antigeenien ja /tai MHC-I. Huomasimme, että mikään näistä hoidoista vaikuttivat ilmentymisen CT-antigeenejä ja MHC-I taas allekirjoituksen geeni CA9 oli säädelty (kuvio S4A, S4b). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt ilmentyminen CT-antigeenejä ja MHC-I syöpäsolulinjoista on erityinen vaste y-säteilyä ja ei ilmene, kun alttius muut indusoijat erilaisten stressivasteeseen polkuja.

ATM ja DNA-PK signalointireittien ovat tarpeeton γ-säteilyn aiheuttamien ilmentymistä CT-antigeenejä ja MHC-I

aktivoituminen DNA-vahinkosaneerauksen tarkastuspiste reittejä vastauksena genotoksisia loukkaus auttaa säilyttämään genomista eheys nisäkässoluissa [28]. DNA-vaurio laukaisee aktivoituminen eri seriini /treoniini-proteiinikinaasien, jotka muodostavat ensisijaisen muuntimia signalointikaskadissa ja jotka, ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja DNA-riippuvaiset proteiinikinaasit (DNA-PKcs), ovat äärimmäisen tärkeitä, [29] . ATM-proteiinikinaasi on kriittinen väli useissa soluvasteiden y-säteilyn ja muiden stressin [30]. Meillä on siis tutkittava, onko säätely ylöspäin CT-antigeenin ja MHC-I ilmaisun vastauksena y-säteily riippuu aktivointi ATM ja /tai DNA- PKcs.