Krooninen sairaus

tiivistelmä

aikaisemmista töistä tunnistaa väli- sitoutumiskohdan taksaanien mikrotubulusverkon nano-. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata johdannaisia ​​paklitakselin suunniteltu sitoutumaan tähän väli- sivuston eri tavoin riippuen isotyyppi β-tubuliinia. Koska β-tubuliinin isotyyppien ovat kudos-riippuvaista ekspressiota sanottuna βIII isotyyppi on hyvin runsaasti aggressiivista kasvaimia ja paljon harvinaisempaa normaaleissa kudoksissa-minkä odotetaan johtavan tubuliinin kohdennettuja lääkkeitä, jotka ovat tehokkaampia ja vähemmän sivuvaikutuksia. Seitsemän johdannaiset paklitakselin suunniteltiin ja neljä niistä olivat alistaa synteesiin riittävän puhtaana ja saanto lisätestejä rintasyövän mallissa solulinjoissa. Yksikään johdannaisten tutkittu olivat parempia kuin nykyisin käytössä taksaaneja kuitenkin tietokonesimulaatioiden edellyttäen oivalluksia toimintaa johdannaisia. Tuloksemme viittaavat siihen, ettei sitoutuminen väli- sitoutumiskohtaan eikä lopullinen sitoutumiskohta riittää selittämään toimintaan johdannaisen taksaanien tutkittu. Nämä havainnot korostavat tarvetta iteratiivisesti parantaa suunnittelun taksaanien perustuu niiden toimintaan mallissa järjestelmissä. Saadun tiedon kykyyn rakennettuja huumeiden sitoutua tavoitteisiin ja saada aikaan toimintaa ennustettavalla tavalla on askel kohti muokkaamiseen hoitoja.

Citation: St. George M, Ayoub AT, Banerjee A, Churchill CDM, Winter P, Klobukowski M, et al. (2015) Suunnittelu ja testaus Novel taksaanit koetin Highly Complex mekanismeja, joilla taksaanit Sido Mikrotubulukset ja Syy Sytotoksisuus syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10,1371 /journal.pone.0129168

Academic Editor: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, Taiwan

vastaanotettu 4 helmikuuta 2015 Hyväksytty: 05 toukokuu 2015; Julkaistu: 08 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 St. George et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Rahoittajat Kanadan Breast Cancer Foundation myönnetty avustus JAT, numero: RES0010014. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

taksaanit, kuten paklitakseli ja dosetakseli, kohdistaa tubuliinin, alayksikön proteiini mikrotubulusten, ja sitoutua hyvin tunnettu sivuston β-tubuliinin [1]. Mekanismit sitova ja toiminta ovat kuitenkin erittäin monimutkaisia. Toisin kuin muut anti-tubuliinin lääkkeet, taksaanit kohdistuvat erityisesti ehjä mikrotubulusta ja niiden sitoutumiskohta on mikrotubulusverkoston onteloon [2]. Edellinen työ Freedman et al. [2] kartoitettiin nanohuokosiin pitkin mikrotubulus pintaa, jonka kautta taksaanien täytyy kulkea päästäkseen sitoutumiskohtaan. Erityinen sivusto nano- todettiin välituotteena taksaani sitoutumiskohdan. Toinen asia on, että on olemassa useita isotyyppien β-tubuliinia ja että nämä eroavat sekä niiden affiniteetti taksaanien ja niiden subsellulaariset roolit ja paikoissa [3]. Paklitakseli näyttää käyttämään sen suurin vaikutus βII isotyypin [4], joka on myös merkittävä β-tubuliinin isotyyppiä hermosoluissa [3], mikä mahdollisesti aiheuttaa neuropatia liittyy taksaanien. ΒIII isotyyppi, joka on hyvin runsaasti aggressiivista kasvaimia ja paljon harvinaisempaa normaaleissa kudoksissa, näyttäisi olevan hyvä vaihtoehto tavoite [5,6]. Tavoitteena oli rationaalisesti suunnitella ja testata uusia taksaanijohdannaisia ​​jotka sitoutuvat väli- sitoutumispaikan ero affiniteetilla riippuen β-tubuliinin isotyyppiä ilmentää soluissa.

taksaanit ovat aktiivisimpia antituumoriaineina hoidossa eri syöpätyyppien, erityisesti rinta-, munasarja- ja keuhkosyövän [7,8]. Kestävyys taksaaneja on ongelma onnistuneen kemoterapiaa ja saattavat syntyä vähintään kolmen erillisen mekanismeja. Ensinnäkin on klassinen mekanismi johtuvat toiminnan P-glykoproteiinin (P-gp, jota koodaa

MDR1

geeni), joka olennaisesti pumppaa huumeet pois syöpäsolujen [9]. Rakenteellisesti erilaisia ​​taksaaneja voisi periaatteessa olla eri alttiuden vaikutukselle P-gp. Toiseksi, β-tubuliinia, kohde taksaaneja, on olemassa lukuisia isotyyppien eroavat aminohapposekvenssin ja koodaa eri geenit [3]. Yksi taksaanien, paklitakseli, on sen vahvin vaikutuksia βII isotyypin [4]. Koska βII on yli-ilmentynyt monissa kasvaimissa [10] Tämä ei ole yllättävää, mutta βII on myös tärkeä osa hermoston [5], mikä voi selittää neurotoksisuutta taksaanien. ΒIII isotyyppi olisi parempi kohde, koska se tapahtuu pitkälti hermosoluissa mutta paljon matalammalla tasolla kuin βII, vaikka sen ilme on hyvin yleistä aggressiivinen ja metastasoituneen syövät [6]. Kolmanneksi sitoutuminen taksaanien mikrotubuluksiin on hyvin monimutkainen, ja lääke on kulkea ulkoa miljöön sitoutumiskohtaan onteloon (sisä-) mikrotubulusverkoston [11] aikaansaamiseksi katalyyttinen tapahtumaketju johtaa polymeroinnin tai depolymerointi. Tämä tarkoittaa sitä, että taksaani on ensin sitoutua väli- sivuston pinnalle mikrotubulusten ja sitten tehdä sen tavalla sisällä. Tämä väli sivusto myös vaihtelee eri isotyyppien. Lääkkeet Tässä kuvattu on suunniteltu ja testattu sekä

in vitro

ja

in silico

jolla pyritään käsittelemään kaikkia kolmea edellä mainituista kysymyksistä.

kemialliset rakenteet paklitakselin ja doketakseli on esitetty kuviossa 1. toisen sukupolven puolisynteettinen lääkkeen doketakselin eroaa kahdessa asemassa paklitakselista. Vaihdosta asetaattiesteriä C-10 asema on hydroksyyliryhmän tekee dosetakseli enemmän vesiliukoisia ja biologisesti kuin paklitakseli [12,13], ja sen seurauksena dosetakselia on suosinut näiden kahden yhdisteen käytettäväksi kliinisissä sovelluksissa. Monet kolmannen sukupolven lääkkeet kehitetään parannella vanhempien yhdisteitä, tavoitteiden kanssa parantaa vesiliukoisuus, kasvain läpäisevyys, ja solujen säilyttämiseen, mikä johtaa parempia tuloksia ja pidemmän eloonjäämisajasta potilaille [14].

taksaanit kohdistuvat erityisesti β-tubuliinin alayksikköä α /β-tubuliinin heterodimeeri [15,16]. Sijainti sitoutumiskohdan löytyy ontelon onton mikrotubulusten rakenne. Ottaen huomioon, että mikroputket, joka koostuu toistuvista pallomainen proteiineja, välitilat (nanohuokosiin) sijaitsevat pitkin pituutta mikrotubulusten vierekkäisten protofilamenttien [2]. Se on näiden nanohuokosiin että taksaaneja on osoitettu liikkua ja saada sitoutumiskohdan ontelon [11,17]. Kun sidottu lopulliseen sitoutumiskohtaan konformaation muutos tapahtuu, jolloin motiivi β-tubuliinin tunnetaan M-silmukka stabiloituu, estää purkamisen mikrotubulusten [16]. Taksaaneja sitoudu suhteessa 1: 1 kanssa heterodimeerejä pituudelta mikrotubulukseen [18]. Vaikka taksaaneja voidaan mahdollisesti sitoa jokaiseen heterodimeerin on mikrotubulusten rakenne, vain yksi taksaani molekyyli vakauttamiseksi tarvittaisiin satoja tubuliinin heterodimeerejä [18,19].

Sekä α-tubuliinin ja β-tubuliinin löytyy useita isotyyppeihin ilmaisemat eri geeniä [20]. On olemassa ainakin kahdeksan ihmisen β-tubuliinia isotyyppien, ja ilmentymistä näissä isotyyppien on havaittu eroavan normaaleissa kudoksissa ja kasvainnäytteet [21]. Luokka III β-tubuliinia (βIII) erityisesti on havaittu olevan yli-ilmentynyt monissa muodoissa syövän, erityisesti lääkeresistenttejä syöpä [6], kun taas βI ilmentyy, ja βII ilmentyy vahvasti aivokudoksessa [21]. Perustuen huomioon rakenteen mikrotubulusten, väli- sitoutumiskohta on nano- ja Sekvenssivaihtelut β-tubuliinin isotyyppien, me arveltu, että taksaanien suunniteltu vuorovaikutuksessa differentiaalisesti kanssa tubuliinit tulee käyttää biologisia vaikutuksia vaikuttavat tilatekijöihin ja /tai affiniteetit suunniteltu-osien sitoutumiskohtiin, suhteellinen runsaus tubuliinin isoformien esteitä asettamat lipidikaksoiskerroksia (suhteellinen liukoisuus) ja vapaa energiat yhdistyksen tai dissosiaation [2]. Erityiset tavoitteet käsitelty tässä tutkimuksessa ovat:

tutkimiseksi välisen vetysidoksen C-7 hydroksyyli taksaanien kanssa Ser275 in

α

I ja

β

II, niiden suhteellinen vuorovaikutus nano-, ja tuloksena levittämistä taksaanien sitoutumiskohdan.

tutkimiseksi välisen vetysidoksen konservoitunutta Ser278 tubuliinin isotyypit (

β

I,

β

II ja

β

III) vaihtelevilla sivuketjuja suunniteltu C-10 taksaanien, niiden suhteellinen vuorovaikutus nano- ja tuloksena levittämistä taksaanien sitoutumiskohdan.

taustalla lähtökohta ensimmäisen tavoitteen perustuu laskennallinen mallintaminen, jossa todettiin, että βIII tubuliinin, joka on alaniini sijasta seriini asemassa 275, ei pysty muodostamaan vetysidoksen kanssa C-7 hydroksyyli paklitakselin, mikä puolestaan heikentää vuorovaikutus paklitakselin kanssa nano-, estää diffuusion paklitakselin välissä olevaan sitoutumiskohtaan, ja johtaa tehokkaaseen menetyksen paklitakselin aktiivisuuden mikrotubulusten sisältävä βIII tubuliinia [2].

testaaminen ensimmäisen tavoitteen vaatii synteesiä paklitakselin johdannaisia, joilla on C-7-hydroksyyli korvattu ei-polaarinen funktionaalinen ryhmä (Tx-A ja Tx-B, kuvio 1) tai fluori (Tx-C, kuvio 1). Odotimme nähdä vähentynyt edistämiseen polymeroinnin paklitakselin mikrotubulushaarojen koostuu βIII isotyypin. Kun joko Tx-A tai Tx-B testataan kuitenkin odotamme, että edistäminen polymerointi on vähemmän vaikutusta β-tubuliinia isotyyppiä; toisin sanoen vaikutukset Tx-A tai Tx-B pitäisi olla tunteeton (tai ainakin vähemmän herkkä) on β-tubuliinia isotyyppiä. Tx-C pitäisi olla välissä toimintaa, koska vähemmän energiaa liittyy vetysidoksella fluoriatomi (3 kcal /mol verrattuna 5 kcal /mol). Pystyimme syntetisoidaan yhdisteitä Tx-A ja Tx-C, ja nämä testattiin

in vitro

polymerointi määrityksiä tai solulinjan malleja sytotoksinen aktiivisuus.

lähtökohtana toisen tavoitteena on, että aukko välillä 4 ja 9 on kohdistettava pääsy Ser278, ja siten sivuketjupuolikkaaseen voisi auttaa tämän puutteen korjaamiseksi. Vetysidosten paklitakselin ja Ser278 ennustetaan aiheuttavan stabilointia taksaanin vuorovaikutus on nano-, mikä nopeuttaa liikkeen lääkkeen sitoutumiskohdan sisällä mikrotubulusten, parannettu mikrotubulusten polymeroitumisen, ja lisääntynyt sytotoksisuus. Testaus Toisen tavoite vaatii synteesi useita muutoksia C-10 asemaan paklitakselia. Suunnittelimme taksaaneja, joilla on erilaiset pituudet on C-10 asema käyttäen joko guani- (yhdisteet Tx-E ja Tx-G, kuvio 1) tai karboksylaatti (yhdisteet Tx-D ja Tx-F, kuvio 1) funktionaalisen ryhmän. Näiden yhdisteiden odotetaan olevan aktiivisempi kuin paklitakseli. Pystyimme syntetisoidaan yhdisteitä Tx-D ja Tx-F ja näitä testattiin

in vitro

polymerointi määrityksiä tai solulinjan malleja sytotoksinen aktiivisuus.

Materiaalit ja menetelmät

kemiallinen synteesi

perin ostettu yhdisteet Tx-A, Tx-C, Tx-D ja Tx-F (joukosta

in silico

suunniteltu yhdisteitä Tx-A kautta Tx-G ; kuvio 1) johtuen niiden suhteellisen helppo synteesiä riittävän saannon ja suhteellinen puhtaus testata ehdotettujen tavoitteiden. Identiteetit yhdisteiden arvioitiin ydinmagneettisen resonanssin (NMR), ja puhtaus ohutkerroskromatografian (TLC); yhdisteet Tx-A, Tx-C, Tx-D ja Tx-F olivat 88%, 94%, 94% ja 96% puhdasta, lla, saannot 6%, 10%, 3,6% ja 3,3%, vastaavasti. Kaikki yhdisteet syntetisoi sopimustutkimusten tarjoaja Helios Biotech Ltd., Edmonton, Alberta, Kanada.

Cell Culture

Rintasyöpä solulinjoissa SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], ja T-47D [24] saatiin ystävällisesti Dr. Ing Swie Goping (University of Alberta, Kanada). Nämä edustavat rintasyöpäsolulinjoissa heijastaa molekyyli heterogeenisyys havaittiin kasvainten kliinisessä ympäristössä. Valittu solulinjat tukea yleistettävyyttä havaintoja ja auttaa sulkea pois suoran vaikutuksen genotyyppi-fenotyyppi solulinjan sitoutumiseen ja sytotoksisen potentiaalin paklitakselia ja sen analogeja. Lisäksi valitut rintasyövän solulinjat on aiemmin raportoitu olevan eriasteisia paklitakselin vastus [25], ja kiinnostuksemme oli saavuttaa nämä tulokset ja kysellä jos luontainen vastus haittaa rakenne-aktiivisuus-suhteet taksaania analogit on kuvattu tutkimuksen tavoitteet. Rintasyöpä kasvaimia tunnettu siitä, mitattuna niiden ilmentyminen solun pinnan useisiin erilaisiin reseptoreihin, kuten HER2 (ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2), estrogeenireseptori (ER) ja progesteronireseptori (PR), jotka ovat mukana solun signalointiin ja solujen lisääntymistä.

SK-BR-3 solulinja on HER2

+, ER

– ja PR

-.

MDA-MB-231-solulinja ei ilmennä tai on hyvin alhainen lauseke reseptoreihin (HER, ER tai PR) ja kutsutaan kolminkertainen negatiivinen. Potilaat, joilla on kolminkertainen negatiivinen reseptoristatus läpi hoitoja sytotoksisten hoitojen, kuten paklitakselin tai doketakselin.

T-47D solulinja on ER

+ mutta HER2

-. Kasvaimet, jotka ovat ER

+ ja HER2

– (joko PR

+ tai PR

-) kutsutaan luminaaliselle kasvaimia.

Ennuste on paras luminal ja pahinta kolminkertainen negatiivinen; HER2

+ kasvaimet (Her2

+ ja ER

-) on väli ennusteen [26].

Toinen joukko ei-rintasyöpäsolulinjoissa käytettiin myös arvioimaan yleisyys havaintojen osalta paklitakselin ja sen analogit, paitsi että nämä solulinjat ovat hyvin ominaista P-glykoproteiinin (P-gp) ilmaisun, ja luokitellaan joko lääkeaineen herkkiä tai resistenttejä fenotyyppejä. MES-SA (P-gp negatiivinen, villityypin) [27] ja MES-SA /Dx5 (P-gp positiivinen, lääkkeille vastustuskykyiset) [28] kohdun sarkooma solulinjoissa, ja K-562 (P-gp negatiivinen, villityypin ) [29] ja K-562 /R 7 (P-gp positiivinen, lääkkeille vastustuskykyiset) [30] KML solulinjat ystävällisesti Dr. Charles DUMONTET (University of Lyon, Ranska). Tämä paneeli valittiin onko tehdyt muutokset taksaania rakenteisiin vaikuttaneet substraattispesifisyys varten monilääkeresistenttisyyden effluksipumpun, P-gp. MES-SA ja MES-SA /Dx5 ovat kiinnittyneet solut, kun taas K-562 ja K-562 /R7 ovat suspensiosoluille. Se on ollut aiemmin raportoitu, että MES-SA /Dx5 ja K-562 /R 7 solulinjoilla-ilmentävät P-gp-proteiinia ja niillä ristiresistenssiä erilaisten kemoterapeuttisten yhdisteiden [28,31].

Kaikki solu linjat pidettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja kostutetussa ympäristössä. Kiinnittyneet solut pidettiin mediassa kunnes ~ 90% konfluentteja. Solut trypsinoitiin liuokseen, joka sisälsi trypsiini-EDTA: a (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), jonka lopullinen pitoisuus on 0,25%.

Microtubule Polymerointi Pitoisuus

naudan aivojen tubuliinin valmistamiseksi ja puhdistaminen αβII ja αβIII dimeerit (α-tubuliinin oli sekoitus isotyyppien, vain β-tubuliinia puhdistettiin osaksi βII ja βIII, vastaavasti) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Mikrotubulusten polymeroitumisen määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Alikvootit (200 ui) isotypically puhdasta naudan aivojen tubuliinin (1,4 mg /ml) tubuliinin puskurissa (100 mM MES-Na, 1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgCI

2, 1 mM GTP, pH 6,4) inkuboitiin, kun läsnä oli lääkkeiden (1-16 uM) 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan DU mallin spektrofotometrillä (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, iN, USA) ja sameus näytteitä tarkkailtiin 350 nm: ssä joka 8 s. Raakadatan hankittiin ja työstää käyttäen KINLOTUS ohjelmistoa. Raakadata sittemmin lähtötilanteessa korjattu ja sameuden arvot ajan funktiona.

MTS-määritys

Solun elinkelpoisuus läsnäollessa lääke määritettiin käyttämällä CellTiter 96 AQ

ueous Non -Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA) tasoilla suhteessa niiden kasvu (välillä 5-10000 solua per kuoppa) kanssa 100 ul: n ja annettiin tarttua levyyn yön yli. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri 100 ui 2x lääkepitoisuudet lopullinen 1x lääkepitoisuus per kuoppa. Kukin lääkepitoisuus annettiin kuuteen eri kuopissa, arvioida teknistä toistettavuuden määritystä. Tämä hoito säilyi muuttumattomana 72 tunnin ajan. Seuraavat 72 tunnin käsittelyn 30 ui MTS-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa aika, joka on 30 minuutista 4 tuntiin, riippuen värin kehittyminen, nopeudella, joka oli vaihteleva solulinjasta solulinjaan. Suhteellinen solujen elinkyky määritettiin mittaamalla kunkin kuopan absorbanssi 490 nm: ssä ja muunnetaan prosenttia koko elinkelpoisuuden verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Kokeelliset tulokset ovat keskimäärin vähintään n = 3 kokeissa.

SDS-PAGE

natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi- polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) analyysi suoritettiin Western blot. 10% polyakryyliamidigeeleillä (kantaliuoksesta 40% 29: 1 akryyliamidi /bis liuosta, 0,375 M Tris, 0,1% (v /v) SDS: ää, 0,1% (v /v) ammoniumpersulfaattia, 0,1% (v /v) TEMED (N, N, N ’, N’-Tetrametyylietyleenidiamiinia), veden tilavuus) käytettiin kaikkien western blot kokeissa. Polyakryyliamidia (7,5%) geelejä käytettiin western blot-analyysi P-gp-proteiinia (170 kDa) varten vaaditun resoluution proteiinia bändejä tässä kokoluokassa. Kokonaisproteiinin lysaatit (25 ug) ladattiin 10 tai 15 sekä polyakryyliamidigeelien käyttäen 1x Laemmlin näytepuskuria (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Geelit ajettiin 200 V ~ 1 h 1x Tris /glysiini /SDS run puskurissa (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, USA) ennen sen poistamista ja värjättiin Coomassie Blue tai siirrettiin nitroselluloosalle kalvo western blot analyysiä. Coomassie-värjätty geelit väri poistettiin käyttämällä liuosta, jossa oli 50% H

2O, 40% metanoli ja 10% jääetikkaa. Väri poistettiin geelit skannattiin on CanoScan 600F (Canon Inc., Tokio, Japani) ja visualisoitiin Adobe Photoshop 6.0 -ohjelmisto (Adobe Systems, San Jose, CA, USA).

Western Blot analyysi

jälkeen geelielektroforeesilla ja proteiinien siirto nitroselluloosakalvoille kalvot estettiin 5% Tris puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), sekä maito- ja Tween (TBSMT) (154 mM Tris-HCl, 1,37 M NaCl: a, 0,1% (v /v ) Tween 20: tä, 5% (w /v) maito) liuosta 1 tunnin ajan. Proteiinit kalvot altistettiin yön yli primaarisen vasta-aineen-TBSMT ratkaisu. Seuraavana päivänä, kalvot pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, ja Tween (TBST) (154 mM Tris-HCl, 1,37 M NaCl: a, 0,1% (v /v) Tween 20: tä, pH 7,6), 6 sykliä 5 min pesu /inkubaation kunkin syklin TBST poistamaan sitoutumaton vasta-ainetta. Membraanit käsiteltiin edelleen sekundaarisen vasta-aineen TBST 30 min. Sen jälkeen sekundaarinen vasta-inkubaation, kalvot pestiin TBST 12 jakson ajan 5 min pesu /inkuboitu kunkin syklin TBST poistamiseksi sitoutumattoman sekundäärinen vasta-aine. Proteiinit havaittiin seuraavan 5 min altistuminen joko ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, Englanti) tai Lumi-Light Western blotting alusta (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) ja altistuvat Filmi kehitettiin käyttäen KODAK m35A X-OMAT Processor (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Proteiinit havaitaan käyttämällä ensisijaista hiiren anti-ihmisen vasta-aineet olivat: βIII (ab14545; Abcam, Cambridge, Englanti) käytettiin laimennoksena 1: 1000 P-gp (ab3366; Abcam, Cambridge, Englanti) käytettiin laimennuksessa 1: 2000 , ja vuohen anti-ihmisen aktiini (sc-1616; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) käytettiin laimennuksessa 1: 4000. Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-hiiri (115-035-003; Jackson Immuno- Laboratories Inc., West Grove, PA, USA), laimennussuhteella 1 10000 ja kanin anti-vuohi (305-035-045; Jackson Immuno- Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) käytettiin laimennuksessa 1: 40000. Alkuperäinen kalvot skannattiin ja kuvat tuotiin PowerPoint. Bändit sijaitsee odotettavissa kokoluokassa oli rajattu pois elokuvista. Koko ja kontrasti kunkin luku oikaistiin siten, että kaikki luvut Hyväksytty kooltaan ja ryhmitellään. Kontrasti koko ryhmän säädettiin siten, että nauhat voitaisiin paremmin visualisoida ja väri oli yhdenmukainen.

Tilastollinen analyysi

GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) käytettiin luomaan lukuja ja suorittaa tilastollisia analyysejä tuloksista. Standard Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan sytotoksisuuden tulokset kunkin analogien suhteen paklitakseliin indusoiman sytotoksisen profiilit; kuten myös kaikkien sytotoksisten määrityksen tulokset ja ilman muiden muuttujien (esim verapamiili). Yksisuuntainen ANOVA (varianssianalyysi) käytettiin osoittamaan välillä tilastollista merkitystä matala-, keski- ja korkea lääkeresistenssin solulinjoissa hoidettiin paklitakselilla ja johdannaiset.

Computational simulaatiot

Sitoutuminen Taksaania sitova alue.

koordinaatit tubuliinia taksaanin reseptori-ligandi-kompleksi saatiin ATE kiderakenne 1JFF [34], joka edustaa paklitakselin yhteistyössä kiteytettiin tubuliinia. Koordinaatit Tämän kiderakenteen käytettiin rakentaa komplekseja muiden taksaanin johdannaisia. Rakenteet rakennettiin käyttäen Avogadro 1.0.3 ohjelmistoa [35]. Yhdeksän komplekseja rakennettiin, kuten Tx-A kautta Tx-G sekä paklitakselin ja doketakselin kontrolleina. Reseptori valmistettiin poistamalla alfa-alayksikköön 1JFF, koska se ei suoraan edistävät sitoutumista taksaanien. Puuttuvat Ensimmäinen metioniinitähde lisättiin ja C-pää oli peitetty N-metyyli jäännös. Kofaktori guanosiinidifosfaatti (BKT) sisällytettiin myös rakenteeseen ja sen parametrit saatiin Meagher et al. [36] ionisaatiotiloja proteiinia jäännökset jaettiin käyttäen PROPKA palvelimen [37-39]. Ligandit olivat parametroida mukaan yleisen AMBER voimakenttä (GAFF) [40] ja osittainen maksuja määrättiin kanssa AM1-BCC menetelmä [41] käyttämällä

antechamber

moduuli AMBER 12 [42]. Kompleksit Sitten rakennettiin käyttämällä

tleap

moduuli AMBER 12, jossa proteiini parametroida käyttämällä AMBERff12SB voimakenttä [43,44]. Kompleksi solvatoitiin typistetyn octahedral laatikko ulottuu 12 Å kumpaankin suuntaan. Monimutkainen neutraloitiin sitten lisäämällä 16 natriumioneja. Toinen 22 natrium- ja kloridi-ioneja lisättiin aikaansaamiseksi suolan konsentraatio oli 100 mM. Kukin kompleksi sitten minimoitu raskaalla rajoituksiin (500 kcal /(mol Å)) on proteiini ja ilman Sekoitetaan vetyatomit 1000 jyrkimmän laskeutumisen kulkee seurasi 1000 konjugaattigradienttimenetelmä ajoja. Toinen minimointi 3000 jyrkimmän laskeutumisen kulkee seurasi 3000 konjugaattigradienttimenetelmä ajoja tehtiin ilman rajoituksia. Kuumentamalla 300 K alle vakiotilavuudessa SHAKE ja rajoituksiin proteiini suoritettiin käyttäen Langevin termostaatti 20 ps. Tiheys tasapainotuksen vakiopaineessa 200 ps suoritettiin sitten käyttämällä Sekoitetaan vetyatomit ja alle alenevasti rajoituksia raskaiden atomien. Tämä seurasi tuotantovaiheessa 10 ns 300 K jatkuvan paineen alla, jossa koordinaatit tallennetaan joka 2 ps. Kaikki simulaatiot tehtiin mukaisesti määräajoin ääriolosuhteissa käyttäen hiukkasten mesh Ewald käsittelymenetelmä pitkän kantaman sähköstatiikan. Tiheys, lämpötila, kokonaisenergian ja RMSD tarkastettiin tasapainottumisen. Viimeiset 2 ns tuotannon run olivat jälkikäsitellään sitoutumisen vapaan energian laskennan käyttämällä Molecular Mechanics /Poisson-Boltzmannin pinta-ala (MM /PBSA) [45] tai molekyylimekaniikka /Yleistynyt Born pinta-ala (MM /GBSA) lähestymistapoja [46]. Poimimamme 200 tasaisesti jakautunutta tilannekuvia viimeisestä 2 ns tuotannon ajaa ja käyttää niitä MM /PBSA ja MM /GBSA laskelmia. Olemme myös suorittaa normaalitilassa analyysi kunkin monimutkaisten käyttäen 100 tasaisesti välit tilannekuvia, jotka poimittiin 2 viimeistä ns tuotannon aikavälillä. Koska normaalissa tilassa analyysi on hyvin aikaa vievää, käytimme lähestymistapaa, jossa proteiini on katkaistu. Erityisesti kaikki tähteet kauempana kuin 12 Å ligandista oli katkaistu, ja analyysi suoritettiin vasta jäljellä järjestelmään. Tämä lähestymistapa on osoittautunut tehokkaaksi ja riittävän tarkan by Genheden et al [46].

Meidän lähestymistapaa, sitoutuminen vapaa energia lasketaan seuraavan kaavan mukaan: (1) missä on keskimääräinen molekyyli- mekaanisen energian lukien maksut alkaen bond, kulma, dihedral, van der Waalsin ja sähköstaattinen ehdot. on solvaatioenergia vapaa energia lasketaan ratkaisemalla Poisson-Boltzmannin (tai Generalized Born) yhtälö saada napa solvaatioenergia vapaan energian ja arvioimalla polaaritonta solvaatioenergia vapaa energia käyttämällä pinta-ala aikavälillä. –

TS

MM

on entropia termi arvioitiin käyttäen normaalitilaan analyysiä. Kun keskimääräinen energia lasketaan ligandi, reseptori, ja monimutkainen, sitova energia saadaan seuraavasta yhtälöstä: (2) B-

Sitoutuminen Intermediate nano- Site.

mikrotubulusten nano- malli koostettiin elektronimikroskoopilla tiedot mikroputkeen (1XRP) [47] X-ray tietoja tietyn αβ-tubuliinin heterodimeeri (1JFF) [34]. Alkaen proteiini- ja nukleotidisekvenssin komponenttien 1JFF kide, puuttuu tähteet (erityisesti α: 1,35-60 ja β: 1) otettiin 1TUB [1] ja päällekkäin päälle 1JFF. Seuraavaksi protonaatiotila ionisoituvien jäämien 1JFF määritettiin käyttäen PROPKA ja vetyatomeista lisätään saada täydellinen αβ-tubuliinia heterodimeeri. Lopuksi, tämä dimeeri on käytetty rakentaa osan mikrotubulusten käyttäen elektronimikroskoopilla tietojen 1XRP. Käytetyn mallin oli tyypin 1 huokosten [2], ja vain neljä tubuliinin monomeerien vieressä huokosten jäivät.

sitoutumispaikan paklitakselin välissä olevaan sitoutumiskohtaan otettiin Freedman et ai. [2], ja päällekkäin päälle nano- Edellä kuvatun rakenteen, jolloin nano–paklitakselin mallia käytettiin tässä tutkimuksessa (kuvio 2) lähtöaineena rakennetta määritellä väli- sitoutumiskohta telakointi laskelmissa. Huomaa, että interdimer yhteyksiä ei ole tasapainotettu tässä mallissa. Sitoutumispaikan paklitakselin välissä sitoutumiskohdan raportoitiin Freedman et ai. poikkeaa raportoineet Maccari et al. [48], joka sijaitsee lähempänä a

3-tubuliinia. On todennäköistä, että molemmat paikat ovat stabiilin samaa sisäistämisen kautta.

nano- katsottuna mikrotubulusten ulkoa. Sininen ympyrä ilmaisee väli sitoutumiskohta.

Telakka laskelmat suoritettiin Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group, Montreal, Kanada). MOE valittiin telakka koska sen aiheuttama-fit telakointi protokolla ja kyky helposti mallintaa ligandeja eri maksuja ja ionisaatiotiloja. Neljä heterodimeerejä säveltää tyypin 1 huokosten käytettiin määrittämään reseptori, ja viisi taksaanit (paklitakseli, Tx-A, Tx-C, Tx-D ja Tx-F) on telakoituna sivuston tunnistaa Freedman et al. [2]. Alhaisen pKa karboksyylihapon funktionaalisia ryhmiä Tx-D ja Tx-F, nämä kaksi taksaanit mallinnettiin anioninen (deprotonoitunut) parhaiten edustamaan rakenteen fysiologisessa pH: ssa. Pisteytys laskettiin alunperin Lontoon dG pisteytyksen toiminto, säilyttäen 30 konformeria (jossa kaksoiskappaleet poistettu). Myöhemmin, hiominen suoritettiin käyttäen Forcefield menetelmää ja muita rescoring käyttämällä GBVI /WSA dG pisteytyksen toiminto. Neljä eri telakointi protokollia kanssa käytettiin erikokoisia sitoutumiskohdan ja joko joustavaa tai jäykkää reseptorin.

Tulokset ja keskustelu

Tubuliinipolymerisaatio paklitakseli ja Syntetisoitiin johdannaiset

tubuliinin polymerisaatiota analyysit suoritettiin käyttäen paklitakselin johdannaisten mitata

in vitro

polymerointi aktiivisuus verrattuna paklitakseliin. Nämä kokeet käyttää Affinitettipuhdistettu βII ja βIII tubuliinin isotyypit peräisin naudan aivoista lähde; α-tubuliinin oli sekoitus isotyyppien; nämä muodot tubuliinin kutsutaan αβII ja αβIII, vastaavasti.

Polymerointi käyrät laadittiin käyttäen paklitakselin ja neljä sen johdannaiset joko αβII ja αβIII. Polymerointi käyrät lääkeaineen pitoisuudet 10 uM, on esitetty kuviossa 3A lääkeaineen pitoisuus 10 uM oli konsentraatio, jossa erot vaikutuksia kaikki lääkkeet oli selvintä; kuitenkin sama suuntaus havaittiin kaikilla pitoisuuksilla testattu (1-16 uM).

Isotypically puhdasta naudan aivojen tubuliinin (αβII tai αβIII) 1,4 mg /ml inkuboitiin, kun läsnä on lääkkeiden ja absorbanssi 350 nm: ssä mitattiin 8 sekunnin välein vähintään 11 ​​minuutin ajan. Konsentraatio kunkin lääkkeen oli 10 uM. PTX on paklitakseli.

Tulokset osoittavat, että paklitakseli vastaa korkeinta mikrotubulusten kokoonpanoa. Tämän jälkeen Tx-A, sitten Tx-C. Tx-D ja Tx-F olivat samanlaiset arvot, jossa hitain hinnat mikrotubulusten kokoonpanoa. Mikään johdannaisten testattu ylitti paklitakselin suhteen määrä tubuliinin polymerisaatiota. Oli nousu kokoonpanoon korko Paklitakselin seurasi Tx-A, sitten Tx-C. Tx-D ja Tx-F olivat samanlaiset arvot, jossa hitain hinnat mikrotubulusten kokoonpanoa.

Tulokset eivät olleet yhdenmukaisia ​​aiempien ennusteiden [2], ja olettamuksen kuvattiin ensimmäisen tavoitteen: paklitakseli ei havaittu on vähentynyt polymerointi βIII tubuliinin (havainto oli kääntöpuolella odotus), ja lisäksi Tx-A ja Tx-C ei ollut odotettua käyttäytymistä. Kumpikaan olivat tulokset sopusoinnussa olettamuksen kuvattu toisen tavoitteen: Tx-D ja Tx-F eivät olleet aktiivisempia kuin paklitakseli. Näin ollen tämä koe ei tue tärkeää tähteet 275 tai 278, tai ennustettu rooli välituotteen sitoutumiskohta mikrotubulusten nano-.

sytotoksisuus paklitakselin analogien vasten Breast Cancer Cell Lines.