Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat keskeisiä säätelijöitä geenien ilmentymistä ja on osoitettu muuttuneen ilmentymisen erilaisia ​​syöpä tyypit, mukaan lukien epiteelin munasarjasyöpä. MiRNA-toiminto on useimmiten saavutetaan sitoutumisen 3′-transloitumattoman alueen kohdeproteiinin koodaavan geenin. Mutaatio seulonta käyttäen massiivisesti-rinnakkaissekvensointijärjestelmät 712 miRNA geenien 86 munasarjasyövän tapauksissa tunnistaa vain 5 muuntunut miRNA geenejä, joista kukin on eri asia. Yksi mutaatio sijaitsi kypsä miRNA, ja kolme mutaatiota ennustettiin muuttaa sekundaarinen rakenne miRNA transkriptin. Seulonta 3′-alueen 18 ehdokkaan syövän tunnistettujen geenien yksi mutaatio kussakin

AKT2

,

EGFR

,

ERRB2

ja

CTNNB1

. Toiminnallinen vaikutus näistä mutaatioista on epäselvä, koska ilmaisu tietoja saatavilla

AKT2

ja

EGFR

ei osoittanut lisäystä geenitranskriptikuvion. Mutaatiot miRNA geenien ja 3′-alueet ovat siten harvinaisia ​​munasarjasyöpää.

Citation: Ryland GL, Bearfoot JL, Doyle MA, Boyle SE, Choong DYH, Rowley SM, et al. (2012) MicroRNA geenejä ja niiden Target 3′-alueet ovat harvoin somaattisesti mutatoitunut munasarjasyöpiä. PLoS ONE 7 (4): e35805. doi: 10,1371 /journal.pone.0035805

Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 tammikuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2012; Julkaistu: 20 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Ryland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Victorian Breast Cancer Research Consortium, Australia, ja Australian National Health ja Medical Research Council (NHMRC). GLR tukee Australian jatko palkinnon. Australialainen munasarjasyöpä Study Group tukivat Yhdysvaltain armeijan Medical Research ja Materiaalilaitoksen Esikunta alle DAMD17-01-1-0729, The Cancer neuvosto Tasmania, The Cancer Foundation Länsi-Australian ja NHMRC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA), luokka pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä, on tärkeä sääntelyn rooleja erilaisissa solureiteillä lukien proliferaatio, erilaistuminen, vanhenemista ja aineenvaihdunta [1]. Tämä asetus on saavutettu osittain komplementaarinen kuoret kanssa 3′-alue (3′-UTR) kohde-lähetti-RNA (mRNA) [1] – [3], sekä 5′-transloimaton alue tai koodaus alueet mRNA, jotka ovat sittemmin hajoavat tai transkription jälkeen vaiennetaan [4] – [6]. Kertyvät näyttöä nyt osoittaa, että miRNA ilmaisu ei ole täydellistä syövän [7], joka johtaa olettamusta, että muutokset miRNA polkuja voi olla tärkeä askel aloittamiseen ja eteneminen maligniteetti. Sopusoinnussa tämän hypoteesin on havainto, että miRNA geenit ovat usein lokalisoitu genomialuetta yleisesti muuttunut syövän, kuten minimaalinen alueet poistetaan, Heterotsygotian menetys ja vahvistus sekä hauras sivustoja [8] – [10]. Mutaatio on vaihtoehtoinen mekanismi miRNA sääntelyn purkamista syövän ympäristössä, jolloin mutaatio voi muuttaa miRNA transkriptio, käsittelyä tai miRNA-mRNA vuorovaikutusta. Tämä mekanismi kuvasi ensimmäisenä Calin

et al.

[8], joka tunnistaa ituradan vaihtelu

HSA-miR-16-1

joka oli yhdistetty herkkyys krooninen lymfaattinen leukemia. Sen jälkeen, ituradan polymorfismien miRNA-geenit on liittynyt alttiutta muihin syöpätyyppeihin [11]. Huolimatta olettamusta, että miRNA voivat toimia perinteisen onkogeenien tai tuumorisuppressorien, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että somaattinen mutaatio miRNA ovat harvinaisia ​​ja ne, jotka on ilmoitettu osoittaa vähän vaikutusta miRNA toimintaa [10], [12] – [14] . Kuitenkin suurin osa näistä tutkimuksista ovat suosineet kandidaattigeeni lähestymistavan ja tähän mennessä, un-puolueellinen arvion esiintyminen somaattisten muutosten miRNA geenien tahansa syöpätyypin puuttuu.

Analogisesti mutaatiot ilmenevät miRNA siemen alueet, mutaatiot ilmenevät kohde-mRNA-sekvenssi voi muuttaa sitovaa ja myöhemmät miRNA-riippuvaista geenin ilmentymisen säätelyyn. Vaikka ituradan solumuutokset miRNA sitoutumiskohdat 3′-UTR voi myötävaikuttaa syöpään alttiuteen [11], [15] – [17], raportit somaattisten mutaatioiden esiintyy vastaavassa tilanteessa on rajoitettu yhteen tapausselostus [13] ja on vielä olla tutkittu laajoissa kasvain ikäluokat. Jos somaattiset mutaatiot eivät tapahdu miRNA sitoutumiskohdista, se merkitsisi aiemmin tuntemattomassa geneettinen mekanismi repression tai aktivaation syöpään liittyvän mRNA.

Aberrant miRNA aktiivisuus liittyy usein patogeneesiin ja etenemiseen epiteelin munasarjasyöpä yleisin muoto munasarjojen maligniteetti. MiRNA profilointi tutkimuksissa johdonmukaisesti tarkkailla maailmanlaajuinen vaiennettu miRNA ilmaisun munasarjakasvainten, joka on osaltaan osittain genomista menetys ja epigeneettiset muutokset [10], [18] – [22]. Samoin ilmaus monia tunnettuja ja otaksuttu syöpä geenien väärin säädellystä munasarjasyövän, esimerkiksi

BRCA2

, joille vain osa havaitun menetyksen ilmaisun voidaan katsoa mutaatio, ja promoottori metylaatio ei noudateta [ ,,,0],23]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että taajuus somaattisten mutaatioiden 10 syöpää sekaantunut miRNA on alhainen ovarioiden [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme laajentaa tätä analyysia kattavasti luonteenomaiset somaattiset mutaatiot 712 miRNA geenien käyttäen massiivisesti rinnakkaisen suunnattu uudelleen sekvensointi. Lisäksi olemme seulotaan 3′-UTR 18 ehdokkaan syövän geenien kanssa tavoitteena on tunnistaa somaattisten mutaatioiden, jotka muuttavat ennustettu miRNA sitoutumiskohtia. Vaikka nämä geenit ovat usein sekaantuneet kasvaimia prosessissa, koodaus mutaatioita, metylaatio tai kopioluvun muutoksia vain osuus osajoukon ilmaisun erot nähdään munasarjojen kasvaimia.

Tulokset ja keskustelu

Somaattiset mutaatiot kohdistaminen microRNA geenit harvinaisia ​​tapahtumia munasarjakasvaimia

sen tutkimiseksi, mutaatioita miRNA geenit edistävät muuttunut miRNA toimintaa munasarjasyövän, 86 ensisijainen epiteelin munasarjojen kasvaimia arvioitiin somaattisten mutaatioiden genomialuetta vastaa esiastetta tai kypsä miRNA sekvenssit. Kliiniset ominaisuudet näistä tapauksista on esitetty taulukossa S1. Kohdennettu seuraavan sukupolven sekvensoinnin avulla arvioitiin 712 miRNA geenien selityksineen vuonna Sanger miRNA tietokannan (versio 13.0, maaliskuu 2009). Seuraavat tiedot linjaus, 95% kohdennettujen emäksiä sisällä 712 miRNA geenit oli vähintään 10-kertainen järjestyksessä kattavuus, ja vastaava keskimääräinen kattavuus 92-kertaiseksi. Suodatus poistaa ituradan variantit havaitaan vastaaviin normaaleihin lymfosyyttien DNA ja validointi tavanomaisilla sekvensoinnilla tunnistettiin somaattisia mutaatioita 5 miRNA geeneistä:

HSA-miR-10a

,

HSA-miR-622

,

HSA-miR-767-5p

,

HSA-miR-888

ja

HSA-miR-1280

(kuvio 1). Kaiken somaattiset mutaatiot havaittiin 6% (5/86) kasvaimissa ja alle 1% (5/712) ja miRNA geenien analysoitu ilman miRNA geenien toistuvasti kohteena mutaatio. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien mutaatiot kypsä miRNA olivat melko harvinaisia; vain yksi mutaatio sijaitsi kypsän alueen

HSA-miR-767-5p

(mutta ulkoinen siemenen alue), kun taas loput neljä tapahtunut esiasteen hiusneula. Tämä data on yhtäpitävä aikaisempien pienemmissä tutkimuksissa viittaa siihen, että somaattiset mutaatiot miRNA geenit ovat epätavallisena tapahtumana Tuumorinäytteissä [8], [12], [14], [24], [25].

kasvain spesifisiä mutaatioita on merkitty mustat palkit suhteessa kypsään microRNA (valkoinen laatikko) ja esiaste microRNA (harmaa laatikko) sekvenssit. Sijainnit mutaatioiden raportoidaan suhteessa seuraavien edeltäjä microRNA selostukset:

HSA-miR-10a

NR_029608.1;

HSA-miR-622

NR_030754.1;

HSA-miR-767-5p

NR_030409.1;

HSA-miR-888

NR_030592.1;

HSA-miR-1280

NR_031703.1.

Mirna biogeneesin on monivaiheinen prosessi aloitetaan RNA-polymeraasi II-välitteisen transkription, jota seuraa RNaasi III riippuvaisen trimmaus osaksi hiusneula väli- ja myöhemmin pilkkominen toimivaksi kypsä miRNA [1], [26]. Tämä prosessi on riippuvainen jaksoryhmittymät ja RNA sekundaarisen rakenteen elementit ensisijainen ja esiaste miRNA-molekyylit [26]. Sinänsä mutaatiot syntyvät esiaste alueet voivat muuttaa RNA sekundaarirakenteissa ja siten estää jalostamista kypsä miRNA. Sen määrittämiseksi, onko RNA rakenteelliset muutokset voivat johtua somaattisten miRNA mutaatiot tunnistetaan, käytimme RNAfold ohjelmaa [27] ennustaa vakain sekundaarirakenteen sekä villityypin ja mutantti-sekvenssit. Konformaatiomuutoksiin oli ennustettu mutantti

HSA-miR-622

,

HSA-miR-767-5p

ja

HSA-miR-1280

(kuva S1). Kuitenkin konformaatiomuutoksia ennustettu

in silico

harvoin merkitse fysiologista vaikutusta [12] ja funktionaalinen seuraus mutaatioista tunnistettu täällä vaatii lisätutkimuksia, joissa

in vitro

määrityksissä.

toisin kuin usein havainto kasvaimeen vaihtelut vaikuttavat aktivoinnin tai tukahduttamisen proteiinia koodaavan geenien syöpää, nämä havainnot osoittavat, että somaattiset mutaatiot miRNA geenit aikana epätavallisena tapahtumana munasarja- synnyssä ja lisää kertyy todisteita useista kasvain tyypit viittaa siihen, että miRNA harvoin väärin säädellystä tällä mekanismilla. Koska suuri määrä mRNA tavoitteita ennusti yhden miRNA ja moninaiset roolit ennakoidut kohdegeenien, mitään somaattinen mutaatio miRNA geenin (ja erityisesti esiintyvien siemenen sekvenssi) vaikuttavat todennäköisesti monia biologisia polkuja [2], [3], joista osa voi olla mukana ylläpitää solun homeostaasin. Näin ollen vaikka somaattisesti mutatoitunut miRNA geeni muuttunut mRNA ilmentymisen vaikuttaa positiivisesti kasvain säilymiseen, on todennäköistä, että siellä olisi useampia geeniekspression muutoksia, jotka eivät olisi edistä kasvainsolun eloonjäämistä. Toisaalta tietyissä tilanteissa, mRNA: n transkription repression voi aiheuttaa toiminta useiden miRNA [28], ja siten, muuttuneen toiminnan yhden miRNA voi olla riittämätön johtaa biologisen vaikutuksen. Lopuksi on yhä enemmän tunnustettu, että miRNA muutoksia havaittu syövän kudoksissa voi esiintyä toissijainen vikoja osien miRNA koneet, kuten transkriptiotekijät ja chromatin remontin säätelevien geenien miRNA transkriptio sekä komponenttien miRNA posttranskriptionaalisella asetuksen [29 ], [30]. Ovarioiden,

DICER1

ja

EIF2C2

(Argonaute2) DNA kopiomäärä voitot on havaittu 24,5% ja 51,5% kasvaimista vastaavasti [9] ja mediaani kokonaiselinaika vähenee naisilla, joiden kasvaimet ovat pienemmät

DICER1

ja

DROSHA

mRNA ilmaisun [31]. Lisätutkimuksia tarvitaan vahvistaa, että on tärkeää muutoksia näihin ja muihin komponentteihin miRNA biogeneesin väylän patogeneesissä munasarjasyöpä.

Somaattiset mutaatiot kohdistaminen 3′-alueet ovat harvinaisia ​​tapahtumia munasarjakasvainten

tutkimaan mahdollisuutta, että somaattiset mutaatiot ilmenevät 3′-UTR syövän geenien muuttaa olemassa miRNA sitoutumiskohta, ja siten merkitsevät uutta mekanismia poikkeavan mRNA: n geenin ilmentymistä syövän, me sekvensoitiin 3′-UTR-alueet 11 onkogeenien (

AKT2

,

BRAF

,

CCNE1

,

CTNNB1

,

EGFR

,

ErbB2

,

FGF1

,

KRAS

,

MYC

,

PIK3CA

ja

RAB25

) kohdennettuja uudelleenjärjestely-in 86 munasarjojen kasvaimia. Kun kyseessä on onkogeenin, kumoaminen on miRNA sidoskohdan voi sallia sääntelemättömien onkogeenin ilmentymisen. Lisäksi 3′-UTR 7 tuumorisuppressorigeeneille (APT) (

BRCA1

,

BRCA2

,

CDKN2A

,

PTEN

,

RB1 ​​

,

SPARC

ja

TP53

) on myös sekvensoitiin arvioida yleisyydestä somaattisista mutaatioista, jotka tuottavat

de novo

miRNA sitoutumiskohta ja tulos in TSG alassäätöä. Nämä geenit ovat tunnustettu Cancer Gene Census olevan syy osallisena munasarjakasvain kehittämiseen joko somaattisen mutaation, geenimonistuksen tai poistamista [32].

FGF1

,

RAB25

ja

SPARC

valittiin perustuen niiden osoitettiin toiminnallista roolia munasarjasyöpä [33] – [37]. 3′-UTR sekvensoitiin 108-kertaisesti tarkoittaa kattavuus ja yli 99%: n kohdennettujen emäkset näillä alueilla katettiin 10 tai enemmän sekvenssin lukee. Kasvain-mutaatioita oli harvoin tunnistettu 3′-UTR munasarjasyövän näytteet: 4/86 kasvainnäytteet kukin tunnistettu mutaatio johonkin neljästä eri onkogeenien (

AKT2

,

CTNNB1

EGFR

ja

erbB2

) (taulukko 1), jossa ei ole mutaatioita havaittu 7 APT tutkittu.

In silico

miRNA tavoite Ennustusalgoritmien mukaan mutatoidut lokuksen

AKT2

,

CTNNB1

ja

ErbB2

voi esiintyä alueella ennustetun miRNA sitova sivusto, jossa kaksi mutaatiota, c. * 538T A (

CTNNB1

) ja c. * 460g C (

ErbB2

) vaihdot, ennustetaan esiintyä siemen jono

HSA-miR-630

ja

HSA-miR-640

sitova vastaavasti. RNA ilmentymisen profilointi oli käytettävissä näytteiden mutaatioita

AKT2

ja

EGFR

ja osoittanut, että transkriptin tasot näiden geenien ei muuttunut näytteiden somaattisten 3′-UTR mutaatiot suhteessa muihin kasvain näytettä samasta munasarjojen alatyypin (kuva S2).

Vaikka tiedetään, että miRNA voi myös antaa transkription repression toimin 5′-UTR mRNA tavoite, tämä tutkimus tarjoaa alustavaa näyttöä siitä, että somaattiset mutaatiot muuttamalla miRNA sitoutumiskohtien 3′-UTR yleisin syöpä geenit ovat harvinaisia ​​epiteelin munasarjojen kasvaimia. Tehokas translaation hiljentäminen voi vaatia synergistisen toiminnan miRNA useisiin kohtiin poikki UTR, joko yhden perheen MikroRNA tai yhdistämällä liity MikroRNA, ja siten yhden somaattiset mutaatiot tunnistettiin tässä todennäköisesti riitä vaientaa vastaaviin transkriptio [28] , [38]. Somaattiset mutaatio esiintyvyys 3′-UTR alueilla ehdokas syövän geenien sekven- oli 1,43 mutaatioita per Mb. Vertailun vuoksi mutaatio esiintyvyys proteiinia koodaavat alueet tunnettujen syövän geenien tässä kasvain kohortissa on 570,57, 183,60 ja 32,63 mutaatioiden per Mb varten

TP53

,

KRAS

ja

PIK3CA

vastaavasti, kun taas arvioitu mutaation esiintyvyys koodaus exome on 2,4 mutaatiota per Mb ovarioiden [23]. Näin ollen on todennäköistä, että alhainen mutaation 3’UTRs verrattuna eksonit osoittaa, että suurin osa mutaatioiden 3′-säätelyalueita, jotka identifioidaan tässä esiintyy sivullisen tapahtumia kasvaimen solujen kehitystä.

Yhteenvetona, somaattiset mutaatiot miRNA geenit harvoin munasarjakasvaimia ja ovat siten todennäköisesti selittää muuttuneen miRNA aktiivisuuden havaittu tässä kasvaimen tyyppi. Lisäksi tarjoamme alustavaa näyttöä siitä, että valinta somaattisten mutaatioiden 3′-UTR ehdokas syövän geenien, joka olisi n oletetaan häiritä miRNA riippuvainen geenisäätelyn, ei todennäköisesti edustavat yhteistä mekanismia muuttunutta mRNA: n ilmentymisen munasarjojen kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Karttuminen ja käyttö potilaan aineistoa tätä tutkimusta varten hyväksyttiin seuraavalla Human Research Ethics valiokunnat: Southampton Hospital Human Research eettiselle toimikunnalle, Peter MacCallum Cancer Centre Human Research Ethics komitea, Queensland Institute of Medical Research Human Research Ethics komitea, University of Melbourne Human Research Ethics komitea, Westmead sairaala Human Research Ethics komitea. Kaikki henkilöt antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen käytöstä niiden kudoksen tutkimukseen. Hanke hyväksynyt Peter MacCallum Cancer Centre Human Research Ethics Committee (hyväksyntä # 09/29).

Munasarjojen kasvain kohortti

86 ensisijainen epiteelin munasarjojen kasvain otettiin kudosnäytteet läpi Peter MacCallum Cancer Center Tissue Bank, Australia munasarjasyöpä Study tai potilailla, sairaaloihin etelä-Englannissa [39]. Kaikki kasvaimen DNA-näytteet microdissected varmistaa suurempi kuin 80% epiteelisolujen komponenttia. Tämä kasvain kohortti käsitti seoksen vakavien (n = 45), endomet- (n = 28), mucinous (n = 7) ja selkeä solujen (n = 6) alatyyppejä. Yhteensopiva perifeerisen veren näytteitä kerättiin myös kaikki potilaita, joilla on tuumorin keräämistä ja käytettiin lähteenä ituradan DNA.

soveltuva alue tunnistamisen suunnattu seuraavan sukupolven sekvensointi

3′-UTR 18 proteiinia koodaavan geenit valittiin somaattisen mutaation seulontaan. Genome koordinaatit valituille 3′-UTR tunnistettiin perustuen niitä selityksin vuonna Ensembl tietokannassa (release 54) seuraaville selostukset:

AKT2

(ENST00000392038),

BRAF

(ENST00000288602)

CCNE1

(ENST00000262643),

CTNNB1

(ENST00000349496),

EGFR

(ENST00000275493 ja ENST00000344576),

erbB2

(ENST00000269571),

FGF1

(ENST00000359370),

KRAS

(ENST00000256078),

MYC

(ENST00000259523 ja ENST00000377970),

PIK3CA

(ENST00000263967),

RAB25

(ENST00000361084),

BRCA1

(ENST00000309486),

BRCA2

(ENST00000380152),

CDKN2A

(ENST00000304494),

PTEN

(ENST00000371953),

RB1 ​​

(ENST00000267163),

SPARC

(ENST00000231061) ja

TP53

(ENST00000269305). Genominen koordinaatit ihmisen esiaste miRNA saatiin Sanger-instituutin miRBase (release 13,0, maaliskuu 2009) [40], [41], mukaan lukien 548 yksittäiset miRNA geenejä sekä 164 miRNA sisällä 62 miRNA klustereita. Kaikki koodaus eksonit

TP53

,

KRAS

ja

PIK3CA

olivat mukana sekvenssianalyysillä.

Kirjasto valmistelu ja kohde rikastamiseen

200 ng kasvain tai vastaaviin normaaleihin lymfosyytin DNA fragmentoidaan satunnaisesti noin 200 bp (Covaris, Woburn, MA) ja lopussa korjaus- ja A-pyrstön suoritettiin Illumina genomisen DNA-kirjaston valmistamiseksi protokollan (Illumina, San Diego, CA). Tämän jälkeen DNA ligoitiin yksi 7 mukautetun multiplexing adapterit yhteensopiva Illumina yhden pää sekvensointi. Indeksoitu DNA-näytteet yhdistettiin yhtä ennen PCR rikastamiseen. Kaikkien käytettävien reagenssien aikana kirjaston valmistelu saatiin New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA). Boutique eksonin talteenotto (SureSelect, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) käytettiin erikseen rikastamiseksi valittu 3′-UTR-alueet, miRNA ja koodaus eksonit syövän geenien genomisten DNA-kirjastojen ennen seuraavan sukupolven sekvensointi. Sieppauskoettimien suunniteltiin käyttäen oletusparametrejä toimittamalla genomista koordinaatit ja eArray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Liuoshybridisaatio, pesu, eluutio ja monistus suoritettiin mukaisesti suosittelemaa menetelmää.

Somaattiset mutaatiot analyysi Illumina GAIIx sekvensointi ja kapillaarielektroforeesilla

Target rikastetun DNA-kirjastot sekvensoitiin Illumina GAIIx, tuottaa 75 ep yhden pään sekvenssi lukee. Kuva-analyysi ja pohja calling suoritettiin käyttäen genomista analysaattorin Pipeline v1.6. Sequence lukee rinnastettiin ihmisen viite genomin (GRCh37 /hg19 kokoonpano) käyttämällä BWA ja loput unmapped lukee olivat linjassa Novoalign ohjelmistojen [42]. Tätä seurasi paikallisten uudelleensuuntausta kanssa GATK [43]. Pistemutaatiot ja insertioita /deleetioita (indeleitä) tunnistettiin käyttäen GATK ja Dindel [44] vastaavasti ja selityksin tiedoilla Ensembl release 56. Vain mutaatiot miRNA selostukset selityksin in miRBase katsottiin lisäanalyysiä.

pistemutaatiot ja indeleitä tunnistettiin somaattisia muutoksia vain, kun (

i

) variantti ei kutsuttu sovitetussa normaalissa näytteessä tai tunnistettu ituradan muutos toisessa kasvain /normaali pari (

ii

) variantti ei nähty 2%: ään sovitetun normaalissa näytteessä seuraava manuaalinen tarkastus järjestyksessä lukee käyttämällä Integrated Genomics Viewer [45] (

iii

) variantti tunnistettiin vähintään neljä ainutlaatuista järjestyksessä lukee jossa on vähintään kaksi kartoitus eteenpäin ja kaksi kartoitus päinvastaisessa suunnassa.

Kaikki mutaatioita, jotka täyttivät edellä mainitut kriteerit alistettiin validointi tavanomaisilla PCR-monistus ja kaksisuuntaisen kapillaarielektroforeesilla annetun ABI3130 Genetic Analyser käyttämällä BigDye Terminator v3 0,1 sekvensointi kemia (Applied Biosystems, Foster City, CA).

tunnistaminen miRNA-sitoutumiskohtien

TargetScan (release 5.2) [46], mikrokosmos Targets (versio 5) [40 ], DIANA-MicroT (versio 3.0) [47], [48] ja Miranda (release elokuu 2010) [49] ennustavan algoritmeja käytettiin sen määrittämiseksi, somaattiset mutaatiot havaitaan mRNA 3’UTRs tapahtui miRNA sitoutumiskohtia. MirSVR pisteet kynnyksen alle -0,1 ja vähintään taitto energian pisteet kynnystä pienempi tai yhtä suuri kuin -16 kcal /mol käytettiin Miranda algoritmia. Oletus parametrejä käytettiin kaikille muille algoritmeja.

tukeminen Information

Kuva S1.

Ennustettu sekundaarinen rakenne muuttuu seurauksena somaattisten mutaatioiden miRNA selostukset. Aikuinen sekvenssit varjostaa ja mutatoitunut pohja nuolenpää osoittaa (a)

HSA-miR-622

, (b)

HSA-miR-1280

ja (c)

HSA -miR-767-5p

. Esiaste miRNA sekvenssi plus 50 emäsparin reunustavien esiaste 5′- ja 3 ’päissä käytettiin ennustamaan toisen rakenne pienin vapaa energia, jonka RNAfold ohjelmassa [29] avulla oletusparametrit.

Doi: 10,1371 /journal. pone.0035805.s001

(PDF) B Kuva S2.

AKT2

ja

EGFR

mRNA: n ekspressio ei muutu, kun läsnä on 3′-transloimaton alue somaattisista mutaatioista suhteessa muihin munasarjojen näytettä samasta alatyypin. (A)

AKT2

ilmentyminen endomet- kasvaimissa, kuten näyte P1768 jossa

AKT2

c. * 892C T somaattinen mutaatio (merkitty punaisella). mRNA: n ilmentymisen profilointi tiedot on saatu Tothill

et al.

[50].

AKT2

ilmaisun anturi asetetaan 225471_s_at ja 226156_at näkyvät. (B)

EGFR

ilmentyminen endomet- kasvaimissa, kuten näyte IC151 jossa

EGFR

c. * 101C G somaattinen mutaatio (merkitty punaisella). mRNA ilmaisu profilointitiedot saatiin Ramakrishna

et al.

[51]. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0035805.s002

(PDF) B Taulukko S1.

Kliinisten tekijöiden munasarjakasvaimia sekvensoitiin somaattisten mutaatioiden microRNA geenien ja ehdokas 3′-alueilla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0035805.s003

(XLS) B

Kiitokset

Kiitämme yhteistyötä toimielinten Australiassa osallistuvat Australian Munasarjojen Cancer Study (AOCS). Olemme myös tunnustaa panos AOCS tutkimuksen sairaanhoitajien, tutkimusavustajia Kaikki kliiniset ja tieteelliset yhteistyökumppanit ja kiittää kaikkia naisia, jotka osallistuivat AOCS. Jäsenet Australian munasarjasyövän Study Group, yhteistyökumppanit ja sairaalat osallistuvat AOCS löytyvät https://www.aocstudy.org.

Australian munasarjasyöpä Study Group: David Bowtell (Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia), Georgia Chenevix-Trench (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Adele Green (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Penny Webb (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Anna DeFazio (Westmead Institute for Cancer Research, Westmead Millennium Institute, Westmead, New South Wales, Australia), Dorota Gertig (Victorian Kohdunkaulan Sytologia Registry, Carlton South, Victoria, Australia).