Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Regulatory T-solut (Treg) ilmentävät transkriptiotekijä forkhead-box proteiini P3 (Foxp3) on tunnistettu torjumiseksi kasvaimen vastaisen immuunivasteen aikana syövän etenemiseen. Sitä paitsi, Foxp3 esittelemän syöpäsoluja itsessään voi myös antaa heille mahdollisuuden kiertää mistä efektori-T-soluvasteita, jolloin eloonjäämishyötyä kasvain. Peräsuolen syöpä (CRC) kliinistä merkitystä Foxp3 ei ole arvioitu yksityiskohtaisesti. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää sen vaikutus kolorektaalisyövässä (CRC).

menetelmät ja havainnot

Gene ja proteiinin analyysi kasvaimen kudoksissa potilailla, joilla on CRC suoritettiin määrällisesti ilmaisun FOXP3 kasvaimen soluttautua Treg ja koolonkarsinoomasoluissa. Tulokset korreloivat kliinis parametrien ja potilaiden eloonjäämiseen. Serial morfologinen analyysi osoitti Foxp3 ilmaistaan ​​syöpäsoluja. Korkea Foxp3 ilmaus syöpäsolujen oli yhteydessä huonoon ennusteeseen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen Foxp3 ilme. Sen sijaan matalan ja korkean Foxp3 tasolla kasvaimen soluttautua Treg soluja ei aiheuttanut merkitseviä eroja yleistä elossaololuku.

Johtopäätökset

havainnot viittaavat vahvasti siihen, että Foxp3 ilmaisu välittämä syöpäsolujen sijaan Treg solut edistävät taudin etenemistä.

Citation: Kim M, Grimmig T, Grimm M, Lazariotou M, Meier E, Rosenwald A, et al. (2013) Expression of Foxp3 kolorektaalisyövässä mutta ei Treg soluissa korreloi taudin etenemistä potilailla, joilla on peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10,1371 /journal.pone.0053630

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 07 marraskuu 2011; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 30 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tunnistaminen CD4 + CD25 + T sääntelyn solujen ( Treg) on ​​osoitettu keskeinen rooli ylläpitää immunologinen toleranssi. Transkriptiotekijän forkhead laatikko proteiinia P3 (Foxp3) on todettu olevan avainasemassa Treg funktio ja on obligatorinen markkeri CD4 + CD25 + Treg [1]. Joitakin alaluokkia Treg kohdistavat tukahduttava vaikutus ilmentämisen kautta immunosuppressiivisten sytokiinien, kuten interleukiini (IL) -10 ja transformoiva kasvutekijä (TGF) -β [2], [3]. Korkea tiheys kasvaimen soluttautua Foxp3 + Treg kasvaimen näyte on yhteydessä huonoon lopputulokseen erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien munasarja- [4], haiman [5], ja maksasyövän [6]. Nämä havainnot viittaavat keskeinen rooli Treg eri kasvaimen yhteisöjä. Täten kohdistaminen Treg voi olla tärkeä vaikutus immunotherapeutic syöpälääkkeen strategioita ja kliininen tulos syöpäpotilaiden [7].

Treg epäillään vähentää T-solujen aktiivisuutta, mutta ei tiedetä, onko läsnäolo Treg voi vaikuttavat kliinisen ja kasvainten liittyvistä potilaiden selviytymiseen CRC. Prognostisia merkitys Treg havaitseminen potilailla, joilla on rajallinen ja edennyt sairaus pysyy yhä kiistanalainen. Tähän mennessä harvat tutkimukset ovat analysoineet soluttautuminen Treg CRC käyttäen Foxp3 + värjäystä. Tuore tutkimus osoitti, että Treg tiheys oli suurempi paikallisesti rajoitettu kuin etäpesäkkeitä, mutta ei ollut yhteydessä selviytymisen CRC potilaiden [8]. Toisin kuin löydökset useimmissa muissa ihmisen karsinoomien, mitään merkittävää suhdetta absoluuttinen määrä Foxp3 + soluttautua T-solujen ja ennuste oli nähtävissä useissa tutkimuksissa CRC potilaita. Lisäksi jotkin muut tutkimukset viittaavat siihen, että korkean taajuuden kasvaimen soluttautua Foxp3 + Treg liittyy suotuisa ennustetta CRC [9].

Uudempia kliiniset tiedot keuhko [10], rintojen [11], [12] haiman [13], hepatosellulaarinen [14], ja virtsarakon syöpä [15] sekä melanooma [16] säädetty ensin näyttöä Foxp3 ilmaisun myös kasvainsoluissa. Kuitenkin biologista merkitystä FOXP3 ilmentymisen syöpäsoluissa sairastavien potilaiden CRC edelleen tuntematon. Erityisesti panos Foxp3 ilmaisun liittyvät kasvainsoluihin verrattuna ilmentymisen liittyvät Treg kliinisissä CRC ei ole tutkittu tähän mennessä. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida Foxp3 ilmaisun välillä kasvaimen soluttautua Treg ja syöpäsolujen potilailla, joilla CRC eri vaiheissa taudin sekä syrjiä sen ennustetekijöitä merkitystä pitkällä aikavälillä.

Tulokset

Detection CD4, CD25, Foxp3 ja immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β geenien RT-qPCR ja immunohistokemiallista analyysiä

analysoida, CD4, CD25, Foxp3, IL-10, ja TGF-β ilmentymistä CRC voi liittyä kliinisiin kasvaimen etenemistä selvitettiin kasvainten rajoitettu tauti (UICC I /II) ja kehittyneiden tauti (UICC III /IV). RT-qPCR-analyysi osoitti, kasvoi merkittävästi geeniekspression CD4 ja CD25 rajoitettu taudin kasvaimet (UICC I /II) verrattuna kasvainten pitkälle tauti (UICC III /IV). Mukaisesti tämän havainnon geenin Foxp3: n ilmentyminen, ja immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β väheni huomattavasti rajoitettu taudin kasvaimet (UICC I /II) verrattuna pitkälle tauti (UICC III /IV) (

Kuva

1A

).

(A) Runsaasti lisää geenin ilmentymistä CD4 ja CD25 vaiheessa UICC I /II verrattuna kasvaimiin vaiheessa UICC III /IV. Geeniekspressiota Foxp3, IL-10, ja TGF-β pieneni merkitsevästi vaiheessa I /II kuin niitä on UICC III /IV. Normalisoituminen suoritettiin normaalia kudosta. Suhteellinen määrällisesti arvo, kertainen ero, ilmaistaan ​​2

-ΔΔCt. * P 0,001. (B) Foxp3 +, IL-10 +, ja TGF-β + ilmentäviä syöpäsoluja kasvoi UICC I /II UICC III /IV verrattuna normaaliin kudokseen. Tulos värjäytyminen ilmaistiin prosentteina (%) positiivisuutta. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD; kaikki pareittain testit (Tukey) johtaa p 0,001 lukuun ottamatta valvonnan vs. UICC I /II Foxp3

+ (p 0,050).

Seuraavaksi tutkimme ilmaus Foxp3 ja immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β syöpäsoluissa. Kuten on esitetty

Kuva

1B

, Foxp3 +, IL-10 +, ja TGF-β + ilmentäviä syöpäsoluja kasvoi aikaista loppuvaiheissa tauti verrattuna normaaliin kudokseen. Foxp3

+ ilmentäviä syöpäsoluja löydettiin 60 ulos 65 kasvaimen tapauksista (n = 60/65, 92,3%). Lisäksi olemme värjättiin 36 koko 65 tapauksessa, jossa eri anti-Foxp3-vasta-ainetta (klooni 2481) ja vahvisti tulokset (tuloksia ei ole esitetty).

immunohistokemiallinen analyysi CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, ja immunosuppressiivisten sytokiinien IL -10+ ja TGF-β + in Treg

ensi tutkinut Treg ja syöpäsolujen yksityiskohtaista ilmentymisen analyysi Foxp3, IL-10, ja TGF-β immunohistokemiallisesti. Ensin tarkasteltiin ilmentymisen CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, ja immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β in Treg. Kuten on esitetty

Kuva

2A

, lisääntynyt CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, IL-10 +, ja TGF-β + ilmentymistä havaittiin vähäinen sairaus, kasvaimet (UICC I /II) verrattuna edistyneeseen tautiin kasvaimia (UICC III /IV) ja normaalia kudosta. Kaiken Foxp3 + ilmentävät Treg eri määrinä havaittiin 61 ulos 65 kasvainten potilaista (n = 61/65, 93,8%). Immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys osoitti, että Foxp3 + Treg olivat CD4 + T-solujen fenotyyppiä (

Kuva

2B

). Vain hyvin pieni osa alle 5% soluista havaittiin edustavat CD8 + T-solujen alaryhmästä ilmentävät Foxp3 (tiedot

ei esitetty

).

(A) Lisääntynyt CD4 +, CD25 +, Foxp3 + , IL-10 +, ja TGF-β + ilmentymisen vaiheessa UICC I /II kuin niitä on UICC III /IV. Tulos värjäytyminen ilmaistiin prosentteina (%) positiivisuutta. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Kaikki pareittain kokeet johtavat p 0,001 kolmea poikkeusta lukuun ottamatta: Foxp3

+, ohjaus vs. UICC III /IV, p = 0,091; IL-10

+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,021; TGF-ß

+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,020. (B) Havaintoesimerkki immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys Foxp3 + ja CD4 + in Treg. Foxp3 ilmentymistä pääasiassa havaittiin CD4 + Treg (nuoli) (x 400 suurennos). FITC, vihreä Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin punainen, ja DAPI 4 ’, 6-diamino-2- phenylindoldihydrochlorid blue – ydin- counterstaining.

Gene ja proteiinin analyysi FOXP3 ilmentymisen syöpäsoluissa sairastavien potilaiden CRC ja ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa RT-qPCR, immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys ja virtaussytometria

Ensimmäinen osoitimme Foxp3 ilmentymistä syöpäsoluissa sairastavien potilaiden CRC käyttäen immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäystä (

Kuva

3

). Vahvista Foxp3 ilmentymistä tuumorisoluissa suoritimme RT-qPCR, FACS-analyysi ja immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys analyysit eri ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa (SW480, SW620 ja HCT-116). Kuten osoitettiin FACS 3,8%: sta 6,1%: n syöpäsolujen ilmaistu todellakin Foxp3 (

Kuva

4A ja B

).

G

eeni analyysi RT-qPCR vahvisti sen ilmentyminen (suhteellinen ilmentyminen solulinjoissa vaihteli 1,76 ja 2,08,

Taulukko

1

).

Havaintoesimerkki immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys, joka osoittaa Foxp3 ilmaisun ja EPCAM costaining syöpäsoluissa sairastavien potilaiden CRC (x 100 suurennus edellä × 400 suurennus alla). FITC, vihreä Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin punainen ja DAPI 4 ’, 6-diamino-2- phenylindoldihydrochlorid blue – ydin- counterstaining.

(A) Virtaussytometria määritys FOXP3 ilmaisun SW480, SW620, ja HCT-116 koolonsyöpäsolulinjoissa verrattuna isotyyppikontrolli. 3,8%: sta 6,1% koolonkarsinoomasoluissa express Foxp3; PE: fykoerytriini; FS: sirontamittari lineaarinen. (B) Edustavia esimerkkejä immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäyksen Foxp3 + ilmaisun SW480, SW620 ja HCT-116 syöpäsoluja. Cy3, indocarbocyanin punainen ja DAPI 4 ’, 6-diamino-2- phenylindoldihydrochlorid blue – ydin- counterstaining (× 400 suurennus).

Korrelaatio Foxp3 + syöpäsolujen kanssa ilmaus immunosuppressiivisten sytokiinien IL -10 ja TGF-β

tutkittava ilmaus immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β vastasivat Foxp3 + ilmentävien syöpäsolujen me kerrostunut kahteen eri ryhmään sen mukaan prosenttiosuudet ilmaisun immunohistokemiallinen analyysi. Ottaen huomioon Foxp3 + ilmentymistä syöpäsoluissa jatkuvana muuttujana, regressioanalyysi osoitti, että Foxp3 + syöpäsolujen ilmentyminen oli heikko, mutta merkittävä suoraa korrelaatiota ilmentymisen immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 (R

2 = 0,23, p 0,001, n = 65; r = 0,48) ja TGF-β (R

2 = 0,33, p 0,001, n = 65; r = 0,57) (

Kuva

5A ja B

) .

(A /B) Merkittävä korrelaatio Foxp3 + syöpäsolun ilmentymisen kanssa IL-10 (A) ja TGF-β (B). Taantumisanalyysi; R

2, determinaatiokertoimen. (C /D) Havaintoesimerkki immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys IL-10 + (C) ja TGF-β + (D) Foxp3 + syöpäsoluissa (nuolet). FITC vihreä Fluoresceinisothiocyanate, Cy3 punainen ja DAPI 4 ’, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blue – ydin- counterstaining.

Immunofluoresenssi kaksinkertainen värjäys osoitti ilmentymisen immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 ja TGF-β in Foxp3 + ilmentävien syöpäsolujen (nuolet) (

Kuva

5C ja D

).

Korrelaatio Foxp3 + Treg kanssa Foxp3 + syöpäsolujen

tutkia Foxp3 + Treg ilmentyminen vastasi Foxp3 + syöpäsolun ilmaisua, me ositettu kahteen eri ryhmään sen mukaan prosenttiosuudet ilmentymisen immunohistokemiallinen analyysi. Ottaen huomioon Foxp3 + syöpäsolujen ilmentymisen jatkuvana muuttujana, regressioanalyysi osoitti, että Foxp3 + syöpäsolujen ilmaisu oli heikko, mutta merkittävä käänteinen korrelaatio Foxp3 + Treg lauseke (R

2 = 0,17, p = 0,01, n = 65; r = -0,41) (

Kuva

6A

). Immunohistokemia osoittivat lisääntynyttä Foxp3 + Treg ilmentymistä Foxp3 negatiivinen syövän strooman kudoksen (nuoli) (

Kuva

6B

). Sen sijaan ei ollut haitallista Foxp3 + Treg ilmaisun löytyy Foxp3 positiivisen syövän kudoksen (nuoli) (

Kuva

6C

).

(A) Merkittävä käänteinen korrelaatio Foxp3 + syöpäsolun ilmaisun kanssa Foxp3 Treg ilmaisua. Taantumisanalyysi; R

2, determinaatiokertoimen. (B) Lisääntynyt määrä Foxp3 + Treg in Foxp3 negatiivinen syöpäkudoksessa (nuoli). (C) ainoastaan ​​satunnaisesti tai ei Foxp3 + Treg in Foxp3 positiivisen syövän kudoksen (nuoli). DAB ruskea väri, Haemalaun sininen väri – ydin- counterstaining. Edustava esimerkki osoittaa alueen suurennoksilla x100 (vasemmalla) ja X200 (oikealla).

Kokonaiselossaoloaika

monimuuttuja Coxin regressioanalyysi suoritettiin vaiheittain kuten ikä, sukupuoli, primaarikasvaimen (paksusuolen tai peräsuoli), UICC (I /II tai III /IV), syvyys kasvaimen invaasion (T luokka 1/2 tai 3/4), erilaistumista (1/2 tai 3/4), imusolmuke etäpesäke (N luokka), Foxp3 (%), Treg (%), TGF-ß (%), ja IL-10 (%). Vaiheittaista menettelyä pidetään mallissa N-luokan ja Foxp3 ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa kuin ennustetekijöitä parametrit (Chi-quadrat tilastojen p 0,01,

Taulukko

2

).

univariate tuloksia käyttämällä Kaplan-Meier

tunnistetut ennustetekijöiden Cox regressiomallia on esitetty kuvioissa 7A ja C. keskiarvo Foxp3 + syöpäsolun ilmentymistä immunohistokemiallisella analyysi kaikille tutkittu kudosnäytteistä 65 kasvainten määritettiin 16%. Potilailla, joilla CRC, joilla korkea Foxp3 + syöpäsolun lauseke ( 16%) oli huonompi ennuste kuin ne, joilla on alhainen Foxp3 + ekspressiotasot ( 16%) (p 0,001, Log-Rank-testi) (

Kuva

7A

ja

Taulukko

3

).

(A) Potilaat, joilla on korkea Foxp3 + syöpäsolun lauseke ( 16%, kun keskimääräinen cut-off) oli huonompi ennuste kuin ne, joilla on alhainen Foxp3 + syöpäsolun ekspressioprofiileja ( 16%, keski cut-off: 16%), (p 0,001, Log-Rank-testi). (B) ei ole merkittävää eroa yleisen eloonjäämisen vertaamalla potilaalla on matala ja korkea Foxp3 + Treg ekspressioprofiileja (keskiarvo cut-off: 12%), (p = 0,202, Log-Rank-testi). (C) Potilaat, joilla imusolmuke etäpesäke oli huonompi ennuste kuin ilman imusolmuke etäpesäke (p 0,001, Log-Rank-testi). Ajat sensuroitu tiedot on merkitty lyhyitä pystyviivoja.

Kun otetaan huomioon immunohistokemiallista analyysiä näytteitä 65 kudosnäytteiden Foxp3 + Treg ilmaisu keskiarvo laskettiin 12%. Ei ollut mitään merkittävää eroa yleisen eloonjäämisen vertaamalla potilaalla on matala ja korkea Foxp3 + Treg ekspressiotasot ( 12% tai 12%) (p = 0,204, Log-Rank-testi) (

Kuva

7B

ja

Taulukko

3

).

potilailla, joilla ei imusolmuke etäpesäke oli merkittäviä eroja kokonaiselinaika verrattuna potilaisiin, joiden imusolmuke- etäpesäke (p 0,001, Log-Rank-testi) (

Kuva

7C

).

Muut parametrit, kuten TGF-ß, IL-10, UICC, ja T-luokan osoittivat lisäksi merkittäviä eroja kokonaiselossaoloaikaa vastaaville alemman ilmaisua ja luokittelu, vastaavasti (p 0,001, Log-Rank testit).

ikä, sukupuoli, primäärikasvain, ja histologinen eroavuus ei liittynyt ennusteen univariate analyysiin.

keskustelu

nykyinen tutkimus tarjoaa ensimmäistä kertaa todisteita merkittävästi lisääntynyt kasvaimeen liittyvää ilmentymistä transkriptiotekijä Foxp3 peräsuolen syöpäsoluja, joka liittyy kielteisiä ennusteeseen . Yksityiskohtaiset proteiinia ja geeni-analyysiä käytettiin tutkimaan sen ekspression profiileja kunkin tuumorikudoksessa potilaista. Joka perustuu äskettäin kuvattu kliiniset havainnot Foxp3 ilmentymistä syöpäsoluissa kasvainten, kuten keuhko-, hepatosellulaarinen ja virtsarakon syövän sekä melanooman ehdotimme, että kohonnut Foxp3 ekspressiotasoja, jotka eivät välttämättä liittyy Treg yksin, mutta myös syöpäsolujen [10 ], [14], [15]. Expression of Foxp3 syöpäsolujen ne voisivat downregulate efektori-T-soluvasteita suunnattu kasvain. Tämä antaisi kliinistä näyttöä tehokkaan mekanismin suoran kasvainperäinen kiertäminen immunologisen tuhoa CRC. Syrjimällä Foxp3 ilmentymistä syöpäsolujen soluttautumasta Treg ja korreloi eloonjäämiseen pitkällä aikavälillä seurannan tarjoamme uusia oivalluksia sen prognostisten merkitys.

Aikaisempien tutkimusten eri pahanlaatuisia sairauksia löysimme merkittävästi useammat soluttautua Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) kaikissa CRC näytteissä verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin [4] – [6], [17] – [20]. Kuitenkin yhdistys FOXP3 ilmaisun Treg ja sen vaikutus yleiseen eloonjäämiseen edelleen kiistanalainen. Epäselvä tiedot viittaavat siihen, että kasvaimen tunkeutumisen Foxp3 + Treg ei aina liittyy huono ennuste, mutta päinvastoin, voidaan yhdistää parannetun ennusteeseen joitakin syöpätyyppejä, kuten CRC [8], [9], [21], [22]. Lisäksi ei ole merkittävää yhteyttä ei havaittu absoluuttinen määrä Foxp3 + Treg ja ennusteeseen CRC [23], [24]. Parempi selviytymisen ja mahdollisesti suojaava rooli Treg saattavat selittyä niiden kyky vähentää kehittämisen aggressiivinen ja sytotoksinen, mahdollisesti proliferogenic sytokiinien miljöö, joka on perusta tulehduksen perustuva eteneminen pahanlaatuisten sairauksien [25], [26] .

Kokeelliset tutkimukset hiirillä osoittivat, että CD4 + CD25 + Treg eivät ainoastaan ​​keskeinen rooli ylläpidossa immunologisen toleranssin mutta Treg ovat myös tehokkaita estäjiä antituumorivaikutuksen immuunivasteen [27], [28]. Aiemmat tutkimukset ovat tutkineet tukahduttava kapasiteetit CD8 + CD25 + Foxp3 + T-solujen ja peräsuolen syövän kudoksissa [29]. CRC yksilöt absoluuttinen määrä CD8 + CD25 + Foxp3 + T-solut olivat alhaiset (alle 5%). Lisäksi nämä solut olivat poissa useimmissa normaalin kudoksen näytteissä, mutta läsnä useimmissa CRC yksilöitä; mutta niiden kliinistä merkitystä ei tiedetä [29]. Useat ryhmät havaittu Foxp3 ilmentymistä eri syöpätyyppeihin ja sen mahdollinen rooli immuunivalvonnan tuottamalla immunosuppressiivisia sytokiinejä, kuten IL-10 ja TGF-β [30].

Lopuksi olemme analysoineet eloonjäämisaste potilaiden, joilla on alhainen tai korkea Foxp3 + Treg tunkeutuminen kasvain verrattuna selviytymisen potilailla, joilla on matala tai korkea Foxp3 mielipiteenilmaisun syöpäsoluja. Ne potilaat, joilla on korkea Foxp3 + mentymisprofiili syöpäsoluissa liittyi huonompi ennuste kuin potilailla, joilla on alhainen ilmaisun profiilia Foxp3 + heidän syöpäsoluja. Tämä iskuäänten Foxp3 ekspressiomallin huonon ennusteen ei havaittu sulan Treg kasvain. Syöpäsolut ilmentyminen Foxp3 seurasi erityksen immunosuppressiivisten sytokiinien osaksi microenvironment kasvaimen solukko voi antaa kasvain tehokas keino kiertää immunologisia tuhoa. Mielenkiintoista on, että käänteinen korrelaatio määrä Foxp3 + Treg ja FOXP3 + syöpäsolujen havaittiin myös potilailla, joilla on CRC, mikä viittaa anti-proliferatiivista vaikutusta TGF-β on Treg.

Näin ollen, huolimatta siitä, että otoskoko tässä kohortissa on pieni tehdä lopullisia päätelmiä, meidän tutkimus osoittaa tämän ensimmäistä kertaa, että korkea Foxp3 ilmentymistä syöpäsoluissa liittyy synkkä ennusteeseen CRC. Coxin monimuuttuja regressioanalyysi osoitti imusolmuke etäpesäke (N luokka) ja Foxp3 ilmentyminen koolonkarsinoomasoluissa merkittävinä prognostisia parametrien säilyminen ihmisen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Eettinen hyväksyntä tutkimuksen saatiin Tutkijavoimavarojen toimikunta yliopiston Würzburg. Kaikki potilaat tarjoavat kasvain kudosta sekä normaalissa paksusuolen kudosnäytteitä allekirjoittivat suostumuslomakkeen ennen kirurgista poistoa suoliston syöpä, jotta tämä tutkimustoimintaan.

Potilaille ja valvonta

Sixty- viisi potilasta, joilla on histologisesti vahvistettu CRC syöpä joille parantava kirurginen resektio meidän osastolla välillä 01/2001 ja 06/2004 otettiin mukaan tutkimukseen. Histologinen vaihe kasvaimen määritettiin unionin Internationale Contre le Cancer (UICC) -TNM pysähdyspaikan järjestelmä [31]. Kasvaimet arvioitiin sijainti, vaihe, ja erilaistumista laatu. Koskevat tiedot iän, sukupuolen, taso seinän tunkeutumisen, ja imusolmuke etäpesäke kerättiin tietokantaan. Säännölliset sairaalakäynneillä potilaista jälkeen parantavaa hoitoa tehtiin väliajoin mukaan valtiollisten suuntaviivat kasvain potilaille. Potilaat, joille on tehty jokin neoadjuvant hoitoa tai R1 resektio jätettiin analyysin ulkopuolelle. Kasvainkudoksen näytteitä sekä normaali paksusuolen kudosnäytteitä potilaiden pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa kunnes analysoitiin. Normaali paksusuolen kudokset terveistä yksilöistä toimivat kontrolleina (n = 10). Immunohistokemiallinen analyysi vahvisti, että ei analysoitu kasvaimen potilaan kohortin ilmaisi hMLH1 ja hMSH2 ohjeellisia microsatellite epävakautta (positiivinen yhteensopimattomuuden korjauksen [MMR] tila). Mucinous fenotyyppi CRC voisi liittyä vääriä positiivisia subsellulaarisista reaktioita immunohistokemiallisesti ja jätettiin siis tutkimuksessamme. Kliiniset ominaisuudet tutkimusväestöstä on yhteenveto

Taulukko 3

. Kaikki potilaat suorittanut vähintään 60 kuukautta kestäneen seurannan jälkeen resektio.

Soluviljely

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa SW620, SW480 ja HCT-116 saatiin ATCC (Manassas, VA ) ja soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 käyttämällä RPMI 1640 Medium (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Gibco, Carlsbad , CA), 1% (v /v) L-glutamiinia (Biochrom AG, Berliini, Saksa) ja 1% (v /v) penisilliiniä /streptomysiiniä (Biochrom AG, Berliini, Saksa).

Virtaussytometria analyysi (FACS) B

Syöpäsolut ihmisen paksusuolen syövän solulinjat SW620, SW480, ja HCT-116 otettiin talteen eksponentiaalisen kasvun vaiheessa käyttäen entsyymiä free soluhajotusprosessin liuosta (Merck Millipore, Billerica, MA) ja analysoitiin for Foxp3 ilme. Pesun jälkeen DPBS: llä (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) kahdesti, 5 x 10

5-soluja käsiteltiin Foxp3 värjäyspuskurissa Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden ja inkuboitiin PE konjugoitu vasta-aine Foxp3 tai IgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) 30 minuuttia 4 ° C: ssa pimeässä. Fluoresenssi Foxp3 mitattiin ja analysoitiin FACS virtaussytometrillä (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, USA).

immunohistokemiallinen ja immunofluoresenssivärjäyksellä

CD4 ja CD25 vasta-aineet toimitti Dako (Hampuri, Saksa). Kaksi eri Foxp3-vasta-kloonia (ab22510 hiiren monoklonaalinen ja ab2481 vuohen polyklonaalinen) ostettiin Abcam (Cambridge, UK), TGF-β-vasta-aine saatiin Serotec (Düsseldorf, Saksa), ja IL-10-vasta-aineen R & D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Saksa). Isotyyppikontrollivasta-vasta-aineet hankittiin eBioscience (San Diego, USA). Toissijainen käytetyt vasta immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäystä ja immunohistokemia toimitti Jackson Immuno- Laboratories Inc. (Suffolk, Englanti). Toissijainen EPCAM ja CD4-vasta-aineet olivat FITC-konjugoitu AffiniPure aasin anti-vuohi lgG: llä ja toisen vasta-aineen Foxp3, IL-10, ja TGF-β oli Cy3-konjugoitu AffiniPure aasin anti-hiiri-IgG, jonka 1:200 laimennus (Jackson Immuno-).

sytospin valmisteiden kolorektaalisyöpää soluja potilaiden CRC viljeltiin lyhytaikaisia ​​primääriviljelmissä ja vakiintunut ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa kerättiin eksponentiaalinen kasvuvaiheessa käyttämällä entsyymiä vapaa soluhajotusprosessin ratkaisu (Merck Millipore, Billerica , MA). Pesun jälkeen DPBS: llä (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) kahdesti, solut säädettiin pitoisuuteen 2 x 10

5 solua /ml. Cytospins suoritettiin 50 ui solususpensiota 550 rpm 1 minuutin ajan Cytospin4 Cytocentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

värjäys CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, ja IL- 10 suoritettiin sarja kryostaattileikkeiden on 65 snap-jäädytetty CRC yksilöt alkuvaiheen kasvaimet (UICC I /II) ja myöhäisen vaiheen kasvaimet (UICC III /IV) naapureina normaalia paksusuolen kudosta ja 10 normaalin paksusuolen yksilöitä. Kaikki kasvaimet värjätään positiivisia sytokeratiini-20 (CK-20) (Dako, Hampuri, Saksa) ja negatiivinen sytokeratiini-7 (CK-7) (Dako), kuvion ominaisia ​​koolonadenokarsinoomasolulinjalla [32]. Ensin arvioidaan H.E. osaa kustakin kasvainkudoksen erottamaan syöpäsolun alueiden, strooman alueet ja soluttautua immuunisolujen. Sitten värjättiin CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, ja IL-10 seuraava järjestysnumero kohdissa. Sillä Foxp3 ilme sytoplasminen, perinuclear soluliman ja tuman värjäytymisen kuvio oli differentiaalisesti määritettiin [30]. Serial kryostaattileikkeitä (5 um) inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen tai kontrollivasta-aineella ja johdetun FITC-konjugoidulla (Fluoresceinisothiocyanate) vasta-aine. Sitten objektilasit jälkeen sitä inkuboitiin toisen primaarisen vasta-aineen, jota seuraa inkubaatio sekundaarisen Cy3-konjugoidun vasta-aineen. Objektilasit vastavärjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa) ja peitetään PVC-alkoholin kiinnitysväliaine (DABCO, Sigma-Aldrich) ja analysoitiin käyttäen Zeiss kamera (Oberkochen, Saksa).

immunohistokemiaa esikäsittely- (kiinnitys) diojen oli sama kuin on kuvattu immunofluoresenssimenetelmällä. Inkubaation jälkeen primaarisen vasta-aineen, käytimme piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua AffiniPure aasi anti-hiiri tai aasin anti-vuohi lgG: llä (Jackson Immuno- Research). Objektilasit viljeltiin sen jälkeen DAB (3,3′-diaminobentsidiiniä) (Biogenex, San Ramon, USA), vastavärjättiin Haemalaun ja asentaa glysergeeliin (Dako, Hampuri, Saksa). Kvantifiointi Kunkin immunoentsymaattisilla värjäytymisen kasvainsolujen ulos 65 yksittäisen kasvaimen kudokset kuusi yksittäistä suurennettu kentät (× 400 suurennus) kunkin värjäystä näyte tekee solun laskenta suoritettiin kaksi riippumatonta tutkijat sokaissut varten taustalla olevan sairauden. Suurennettu kentät olivat edustavia koko kasvain osassa. Tulos värjäytyminen ilmaistiin prosentteina (%) positiivisuutta. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR-analyysi

analysoimiseksi geenin ilmentymisen CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, ja IL-10 RT-qPCR, me uutettiin kokonais-RNA käyttämällä RNeasy Minikit Qiagen (Hilden, Saksa). Kiinnostuksen (vain epiteelin alueet) kunkin kudoksen osassa manuaalisesti microdissected käyttäen leikkausveitsellä terä. Yhtä suuret määrät kudoksen alueita arvioitiin (2 x 1,5 cm

2 pinta-alaa kohti osassa, paksuus 10 pm). RNA potilaan näytteistä ja vakiintunut ihmisen paksusuolen solulinjoja (for Foxp3) suoritettiin valmistajan ohjeiden. Alukesarjat saatiin Qiagen, 18S RNA alukeparia (eteenpäin: TCA AGA ACG AAA GTC GGA GGT TCG, käänteinen: TTA TTG CTC AAT CTC GGG TGG CTG) suunnitellut Biomers (Ulm, Saksa). Hyväksytty ihmisen koolonin cDNA hankittiin Pharmingen (Heidelberg, Saksa) ohjaus ja sen standardoitu perustasolle. Housekeeping geenit glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), ß-aktiini, ja 18S-RNA: ta [33] käytettiin suhteellista kvantifiointia ja cDNA laadunvalvontaa. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Saksa). Suhteellinen määrällisesti arvo, kertainen ero, ilmaistiin 2

-ΔΔCt. Jotta analyysi koolonsyöpäsolulinjaa ilmentyminen on osoitettu keskiarvo, ACt ja suhteellinen ilmentyminen (Foxp3 /taloudenhoito geenejä).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SAS 9.2. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin ajanjakso satunnaistamisesta ja kuoleman tahansa syystä. Potilaat, jotka olivat menettäneet seurata sensuroitiin ajankohtana viime yhteystiedot. Yleinen eloonjääminen arvioitiin avulla PROC PHREG (Cox Proportional vaarat Model). Parametrit prognoosi- potentiaalia, yksilöityjen vaiheittain siten, ovat edelleen tutkittava Kaplan-Meier-menetelmällä (PROC LIFETEST). Sillä univariate analyysi tarkoittaa cut-off-arvo joko korkea tai matala ilmentymisen asetettiin 12% varten Foxp3 kasvaimen soluttautua Treg ja 16% Foxp3 syöpäsoluissa. Univariate analyysi merkitys Foxp3 ilmentyminen kasvaimen soluttautua Treg ja syöpäsolun ilmaisun eroja eloonjäämiskäyrien arvioitiin Log-rank-testi. Samalla tavalla eloonjäämiskäyrissä verrattiin N ja T luokat sekä primaarikasvaimen.

kaksi itsenäistä potilasryhmille analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä (Satterthwaite). Yli kaksi ryhmää analysoitiin soveltamalla PROC GLM (analyysi varianssit) kanssa post-hoc testaus (Tukey). Frekvenssijakaumien verrattiin käyttäen kxm taulukoita (Chi-quadrat). Pearsonin korrelaatiokerroin oli käytetty kuvaamaan sekä testata bivariate korrelaatioita. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää herra Dipl.-Math. Mathias Brosz tilastollisiin neuvoja ja Mrs Sabine Müller-Morath, rouva Mariola Dragan, Ms Nadine Gutermuth, ja rouva Ingrid Strauss heidän teknistä tukea.