Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transmembraanipaine ja erittyvä proteiini delta-like 1-homologi (

DLK1

) kuuluu EGF-kaltainen perhe. On yleisesti hyväksytty, että

DLK1

on merkittäviä rooleja säätelyssä solujen erilaistumista, kuten adipogeneesi ja osteogenesis. Poikkeava ilmentyminen

DLK1

on löydetty erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Aiemmassa tutkimuksessa on tässä laboratoriossa on paljastanut, että

DLK1

liittyy kasvaimen invaasio, vaikka mekanismi on vielä tuntematon. Tutkia mahdollisia vaikutuksia, että

DLK1

voisi olla hyökkäyksen,

DLK1

yliekspressoitui tai kaatanut ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Proteiinin vaikutteita soluinvaasiota sittemmin arvioitiin. Transwell määritys osoitti, että

DLK1

yli-ilmentymisen merkittävästi edistänyt syöpäsoluinvaasiota. Western blotting ja gelatiinitsymografialla analyysi osoitti, että

DLK1

voivat vaikuttaa sekä matriksimetalloproteinaasi-9 (

MMP-9

) ilmentyminen ja sen solunulkoisen toimintaa. Analyysi

Notch1

ja

HES1

geenien ilmentyminen ja Notch solunsisäinen domeeni (NICD) tumaansiirtymiseen aikana

DLK1

stimulaatio tai ehtyminen osoittaneet

DLK1

voisi aktivoida Notch signalointi keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi kohonnut ilmentyminen

MMP-9

aiheuttama

DLK1

stimulaation voitaisiin merkittävästi vähentynyt estämällä Notch signalointia käyttäen γ-sekretaasin estäjä (GSI). Tiedot esitetään tässä tutkimuksessa viittaa siihen, että

DLK1

voi edistää hyökkäyksen keuhkosyöpään solujen säätelemällä

MMP-9

ilmaisu, joka on riippuvainen Notch signalointi.

Citation: Li L Tan J, Zhang Y, Han N, Di X, Xiao T, et ai. (2014)

DLK1

Edistää keuhkosyöpäsolua Invasion kautta lisääntymisen merkkejä

MMP-9

Expression Riippuen Notch Signaling. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10,1371 /journal.pone.0091509

Editor: Yunli Zhou, Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2013; Hyväksytty: 11 helmikuu 2014; Julkaistu: 12 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Natural Science Foundation of China (30930042 ja 81301852) sekä Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education (20111106110017). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti, ja kasvaimen etäpesäke liittyy vahvasti ennustetta syöpäpotilaiden [1], [2]. Aikaisemmat tutkimukset ilmennetty eri geenien ihmisen keuhkojen okasolusyöpä (SCC) kanssa tai ilman imusolmuke etäpesäke käyttäen DNA-siru analyysissä havaittiin joukko etäpesäke liittyvien geenien (fdr 0,05, tuloksia ei ole esitetty). Niistä geenit,

DLK1

osoitti enemmän kuin kaksi kertaa suurempi ilmentyminen primaarikasvainten kanssa imusolmuke etäpesäke, mikä viittaa siihen, että

DLK1

voi olla rooleja syövän etäpesäkkeiden. Sekä suhde

DLK1

ja kasvaimen etäpesäke, ja sen mekanismi on huonosti tunnettu.

delta-like-1-homologi (

DLK1

) geeni, jolla on alias-

FA1

,

Zog

ja

PREF-1

, koodaa transmembraanisen ja erittyvän proteiinin (DLK1), joka sisältää kuusi epidermaalinen kasvutekijä (EGF) verkkotunnuksia, joka on jäsen EGR kaltainen perhe. Tämä proteiini on erittäin homologinen Notch ligandin DLL1 mutta siitä puuttuu Delta /Serrate /Lag (DSL) motiivi, joka on kriittinen vuorovaikutuksessa Notch-reseptorien [3], [4]. Tutkimukset

DLK1

ovat paljastaneet sen rooli solujen erilaistumista. Esimerkiksi

DLK1

voi toimia moduloimalla adipogeneesi [5], [6], [7], säännellään osteoblastien erilaistumista [8], [9] ja estämällä erilaistumista ja lisääntymistä hematopoieettisten solujen [10]. Nonclassical ligandi

DLK1

havaittiin poikkeuksellisesti ilmaistu useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien neuroblastooma [11], maksasyövän [12], [13], gliooma [14] ja ihmisen eturauhassyövän [15]. Aikaisemmat työ totesi myös, että

DLK1

ilmentyy voimakkaasti ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja toimii onkogeenin [16]. Voimistunut ilmentyminen

DLK1

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä liittyy imusolmuke etäpesäke, mutta mekanismia ei vielä tunneta.

Notch reitti on tunnettu signaalinvälitysreitin aikana kehitysprosessiin ja solujen kohtalon määrittämiseen. Vaikka puuttuu DSL-motiivi,

DLK1

on osoitettu toimivan estäjänä Notch signaloinnin in vitro [17], [18]. Sekä kalvoon sitoutuneen ja erittävät DLK1 voivat olla vuorovaikutuksessa Notch1 [17], mikä johtaa muuttuneisiin solujen jakautumista Notch1 ja eston Notch-säädellään geenin ilmentymisen [4], [5], [19]. On raportoitu, että

Notch1

voi säätelemään matriksimetalloproteinaasi-9 (

MMP-9

) eturauhassyöpäsoluissa, joka pelaa keskeinen rooli syövän invaasio [20]. Kun nämä löydökset yhdessä oletamme, että Notch signalointi voisi olla mukana

DLK1

indusoimaan syöpäsoluinvaasiota.

Tutkimus että esitämme täällä tarjoaa näyttöä siitä, että

DLK1

parannettu kyky keuhkosyöpään solujen hyökätä soluväliaineen (ECM), joka validoitu edellisessä geeniekspressioprofilointi tulokset johdettu mikrosiruanalyysillä. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että

DLK1

edistänyt syöpäsoluinvaasiota kautta säätelyä

MMP-9

ilmaisun ja esiin sen solunulkoisen toiminnan, jotka ovat riippuvaisia ​​Notch signalointireitille.

materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja hoidon

ihmisen keuhkosyöpää solulinja H520, H1299 ja A549 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Life Technologies, Grand Island, NY), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa . Notch-inhibiittori L-685458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lisättiin viljelyalustaan ​​12 tunnin kuluttua ohimenevän transfektion

DLK1

ekspressioplasmidin tai nollavektori (pcDNA3.1), jossa lopullinen tehokas konsentraatio 5 uM RPMI 1640, joka sisälsi 1% FBS.

DLK1

ekspressioplasmidin ja sirna (siRNA) B

DLK1

eukaryoottiekspressio- plasmidi rakennettiin ja sitten transfektoitiin stabiilisti H520-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [16].

DLK1

ekspressioplasmidin myös transfektoitiin lyhytaikaisesti H520 ja H1299-soluihin käyttäen Lipofectamine-2000-transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA); ja Invitrogen Stealth siRNA duplex (Carlsbad, CA) vastaan ​​

DLK1

hyödynnettiin geenien käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), seuraten valmistajan ohjeita.

In vitro ECM invaasiomääritys

Solut joko pysyvästi (H520) tai lyhytaikaisesti (H1299) transfektoitu

DLK1

tai nollavektori viljeltiin erikseen, kunnes 80% konfluenssiin. Sitten solut pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa yli yön, ennen kuin se altistetaan ECM invaasiomääritys in vitro. Chemoinvasion määritys suoritettiin käyttäen BioCoat matrigeelin Invasion Chambers 8 um huokosia (BD Biosciences, Bedford, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 2,5 x 10

4 solut suspensoitiin tuoreeseen seerumittomassa alustassa ja kylvetään ylempään kammioon 24-kuoppaisen siirtokuoppaan levy, kun taas alempi kammio sisälsi tuoretta elatusaineita 20% FBS kuin kemoattraktantti. Solujen annettiin tunkeutua 22 tuntia (37 ° C, 5% CO

2-ilmakehä), ja kammiot pestiin sitten PBS: llä. Ne solut, jotka eivät hyökätä kalvon läpi poistettiin. Tunkeutuvat solut alapinnalle kalvon fiksoitiin kylmällä metanolilla, värjättiin 0,2% kristallivioletilla ja tutkittiin. Solut kunkin kalvon laskettiin vähintään viisi kenttää valomikroskoopilla.

RNA ja määrällisiä käänteistranskriptio-PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista, joissa TRIzol reagenssia (Invitrogen , Carlsbad, CA), ja 1 ug kokonais-RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon kanssa SuperScript II käänteistranskriptio (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR-analyysi

MMP-9

ja

HES1

ekspressio tehtiin seuraavilla alukkeilla: MMP-9-F 5′-TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3 ’, MMP-9-R 5′-CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3′ , HES1-F 5’-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 ’ja HES1-R 5′-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3’. Housekeeping-geeni

18S

ribosomaalisen RNA valittiin sisäisenä kontrollina tässä tutkimuksessa, jossa alukkeita 18S-F 5′-GAAACGGCTACCACATCC-3 ’ja 18S-R 5′-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3’. SYBR Esiseos Ex Taq kit (TaKaRa, Shiga, Japani) käytettiin reaaliaikaista PCR-analyysiä, jolla on vakio vahvistus protokolla: 95 ° C: ssa 10 s, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 3 min. Sen jälkeen kun vahvistus, standardi sulamiskäyrä menettely suoritettiin kullekin geenille tutkia spesifisyys monistamisen.

Western blotting -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin noin 2 x 10

6 viljeltiin solut RIPA-puskuria, ja ydinvoima proteiini uutettiin käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasman uuttoreagenssit (Pierce, Rockford, IL) seuraten valmistajan toimitukseen protokollaa. Yhteensä 40-80 ug proteiineja erotettiin elektroforeesilla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Membraani blokattiin 5% maidon rasvatonta ja niitä inkuboitiin primäärisen vasta-aineen DLK1 (Proteintech Group, Chicago, IL), Notch1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), lohkaistaan ​​Notch1 (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) tai MMP9 (Aviva Systems Biology, San Diego, CA). Anti-Notch intrasellulaarisen domeenin (NICD) vasta Tässä tutkimuksessa käytettiin tunnistaa vain pilkkoa ja aktivoida Notch1 muttei täyspitkä Notch1. PBS-pesun jälkeen, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (PBST), kaivoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Dako, Glostrup, Tanska), ja runsaasti proteiineja havaittiin kemiluminesenssin reagenssit. Kalvo uudelleenseulottiin vastaisella vasta-aineella GAPDH (KangChen Bio-Tech, Shanghai, Kiina) tai TBP (Abcam, Cambridge, MA) sisäisenä ohjauslaitteet vastaavaa proteiinia lastaus.

gelatiinitsymografialla

pysyvästi

DLK1

ilmentävää H520-dlk1 solut yhdessä nolla-ohjaus H520-pcdb ja vanhempien H520 soluja, viljeltiin erikseen 10 cm ruokia asti 80% konfluenssiin. Esikäsitelty väliaine kerättiin ja konsentroitiin käyttäen Amicon suodattimen (Millipore, Bedford, MA) mukaan valmistajan protokollaa. Kaikkiaan 20 ug väkevää proteiinien elektroforeesi ei-pelkistävissä olosuhteissa, ja Gelatinolyyttinen aktiivisuutta MMP-9 analysoitiin sitten käyttäen symografialla reagensseja (Bio-Rad, Hercules, CA) seuraten valmistajan ohjeita.

Tilastollinen analyysi

erot laskee tunkeutumaan solujen kussakin ryhmässä on invaasiomääritys ja erot suhteellisen ilmentymisen reaaliaikaisen PCR-analyysi arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Kaikki testit olivat kaksipuolisia, ja p-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin SPSS ohjelmistopaketin, version 13,0 (SPSS, Chicago, IL).

Tulokset

yli-ilmentyminen

DLK1

parantaa ECM hyökkäystä keuhkosyöpäsoluissa

Vastatakseen onko

DLK1

on mahdollisia rooleja keuhkosyövän etäpesäke, keuhkoissa cancercell linjat H520 ja H1299 työskentelivät in vitro -mallissa, jossa endogeeninen ilmentyminen

DLK1

was puuttuu. H520-solujen stabiilia ekspressiota eksogeenisten

DLK1

(H520-dlk1) tuotettiin aiemmin, yhdessä H520-pcdb soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu vektorilla (pcDNA3.1) kuin nollaverrokissa [16]. H520-dlk1 solut altistettiin invaasiomääritys, jossa H520-pcdb ja vanhempien H520 solujen valvontaa. Kuten kuviossa 1 on esitetty paneeli A ja B, kun 22-tunnin jakson aikana hyökkäyksen, oli huomattavasti enemmän H520-dlk1 solujen tunkeutuneet kammion läpi kalvon päällystetty Matrigel, verrattuna H520 ja H520-pcdb soluja (p-arvo 0,05). Samanlainen ilmiö havaittiin H1299 soluissa. Lisää

DLK1

transfektoitiin ohimenevästi H1299-soluja (H1299-dlk1) havaittiin tunkeutuneet kalvon läpi verrattuna H1299-soluja, jotka on transfektoitu nolla- vektorilla (H1299-pcdb), kuten on esitetty kuviossa 1C ja D. Nämä tulokset viittaa siihen, että yli-ilmentyminen

DLK1

voisi merkittävästi parantaa solujen kykyä hyökätä ECM.

edustava mikrovalokuvia tunkeutuvat läpi vaeltaneiden solujen Matrigel-päällystetty kalvo transwell, joka on otettu kolmen ryhmät: H520, emosoluilta, H520-pcdb, nollavektorin-ohjaus solujen ja H520-dlk1 solut ilmentävät stabiilisti DLK1. B, histogrammi varten laskee muuttavien solujen H520, H520-pcdb ja H520-dlk1 ryhmiä. C, edustaja mikrovalokuvia esittäen H1299-solut, jotka transfektoitiin ohimenevästi

DLK1

(H1299-dlk1) tai tyhjä vektori (H1299-pcdb), joka tunkeutuu läpi Matrigel-päällystetty kalvo Transvvell-. D, histogrammi varten laskee muuttavien solujen H1299-dlk1 ja H1299-pcdb ryhmiä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (* t-testi, p-arvo 0,05).

yli-ilmentyminen

DLK1

voimistunut MMP-9 ilmaisun ja toiminnan

Based hypoteesiin, että

DLK1

indusoimaan syöpäsolujen invaasio välittävät säätelyä

MMP-9

, ilmaus

MMP-9

kun

DLK1

stimulaatio analysoitiin sekä reaaliaikainen PCR ja Western blotting. Tulokset osoittivat, että

MMP-9

n ekspressio oli lisääntynyt H520-dlk1 soluissa verrattuna H520 ja H520-pcdb soluissa sekä mRNA: n ja proteiinin tasot (kuvio 2A ja B). Sama suuntaus on havaittu myös, kun

DLK1

yliekspressoitui toisessa keuhkosyövän solulinjassa H1299. Sen jälkeen kun oli transfektoitu tilapäisesti

DLK1

, erittäin ilmaistu

MMP-9

havaittiin sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 2D ja E). Kuten MMP9 proteiini täyttää tehtävänsä aktivoidussa muodossa solunulkoisessa tilassa, elatusaine kerättiin ja gelatiinitsymografialla käytettiin testaamaan MMP-9 toimintaa. Kuviossa 2C on esitetty, että

DLK1

voitaisiin lisätä myös MMP-9 aktiivisuutta solunulkoisessa tilassa, kun taas aktiivisuus MMP2 oli ennallaan. Edelleen vahvistaa suhdetta

DLK1

ja

MMP-9

, RNA-interferenssi palkattiin heikentävistä

DLK1

ilmentymistä A549-soluja, ja

MMP-9

ilme oli tutkittava järjestyksessä. Tulokset osoittivat, että DLK1 ekspressio ehkäistään tehokkaasti RNAi proteiinitasolla (kuvio 2G), ja MMP-9 ilmentyminen inhiboitui merkittävästi sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 2F ja G). Nämä tulokset viittaavat siihen,

DLK1

voisi edistää solujen invaasiota kautta säätelevät MMP-9 ilmaisun ja toimintaa.

, histogrammi suhteellista mRNA ilmaus

MMP-9

vuonna H520 transfektoiduissa soluissa

dLK1

(H520-dlk1) tai null vektorin (H520-pcdb) havaitsee reaaliaikaisen PCR-analyysillä. Ilmentymisen taso

MMP-9

aihion H520-soluja käytettiin kontrollina ja asetetaan 1. B, proteiinin ilmentymistä MMP-9 on H520-dlk1, H520-pcdb ja H520-soluissa arvioitiin Western blotting -analyysi. C, gelatiinitsymografialla joka ilmaisee aktiivisen erittyvän MMP-9 ja MMP2 in H520-dlk1, H520-pcdb ja H520-soluissa. D, reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisen mRNA: n ilmentymisen on

MMP-9

in H1299-soluissa, jotka on transfektoitu

DLK1

(H1299-dlk1) tai tyhjä vektori (H1299-pcdb) on esitetty histogrammi. E, Western blotting osoittaa proteiinin ilmentymistä MMP-9 in H1299-dlk1 ja H1299-pcdb soluissa. F, histogrammi, jolla suhteellinen mRNA ilmaus

MMP-9

in

DLK1

siRNA (A549-si-dlk1) tai null ohjaus siRNA (A549-NC) transfektoitujen A549-solut arvioitiin reaaliaikaisen PCR-analyysillä. G, proteiini ilmentymistä MMP-9 A549-si-dlk1, A549-NC ja tyhjiä A549-soluja havaittiin Western blottauksella. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

18S

ribosomaalisen RNA: ta käytettiin sisäisenä valvonta reaaliaikaisen PCR-analyysiä, kun taas GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina Länsi blotting-analyysi (* t-testi, p-arvo 0,05).

yli-ilmentyminen

DLK1

aktivoitu Notch signalointireitille

vahvista yhdistyksen välillä

DLK1

ja

Notch1

, me ensimmäinen testattu Notch1 ilmentymistä kokosolulysaateista Western-blottauksella. Todettiin, että yli-ilmentyminen

DLK1

voisi ylössäätävät Notch1 ilmentymistä sekä H520 ja H1299-soluja (kuvio 3A ja D). Koska Notch1 aktivointi seuraa sen pilkkominen osaksi NICD ja translokaation NICD tumaan edelleen transkription säätelyyn, määrä NICD vuonna ytimien voisi heijastaa Notch signalointia. Poimimamme ydinvoiman proteiineja H520-soluihin väliaikaisesti transfektoitu

DLK1

tai null-vektorin ja tutki määrä NICD käyttämällä Western-blottauksella. Tulokset osoittivat, että NICD siirtämisellä tumiin intensiivisemmin jälkeen yliekspressio

DLK1

verrattuna nollaverrokissa (kuva 3B). Lisäksi ilmaus

HES1

nimenomainen Notch polku kohdegeenin, tutkittiin myös reaaliaikaisella PCR: H520 ja H1299 soluja. Oli merkittävää voimistumista

HES1

stimulaation jälkeen

DLK1

ilmentymisen verrattuna nollaverrokissa molemmissa soluissa (p-arvo 0,05, kuvio 3C ja E). Sen sijaan, vähentynyt ilmentyminen Notch1 ja HES1 havaittiin Western-blottauksella ja reaaliaikaisella PCR: llä, vastaavasti, kun DLK1 ilmentyminen oli tyhjentynyt, jonka RNAi A549-soluja (kuvio 3F ja G).

A, Western blotting osoittaa Notch1 ilmentyminen H520-soluissa transfektion jälkeen

DLK1

(H520-dlk1) tai tyhjä vektori (H520-pcdb) tutkitaan kokosolulysaateista. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. B, Western blotting arvioidaan ydin- NICD ilmentymistä H520-dlk1 andH520-pcdb soluissa. TBP käytettiin sisäisenä kontrollina. C, histogrammi suhteellista mRNA: n ilmentymisen Notch kohdegeenin

HES1

, että H520-dlk1 ja H520-pcdb solujen havaitaan reaaliaikaista PCR-analyysiä. H520-pcdb soluja käytettiin kontrollina, ja sen ilmentyminen tasolla

HES1

oli asetettu 1.

18S

ribosomaalisen RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. D, Western blotting osoittaa ilmentymisen Notch1 in H1299-soluissa, jotka on transfektoitu

DLK1

(H1299-dlk1) tai tyhjä vektori (H1299-pcdb). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. E, histogrammi esittää suhteelliset mRNA ilmaus

HES1

in H1299-dlk1 ja H1299-pcdb solujen havaitaan reaaliaikaista PCR-analyysillä. F: n ilmentyminen Notch1 sytoplasmassa arvioitiin Western-blottauksella A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi

DLK1

siRNA (A549-si-dlk1) tai null-ohjaus siRNA (A549-NC). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. G, reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisten mRNA ilmaus

HES1

A549-si-dlk1 ja A549-NC-solut, ja esitetty histogrammi. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (* t-testi, p-arvo 0,05).

DLK1

säännelty

MMP-9

ilmaisun osittain läpi Notch signalointireitille

sen määrittämiseksi, onko

DLK1

voimistunut

MMP-9

ilmentymistä Notch signalointi-riippuvaisella tavalla, L-685458 on haettu, joka on γ-sekretaasi-estäjä (GSI), että tukahduttaa Notch1 solujen välinen domain lohkaisu γ-sekretaasi, estäen siten Notch signalointi aktiivisuutta. Suhteellinen ilmentyminen

MMP-9

aikana stimulaation

DLK

1 ilme kanssa tai ilman GSI käsittelyä analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset osoittivat, että kun Notch signalointi estettiin käsittelemällä L-685458,

DLK1

stimuloduista

MMP-9

säätelyä väheni merkittävästi (kuvio 4A), joka osoittaa osallistumista Notch signalointi tässä asetuksessa käsitellä asiaa. Lisäksi havaittiin myös, että vaikka Notch signalointi aktiivisuutta tukahdutettiin tasolle verrattavissa puute

DLK1

yliekspressio (merkitään

HES1

ilmaisun kuvassa 4B, dlk1 + /GSI + verrattuna dlk1 – /GSI +, t-testi, p-arvo = 0,078), ilmaus

MMP-9

eivät noudattaneet samaa suuntausta, mikä viittaa siihen, että

DLK1

voi säädellä

MMP-9

ilmaisun kautta signalointi transduktioreittejä muu kuin Notch. Ilmaus

HES1

, joka on kohdegeenin Notch signalointireitin, arvioitiin rinnakkain indikaattorina Notch signaloinnin aktiivisuuden (kuvio 4B).

A, pylväskaaviona mRNA ilmaus

MMP-9

havaitsee reaaliaikaisen PCR H520-soluissa tai ilman

DLK1

yli-ilmentymisen ja tai ilman GSI hoitoa. Ryhmässä ei

DLK1

stimulaation eikä GSI hoitoon (dlk- /GSI-) käytettiin verrokkina ja ilmentymistason

MMP-9

asetettiin 1.

18S

ribosomaalisen RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. B, ilmaus

HES1

arvioitiin reaaliaikaisen PCR rinnakkain

MMP9

ilmentyminen näkyy pylväsdiagrammi, joka osoittaa Notch signalointi toiminnan yhteydessä

DLK1

yliekspressio tai GSI hoito. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (* t-testi, p-arvo 0,05).

Keskustelu

Tutkimukset

DLK1

ovat paljastaneet sen toimintoja solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon [5], [6], [10]. On myös raportoitu, että

DLK1

on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​eri ihmisen syövissä, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14], [16], [22], [23]. Nämä tutkimukset ihmisen syövissä lähinnä epänormaali ilmentyminen

DLK1

mutta ei tarkasteltu sen yhdessä syövän etäpesäkkeitä. Aikaisemmat työt etäpesäkkeitä liittyvien geenien ihmisen keuhkojen SCC ehdotti, että

DLK1

voisi toimia kasvaimen etäpesäkkeiden (tuloksia ei ole esitetty). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistettu, että yli-ilmentyminen

DLK1

voisi parantaa invasiivisen kyvyn keuhkosyövän soluja (kuten kuviossa 1 on esitetty), joka on johdonmukainen aiemmat havainnot, jotka ovat peräisin geeniekspressioprofilointi ja laajentaa tietämystä dlk1 tehtävänä ihmisen syövässä.

Vaikka DLK1 proteiini puuttuu DSL aihe, jonka uskotaan olevan keskeinen rooli ligandeja ’vuorovaikutusta Notch reseptoreihin, vuorovaikutusta DLK1 ja Notch1 reseptori on näkyvät hiivan kahden hybridin järjestelmä [19]. Kuitenkin DLK1 n vaikutus Notch signalointireitin on edelleen kiistanalainen [4], [5], [19]. Baladron et ai. ehdotti, että vaikutus

DLK1

Notch signalointi on erilaiset

DLK1

variantteja. Kun taas erittyy DLK1 voi toimia Notch antagonisti, kalvo DLK1 voi aktivoida Notch. Meidän havainnot osoittivat, että seos kalvon ja erittävät DLK1 voi aktivoida Notch-signaloinnin ihmisen keuhkosyövän soluja. Käyttö seoksen

DLK1

variantteja tässä suoritettiin pyritään jäljittelemään tilanteissa in vivo. Lisäksi Notchiin signaloinnin aktivointi, me myös havainneet voimistumista Notch1 ilmaisun aikana stimulaation

DLK1

yli-ilmentymisen. Huomattavaa on, että aktivointi Notch opastinjärjestelmillä

DLK1

voi olla yhdistetty vaikutus voimistumista Notch1 ilmaisun ja Notch1 pilkkominen stimuloida DLK1 sitova. Lisäksi, poikkeava ilmentyminen Notch1 on löydetty erilaisten ihmisen syöpien [24], [25], mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [26], [27]. Koska tutkimuksemme on sääntely- suhde

DLK1

ja

Notch1

, on luontevaa oletuksen, että epänormaali ilmentyminen Notch1 syövissä on osittain seurausta poikkeavasta ilmentymisen DLK1.

Olemme havainneet, että

DLK1

-promoted invaasion keuhkosyöpään solujen liittyi voimistumista MMP-9 ilmaisun ja sen solunulkoisen aktiivisuus (kuvio 2), jotka ovat mukana ECM jakautuminen ja erittäin liittyy kasvaimen invaasio [ ,,,0],20]. Olemme edelleen tutki Notch signalointi oli mukana

DLK1

-regulated MMP-9 ilmaisun käyttäen GSI estää Notch signalointi ja sitten arvioidaan vaste MMP9 aikana stimulaation

DLK1

ilme. Havaitsimme vähentynyt merkittävästi koholla MMP-9 ilme, kun Notch signalointi on estetty (kuva 4). Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu, että

DLK1

voisi silti kohtalaisen ylössäätävät MMP-9 ilmaisun kun Notch signalointireitin oli tukossa, mikä tarkoittaa, että

DLK1

voivat toimia syövän invaasio sekä Notch signalointi riippuvaista ja riippumattaman käytöstapoja. Huolimatta vuorovaikutus DLK1 ja Notch1, se on myös raportoitu, että DLK1 voisi toimia muissa signaalinvälitysreittien. Esimerkiksi DLK1 voivat olla vuorovaikutuksessa IGFBP1 /IGF-1-kompleksit ja aktivoi IGF-reseptori signalointi [6], ja se voisi myös lisätä fosforylaatiota MEK /ERK ja aktivoi MEK /ERK signalointi [28], [29]. Työmme ehdotti myös, että DLK1 voisi aktiivinen NF-KB: n signalointia (tuloksia ei ole esitetty). Ottaen huomioon, että signalointireiteissä solussa on merkittävä rajat puhua ja että geeni transkriptio säätelee yhdistämällä erilaisia ​​reittejä, joiden uskomme olevan sekä looginen ja annoksesta riippuvainen, ei ole yllättävää, että

DLK1

voisivat tehostaa soluinvaasiota läpi useita reittejä.

Johtopäätöksenä esitetyt tiedot tässä tutkimuksessa osoittautui roolista

DLK1

syövän invaasio ja tutkitaan molekyylitason mekanismia tätä toimintoa, joten

DLK1

uusi kandidaattigeeni syövän etäpesäkkeiden tutkimuksissa.