Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Syöpä kehittymistä ja etenemistä ei ole vain liittyy kasvainsoluproliferaation mutta riippuu myös vuorovaikutusta kasvainsolujen ja strooman microenvironment. Uusi ymmärrystä rooli kasvaimen microenvironment viittaa siihen, että menetys strooman caveolin-1 (Cav-1) on keskeinen säädin voi tulla potentiaalinen hoito tavoite. Tutkimus pyrkii selvittämään, onko strooman Cav-1 ilmentymisen haimasyövän voi olla vahva ennusteen biomarkkereiden.

Methods

kudosnäytteitä 45 haimasyövän potilaat tutkittiin. Parenchyma ja strooman erotettiin ja puhdistettiin käyttämällä laser kaapata mikrodissektion. Stroomakasvaimet Cav-1 ilmentyminen mitattiin haimasyöpä, paraneoplastic, ja normaalin kudoksen avulla immunohistokemiallisesti. Analysoimme korrelaatio strooman Cav-1 ilmaisutapoja viittaavia tekijöitä sekä varoituksia indikaattoreita, kuten tuumorimarkkeri HER-2 /neu-geenin.

Tulokset

näytteet kuudesta potilaasta (13,3%) osoitti korkea strooman Cav-1 värjäystä, jotka tulevat kahdeksan potilasta (17,8%) oli pienempi, keskitason värjäystä, kun taas 31 potilasta (68,9%) osoitti värjäytymisen puuttuminen. CAV-1 ilmentymisen syöpään liittyvän fibroblastit oli alhaisempi kuin paracancer liittyviä ja normaalien fibroblastien. Stroomakasvaimet Cav-1 tappio liittyi TNM (

P =

0,018), imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,014), kaukainen etäpesäke (

P

= 0,027) , ja HER-2 /neu vahvistusta (

P

= 0,007). Suhteet iän, sukupuolen, histologinen luokka, ja kasvaimen kokoa strooman Cav-1 ilmentymisen eivät olleet merkittäviä (

P

0,05). Negatiivinen korrelaatio löytyi kiertävien kasvainsolujen ja strooman Cav-1 ilmentymisen (

P

0,05).

Johtopäätös

häviäminen strooman Cav-1 haiman syöpä oli itsenäinen prognostinen indikaattori, mikä viittaa siihen, että strooman Cav-1 voi olla tehokas terapeuttinen kohde potilaiden haimasyöpä.

Citation: Shan T, Lu H, Ji H, Li Y, Guo J, Chen X, et ai. (2014) menetys stroomakasvaimet Caveolin-1 Expression A Novel Kasvain mikroympäristölle biomarkkereiden Se voi ennustaa Huono Kliiniset tulokset varten Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (6): e97239. doi: 10,1371 /journal.pone.0097239

Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Ranska

vastaanotettu: 25 lokakuu 2013; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2014; Julkaistu: 20 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Shan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Scientific Grand Shaanxin (2012SXKG-21). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on eloonjäämisaste on alle 25% viiden vuoden kuluttua osittaisen pankreatikoduodenektomia ja on yksi aggressiivinen ja hankala ihmisen pahanlaatuisia kasvaimia [1]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että microenvironment palvelevat funktio etenemisessä pahanlaatuisia kasvaimia, mikä korostaa, kuinka tärkeää on käsitys stroomasolujen ehkäisyssä syöpäsolun aggression ja anti-syövän hoitoon strategioita [2]. Ymmärtämään täysin käyttävä mekanismi kasvaimen uusiutumisen, etäpesäke, ja kliinisten tulosten syöpäpotilailla, rooli kasvaimen microenvironment on tutkittava. Erityisesti, syöpään liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisiin) on todettu toimivan ratkaiseva toimintoa paracrine vuorovaikutus viereisten epiteelisyöpäsolujen [3], [4].

Caveolins (CAV) käsittävät perheen telineet proteiinien että takki 50 100 nm solukalvon kohtiin, [5]. CAV perhe koostuu kolmesta isoformia: Cav-1, Cav-2, ja Cav-3. CAV-1-geeni sijaitsee kromosomissa 7 (locus 7q31.1) ja sisältää kolme eksonia (30, 165, ja 342 bp) ja kaksi intronia (1,5 ja 32 kb). CAV-1 on rakenteellinen komponentti kaveoleja mukana erilaisissa solun toimintoja, kuten vesicular liikenne, kolesteroli homeostaasin, ja signaalitransduktion [6]. Huolimatta kasvava määrä todisteita Cav-1 vaikutuksia kasvainten synnyssä, onko Cav-1 toimii tuumorisuppressorina tai onkogeenin jää epäselväksi. Nämä ristiriitaiset tulokset ovat luultavasti peräisin tutkimuksen pahanlaatuisten kasvaimia [7], [8], [9]. Uusi paradigma ”The autophagic kasvain strooman malli syövän aineenvaihdunta” oli äskettäin ymmärtämisen helpottamiseksi toiminnan kasvain mikroympäristöihin [10], [11]. Tässä mallissa, menetys strooman Cav-1 on keskeinen säädin on mahdollinen hoito kohde, joka viittaa siten prognostisia stro- Cav-1 [12]. Menetys strooman Cav-1 on yksi itsenäinen ennustaja varhaisen rintasyövän uusiutumisen ja etenemisen [7]. Ayala et ai. raportoitu, että menetys strooman Cav-1 osaltaan metastaattisen käyttäytymisen eturauhassyöpäsolujen mekanismilla, johon liittyy säätelyä TGF-β1 ja SNCG kautta Akt aktivaation [13]. Zhao et ai. kertoi, että Cav-1 ekspressiotaso valuuttalisiin ennusti mahasyövässä tuloksia [14]. Karen et al. totesi, että menetys strooman Cav-1 ilmentymisen pahanlaatuisen melanooman etäpesäkkeet ennustettu huono selviytyminen [15]. Kuitenkin strooman Cav-1 ilmentymisen haimasyövän, sekä sen kliinistä merkitystä, jää epäselväksi. Valaista funktio strooman Cav-1 haimasyövän, tutkimme strooman Cav-1 ilmentymisen haimasyövän näytteet, sekä korrelaatio strooman Cav-1-ilmentymisen tuumorimarkkeri HER-2 /neu, ja useiden kiertävässä kasvaimen solut (CTC).

Materiaalit ja menetelmät

potilasnäytteiden

Vuodesta tammikuusta 2007 joulukuuhun 2012 haimasyöpä kudokset (mukaan lukien mitoitettu kasvain kudosnäytteitä ja kudosnäytteiden saatujen alueet 2,0 cm: n kasvain) saatiin 45 potilaalla, joille osittainen pankreatikoduodenektomia (Whipple resektio) haimasyövän laitoksella Maksa ja haiman kirurgian, ensimmäinen ja toinen Affiliated sairaala Xi’an Jiaotong yliopisto. Osa kustakin näytteestä jäädytettiin ja valmis laser kaapata mikrodissektion (LCM); muut näytteen osat kiinnitettiin 10% formaliinilla histologista tutkimuksiin. Kymmenen näytettä, jotka sisältävät normaalin haiman kudoksia potilailta, jotka saivat osittaisen pancreatectomy varten hyvänlaatuiset kasvaimet käytettiin normaalia valvontaa. Niistä 45 tutkimuksessa potilaat, 24 oli miehiä ja 21 naisia. Mediaani-ikä aikaan leikkaus oli 64,5 vuotta (vaihteluväli 44 vuotta 82 vuotta). Kaikkien 45 potilailla oli haiman adenokarsinooma. Kasvain vaiheessa ja histopatologisia luokittelu kirjattiin luokituksen mukaan International Union syöpää vastaan. Kolme potilasta oli vaiheen I kasvaimia, 11 oli vaihe II, 27 oli vaiheen III, ja 4 potilaalla oli vaihe IV kasvaimia. Histologinen kasvain laadut olivat seuraavat: 7 potilaalla oli asteen I, 20 oli luokan II, ja 18 oli asteen III kasvaimia. Kaikki potilaat osallistuivat seurantamenettelyä. Mediaani aika seuranta-aika oli 22 kuukautta (vaihteluväli 4 kuukaudesta 52 kuukautta). Nämä näytteet saatiin luovuttajilta tai lähiomaiset, jotka allekirjoittivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimukset hyväksynyt Institutional Review Board ja eettisen komitean Xi’an Jiaotong University, Kiina.

immunohistokemia

Cav-1 proteiini havaittiin immunohistokemiallisesti käyttämällä standardoituja streptavidiini-peroksidaasilla menetelmällä. Kudosleikkeet (4 um) inkuboitiin yön yli standardin primaarisen vasta-aineen pitoisuudesta. Levyjä inkuboitiin 30 minuuttia biotinyloidun vuohen anti-kani-IgG: tä, jonka jälkeen inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua streptavidiinia 20 min huoneen lämpötilassa. Väri kehitettiin käyttämällä 0,02% Liuosta, jossa oli 3, 3′-diaminobentsidiini 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,6) 5 minuutin ajan ja 7 min. Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, huuhdellaan vedellä, kuivattu, poistetaan, ja kansi liukastui. In negatiivisten kontrollien immunovärjäystä, ensisijainen vasta-aine korvattiin ei-immuuni vuohen tai kanin seerumia. Lukumäärä värjättyä solua 1000 määritettiin mikroskoopilla (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japani) kolmessa näkökentän suurennuksella × 400. Kun kokonaismäärä solujen havaittiin mikroskoopilla oli alle 1000, kaikki solut laskettiin. Värjäys pisteytettiin semikvantitatiivisesti negatiiviseksi (0, ei värjäys), heikko (1; joko hajanainen heikkoa värjäytymistä tai voimakasta värjäytymistä alle 30% stroomasolujen), tai vahva (2; määritellään vahva värjäys 30% tai enemmän stroomasolut). Vasta-aineita Cav-1, vimentiinistä, ja β-aktiini ostettiin Abcam (Cambridge, MA, USA tai Santa Cruz, Kalifornia, USA).

LCM

Jääleikkeitä (5 pm paksu ) haimasyövän, paraneoplastic, ja normaali kudos oli microdissected käyttäen PixCell II LCM järjestelmä (Arcturus Engineering, Mountain View, Kalifornia, USA). Laser talteenottojärjestelmä varustettiin PixCell II kuvan arkistointiohjelmisto. Asetukset Laserin olivat seuraavat: spot halkaisija on 15 um, pulssin kesto on 50 ms, ja teho on 50 mW. Kudos microdissected 10 osiin kunkin näytteen on erillinen ”cap” käytetään kuvaamaan materiaalia kussakin osiossa. Tyypillisesti 2500-3000 laserpulsseille käytettiin kunkin korkki. Jälkeen mikrodissektion, muovikalvo, joka sisältää mikropaloitelluista solut poistettiin muusta korkki, ja kaikki kalvot sisältävän materiaalin yhdestä näytteestä asetettiin mikrosentrifuugiputkeen ja jäädytettiin nestetypessä tai säilytettiin -80 ° C: ssa mRNA uuttamalla . Jäädytetyt leikkeet leikattiin kryostaatissa. Osiot sulatettiin ja asennettu päällystämättömän lasin dioja. Jäädytetyt leikkeet kiinnitetään 70% etanolissa 30 s ja värjättiin H ja (2) puuttuminen kannen slip analysoinnissa mikropaloitelluista kudoksen osassa. Puuttuminen kannen liukua ja indeksi sovitus välillä kiinnitysväliaineet ja kudos aiheuttaa kuivan kudoksen osassa saada valoa taittava laatu, joka peittää solun yksityiskohtia suurilla suurennoksilla. Parantaa visualisointi, pisara ksyleeniä lisätään kudokseen antaa kostumisen ja helpottaa taitekertoimen yhteensopivuuden.

RT-PCR: llä ja Real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin haiman kasvain, paraneoplastic, ja normaalin kudoksen näytteissä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Gibco BRL, Life Technology, Grand Island, New York, USA).

ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttäen RevertAid Kit ( Fermentasilta MBI, Waltham, Massachusetts, USA). PCR-alukesarjat suunniteltiin seuraavasti: 1) CAV-1 (140 bp), välittämään CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 ’ja reverse 5′-CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3′; ja 2) β-aktiinin (179 bp), eteenpäin 5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ’ja reverse 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’. PCR-olosuhteet sisälsivät alkuperäisen denaturoinnin vaihe 5 minuutin ajan 94 ° C: ssa seurasi 22 monistussykliä 30 s 94 ° C: ssa, 30 s 55 ° C: ssa, ja 30 s 72 ° C: ssa. Viimeisen syklin jälkeen, lopullinen pidennys suoritettiin 72 ° C: ssa 10 min. Taloudenhoito geeni, β-aktiini, käytettiin sisäisenä kontrollina.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin Platinum SYBR Green qPCR SuperMix- UDG (Invitrogen, USA) käyttäen Roottorin Gene RG-3000 (Corbett tutkimus, Doncaster Victoria, Australia). Kunkin amplikonin määrä Cav-1 ja β-aktiini määritettiin standardikäyrän avulla, sarjalaimennuksella. Ennen monistamista, näytteitä inkuboitiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja kukin monistaminen sykli koostui denaturaatio 45 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeiden 30 sekuntia 57 ° C: ssa ja pidentäminen 30 sekuntia 73 ° C: ssa. Määrä kohdegeenien cDNA näytteissä laskettiin kynnysarvon (Ct). PCR-signaalit kvantitoitiin densitometrisellä analyysin avulla Määrä Yksi analyysin ohjelmisto.

eristäminen ja kulttuuri Primary Human fibroblastit

valuuttalisiin ja normaalien fibroblastien (NFS) eristettiin haimasyöpä ja ei-syöpä osittainen pancreatectomy yksilöitä, vastaavasti. Näytteet kerättiin ja siirrettiin laboratorioon. Useiden pesujen jälkeen steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), 1 cm

2 osa kudokset pantiin kuoppiin viljelypulloihin. Kun kudos näytti liittää pulloihin (5 h 6 h), Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia lisättiin. Näytteet tarkastettiin päivittäin syntymistä fibroblastien, ja väliaine vaihdettiin 24 tunnin jälkeen ja joka kolmas päivä sen jälkeen. Kudosnäytteet poistettiin viljelmistä, kun fibroblastien oli 70% konfluenssin (noin kaksi viikkoa), ja fibroblastit siirrettiin suuri kudosviljelmässä aluksia. Kaikki fibroblastien käytetty tässä tutkimuksessa olivat kohdista 3 5. Fibroblasteja varmistettiin vimentiinista positiivinen immunohistokemiallisesti värjäytymistä.

immunofluoresenssimääritystä

Eksponentiaalisesti kasvavat solut ympättiin 25 mm neliön lasipeitelevyihin sijoitetaan 35 mm halkaisijaltaan kulttuurin ruokia. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 5 min, läpäiseviksi 0,2% Liuosta, jossa oli Triton X-100 PBS: ssa, ja estettiin 2% naudan seerumin albumiinia (BSA) -PBS 30 min. Laseja inkuboitiin anti-CAV-1 yön yli. Fluoresoiva kuvantaminen saatiin konfokaalisella laserkeilauksen mikroskooppi (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

Fluoresenssi in situ -hybridisaatio

HER-2 /neu-geeni monistettiin ja kaksivärinen (fluoresenssi in situ -hybridisaatio) FISH käyttäen Passvision HER-2 DNA koetinpakkauksen (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten, 4 um kudosleikkeet paistettiin yli yön 56 ° C: ssa ja alistettiin deparaffinization, entsyymidigestiolla ja kiinnitys. Sitten lasit denaturoitiin 70% formamidi /kaksi kertaa standardi suolaliuosta sitraatti 72 ° C: ssa 5 min. Jälkeen puskuri pesun, 10 ui seosta, jossa on kaksi suoraan leimattuja koettimia (HER-2 /neu-spesifinen sekvenssi koetin) lisättiin kudosleikkeiden, ja hybridisaatio suoritettiin 37 ° C: ssa 14 h ja 18 h. Sitten lasit pestään hybridisaation jälkeinen pesu 72 ° C: ssa, vastavärjättiin 4, 6-diamino -2-fenyyli-(DAPI), asennettu, ja säilytetään pimeässä ennen signaalin luettelointia. HER-2 /neu-spektri oranssi koetin sisältää DNA-sekvenssin spesifinen HER-2 /neu-geenin lokuksen ja hybridisoitiin alueen 17q11.2-q12 ihmisen kromosomeja. Kromosomi luettelointi koetin 17 (CEP17) /spektri vihreä koetin sisältävät alfa-satelliitin DNA, joka hybridisoituu D17Z1 lokuksen (sentromeeriantigeenin kromosomin alueen 17) käytettiin kontrollina. Levyjä tarkkailtiin fluoresenssimikroskooppiin varustettu digitaalikameralla (DP50; Olympus, Tokio, Japani). Kunkin näytteen, geenien monistuminen pisteytettiin, kun vähintään 20 syöpäsolun ytimien näytteillä HER-2 /CEP17 suhde ≥2 tai kun HER-2-signaalin klusterin havaittiin.

verinäytteen ottoa ja rikastaminen CTC

suostumuslomakkeet hyväksyi eettisen Review komitean ihmiseen kohdistuvan komitean Xi’an Jiaotong University, Kiina ja jonka kaikki tutkimuksessa potilaat. Ensimmäinen, 7,5 ml näytteitä perifeerisen veren kerättiin BD Vacutainer putkilla (Becton, Dickinson and Company, Franklin, New Jersey, USA) ja pestiin PBS: llä. Välttämiseksi epiteelisolujen epäpuhtaudet injektiokanyyli, kaikki näytteet kerättiin jälkeen hylätään ensimmäiset 2 ml verta. Punasoluja (RBC), sekoitettiin 45 ml: lla lyysipuskuria (155 mM NH

4CL, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM EDTA), minkä jälkeen kierto 8 min ja sentrifugoitiin (600 g 5 min ) poistamiseksi RBC. Saatu solupelletti suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja sen jälkeen niitä inkuboitiin 0,5 ml: lla antileukocyte pintamarkkerin CD45 monoklonaalinen vasta-aine-pinnoitettu magneettisia helmiä 30 minuutin ajan, minkä jälkeen erottaminen magneettiset helmet käyttämällä magneettista jalusta (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Supernatantit siirrettiin uuteen putkeen, ja sen jälkeen sentrifugoitiin 800 g: ssä 3 minuutin ajan. Solupelletit laikullinen lasilevyille, seurasi (im- in situ -hybridisaatio) imFISH värjäystä.

imFISH Värjäys (CEP8-CD45-DAPI) B

Negatiivinen rikastumista kasvainsolujen suoritettiin käyttäen immu- helmet, jonka jälkeen samastuminen sytologia analyysiin. FISH suoritettiin käyttäen sentromeeriantigeenin DNA-koettimia kromosomin 8 (keltainen) (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA), ja immunofluoresenssimäärityksellä suoritettiin käyttäen anti-CD45 (punainen) (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Levyjä pestiin kolme kertaa tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) (10 mM Tris, 2,8 mM KCI, 137 mM NaCl, pH 7,4), joka sisälsi 0,2% BSA: ssa 3 minuutin ajan ja sen jälkeen huuhdeltiin TBS: llä kerran. Solut asentaa kiinnitysväliaine sisältävä ydin- väriaine DAPI. Sokkoutettu tarkastelu loisteputki kuvien kolme teknikot vahvisti identiteettiä CTC kolmesta värin fluoresoiva kuville, jotka suurennettu 400 kertaa. Arviointikriteerit CTC henkilötodistuksensa loisteputki kuvien mukana sekä CEP8≥3 ja CD45 (-) Värjäytymiskuvio päällä olevan DAPI värjäytyminen tumassa.

Tilastollinen analyysi ja potilaiden hoitotuloksiin

Tiedot analysoitiin käyttämällä chi-neliö testi (χ2) tai kaksipuolinen Fisherin tarkkaa testiä, tarvittaessa. Pearsonin korrelaatiokerrointa käytettiin mittaamaan vahvuus yhdistyksen kesken Cav-1, luettelointi CTC, ja HER-2 /neu ekspressiotasoja. Survival laskettiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot tutkittiin log-rank-testi. Tekijöitä todettu merkittäviä valittiin sitten vaiheittain Coxin monimuuttuja verrannollinen riskin malliin määrittää niiden ennustetekijöitä arvoja.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS versio 13.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).

Tulokset

Expression of stroomakasvaimet Cav-1 in Haimasyöpä

Cav-1 ilmaistaan ​​sekä kalvon ja solujen sytoplasmassa [16]. Ekspression tutkimiseksi tilan strooman Cav-1 haimasyövän, käytimme immunohistokemia arvioida haimasyövän, paraneoplastic, ja normaalin kudoksen osia. Tuloksemme osoittivat edustavat kuvat Cav-1 vasta värjätään kudosleikkeiden (Fig. 1), mikä korostaa eroja havaittiin Cav-1 immuunivärjäyty- fibroblastiselle strooman osastoon. Mielenkiintoista, Cav-1 ilmentymisen oli vahva ja lähinnä vain strooman vuonna paraneoplastic ja normaaleissa kudoksissa, mutta havaittiin vain satunnaisesti kasvain strooman. 45 syöpä yksilöitä, 6 (13,3%) potilaista osoittivat korkeita strooman Cav-1 värjäystä, kun taas 8 (17,8%) oli pienempi keskitason värjäystä, ja 31 (68,9%) osoitti poissaolo strooman Cav-1 värjäystä .

Parafiinisektioista immunovärjättiin kuten on kuvattu menetelmät jaksossa. (N) Normaali kudos voimakkaasti positiivisia Cav-1 ilmentymisen; (P) Paracancer kudosta kohtalainen Cav-1 ilmentymisen; (C) Tuumorikudos negatiivinen Cav-1 ilmentymisen (x 400).

PCR Analysoi Laser Otetut näytteet

Menetys strooman Cav-1 on yksi itsenäinen ennustaja varhaisen rintasyövän uusiutumisen ja etenemiseen [17]. Meidän immunohistokemiallista tiedot osoittivat myös alemman strooman Cav-1 ilmentymisen haimasyöpä. Voit tarkistaa immunohistokemiallista dataa edelleen, me erotettu ja puhdistettu strooman käyttäen LCM. Strooman solut haiman yksilöt microdissected onnistuneesti kasvain, paraneoplastic, ja normaali kohdat. LCM tekniikka ei aiheuttanut näkyvää muutosta morfologia leikattiin näytteitä (Fig. 2A). Me peräkkäin analysoitiin mRNA ilmentymisen Cav-1 laser-vangiksi strooman näytteiden RT-PCR ja reaaliaikainen PCR (qPCR). MRNA taso Cav-1 oli merkitsevästi huonontunut laser-kiinni kasvain strooman näytteitä verrataan paraneoplastic ja normaalin kudoksen (kuviot. 2B, 2C) (

P

0,05).

V: Kaavamainen edustaa LCM tekniikkaa. B: mRNA ilmaus strooman Cav-1 laser-kiinni näytteistä määritettynä RT-PCR. C: kvantifiointi mRNA reaaliaikaisella kvantitatiivinen PCR. Tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen kanssa rinnakkaiskokeiden ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (N) Normaali kudos; (P) Paracancer kudos; (C) Tuumorikudos. *

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Expression of Cav-1 in valuuttalisiin, PAFin, ja NFS

Ymmärtääksemme edelleen strooman Cav- 1-proteiinin ilmentymistä haiman strooman (enimmäkseen fibrosyyttien), ensin uutettu valuuttalisiin haiman syöpäsoluja, paracancer liittyvä fibroblasteja (PAFin), paracancerous kudos, ja NFS peräisin ei-syöpä osittainen pancreatectomy yksilöitä. Eri vimentiinista ekspressiotasot strooman valuuttalisiin, PAFin, ja NFS arvioitiin immunohistokemiallisesti analyysi. Nämä tulokset varmisti myös, että meidän solu uutto oli onnistunut (kuviot. 3A, 3B). Myöhemmin me määritetään ja analysoidaan strooman Cav-1 ilmentymisen valuuttalisiin ja NFS värjättiin fluoreseiini merkintöjä-IgG-vasta-konfokaalimikroskopiaa. CAV-1 fluoresenssi signaali valuuttalisiin oli alhaisempi kuin vuonna PAF ja NF yksilöt (Fig. 3C), mikä viittaa siihen, että CAV-1 on menetetty haimasyövän mikroympäristön.

V: Cell morfologiset ominaisuus valuuttalisien, PAFin, ja NFS (x 100). Extracted valuuttalisiin päässä haimasyöpä ja PAFin ja NFS päässä paracancerous kudoksesta ja ei-syöpä osittainen pancreatectomy yksilöitä. B: Eri vimentiinista ekspressiotasot strooman valuuttalisiin, PAFin, ja NFS arvioitiin immunohistokemiallisesti (x 200). C: Cav-1-proteiinin ilmentymistä valuuttalisiin ja NFS värjättiin FITC merkintöjä-IgG vasta-aineella ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla. CAV-1 fluoresenssisignaalisuhteet valuuttalisien on pienempi kuin PAFin ja NFS (x 200). (Valuuttalisiin) Cancer liittyy fibroblastien; (PAFin) Paracancerous liittyy fibroblastien; (NFS) Normaali liittyy fibroblasteissa.

välistä suhdetta stroomakasvaimet Cav-1 Expression ja kliinis parametrit

Taulukko 1 on yhteenveto yhdistysten strooman Cav-1-proteiinin ilmentymisen ja kliinis parametrit haimasyövän . Sidekudosmateriaali Cav-1 tappio nähtiin kuusi 14 vaiheen I ja II tapauksia (42,9%) ja oli merkittävästi alhaisempi kuin vaiheen III (77,8%, 21 27 tapausta) ja vaihe IV tapauksissa (100,0%, 4 4 tapausta ) (

P =

0,018). Stroomakasvaimet Cav-1 tappio liittyi myös imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,014) ja etäpesäkkeiden (

P

= 0,027). Tutkimme myös suhdetta iän, sukupuolen, histologinen luokka, ja kasvaimen kokoa strooman Cav-1 ilme. Kuitenkin tilastollisesti merkitseviä suhteita ei havaittu (

P

0,05).

Menetys stroomakasvaimet Cav-1 korreloi HER-2 /neu Geeniamplifikaation

HER-2 /neu on transmembraaninen kasvutekijän reseptorin yliekspressio, joka on tunnustettu riippumaton haitallisia ennustetekijä useita syöpiä, mukaan lukien haimasyöpä [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25]. Tutkia tarkemmin, onko strooman Cav-1 tappio on haitallinen ennustetekijöiden biomarkkereiden haimasyövän, korrelaatio strooman Cav-1 ilmentymisen ja HER-2 /neu-geenin monistaminen analysoitiin. HER-2 /neu-geenin monistaminen arvioitiin käyttämällä FISH, jota pidetään kultainen standardi mittaamiseksi positiivisten solujen prosenttiosuuden. Tuloksemme osoittivat, että 64,4% haiman adenokarsinooman näytteillä HER-2 /neu-geenin monistaminen (Fig. 4). Stroomakasvaimet Cav-1 tappio oli positiivinen korrelaatio HER-2 /neu-geenin monistaminen (r = -0,697,

P

= 0,000; taulukko 2). Nelinkertaisesti strooman Cav-1 tappio havaittiin näytteissä näyttämällä HER-2 /neu-geenin monistaminen. Sitä vastoin peritumoraalista ja normaali näytteet, strooman Cav-1 ilmentyminen oli suuri, kun HER-2 /neu-geeni ei monistettiin. Lopuksi, strooman Cav-1 menetys korreloi positiivisesti monistamiseen HER-2 /neu-geenin.

(N) Normaali kudos negatiivinen HER-2 /neu-geenin monistamisen; (P) Paracancer kudosta kohtalainen HER-2 /neu-geenin monistaminen; (C) Tuumorikudos positiivisia HER-2 /neu-geenin monistaminen (x 1000).

Menetys stroomakasvaimet Cav-1 korreloi CTC Enumeration

CTC ovat kasvain solut irtoa primaarikasvaimen osaksi verenkierrossa. Läsnäolo CTC perifeerisessä veressä potilaiden on liittynyt etäpesäkkeitä ja huono selviytyminen, vaikka biologinen merkitys CTC johtuvan kasvain genomista epävakaus ja mahdollinen metastaattisen tehottomuus on keskusteltu [26]. Perustuu sen kliinistä merkitystä, CTC suosittelee American Society of Clinical Oncology hyväksyttävänä syöpämarkkerina [27]. Tutkia tarkemmin, onko strooman Cav-1 tappio on haitallinen ennustetekijöitä biologisten merkkiaineiden, korrelaatio strooman Cav-1 ilmentymisen ja CTC luettelointi analysoitiin. Tuloksemme osoittivat, että CTC havaittiin 35.71% (5/14) haimasyövän potilaille, joilla strooman Cav-1 ilmentymisen verrattuna 77,42% (24/31) potilaista, joilla strooman Cav-1 tappio (Fig. 5). Lisäksi merkitsevästi suurempi CTC luettelointi havaittiin potilailla, joilla strooman Cav-1 tappio kuin potilailla, joilla strooman Cav-1 ilmentymisen (18,5 ± 2,0 7,5 ml verta vs. 6,0 ± 1,5 7,5 ml verta). Lopuksi strooman Cav-1 häviö korreloi positiivisesti CTC luettelointia.

V: CTC negatiivinen potilailla, joilla strooman Cav-1 tappio. B: CTC positiivinen, jos potilaalla on strooman Cav-1 tappio. C: CTC negatiivinen potilailla, joilla strooman Cav-1 ilme. D: CTC positiivinen, jos potilaalla on strooman Cav-1 ilme. Valkoiset Mittakaavapalkki osoittaa 10 um (X400).

Prognostic arvot Menetys stroomakasvaimet Cav-1 Potilaat, joilla Haimasyöpä

Voit selvittää ennusteen arvioinnissa peruskudoksen Cav-1 haimasyöpä, olemme analysoineet kumulatiivinen potilaiden selviytymiseen niiden Cav-1 tila (Fig. 6). Stroomakasvaimet Cav-1 poissa, kuten puute värjäys, pidettiin negatiivisena, kun taas heikko tai voimakas värjäytyminen nähtiin positiivinen. Kumulatiivinen eloonjääntiaste strooman Cav-1 negatiivinen potilailla (n = 31) kolmen vuoden kohdalla oli 8,8% (mediaani elinaika 16 kuukautta). Sitä vastoin kumulatiivinen eloonjäämisaste in strooman Cav-1 positiivisten potilaiden (n = 14) oli 20,2% (mediaani elinaika 28 kuukauden), ero, joka oli tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05).

perusteella monimuuttuja-analyysissä, tiivistelmä tai imusolmukkeiden etäpesäke kumulatiiviseen selviytyminen kertaa kolmen vuoden aikana 1,32 (95% CI, 1,10-1,63), ja TNM (III + IV /II + I ) vaiheen (OR = 1,27, 95% CI, 1,15-1,46) oli itsenäinen ennustetekijä yleistä elinaika tutkimuksessa potilailla, joilla haimasyöpä. Menetys strooman Cav-1-proteiini oli myös itsenäinen ennustetekijä yleisen elinaika (

P =

0,006). Kuitenkin kasvaimen halkaisija ja muut kliiniset parametrit olivat riippuvaisia ​​ennustavia tekijöitä.

Keskustelu

Kiinteä kasvaimia ei enää pidetä pelkästään klonaalinen laajennuksia syöpäsoluja. Lisäksi hankittu solun sisäisiä ominaisuuksia, kasvaimen aloittamista ja kasvua tukee runsaasti parenkyymielimen, tulehduksellinen, ja strooman solutyyppejä, jotka soluttautuvat ja ympäröivät kasvain [28]. Meidän havainnot korostavat kehittyvän mikroympäristön ja viittaavat siihen, että hoito olisi kohdistettava sekä neoplastisia soluja ja tukevaa stroomasolujen [29]. Autophagic kasvain strooman malli syövän aineenvaihdunnan [30] viittaa siihen, että menetys strooman Cav-1 keskeisenä säädin on potentiaalinen hoito tavoite, vielä viittaa siihen, että strooman Cav-1 ilmentymisen stroomasoluissa voi olla prognoosi- merkitystä. Lisäksi menetys strooman Cav-1: n on raportoitu olevan ennustaja aikaisin kasvaimen uusiutumisen, imusolmuke etäpesäke, tamoksifeeni kestävyys ja huono kliinistä tulosta ihmisen rintasyövän potilailla [17]. Olemme tutkineet strooman Cav-1 ilmentymisen haimasyövän arvioida mahdollinen rooli strooman Cav-1 ennustetyövälineenä merkki. Stroomakasvaimet Cav-1 vaimentua haimasyövän verrattuna paraneoplastic ja normaalia kudosta. Menetys strooman Cav-1 korreloi kehittyneitä TNM, imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke, ja huono ennuste. Menetys strooman Cav-1 korreloi monistamisen klassinen merkkiaineita kasvaimen etenemiseen (HER-2 /neu-geeni). Vielä tärkeämpää on, menetys strooman Cav-1 liittyi etäpesäkkeitä, koska verenkierrossa olevia kasvainsoluja löydettiin potilaan verestä. Nämä havainnot laajentaa ymmärrystämme toiminta strooman Cav-1 diagnostisena markkerina. Tärkeintä on, tietojemme mukaan tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa, että menetys strooman Cav-1 haimasyövän on negatiivinen prognostinen indikaattori. Kuitenkin työ Witkiewicz et al. [31] paljasti, että koekspressio FASN ja Cav-1 voi olla informatiivinen kliininen markkeri. Witkiewicz et ai. havaitsivat, että Cav-1 ja FASN oli korkeampi ilmaisuja PDA kuin Panin. Lisäksi värjäämällä neoplastisten epiteelisolujen Cav-1 oli myös läsnä fibroblasteissa desmoplastic syövän strooman. Strooman solujen normaalin haiman tai krooninen haimatulehdus kudoksen vieressä kasvainsolut olivat negatiivisia, mikä on ristiriidassa meidän havaintoja. Tämä ero voi johtua siitä mahdollisuudesta, että tutkimuksen Witkiewicz et al. tapahtui immunolokalisoinnissa kahden molekyylin (FASN ja Cav-1), ja tulokset voivat johtua keskinäisen häiriön. Lisäksi käytetty Cav-1 Ab oli erilainen spesifisyys. Menetelmä, jota Witkiewicz et al. (Immunohistokemia) on erilainen kuin tässä tutkimuksessa, jossa PCR käytettiin suhteessa kvantifiointiin. Lopuksi näyte heterogeenisyys voi myös vaikuttaa tuloksiin. Vaikka havainnot Witkiewicz et al. [17] ovat yhtäpitäviä Tutkimuksessamme edelleen tulisi tehdä tutkimus tästä aiheesta.

CTC ovat kasvainsoluja irtoa primaarikasvaimen verenkiertoon. Läsnäolo CTC perifeerisessä veressä potilaista on pitkään liittynyt etäpesäkkeitä ja huono säilyminen [32], ja sitä pidetään nyt hyväksyttävänä syöpämarkkerina [27]. Kuitenkin nykyiset tekniikat ovat rajalliset. Ainoat kaupallisesti saatavilla CTC testi (Cell haku; Veridex LLC, Pohjois Raritan, New Jersey, USA) on havaitsemismäärä 50% myöhäisvaiheen potilaiden [33].