Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että useita tekijöitä, kuten isäntä genetiikka, ympäristö ja ruokavalio voi edistää etenemistä terveen limakalvon kohti satunnaista peräsuolen syöpä. Kertyvät todisteet on lisäksi liittynyt suolistobakteerien sairauteen taudin alkamisen ja etenemisen. Jotta voidaan tutkia ja analysoida koostumuksen suoliston mikrobiston puuttuessa sekoittavia vaikutteita, olemme laatineet eläinmallissa 1, 2-dimetyylihydratsiinin (DMH) aiheuttama paksusuolen syöpä. Mallin, olemme suorittaneet pyrosekvensointi V3 alueen 16S rRNA geenit tässä tutkimuksessa määrittää monimuotoisuuden ja leveys suoliston mikrobien lajia. Meidän tulokset osoittavat, että mikrobien koostumusta suolistossa eroaa huomattavasti ohjaus ja kasvaimen ryhmiä. Runsaasti firmicutes nostettiin taas runsaasti Bacteroidetes ja spirokeettojen pelkistettiin onteloon CRC rotilla. Fusobacteria ei havaittu missään terveet rotat ja ei ollut merkitsevää eroa havaitun proteobacteria lajien verrattaessa bakteerien yhteisöjen välillä kahteen ryhmään. Mielenkiintoista on, että runsaasti proteobacteria oli korkeampi CRC rotilla. Tällä suvun tasolla,

Bacteroides

näytteillä suhteellisesti suurempi runsautta CRC rotilla verrattuna kontrolleihin (14,92% vs. 9,22%,

p

0,001). Samaan aikaan,

Prevotella

(55.22% vs. 26,19%),

Lactobacillus

(3,71% vs. 2,32%) ja

Treponema

(3,04% vs. 2,43%), todettiin olevan huomattavasti runsaampaa terveet rotat kuin CRC-rottia (

p

0,001, vastaavasti). Osoitamme myös merkittävästi vähentää butyraatti tuottavien bakteerien kuten

Roseburia

ja

Eubacteriumilla

suolistossa mikrobiston CRC rotilla. Lisäksi merkittävä kasvu

Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae

ja

Fusobacterium

havaittiin myös kasvaimen ryhmässä. Väheneminen probiootti lajien kuten

Ruminococcus

ja

Lactobacillus

niinikään havaittu kasvain ryhmään. Yhdessä voimme päätellä, että merkittävä ero suolistobakteerikasvuston välillä terveet rotat ja CRC rotilla.

Citation: Zhu Q, Jin Z, Wu W, Gao R, Guo B, Gao Z, et al. (2014) analyysi suolistossa Microbiota eläinmallissa paksusuolisyövän. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10,1371 /journal.pone.0090849

Editor: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 10 joulukuu 2013; Hyväksytty: 30 tammikuu 2014; Julkaistu: 06 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Nature Science Foundation of China (nro 81230057). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Joka vuosi noin 1,2 miljoonaa ihmistä on diagnosoitu kolorektaalisyöpä (CRC) maailmanlaajuisesti [1]. CRC on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja toiseksi yleisin naisilla, joilla useimmissa tapauksissa esiintyy kehittyneissä maissa. Monimutkainen solu yhteisö vallitsee pahanlaatuinen kasvain. Tämä yhteisö on muodostettu onkogeenisesti transformoiduissa soluissa ei-neoplastisia soluja, kuten strooman ja immuunijärjestelmän solujen, ja mikrobit, kuten bakteerit ja virukset joissakin tapauksissa [2]. Monet syöpätyypit liittyvät tartunnanaiheuttajia ja näiden syöpien tehdään usein limakalvokudoksille joilla on korkean tason altistuminen mikrobeille. Jotkut uskovat, että jopa viidennes kaikista syövistä johtuvat tai edistetään tartunnanaiheuttajien [3]. Esimerkiksi, kohdunkaulan syöpä ja mahasyöpä voi johtua ihmisen papilloomavirukset ja bakteeri,

Helicobacter pylori

, vastaavasti [4].

On arvioitu, että solujen kokonaismäärä eri bakteerien lajien ihmisen ruoansulatuskanavassa on 10

14, joka on yli 10-kertainen määrä eukaryoottisten ihmisen soluista [5] ja ehkä jopa 10-kertaisesti enemmän viruksia. Terveessä gut, normaali bakteerifloora ylläpitää homeostaasiin isännän kanssa [6]. Kuitenkin, muutokset bakteerien populaatioita ja niiden aineenvaihduntatuotteiden on liitetty useiden sairauksien, mukaan lukien haavainen paksusuolentulehdus, Crohnin tauti ja CRC [7] – [9]. Ja on kasvava raporttien mukaan suoliston mikrobiston näyttelee tärkeää roolia kehityksessä paksusuolen syövän synnyn [10]. Esimerkiksi eläinmallissa tutkimuksissa mutanttihiirien jotka ovat geneettisesti alttiita CRC todettiin kehittää huomattavasti vähemmän kasvaimia kun ylläpidetään alkio-ympäristöjä [11]. Wei ja hänen kollegansa määräytyy rakenteen muutokset suoliston mikrobiston rottien kehittää precancerous limakalvomuutoksia aiheuttama karsinogeeni DMH hoitoon, ja osoitti, että runsaasti

Ruminococcus

-kuten ja

Allobaculum

kaltainen bakteereita lisääntyi ulosteet DMH saaneilla rotilla [12]. Moore ja työtoverit kertoi myös, että 15 bakteerilajit ihmisen ulosteen kasvisto merkittävästi liittyy suuri riski paksusuolen syövän ja 5 liittyy alhainen riski paksusuolen syöpä [13]. Lisäksi Bacteroides ja Bifidobacterium olivat voimakkaimmin liittyy lisääntynyt riski tutkimuksessaan Valkoihoisilla, Japani, Havaiji, ja Afrikkalainen potilaat. Nämä tutkimukset alustavasti osoittaneet, että oli läheinen suhde suoliston mikrobiston ja kehittäminen CRC [13]. Ei kuitenkaan selkeää yksittäistä bakteerilajit havaittiin riskitekijöiksi CRC koska noin 80% ihmisen bakteereista katsottiin uncultivable [14]. Tämän ongelman voittamiseksi ja tutkia mikrobien monimuotoisuutta, tutkijat ovat kääntyneet alan metagenomics [15]. Vuonna 2011 oli neljä tarkkoja karttoja viitaten yhteydestä ihmisen paksusuolen dysbiosis ja CRC syntyi peräkkäin, mikä raportoinut kolme riippumatonta ryhmää [2], [8], [16], ja useat bakteerilajit todettiin olevan edullisesti asuttavat joko tuumorikudoksista tai ympäröivän ei-kasvainkudoksia. Rikastamista

Fusobacterium spp.

Kasvain näytteissä oli silmiinpistävän samanlaisia ​​niihin dokumentoitu CRC microbiomes. Erityisesti, yksi isolaatti Fusobacteria (CC53), on osoitettu olevan invasiivisuus viljellyissä koolonin adenokarsinooma-2 (Caco-2-solut) [16]. Nämä tutkimukset myös raportoitu suhteellisen runsaasti

Bacteroidaceae

,

Streptococcaceae

,

Fusobacteriaceae

,

Peptostreptococcaceae

,

Veillonellaceae

, ja

Pasteurellaceae

in syöpäkudoksiin verrattuna normaaliin suolen onteloon [17]. Lisäksi jotta voidaan luoda peräsuolen syöpään liittyvien dysbiosis, Sobhani

et al

. tutki ulosteesta mikrobiston normaali ja paksusuolen syöpäpotilaiden käyttävät pyrosekvensointi ja myöhemmät pääkomponenttianalyysi (PCA) [18]. Ja he havainnut koostumuksen muutos suoliston mikrobiston CRC potilaista. Erityisesti

Bacteroides

ja

Prevotella

lajia havaittiin olevan runsaammin syöpäpotilailla kuin verrokeilla. Yhdessä nämä tutkimukset osoittivat, että suoliston mikrobiston voisi olla tärkeä rooli CRC kehittämisessä.

Isäntä genetiikka, ympäristö ja ruokavalio on dramaattinen vaikutus isäntä mikrobisto yksilöiden eri maiden [19] – [20 ]. Siksi voimme todeta, että vaihtelua esiintyy koostumuksessa suoliston mikrobiston johtaa kliinisiin assosiaatioita bakteeritartunta ja CRC. Tässä tutkimuksessa olemme perustaneet eläinmallissa 1,2-dimetyylihydratsiinin (DMH) aiheuttaman paksusuolen syöpä ja suoritettu pyrosekvensointi 16S rRNA geenien verrata mikrobiston sisällä suolen onteloon CRC rottien ja terveillä verrokeilla. Olemme lisäksi tunnistettu bakteeri phylotypes jotka voivat toimia mahdollisina biomarkkereita CRC kehittämiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja reagenssit

neljä viikkoa vanhoja Wistar rottia (180 -200 g) ostettiin Shanghai shriek Laboratory Animal Corporation (Shanghai, Kiina) käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki Eläimiä pidettiin muovisissa häkeissä (neljä tai viisi rottaa /häkki) valvotuissa olosuhteissa kosteuden (44 ± 5%), kevyt (12 h valo /pimeä sykli) ja lämpötilan (22 ± 2 ° C). 1, 2-dimetyylihydratsiinia (DMH) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DMH valmistettiin juuri ennen käyttöä 1 mM EDTA-suolaliuoksella ja pH säädettiin arvoon 7,0 käyttäen laimeaa NaOH-liuosta.

Kokeelliset menetelmät

Neljäkymmentä 4 viikon ikäinen Wistar-rottaa jaettiin kahteen ryhmään a DMH indusoima kasvaimen ryhmä (TG, n = 30) ja ei-DMH-indusoitua kasvaimen ryhmä (kontrolliryhmä, CG, n = 10). Eläimiä sopeutettiin jyrsijöiden ruokavalion ja vesi

mielin määrin

1 viikko. Kun totuttamistiedot, rottia TG olivat vatsaonteloon (i.p.) injektoitiin DMH (40 mg /kg) kerran viikossa 10 peräkkäistä viikkoa. Loput 10 rottaa intraperitoneaalisesti EDTA – normaalia suolaliuosta kontrollina. Eläinten painot kirjattiin kerran viikossa koko koejakson ajan. Alkaa 12. viikolla pöytäkirjan, kolme rottaa lopetettiin 2 viikon välein, jotta voidaan tutkia muodostumista paksusuolen kasvaimista. Eläimiä nukutettiin ketamiinilla 100 mg /kg ja ksylatsiini 15 mg /kg kehon painoa i.p. aseptisissa olosuhteissa. Koko paksusuoli poistettiin kirurgisesti ja avattiin pituussuunnassa. Ulostenäytteitä kerättiin ja jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä. Ulosteesta näytteet siirrettiin myöhemmin -80 ° C: ssa, kunnes DNA: n uuttaminen suoritettiin. Paksusuolen kuvattiin, ja kokonaismäärä kasvainten laskettiin. Histologista tutkimusta, paksusuolen kasvaimet erikseen leikattiin irti ja kiinnitettiin 10% neutraaliin fosfaattipuskuroitu formaliinilla.

histologinen tutkimus

histologista tutkimusta, kiinteään kudokset upotettu ja leikattiin 5 um välein. Kudos värjättiin standardin hematoksyliinillä ja eosiinilla kevyen mikroskooppista tutkimusta. Kudosleikkeet tarkastelleet kahden riippumattoman patologeja sokkotavalla. Eroavaisuuksia näiden kahden tutkijoiden ratkaistiin läpi uudelleenarviointia kolmannen patologi kunnes yhteisen mielipiteen saavutettiin.

Bakteeri-DNA Extraction

Nukleiinihapot poimittiin kustakin ulostenäytteitä menetelmällä muokattu valmistajan ohjeet QIAamp DNA jakkara Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). DNA: n määrää määritettiin Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA). Eheyden ja koko DNA määritettiin 1% (paino /tilavuus) agaroosi- geelielektroforeesilla. Kaikki DNA-näytteet säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Putket, jotka sisältävät vain QIAamp DNA jakkara Mini Kit louhinta kontrollia sisällytettiin koko lyysin ja PCR vaiheet palvelemaan negatiivisia verrokkeja.

PCR ja 454 pyrosekvensointi

Seuraavat universal 16S ribosomaalisen RNA alukkeita: ( 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’, 533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) vastaavat V3 kantojen 16S rRNA-geenin, jossa on näytteen viivakoodin sekvenssin ja FLX Tianium adapterit käytettiin monistamaan V3 alueen kunkin ulostenäyte polymeraasiketjureaktiolla. PCR suoritettiin 10 ng templaatti, 0,4 ui FastPfu Polymerase (transgeeniset Biotech, Kiina), 4 ui 5 x FastPfu puskuria, 2 ul dNTP: tä (2,5 mM kutakin, Takara Bio, Japani), 0,4 ui eteenpäin-alukkeita (5 uM) ja 0,4 il reverse-alukkeita (5 uM) ABI GeneAmp® 9700 cycler. Pyöräily parametrit olivat seuraavat: 5 min denaturaatio 95 ° C: ssa seurasi 25 sykliä 30 sekuntia 95 ° C: ssa (denaturointi), 30 sekuntia annealing 55 ° C: ssa ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa (venymä), jossa lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 5 min. Kolmena kappaleena PCR-reaktiot suoritettiin kullekin näytteelle. Monistetut tuotteet ulosteesta näytteet varmistettiin geelielektroforeesilla käyttäen 5 ui PCR-reaktioseoksesta 2,0% agaroosigeelillä. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä AxyPrepDNA Gel Extraction Kit (Axygen, US) ja kvantitoitiin QuantiFluor ™ -st fluorometri (Promega, USA). Tuotteita eri näytteistä sekoitettiin tasaisin suhdeluvut pyrosekvensointi käyttäen Roche GS FLX 454 Sequencer mukaan valmistajan ohjeiden.

Kaikki pyrosekvensointi lukee poistettiin sitten niiden alukkeiden, viivakoodeja, ja adapteri sekvenssit, ja edelleen seulotaan ja suodatetaan standardien mukaisesti laadunvalvontaa seuraavasti: poistaminen sekvenssit, jotka eivät täysin vastaa proksimaalisen PCR (yli kaksi epäsuhta alukkeisiin), joilla on lyhyet sekvensointi pituus (alle 200 nt) sekvenssit, jotka sisälsivät mononukleotidi toistoja 6 nt, sekvenssit epäselvä merkkiä, tai sekvenssejä luku- laatupisteet 25. Lopuksi, yhteensä 197911 laadukkaita sekvenssit kahdenkymmenen näytteistä tuotettiin, jonka osuus 62,9% on voimassa sekvenssien mukaan barcode- ja alukkeen sekvenssin suodatus.

bioinformatiikka- analyysi Sequencing Data

sekvenssit rinnastettiin käyttämällä SILVA (https://www.arb-silva.de/) tietokantaan, ja rajaaminen operatiivisten taksonomisten yksiköiden (Otus) suoritettiin Mothur 97% sulku mukaan niiden pairwise matkoja. Sitten teimme analyysi Good kattavuutta, monimuotoisuus estimaattorit (Shannon ja Simpson), rikkaus estimaattorit (Chao1 ja ässä), ja alipaine- käyrä käyttämällä Mothur ohjelmistopakettia (https://www.mothur.org/wiki/Main_Page) at 80%: n luotettavuustasolla [21]. Heatmap muodostettiin suvun kanssa tietoja heatmap 2 toiminto R vegaani pakkauksessa. Lisäksi Bray-Curtis yhtäläisyyksiä oli käytetty klusterin dendrogrammina. Olemme myös johti Painottamaton Unifrac etäisyysmittojen analyysin avulla Otus kustakin näytteestä ja suoritetaan Pääkomponenttianalyysin kannalta matriisin etäisyyttä. Metagenomic biomarkkereiden löytö lähestymistapaa työllistetyt LEFSE [lineaarinen erotteluanalyysi (LDA) yhdistettynä vaikutus koko mittaus], joka suoritetaan parametrisen Wilcoxonin summa-rank testi seurasi LDA analyysin avulla online-ohjelmistot (https://huttenhower.sph.harvard.edu /galaxy /) vaikutuksen arvioimiseksi koko kunkin differentiaalisesti runsas luokitusjärjestelmän mukaan [22].

tilastollinen analyysi

t

-testin ja Mann-Whitneyn testi suoritettiin käyttämällä SPSS versio 19.0 for Windows.

Ethics lausunto

Koemenettely tarkasteli ja hyväksynyt eläinten hoidon ja käytön komitea ja eettisen komitean kuudennen kansan sairaalan Affiliated Shanghai Jiao Tong University.

Data Access

16S sekvenssi tuotetut tässä tutkimuksessa on toimitettu NCBI Sequence Lue Archive hakunumerolla SRA098098.

tulokset

Animal mallit ja kasvainten muodostumiselle

mukaan koesuunnitelmalla (kuvio 1A), me lopetettiin kolme DMH saaneilla rotilla kahden viikon välein alkaa 12. viikolla. Adenooma löydettiin alunperin 12. viikolla yksi kolmesta eläinten lopetetaan. Suurin osa adenoomien kuitenkin havaittiin välillä 14. ja 18. viikon (7/9). Valitettavasti kaksi DMH saaneilla rotilla kuoli 19. viikolla paksusuolen tukkeuma ja kakeksia. Kun näytteet 20. viikolla, olemme huomanneet, että kaksi rotat osoittivat, adenokarsinooma (2/3) ja joskus adenooma kudoksen sisällä. Tämän seurauksena päätimme euthanize loppuosa DMH käsiteltyjen rottien samoin kuin kuuluvat kontrolliryhmään 22. viikolla pitääkseen rottien elinkaaren yhdenmukaiset. Ruumiinavauksessa löysimme patologisesti vahvistaneet koolonadenokarsinooma menestyksekkäästi indusoitui yksitoista DMH saaneilla rotilla (11/13) ilman näyttöä elimen etäpesäke. Loput kaksi rotilla ei esiintynyt merkkejä kasvaimen muodostumisen. Kuitenkin yksi eläimistä todettiin epätäydellinen paksusuolen tukkeuma, siis vain kymmenen DMH-käsiteltyjen rottien olivat mukana lopullisissa study group. Samaan aikaan kaikki rotat kontrolliryhmässä säilynyt 22th viikolla. Keskimääräinen painon kymmenen valitun DMH saaneilla rotilla oli 343,5 ± 10,74 g ja 359,3 ± 7,61 g kontrolliryhmässä eläimillä ei ole tilastollista merkitystä (

p

= 0,59). Yksityiskohdat DMH-tuumoreita on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa 1B on esitetty-G.

(A) Kokeelliset menettelyt. (B) Normaali paksusuolen. (C) adenooma (valkoinen nuoli). (D) Adencarcinoma (keltainen nuoli). Veritahra ympärillä kasvain aiheutti kasvaimen haavauma sijaan meidän leikkely. Edustavia mikrovalokuvia esittäen normaalia limakalvo (E), adenooma (F) ja adenokarsinooma (G) on suurennettu 40 × (vasemmalla), ja kukin oikea micrograph (400x) korosti piirin vastaavasta vihreä suorakulmio.

Ominaisuudet 454 pyrosekvensointi

Kaikkiaan 314.880 voimassa sekvenssit saatiin kaikista 20 näytteestä, joissa on keskimäärin 15744 sekvenssien näytettä kohti. Saatu sekvenssit käsiteltiin käyttäen Seqcln (https://sourceforge.net/projects/seqclean/) ja Mothor [23]. Poistamisen jälkeen heikkolaatuinen sekvenssit ( Q25) ja sekvenssit lyhyempi kuin 200 emäsparia, jossa homo- yli kuusi nukleotidia, ja jotka sisältävät moniselitteisiä pohja puhelut tai väärä alukesekvensseissä, yhteensä 197911 korkealaatuisten sekvenssit tuotettiin keskimääräinen pituus on 481 kp sarjaa kohti. Sekvenssit kohdakkain vastaan ​​Silva tietokannasta (SSU111 versio: https://www.arb-silva.de/) käyttämällä k-mer haku (https://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Mahdollisesti kimeeriset sekvenssit havaittiin käyttämällä UCHIME (https://drive5.com/uchime) ja poistetaan. Loput lukee esi-klusteroitu (https://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) ja sitten aihekokonaisuuksien käyttäen korjaamattomia pairwise algoritmia. Yksityiskohtaiset ominaisuuksia kunkin näytteen on esitetty taulukossa 2. Lisäksi Operational taksonominen yksiköt määriteltiin jakaminen 97% sekvenssin samanlaisuus käyttäen Kauimpana naapurin menetelmä (https://www.mothur.org/wiki/Cluster). Kokonaismäärä Otus on 97% samankaltaisuus taso oli 41923, ja keskimäärin 2096 Otus näytettä kohti.

keskiarvon Good kuuluvuudesta kussakin ryhmässä oli yli 80%, mikä osoittaa, että 16S rRNA sekvenssit tunnistettu kaksi ryhmää muodostavat enemmistön bakteerien läsnä tutkittavat näytteet. Kun taas emme tarkkailla tasangolla taittumisen käyrän (kuva S1A) nykyisen sekvensointi, Shannonin monimuotoisuus arviot kaikista näytteistä oli jo vakaa arvot tässä sekvensointi syvyydessä, mikä viittaa siihen, että vaikka tunnistaminen uusia phylotypes olisi odotettavissa ylimääräisistä sekvensointi, välillä monimuotoisuutta näytteet oli kaapattu (kuvio S1B, C, D). Tilastollisesti merkitseviä eroja nähtiin Shannon indeksit välillä kasvaimen ryhmän ja kontrolliryhmän (5,92 ± 0,30 vs. 6,17 ± 0,20,

p

= 0,042, Kuvio S1E). Erot osoittavat, että suurempi monimuotoisuus voisi löytyä noncancerous suolen onteloon rottien kontrolliryhmään, joka on vahvistettu Simpsonin diversiteetti-indeksi (0,024 ± 0,013 vs. 0,013 ± 0,007,

p

= 0,037, Kuvio S1F). Estimaattorien yhteisön rikkaus (Chao1 ja Ace) sekä yksityiskohtaiset ominaispiirteet kunkin näytteen on esitetty taulukossa S1.

vertailu suoliston mikrobiston välillä kontrolliryhmässä ja kasvaimen Ryhmä

mikroflooraan ja koostumukset kaksi ryhmiä analysoitiin ja verrattiin kautta suhteellinen runsaus Otus käyttämällä painottamaton Unifrac etäisyys matriisi kullekin ryhmälle. Myöhemmät tulokset PCA näytteillä, että oli merkittävä ero bakteeri yhteisössä koostumuksessa terveiden rottien ja CRC rotille käyttämällä kahta ensimmäistä pääkomponentti tulokset PC1 ja PC2 (31.32% ja 20,4% selitti varianssi, vastaavasti) (kuvio 2). Lisäksi, LEFSE suoritettiin saamiseksi cladogram edustuksen ja hallitseva bakteerien mikrobiston sisällä kaksi ryhmää, jotka on esitetty kuviossa 3A. Osoitimme myös suurimmat erot taksonien molempien yhteisöjen välillä kuviossa 3B.

Peptostreptococcaceae

,

Erysipelotrichales

,

Coriobacteriaceae

ja

Porphyromonadaceae

rikastuneet CRC rotilla, kun taas

Roseburia

ja

Prevotella

rikastuneet terveet rotat, jotka kaikki olivat keskeisiä phylotypes mukana erottelu suoliston mikrobiston CRC ja terveet rotat mukaisesti lEFSE analyysiin.

Jokainen symboli edustaa näytettä. Punaiset ympyrät edustavat terveet rotat; Sininen ympyrä edustaa CRC rotilla.

(A) Taksonominen edustus tilastollisesti ja biologisesti johdonmukaisia ​​eroja terveet rotat ja CRC rotilla. Erot edustavat väri runsain luokka (punainen osoittaen kontrolliryhmä, vihreä kasvain ryhmä ja keltainen ei-merkitsevä). Halkaisija kunkin ympyrän halkaisija on verrannollinen taksoniin n runsautta. (B) Histogrammi LDA pistemäärät erilaisesti runsas sukuihin. Cladogram laskettiin lefse, ja näytetään niiden vaikutusta koko.

vertaaminen suoliston mikrobiston välillä eri tasoilla terveet rotat ja CRC Rats

Tutkimme bakteeri yhteisöt ulosteesta peräisin suolistossa rotilla tai ilman CRC. Eri phyla ja sukuihin arvioitiin taksonomisen luovutus kaikki sekvenssit ja yleinen mikrobien koostumusta kunkin ryhmän Mollusca tasolla on esitetty kuviossa 4A, B. mukaan taksonomisen tuloksiin, osoitimme, että Bacteroidetes, osuus 79,26% ja 63,95 %: n suoliston mikrobiston terveillä ja CRC rotilla vastaavasti, oli kaikkein hallitseva phylum tutkimuksessamme. Ja firmicutes olivat toissijaisia ​​phylum kanssa osuus 15,14% ja 29,55%, tässä järjestyksessä. Lopuksi -spirokeettakantaan ja proteobacteria muodostivat kolmanneksi yleisin phyla, edistää 3,04% ja 1,06% terveillä rotilla, ja 2,44% ja 2,95% vuonna CRC rotilla, vastaavasti. Koostumus hallitseva phyla on esitetty taulukossa S2. Huomaamme, että mikrobien koostumus osoittaa korkea yksilöiden välisten erojen (kuvio 4C). Firmicutes osuus 3,39% -48,35%, ja Bacteroidetes 43,24% -95,79% kaikista yksittäisistä eläimistä (taulukko 3). Paitsi että, runsaasti Bacteroidetes ja Sinilevien olivat korkeammat suoliston mikrobiston terveiden rottien kuin että CRC rotilla, ja ero osoitti tilastollisesti merkittävä (

p

= 0,044 ja 0,003) (kuvio S2A, B ). Katsovat, firmicutes ja Actinobacteria olivat merkitsevästi vähemmän runsas mikrobiston terveillä rotilla (

p

= 0,01 ja 0,035, vastaavasti) (kuvio S2C, D). Meidän data ei Fusobacteria havaittu missään terveet rotat (kuvio S2E) ja ei ollut merkitsevää eroa proteobacteria (

p

= 0,175) (kuvio S2F), kun verrataan bakteerien yhteisöt kaksi ryhmää, vaikka sen runsaus oli suurempi CRC rotilla. Tilastollisesti merkittäviä eroja kasvaimen ryhmän ja kontrolliryhmän perheiden tasolla suoritettiin myös tutkimuksessamme. Ero suhteellinen runsaus Bacteroidetes (11,6% vs. 4,6%,

p

= 0,0029), Rikenellaceae (3,71% vs. 1,47%,

p

= 0,0008), ja Peptostreptococcaceae (9,18 % vs. 1,61%,

p

= 0,046) olivat merkittäviä välillä CRC rottien ja terveet rotat, vaikka oli erittäin alhaisempi Prevotellaceae (31.91% vs. 62.88%,

p

= 0,0027) ja syanobakteerit (0,3% vs. 0,82%,

p

= 0,003) CRC rotilla kuin terveillä rotilla.

(A) terveet rotat, (B) CRC rottia. Histogrammi edustaa suhteellinen runsaus bakteerien phyla on mikrobiston Kunkin näytteen (C). ”Muut” edustaa luokkiin bakteerit, Actinobacteria, syanobakteerien Deferribacteres, Elusimicrobia, Fusobacteria ja Tenericutes.

Tällä suvun tasolla, tutkimme mikrobien koostumusta kunkin näytteen (kuva S3) ja huomannut niiden olevan merkittävästi erilaisia ​​ryhmien välillä. Kymmenen runsain sukuihin kontrolliryhmässä oli

Prevotella

,

Bacteroides

,

Lactobacillus

,

Treponema

,

Parabacteroides

,

Anaerovibrio

,

Ruminococcus

,

Roseburia

,

Oscillospira

ja

Sutterella

. Kuitenkin

Prevotella

,

Bacteroides

,

Allobaculum

,

Treponema

,

Lactobacillus

,

Blautia

,

Parabacteroides

,

Paenibacillus

,

Anaerovibrio

ja

Paraprevotella

olivat kymmenen runsain sukuihin kasvaimen ryhmässä, vastaavasti (kuva S4). Mielenkiintoista, vaikka

Prevotella

oli runsain suvun molemmissa ryhmissä, runsaus oli huomattavasti korkeampi terveillä rotilla. Tilastollisesti,

Bacteroides

Yli 1% kaikista bakteereista ulosteessa, olivat suhteellisen runsaasti CRC rotilla. Erityisesti on huomattava, suvut

Bacteroides. fragilis

pääasiassa löytyi CRC rotilla. Samaan aikaan,

Prevotella

,

Lactobacillus

ja

Treponema

todettiin olevan huomattavasti suuremmat terveillä rotilla kuin CRC rotille (kuva 5). Suvut

Desulfovibrio

,

Clostridium

,

Actinobacillus

,

Succinatimonas

,

Dorea

,

Phascolarctobacterium

,

Parabacteroides

,

Bilophila

,

Paraprevotella

,

Helicobacter

ja

Paenibacillus

osoittautunut alhaiseksi runsaus; mutta ne olivat kaikki tilastollisesti rikastettu ulosteesta CRC rottien verrattuna terveisiin rottiin. Lisäksi suvut

Roseburia, Eubacteriumilla

ja

Ruminococcus

rikastuneet kontrolliryhmässä, ja

Fusobacterium

oli poissa terveet rotat. Heatmap bakteeri suvun tasolla osoitti myös sama ilmiö (kuva S5). Muihin eroja näiden kahden ryhmän välillä löytyy taulukosta S3.

Mann-Whitneyn testiä käytettiin arvioimaan tärkeää väliset vertailut osoitettu ryhmiin.

Keskustelu

mikrobipopulaatiota suolistossa on heterogeeninen ja monimutkainen. Laboratorio jyrsijät ovat olleet mukana tutkijoita purkaa monimutkaisesta vuorovaikutuksesta, nisäkkäiden, mukaan lukien ihmiset, ovat niiden mikrobien commensals [24]. Olemme hyödyntäneet yhteisen eläinmalli CRC tässä tutkimuksessa tutkia luonnetta mikrobien rakenteen CRC verrattuna terveisiin eläimiin. Tutkimukset suoritettiin eläinmalleissa voisi olla merkittäviä vaikutuksia merkitystä ihmisten sairauksien [25].

Tässä tutkimuksessa vertasimme bakteerien koostumus suolen onteloon rottien terveiden ryhmä ja CRC ryhmä käyttäen alustan Roche 454 sekvensserin. Havaitsimme merkittävän erilaistumista suoliston mikrobiston välillä terveet rotat ja karsinogeeni saaneilla rotilla että kehittyi paksusuolen karsinoomat. Meillä oli suhteellisen korkea runsaasti firmicutes, proteobacteria ja Actinobacteria suolistossa CRC rottien, ja osoitti lisäksi, että Bacteroidetes oli vähemmän runsasta tässä ryhmässä. Tämä tulos on sopusoinnussa samanlaisia ​​havaintoja Zhao

et al.

[26] ihmisen tutkimuksista. On raportoitu, että tulehdukselliset suolistosairaudet kuten Crohnin tauti ja haavainen paksusuolentulehdus ovat tunnettuja riskitekijöitä peräsuolen syövän, ja merkittävä väheneminen Mollusca Bacteroidetes havaittiin näiden kahden sairauksia tutkijat [27] – [28]. Jatkotutkimuksissa, muutokset joukossa sukuja tämän phylum havaittiin myös tutkimuksessamme. Varsinkin, havainto, että

B. fragilis

nostettiin suolistossa CRC rottien.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaiset

Bacteroides

kannat voivat vaikuttaa terveyteen isännän kautta colitogenic tai probiootti potentiaalia. Waidmann ja hänen kollegansa olivat kuvannut eristetty B. vulgates -kanta mahdollista probioottisten propertites joka pystyi parantamaan E. coli aiheuttama koliitti kehitys jota ei vielä tunneta mekanismia interleukiini-2-hiirillä [29]. Kuitenkin ihmisen paksusuolen kommensaali, enterotoxigeeninen

B. fragilis

on osoitettu, että siirtokuntien sitä useissa suoliston neoplasia (Min) hiiret voisi johtaa huomattavaan kasvuun paksusuolen paksuuden, tulehdus ja näkyvä koolonikasvainten joka liittyy aktivoitumisen STAT3 ja soluttautumisen T

H17 tulehdussolujen [30]. Nämä tutkimustulokset ovat yhtä mieltä meidän toteamisesta

B. fragilis

oli kohtauksia CRC rotilla. Lisäksi, proteobacteria on myös raportoitu olevan lisääntynyt mikrobiston eläinten kokeellisesti aiheutetun koliitin ja potilaille, jotka kärsivät IBD [31]. Se voisi olla merkitystä kanssa suora vuorovaikutus proteobacteria ja suoliston solujen kautta bakteerien eritys järjestelmiä, kuten tyypin III eritystä järjestelmä (T3SS) [32]. Lisäksi on raportoitu, että firmicutes järjestetään kyky aseman energiansaannin sadonkorjuun ruokavalion [33]. Firmicutes phylum sisältää tarvittavat sukujen, kuten

Ruminococcus

,

Clostridium

ja butyraatti tuottajat

Eubacteriumilla

,

Faecalibacterium

ja

Roseburia

[34]. Butyraatti on tärkeä energianlähde paksusuolen epiteelisolujen, usein parempana kuin verenkierron glukoosin tai glutamiinin. Jopa 90% butyraatti metaboloituu colonocytes [35]. Tässä näytämme vähennetään runsaasti

Roseburia

ja

Eubacteriumilla

suolistossa mikrobiston CRC rotilla. Kahdessa ruokavalion interventiotutkimuksissa, populaatiotiheyksissä

Roseburia

ja

Eubacteriumilla

oli todettu olevan vahva korrelaatio ulosteen butyraattia pitoisuuksia vastauksena muuttuneessa hiilihydraattien saanti [36], mikä viittaa, että on tärkeää

Roseburia

ja

Eubacteriumilla

tuotannossa butyraattia in vivo. Sengupta

et al.

[37] osoittivat, että voi olla joitakin todisteita siitä, että toimituksen riittävä määrä butyraatti suolen limakalvolle voidaan suojata alussa tuumorigeenisiä tapahtumia. Näin ollen, rakenne epätasapaino tässä asiakirjassa on tärkeä rooli vähentää butyraatti tuottavien bakteerien suolistossa CRC rotilla.

Lisäksi, rakenteen epätasapaino sisällä suoliston mikrobiston CRC rottien merkittävästi liittyy lisäys useita mahdollisia taudinaiheuttajia ja lasku probiootti lajien. On osoitettu, että

Bacteroides

väestön ja erityisesti niille

B. fragilis

tuottaa metalloproteaasi tunnetaan fragilysin paksusuolen syövän potilaille, mutta ei kontrollien. Tämä raportti viittaa siihen, että tämän alaryhmän voisi suosia syövän synnyn [38]. Lisäksi tiivis

Desulfovibrio

vähentää sulfaatti tuottaa rikkivetyä (H

2S), joka on osoitettu olevan kyvyttömiä tuottamaan DNA-vaurion, joka voi olla osittain vastuussa sukupolven genomin epästabiilisuuden ja kumulatiivinen mutaatioiden havaittu peräsuolen syöpä [39] – [40].