Krooninen sairaus

tiivistelmä

Homeostasis eukaryoottisissa kudoksissa on tiukasti säännelty monimutkainen tasapaino prosurvival ja antisurvival signaaleja. Tuumorisuppressorigeenin PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10), dual-spesifisyys fosfataasi, näyttelee toiminnallista roolia solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin. NF-KB: n ja sen loppupään sääntelyviranomaisten (esimerkiksi VEGF) on keskeinen asema ennaltaehkäisyssä apoptoosin edistäminen tulehduksen ja kasvaimen kasvua. Siksi ajattelimme arvioida ilmentymisen PTEN, Poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP), NF-κBp50, NF-κBp65 ja VEGF: n vaikutuksen arvioimiseksi lisäravinteiden kalaöljyn apoptoottisten ja tulehduksellinen signalointia paksusuolen syöpä. Wistar rottia Group sain puhdistettua ruokavaliota, kun taas ryhmän II ja III sai modifioitu täydennettyä ravintoa FO:CO (1:01) FO:CO (2.5:1) vastaavasti. Nämä jakautuvat edelleen kontrolliryhmään, joka sai etyleenidiamiini-tetra etikkahaposta ja käsiteltiin ryhmät saivat dimetyylihydratsiinin-dihydrokloridi (DMH) /viikko 4 viikon ajan. Eläimet tapettiin 48 tunnin kuluttua viimeisen injektion muodosti aloitusvaiheessa ja jotka tapettiin 16 viikon jälkeen muodosti jälkeisessä alkuvaihe. Olemme analysoineet ilmentymä PTEN, NF-κBp50, NF-κBp65 by virtaussytometriin ja ydinvoiman lokalisointi NF-KB immunofluoresenssilla. PARP ja VEGF arvioitiin immunohistokemiallisesti. Aloittamisen vaiheessa, eläimet, jotka saivat DMH on osoitettu lisäävän% apoptoottisten solujen, PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 ja VEGF, mutta post-aloitusvaiheessa ole merkittävää muutosta apoptoosin vähentynyt PTEN ja lisääntynyt PARP, NF-κBp50 NF-κBp65 ja VEGF havaittiin verrattuna kontrollieläimiin. Käsittelemällä molemmat osuus kalaöljyä molemmissa vaiheissa, augmentation% apoptoottisten solujen vähentynyt PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 ja VEGF dokumentoitiin osalta DMH hoidettujen eläinten kanssa tehosteen enemmän kohdistu korkeammat annos jälkeisessä alkuvaihe. Näin ollen, kalaöljy aktivoi apoptoosia, vähentää DNA-vaurioita ja estää inflammatorisia signaloinnin annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla siten, että se estää etenemistä paksusuolen syöpä.

Citation: Kansal S, Bhatnagar A, Agnihotri N (2014) Fish Oil vaimentaa Solukasvunsäätelijä ja Metastaattinen Potential säätelemällä PTEN ja NF-KB: n signaloinnin in peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (1): e84627. doi: 10,1371 /journal.pone.0084627

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2013; Hyväksytty 25 marraskuuta 2013 Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Kansal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Intian neuvoston Medical Research (Immuno /18/11/27/2008-ECD-I). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epidemiologiset raportit ovat osoittaneet, että syöpätapausten kasvaa maailmanlaajuisesti [1]. Syöpä on sairaus, jossa on vapauttaminen soluproliferaation ja solukuoleman. Vuonna syöpäsoluja, endogeeninen signaalintransduktioreitteihin häiriintyvät ohjata solujen päätöksiä erilaistumista ja apoptoosia leviämisen ja, myöhemmin, hyökkäys [2]. Fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) signalointireitin on keskeinen rooli solun eloonjäämisen edistämisessä estämällä apoptoosin. PI3K muuntaa plasmamembraanin lipidi- fosfatidyyli 4,5-bisfosfaatin (PIP

2) fosfatidyyli-3,4,5-trifosfaatti (PIP

3), joka sitten rekrytoi proteiineja, jotka sisältävät pleckstrin homologia (PH) verkkotunnuksen solukalvoissa [3], kuten phosphoinositol riippuvaisen kinaasin-1 (PDK1) ja Akt. Aktivoitu Akt on hallitseva ja olennainen välittäjänä apoptoosin säätelyyn ja leviämisen suuntaamalla eri loppupään alustat: IKB kinaasi, Bcl-2, sytokromi c ym [4], [5]. Aktiivisuus PI3K /Akt-reitin säätelee negatiivisesti fosfataasin ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10 (PTEN). PTEN defosforyloi 3’OH ryhmä ja muuntaa PIP

3 osaksi PIP

2, joka johtaa apoptoosin aktivaatiosta ja siten toimii tuumorisuppressori [6]. Raportit ovat osoittaneet, että ilmentyminen

PTEN

on transkriptionaalisesti tukahdutettu kautta NF-KB: n. NF-KB-koostuu transaktivaation alayksikön RelA /p65: n ja DNA: ta sitova alayksiköt p50 ja p52, joita käsitellään esiasteesta: n p105 ja p100 vastaavasti [7]. NF-KB on erottautuvat sytoplasmassa jonka estäjä IKB estää sen transkription aktivoitumisen stimuloimattomissa olosuhteissa. Tulehduksellisten sytokiinien aiheuttaa fosforylaatio IKB, joka puolestaan ​​vapauttaa NF-KB: n, joka myöhemmin translokoituu tumaan ja vaikuttaa ilmentymistä kohde- geenien, joilla on keskeinen rooli apoptoosin edistäminen kasvaimen kasvua, ja aktivointi tulehdusvasteiden, joka edelleen edistää etäpesäkkeiden lisäämällä ilmentymistä vasucular endoteelin kasvutekijä (VEGF) [8]. Kovalenttisen muutoksia proteiinien Poly (ADP-ribosyyli) ation on välitön ja dramaattinen biokemialliset vasteena DNA-vauriolle. Se on kaikkialla läsnä oleva proteiini muutos löytyy nisäkässoluissa, joka moduloi monia soluvasteita, mukaan lukien DNA: n korjaukseen. Poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) katalysoi polymerointi ADP-riboosin yksiköiden luovuttajalta NAD

+ molekyylien kohde proteiineihin, jolloin kiinnitys lineaarinen tai haarautunut polymeerejä [9]. PARP näytteille pleiotrooppinen solutoiminnoille vaihtelevat ylläpito genomista vakauden ja chromatin remontin sääntelyä solukuoleman, tehden siten PARP homologien lupaava tavoitteita syövän hoidossa [10].

Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että peräsuolen syöpä ( CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä (kun eturauhassyövän ja keuhkosyöpä) ja naisten (rintasyövän jälkeen ja keuhkosyöpä) [1]. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että eri tekijät ovat yhteydessä kehittämiseen CRC [11]. Edellisen kokeet laboratoriossamme ovat osoittaneet, että hallinto kalaöljyä (n-3 PUFA) /maissiöljy (n-6 PUFA) 2,5 /1-suhde on parempi teho verrattuna 1/1 varten kemopreventioon kokeellisesti aiheuttama kolorektaalisyöpä [12]. Toinen tutkimus on osoittanut, että chemopreventive toiminta eri osuus kalaöljyä ja maissi öljy saattaa välittyä läpi Ras signalointireitistä [13]. Yksi toisessa tutkimuksessa meidän lab on osoittanut, että kalaöljy (FO) ja maissiöljy (CO) in 2.5:1 suhde muuttunut mitokondrion kalvon parametrit, ROS, ja Ca

2+ siten lisäämiseksi apoptoosin molemmissa vaiheissa, kun taas FO:CO vuonna 1:01 suhde tehostetun apoptoosin ainoastaan ​​jälkeisessä alkuvaihe [14]. On aikaisemmin osoitettu, että EPA: n ja DHA lisääntynyt taso PTEN, joka puolestaan ​​inhiboi transkriptiota anti-apoptoottisten geenien, joten osoitti suotuisia vaikutuksia kalaöljyn rintojen kasvainsolujen kasvua [15]. Siksi tässä tutkimuksessa tehtiin ymmärtää rooli eri osuus kalaöljyä ja maissi öljy apoptoottisia reittejä ja metastaattista potentiaalia välittyy PTEN ja NF-KB: kokeellisesti aiheutetun paksusuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

N, N ’

-Dimethylhydrazine dihydrokloridi (DMH), PARAFORMALDEHYDILIUOKSISSA (PFA), propidiumjodidia (PI), Hoechst 33342 (H342) ja naudan seerumin albumiinia (BSA ) saatiin Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Monoklonaalinen vasta-aine PTEN hankittiin genescript, Piscataway, NJ, USA. Monoklonaalisia vasta-aineita PARP, VEGF, NF-KB: n p50: n ja NF-KB: n p65 hankittiin Santacruz, CA, USA ja BD Biosciences, MD, USA vastaavasti. Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG

1 ostettiin Bangalore genei, Bangalore, Intia. Maxepa kalaöljy [joka sisältää 180 mg Eikosapentaeenihappo (EPA) ja 120 mg dokosaheksaeenihappoa (DHA) /ml] saatiin Merck Chemicals Limited, Goa, Intia ja Maissiöljy joka sisälsi 58,8% linolihappoa, 26,4% öljyhappoa, 1,3% linoleeni- ja 12,8% tyydyttyneitä rasvahappoja hankittiin Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Mineraali seos (Agrimin) saatiin Virbac Eläinten terveys India Pvt. Ltd., Mumbai, Intia. Kaikki muut kemikaalit käytettiin tutkimuksessa olivat analyyttistä laatua.

Eläimet ja Diet

Wistar rottia, jotka painoivat 100-200 g hankittiin ja sijoitettu Keski Animal House, Panjab University, Chandigarh . Kokeelliset protokollat ​​oli hyväksynyt ”Institutional Animal eettinen komitea, Panjab University, Chandigarh” (Ref. No. 1-12 /IAEC 09.3.2009) ja suoritettu mukaisesti suuntaviivoja ”Intian National Science Academy” käyttöä ja hoito koe-eläimillä. Eläimiä pidettiin vuonna polypropeenia häkeissä eläinten talossa ja sopeutettiin ennen kuin niitä käytettiin kokeellisessa tutkimuksessa. Vettä annettiin

halun

. Viikon kuluttua sopeuttamiseen, eläimet jaettiin satunnaisesti eri ryhmiin ja syötettiin kokeellisia ruokavaliota neljä viikkoa. Koostumus koeruokavalion on annettu taulukossa 1. ruokavalion valmisteltiin pohjalta American Institute of Nutrition standardivertailulannoitteita ruokavalio AIN-76A [16]. Koostumus kaikkien koedieettejä säädettiin siten, että eläimiä kaikissa ryhmissä kuluttaisi saman määrän kaloreita [12].

Experimental Suunnittelu

koeasetelma on esitetty kuviossa . 1. Wistar rottia (N = 96) on tasan jaettu seuraaviin koeryhmään:

Eristetyt colonocytes inkuboitiin Hoechst 342 (H342) väriainetta ja PI. Mikrovalokuvia hankittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse 80

i

) A- kontrolliryhmään, B- DMH käsitelty, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Tummansininen väri edustaa normaalia elävät solut, heikko sininen tai vaaleanpunainen edustaa apoptoottiset solut (suurennus 400 x). E) Graafinen esitys% elävien ja apoptoottisten solujen eri ryhmissä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. n = 4 (

** p 0,01 WRT ohjaus,

### p 0,001 wrt DMH).

kontrolliryhmä) B – Nämä eläimet sai puhdistettua ruokavaliota ja viikoittain vatsaonteloon 1 mM etyleenidiamiinitetra-etikkahappoa (EDTA), pH 6,5, ajan 4 viikkoa.

DMH käsiteltiin

– eläimet tämän ryhmän annettiin puhdistettiin ruokavalio yhdessä viikossa intraperitoneaalisesti DMH (20 mg /kg kehon paino) ja 4 viikkoa.

FO + CO (01:01) + EDTA

eläimet saivat muunnettu ruokavalio täydennettynä 1:01 suhde FO ja CO. viikoittain vatsaonteloon EDTA annettiin myös ajaksi 4 viikkoa.

FO + CO (01:01) + DMH

modifioitu ruokavaliota täydennetään 1:01 suhde FO ja CO annettiin eläimille tämän ryhmän ja viikoittain vatsaonteloon DMH ajaksi 4 viikkoa.

FO + CO (2,5 :1) + EDTA

eläimet tässä ryhmässä annettiin modifioitu täydennettyä ravintoa FO + CO suhde 2.5:1 ja sai viikoittain vatsaonteloon EDTA ajaksi 4 viikkoa.

FO + CO (2.5:1) + DMH

modifioitu ruokavaliota täydennetään FO + CO suhde 2.5:1 annettiin eläimille tämän ryhmän ja viikoittain vatsaonteloon DMH ajaksi 4 viikon ajan.

Kutakin ryhmää jaoteltuna edelleen tutkimuksia aloittamiseen ja post alkuvaiheen ja eläimet jaettiin tasan kahden faasin. Eläimiä, jotka tapettiin 48 tuntia viimeisen EDTA /DMH injektiot muodosti alkuvaihe [17], ja eläimet pidetään 12 viikon kuluttua hoito muodostivat jälkeisessä alkuvaihe tutkimuksessa. Kaikki eläimet tapettiin saattamalla niska sijoiltaan.

eristäminen colonocytes

colonocytes eristettiin menetelmällä Sanders [18]. Koko paksusuoli leikattiin pituussuunnassa paljastaa onteloon ja sijoitetaan lämpimään Ca

2+ ja Mg

2+ free-Hankin puskuroitu suolaliuos (HBSS), 30 mmol /l EDTA: a, 5 mmol /l ditiotreitolia (DTT) , 0,1% BSA (naudan seerumialbumiini). Sen jälkeen, kun 15 min ravistellen inkuboitu 37 ° C: ssa, limakalvon puolella on raaputettiin hellävaraisesti poistamiseksi ehjänä crypts. Eristettyjä soluja sentrifugoitiin 2200 rpm: llä ja pestiin kaksi kertaa lämpimällä HBSS, joka sisälsi 1,3 mM CaCl

2, 1 mM MgSO

4 ja 0,1% BSA: ta. Solut laskettiin käyttämällä hemosytometriä ja niiden elinkelpoisuus tarkistettiin trypaanisinieksluusiolla menetelmä [19].

arviointi elävien ja apoptoottisten solujen

prosenttiosuus elävien ja apoptoottisten solujen arvioitiin immunofluoresenssimenetelmällä . Eristetty colonocytes (1-2 x 10

6) suspensoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja inkuboitiin 10 ui Hoechst 342 (H342) väriainetta (1 mM) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Solut pestiin kahdesti ja suspensoitiin uudelleen PBS: ään. Sitten soluja inkuboitiin 10 ui PI (1 mg /ml) 37 ° C: ssa 10 min. Solut pestiin jälleen ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Mikrovalokuvia hankittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse 80

i

) ja analysoitiin Northern Eclipse kuvantamisen Elements-D (NIS-D) ohjelmistoja. Mikrovalokuvia solujen H342 ja PI yhdistettiin. Vuonna sulautunut mikrovalokuvia solut vaaleanpunainen väri solujen ja solujen tummansininen väri ulkokehällä edustavat apoptoottiset solut ottaa kondensoidaan /hajanainen DNA taas pyörtyi sininen ympäri pidettiin normaalit solut.

Analyysi PTEN, NF KB: n p50 ja NF-KB: n p65 by virtaussytometriin

solunsisäisiä proteiineja arvioitiin virtaussytometriin. Colonocytes fiksattiin 4% paraformaldehydillä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. PBS-pesun jälkeen kahdesti, colonocytes permeabilisoitiin 100% jääkylmällä metanolilla (lisättiin tipoittain) ja jätettiin 15 min -20 ° C: ssa. Solut pestiin jälleen kylmällä PBS: llä kahdesti. Noin 1 x 10

6 solua lisättiin FACS putkeen, suspendoitiin uudelleen saponiini-puskuriin (PBS, joka sisälsi 0,1% saponiinia ja 2% BSA: ta) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Eri eriä colonocytes inkuboitiin sitten laimealla PTEN, NF-KB: n p50: n ja NF-KB: n p65 (1:100) monoklonaalisia vasta-aineita 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen pestiin kerran saponiinia puskurilla. Colonocytes inkuboitiin sitten laimealla FITC konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kerran saponiinia puskurilla ja sitten PBS: llä. Solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Hankinta kustakin näytteestä tehtiin FACS Canto (BD Biosciences, US) ja kerätyt tiedot analysoitiin käyttämällä BD FACS Diva ohjelmisto. Myöhempi säätimet PTEN, NF-KB: n p50 ja NF-KB: n p65 oli myös ajaa samanaikaisesti. Tulokset PTEN, NF-KB: n p50 ja NF-KB: n p65 olivat edustettuina keskiarvo Net MFI (MFI käsiteltyjen solujen Ab – MFI solujen vain).

lokalisaatio NF-KB: n p50 ja NF -κB p65 immunofluoresenssilla

eristetyt kiinteät colonocytes pestiin jääkylmällä PBS: llä kahdesti. Soluja kuivattiin ilmassa lasilevyille (VWR Scientific, Thane, Maharashtra, Intia) ja annettiin kiinnittyä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 ja ei-spesifinen sitoutuminen blokattiin käyttäen 2% (w /v) BSA: lla PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ennen inkubointia laimealla monoklonaalinen vasta-aine NF-KB: n p50 (1 :50) ja NF-KB: n p65: n (1:50) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet pestiin PBS: llä, inkuboitiin laimennetun FITC-konjugoitu anti-hiiri-IgG

1 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin jälleen PBS: llä. Leikkeet vastavärjättiin PI 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten PBS: llä. Leikkeitä asennettu ja sinetöity selkeä kynsien maali. Kuvat hankittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse 80

i

) ja analysoitiin Northern Eclipse kuvantamisen Elements-D (NIS-D) ohjelmistoja. Mikrovalokuvia solujen NF-KB: n p50 /p65 ja PI yhdistettiin. Yhdistämisen jälkeen valomikroskooppikuvat, vihreä väri kertoo ilmentymistä NF-KB: n p50 /p65 sytoplasmassa solun, punainen väri edustaa tumavärjäystä PI ja keltainen väri osoittaa lokalisoinnin NF-KB: n p50 /p65 on solun tumassa .

immunohistokemiallinen arviointi VEGF ja PARP

kudosnäytteiden (2-3 pm paksu) on kiinnitetty poly-L-lysiinillä päällystetty dioja. Levyjä lämmitettiin 65 ° C: ssa ennen deparaffinization ksyleenissä. Objektilasit rehydratoitiin serial alkoholia liuoksia (100%, 90%, 70%, 50%, 30%). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin inkuboimalla diat 3% H

2O

2 (metanolissa) 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kohdat blokattiin käyttäen 2% BSA: ta PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Antigeeni haku tehtiin haku (pH 6,0) käyttämällä mikroaaltouuni (mikroaalloilla 5 min VEGF: n ja 5 min x 2 PARP). Objektilasit annettiin jäähtyä 20 minuuttia. Sen jälkeen antigeeni haku, leikkeitä inkuboitiin VEGF (1:100) ja PARP (01:50) vasta yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Objektilasit pestiin PBS: ssä ja sen jälkeen inkuboimalla 2 tunnin HRP-konjugoidun anti-hiiri-vasta-aine (1:100) ja VEGF: n ja HRP-konjugoitua anti-kani-vasta-aine (1:100) PARP 37 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Objektilasit visualisoitiin käyttäen DAB ja H

2O

2. Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä 2 min, jota seurasi huuhtelu deionisoituun H

2O. Dioja poistettiin vesi ja asennettu DPX analysoitavaksi. Kuvat otettiin ja analysoitiin käyttämällä Nikon Eclipse 80

i

mikroskooppi (Japani) ja Pohjois Eclipse kuvantaminen Elements-D (NIS-D) ohjelmistoja.

Tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD Erot ryhmien arvioitiin ANOVA Todettuaan normaalisuus Q-Q juoni. Ohjelmisto käyttää tilastolliseen analyysiin oli SPSS 18.0 ohjelmistopaketti Windowsille. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Bonferroni monivertailu post hoc testit, ja erot katsottiin merkittäviä p 0,05.

Tulokset

vaikutus lisäravinteiden kalaöljyn apoptoosin /nekroosiin kokeellisesti aiheutetun paksusuolen syövän

esillä olevassa tutkimuksessa,% apoptoottisten solujen laskettiin käyttämällä immunofluoresenssilla ja tulokset on kuvattu kuviossa. 1 ja 2. aloitusvaiheessa, eläimet, jotka saivat DMH ovat osoittaneet merkittävää kasvua% apoptoottisia soluja verrattuna kontrollieläimiin (kuvio 1). Kuitenkin hoidon FO + CO (01:01) + DMH ja FO + CO (2.5:1) + DMH, merkittävä lasku% elävien solujen ja merkittävä augmentation% apoptoottisten solujen havaittiin verrattuna DMH hoidettujen eläinten. On havaittu, että post-aloitusvaiheessa, käsittelemällä DMH, ei ollut merkittävää muutosta, että% apoptoottisten solujen verrattuna kontrollieläimiin (kuvio 2). Saatuaan molemmat suhteet, kalaöljyä ja maissiöljy, on osoitettu, että merkittävä väheneminen% elävien solujen ja merkittävä parannusta% apoptoottisten solujen verrattuna DMH käsiteltyihin eläimiin.

Eristetty colonocytes inkuboitiin Hoechst 342 (H342) väriainetta ja PI. Mikrovalokuvia hankittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse 80

i

) A- kontrolliryhmään, B- DMH käsitelty, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Tummansininen väri edustaa normaalia elävät solut, heikko sininen tai vaaleanpunainen edustaa apoptoottiset solut (suurennus 400 x). E) Graafinen esitys% elävien ja apoptoottisten solujen eri ryhmissä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. n = 4 (

### p 0,001 wrt DMH).

Alteration ilmaus PTEN käsiteltäessä eri osuus kalaöljyä

Kun arvioidaan muutosten in% apoptoottisten solujen saaneet näitä PUFA, me sitten ajateltiin ekspression tutkimiseksi säädin apoptoosin. Tuumorisuppressorigeenin PTEN (fosfataasi ja tensin homologi) on tärkein säädin apoptoottisen signalointireitin. Siksi nykyinen tutkimus, ilmaus PTEN arvioitiin ja tulokset PTEN on esitetty taulukossa 1. aloittamisen vaiheessa virtaussytometria data on kuvattu, että ilmentyminen PTEN kohosi merkittävästi DMH hoidetuissa eläimissä verrattuna kontrollieläimiin ottaa huomioon käsittelemällä eläimet, joilla on eri suhteissa FO + CO, PTEN lisättiin merkittävästi suhteessa kontrollieläimiin, mutta kasvu oli vähäisempää verrattuna DMH käsiteltyihin eläimiin. Jälkeinen alkuvaihe data on osoittanut, että PTEN ilmentyminen väheni merkittävästi hoidon DMH suhteessa kontrollieläimiin. Kuitenkin hoito sekä osuus kalaöljyä ja maissiöljy, PTEN ekspressio lisääntyi huomattavasti. Lisäys oli merkittävämpi kanssa FO + CO (2.5:1) + DMH jälkeisessä alkuvaihe.

vaikutus lisäravinteiden kalaöljyä ja maissi öljy PARP-aktiivisuuden

PARP on runsas DNA: ta sitova entsyymi, joka tunnistaa DNA katkeamisen. PARP-entsyymin on tärkeä rooli eri solun toimintoja, tehden siten PARP lupaava kohde syövän hoidossa [10]. Siksi nykyisessä tutkimuksessa, PARP- analysoitiin tutkia vaikutus eri osuus kalaöljyä ja maissiöljy DNA korjaukseen entsyymiä. Tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä PARP on esitetty kuviossa. 3. paksusuolen limakalvon verrokkieläimestä on kuvattu hyvin maltillinen tai heikko ilmaus PARP. Käsittelemällä DMH, PARP ilmentyminen täydennetty sekä vaiheissa verrattuna kontrollieläimiin. Solut olivat vahvasti positiivisia PARP jälkeisessä aloitusvaiheessa verrattuna alkuvaihe. Kuitenkin vastaanotettuaan eri osuus kalaöljyä ja maissiöljy, ilmaus PARP hylättiin verrattuna DMH hoidettujen eläinten kanssa vaikutus on korostunut kanssa FO + CO (2.5:1) + DMH jälkeisessä alkuvaihe.

immunohistokemiallinen värjäys PARP formaliiniin parafiiniin upotetut leikkeet paksusuolen kudosta. A-D kuvaa edustavan fotomikrograafeja alkuvaiheen ja E-H edustaa jälkeisen alkuvaiheen ( ”nuoli” kuvaa ilmaus PARP). (A ja E) ohjaus, (B ja F) DMH käsitelty, (C ja G) FO + CO (01:01) + DMH, (D ja H) FO + CO (2.5:1) + DMH (suurennus 400X) .

alassäätely NF-KB: n alayksiköt on täydentämistä kalaöljyn

NF-KB-reitin on ratkaiseva tapahtuma tulehduksen aiheuttama kasvaimen kasvua ja etenemistä [20]. NF-KB on kaikkialla läsnä transkription tekijä, joka on keskeinen rooli solujen eloonjäämisen ja solukuolemaa [21]. NF-KB on läsnä sytosoliin sidotussa muodossa IKB. Fosforylaatio seriinitähteit IKB proteiinien IKB-kinaasit (IKKS), kohdistuu IKB varten proteasomaalisten hajoamista. Vapaa NF-KB: n alayksiköt (p50 ja p65) kuljetetaan tumaan, kuten dimeeri, ja kohdistaa promoottorit, jotka johtavat geenien aktivaation, jotka ovat mukana solujen lisääntymisen, invaasion ja solukuolemaa. NF-KB säätelee negatiivisesti PTEN ja edelleen tavoitteita monet anti-apoptoottisia geenejä, kuten Bcl-2 ja Bcl-XL [15]. Näin ollen, kun arvioidaan ekspressio PTEN, me sitten ajatellaan ekspression analysoimiseksi sekä sijaintia molempien alayksiköiden NF-KB: kokeellisesti aiheutetun paksusuolen syöpä.

Expression and Localization of NF-KB: n p65

ilmentymistä NF-KB: n p65 on mitattu virtaussytometriin ja sijaintia tutkittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Virtaus-sytometrinen tulokset alkuvaiheen kuvattu, että ilmentyminen NF-KB: n p65 on merkittävästi kasvanut käsittelemällä DMH verrattuna kontrollieläimiin. Käsittelemällä FO + CO (01:01) + DMH, NF-KB p65 edelleen täydennetty merkittävästi kuitenkin, saatuaan FO + CO (2.5:1) + DMH, ilmentymistä NF-KB p65 oli laskenut huomattavasti verrattuna DMH hoidetuilla eläimillä (taulukko 2). Post-alkuvaihe data on osoittanut, että antamalla DMH, NF-KB: n p65: n ekspressio lisääntyi merkittävästi verrattuna kontrollieläimiin. Käsittelemällä sekä suhteet FO + CO + DMH ilmaisu väheni merkittävästi suhteessa DMH hoidetussa ryhmässä. Lasku oli merkittävämpi kanssa FO + CO (2.5:1) + DMH verrattuna FO + CO (01:01) + DMH.

Koska aktivoitua NF-KB alayksiköiden translokoituvat välillä sytoplasmasta ydin, siis esillä olevassa tutkimuksessa, tumalokalisaatio NF-KB: n arvioitiin myös. Tulokset lokalisointi NF-KB: n p65 on koottu kuva 4. immunofluoresenssilla data on osoittanut, että hoito DMH, että% soluista, joilla on NF-KB: n p65: n tumassa ja sytoplasmassa on lisääntynyt merkittävästi molemmissa vaiheissa verrattuna kontrollieläimiin (kuva 4B 4F). Kuitenkin hoidon eri osuus kalaöljyä ja maissiöljy, lokalisaatio NF-KB p65 alkaen sytoplasmasta tumaan pelkistettiin vaikutus on enemmän merkitty FO + CO (2.5:1) + DMH jälkeisessä alkuvaihe .

eristetyt kiinteät colonocytes tehtiin läpäiseviksi ja inkuboitiin monoklonaalinen vasta-aine NF-KB p65 ja vastaavien FITC konjugoitua sekundaarista vasta-leikkeet vastavärjättiin PI visualisoimiseksi tumaanohjaussignaali. Punainen fluoresenssi edustaa tumavärjäystä PI ilman ilmentymistä NF-KB (kuvattu ”Katkonuolen”) ja vihreän fluoresenssin osoittaa ilmentymistä NF-KB: n p65. Keltainen väri osoittaa lokalisoinnin NF-KB p65 välillä sytoplasmasta tumaan (edustaja ”nuolen”). A-D kuvaa alkuvaiheen ja E-H edustaa jälkeisessä alkuvaihe. (A ja E) ohjaus, (B ja F) DMH käsitelty, (C ja G) FO + CO (01:01) + DMH, (D ja H) FO + CO (2.5:1) + DMH (suurennus 400X) .

Expression ja lokalisaatio NF-KB: n p50

Flow-sytometrinen analyysi on osoittanut, että käsiteltäessä karsinogeeni, ilmentymistä NF-KB: n p50 oli lisääntynyt merkittävästi (p 0,001) sekä vaiheissa verrattuna kontrollieläimiin (taulukko 3). Kuitenkin hoidon FO + CO (01:01) + DMH ja FO + CO (2.5:1) + DMH, ekspressiota NF-KB: n p50 oli laskenut merkittävästi (p 0,001) verrattuna DMH hoidettujen eläinten molempiin aloittamisesta sekä post-alkuvaihe.

Tässä tutkimuksessa, lokalisaatio NF-KB: n p50 välillä sytoplasmasta tumaan tehtiin kaksinkertainen merkintä. Immunofluoresenssikoe data on osoittanut, että käsiteltäessä DMH, että% solujen NF-KB: n p50

+ nucleus ja sytoplasmassa täydennettiin merkittävästi sekä vaiheet verrattuna kontrollieläimiin (kuva 5B 5F). Kuitenkin hoidon eri osuus kalaöljyä ja maissiöljy, lokalisoinnin NF-KB: n p50 alkaen sytoplasmasta tumaan hylättiin kanssa vaikutus on suurempi, FO + CO (2.5:1) + DMH jälkeisessä aloittamista vaihe.

eristetyt kiinteät colonocytes tehtiin läpäiseviksi ja inkuboitiin monoklonaalinen vasta-aine NF-KB p65 ja vastaavien FITC konjugoitua sekundaarista vasta-leikkeet vastavärjättiin PI visualisoimiseksi tumaanohjaussignaali. Punainen fluoresenssi edustaa tumavärjäystä PI ilman ilmentymistä NF-KB (kuvattu ”Katkonuolen”) ja vihreän fluoresenssin osoittaa ilmentymistä NF-KB: n p65. Keltainen väri osoittaa lokalisoinnin NF-KB p65 välillä sytoplasmasta tumaan (edustaja ”nuolen”). A-D kuvaa alkuvaiheen ja E-H edustaa jälkeisessä alkuvaihe. (A ja E) ohjaus, (B ja F) DMH käsitelty, (C ja G) FO + CO (01:01) + DMH, (D ja H) FO + CO (2.5:1) + DMH (suurennus 400X) .

vaikutus kalaöljyn VEGF sekä aloittamista ja post-aloittamisen vaiheeseen paksusuolensyöpä

Angiogeneesi on keskeinen osa normaalia alkion kehitys, vaativat monimutkaisia ​​vuorovaikutuksia endoteelisolujen ja solujen ympäröivään kudokseen. Signalointia VEGF ja niiden reseptorien VEGFRs avainasemassa tässä yhteistyössä [22]. VEGF sitoutuu näihin reseptoreihin ja stimuloi endoteelisolujen proliferaatiota, migraatiota ja selviytymistä. Näin ollen esillä olevassa tutkimuksessa, vaikutus lisäravinteiden kalaöljyä ja maissiöljy on VEGF: n ilmentymistä arvioitiin. Tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä VEGF nykyisen tutkimuksen on kuvattu kuviossa. 6. paksusuolen limakalvon kontrollieläinten on kuvattu heikko VEGF: n ilmentyminen on endoteelisoluissa. Käsittelemällä DMH, VEGF: n ilmentymistä on kohonnut endoteelisolujen paksusuolen sekä vaiheissa verrattuna kontrollieläimiin. Kasvu ilmentymisen VEGF oli huomattavampi jälkeisessä aloitusvaiheessa verrattuna alkuvaihe. Vastaanotettuaan FO + CO (01:01) + DMH, ei ollut merkittävää eroa VEGF: n ilmentyminen in alkuvaiheen verrattuna DMH käsiteltyihin eläimiin, mutta hoito FO + CO (01:01) + DMH jälkeisessä aloitusvaiheessa, VEGF: n ilmentymistä on vähentynyt. Saatuaan FO + CO (2.5:1) + DMH, VEGF: n ilmentymistä on vähentynyt sekä vaiheissa verrattuna DMH käsiteltyihin eläimiin.

VEGF: n ilmentyminen analysoitiin käyttäen immunohistokemia formaliinilla parafiiniin upotetut leikkeet paksusuolen kudosta. A-D kuvaa edustavan fotomikrograafeja alkuvaiheen ja E-H edustaa jälkeisen alkuvaiheen (→ kuvaa VEGF: n ilmentymistä). (A ja E) ohjaus, (B ja F) DMH käsitelty, (C ja G) FO + CO (01:01) + DMH, (D ja H) FO + CO (2.5:1) + DMH (suurennus 400X) .

keskustelu

on osoitettu, että aiemmat raportit että DHA ja EPA, kaksi aktiivisia komponentteja kalaöljyä, estävät transkription NF-KB riippuvainen geeneistä ja lisää ilmaisun PTEN haiman, rinta- ja paksusuolen syövän soluja. Edelliset tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että FO + CO (2.5:1) on parempi chemopreventive teho verrattuna FO + CO (01:01) in kokeellisesti aiheutetun paksusuolen syöpä [12]. Siksi nykyinen tutkimus tehtiin ymmärtää mekanismia chemopreventive toiminnan näiden ravinnon PUFA on apoptoottisia reittejä. Tulokset Tutkimuksemme ovat osoittaneet, että lisäksi kalaöljyä ja maissiöljy ruokavalio kykenee ero chemopreventive vaikutus lisäämällä apoptoosin, jotka voivat välittyä läpi muutoksen ilmaus PTEN: n ja NF-KB: n signalointia.

tärkeä säätelijä apoptoosin on PTEN polku. PTEN antagonisoi PI3K-vaikutusta muuntamalla PIP3 takaisin PIP2, ja siten, vähentää solujen pooli PIP3 [23], [24]. Menetys funktio tuumorisuppressorigeenien PTEN, on yleisin geneettinen poikkeavuus syöpä [25]. Sen lisäksi toimintoja säätelevät PI3K /Akt-reitin, lakkaa toimimasta PTEN aiheuttaa myös geneettinen epävakaus [26].