Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka ohjaavat geenien ilmentymistä kohdentamalla mRNA: t ja käynnistää joko kääntäminen tukahduttamisen tai RNA: n hajoamisen. Kehittyvät todisteet osoittavat potentiaalia osallistumista muuttuneen sääntelyn miRNA patogeneesissä syöpien, ja näiden geenien ajatellaan toimia sekä tuumorisuppressoreilla ja onkogeenit.

Menetelmät /Principal Havainnot

käyttäminen microRNA mikrosiruja me tunnistaa useita miRNA poikkeuksellisesti ilmaistu ihmisen munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa.

miR-221

erottuu erittäin kohonnut miRNA munasarjasyövän, kun taas

miR-21

ja useat jäsenet

let-7

perheen löytyy vaimentua. Julkisia tietokantoja käytettiin paljastamaan mahdollisia kohteita erittäin ilmentyvät eri miRNA. Jotta kokeellisesti määrittää transkriptit, joiden vakaus voi vaikuttaa eri tavalla ilmaistuna miRNA, transfektoimme esiaste miRNA ihmisen syöpäsolulinjoissa ja käytetään oligonukleotidigeenisirumenetelmää tarkastella muutoksia mRNA-tasoja. Kiinnostavaa, oli vähän päällekkäisyyttä ennustetun ja kokeellinen tavoitteita tai kulkuväylillä tai kokeellisen tavoitteiden /reitit on saatu käyttämällä erilaisia ​​solulinjoja, korostaen monimutkaisuus miRNA kohdistinvalinta.

Päätelmä /merkitys

Tuloksemme tunnistaa useita ilmennetty eri miRNA munasarjasyövän ja tunnistaa mahdolliset kohde selostukset, jotka voidaan säädellä näillä miRNA. Nämä miRNA ja niiden tavoitteet voivat olla tärkeitä rooleja aloittamisen ja kehittämisen munasarjasyöpä.

Citation: Dahiya N, Sherman-Baust CA, Wang T-L, Davidson B, Shih I-M, Zhang Y, et al. (2008) MicroRNA Expression ja tunnistaminen Otaksuttavat miRNA tavoitteet munasarjasyövässä. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10,1371 /journal.pone.0002436

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 04 tammikuu 2008; Hyväksytty: 06 toukokuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma NIH, National Institute on Aging.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat 21-23 nukleotidin sääntelyn RNA: iden jalostettu 70-100 nukleotidin hiusneula pre-miRNA [1], [2]. Mirna sisällytetään osaksi ribonukleoproteiini- monimutkainen kutsutaan RNA-induced hiljentäminen kompleksi (RISC) ja ohjata RISC kohde mRNA [3]. Sitoutuminen miRNA kohde mRNA 5’UTR- voi downregulate geeniekspression eston kautta kääntämistä tai lisääntynyt RNA: n hajoamisen. Lisäksi viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että miRNA voi myös upregulate käännöksen tietyissä olosuhteissa [4]. Satoja miRNA on havaittu eri lajien, kuten

C. elegans

, ihmisten ja kasvien

Arabidopsis thaliana

. Uskotaan, että nisäkkään miRNA on potentiaalia säännellä vähintään 20-30% kaikista ihmisen geeneistä [5]. Jokainen miRNA voi kohdistaa jopa 200 selostukset suoraan tai epäsuorasti, ja useita miRNA voi kohdistaa tietyn geenin [6]. Siksi mahdollinen sääntely piiri tarjoamia miRNA on äärimmäisen monimutkainen. Ekspression useita miRNA on osoitettu säädellä kehityksellisesti ja useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA ovat vastuussa määrittämiseksi solujen kohtalon. Nämä tulokset osoittavat, että miRNA on merkittävä rooli perustutkimuksessa solun prosesseja sekä ajoitus solujen kehitystä, hematopoieesin, rasva-aineenvaihdunta, organogeneesin, apoptoosin, soluproliferaatiota ja erilaistumista. On myös vahvaa näyttöä siitä, että miRNA ovat osallisina puhkeamisessa ja etenemisessä monien sairauksien, kuten syövän [3].

vertailu ihmisen syövissä ja niiden normaali kollegansa ovat osoittaneet selvästi miRNA ekspressioprofiileja. Itse asiassa useissa tutkimuksissa on raportoitu säädellään eri tavalla miRNA erilaisissa syöpätyypeissä, kuten rintasyövän [7], keuhkosyöpä [8], krooninen lymfaattinen leukemia [9], paksusuolen syöpä [10], kilpirauhasen karsinoomat [11], haimasyöpä [12], pään ja kaulan alueen syöpä [5], eturauhassyöpä [13], Aivolisäkekasvainten [14], ja munasarjasyöpä [15] – [18]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että jotkut ihmisen miRNA johdonmukaisesti vapautettiin ihmisen syövässä, mikä viittaa rooli näiden geenien kasvainten synnyssä. Erityiset yli-ilmentyminen tai alle ilmentymistä tietyissä miRNA on osoitettu korreloivan erityisen kasvaintyypin [19]. Yliekspressoitu miRNA saattavat kohdistaa tuumorisuppressorigeeneille, kun taas vaimentua miRNA teoreettisesti säädellä onkogeenien. Esimerkiksi

let-7

miRNA, joita alaspäin säännellään keuhkosyöpä, voi säädellä negatiivisesti onkogeenien RAS ja HMGA2, säätämättä säätely näiden onkogeenien [8], [20], [ ,,,0],21]. Siten jäsenet

let-7

perheen toiminta biologisesti tuumorisuppressoreilla ja niiden menetys ennustetaan edistää muutosta ja syövän etenemiseen. Sitä vastoin ihmisen miRNA klusterin

miR-17-92

toimii onkogeenin B-solulymfooman [22] ja keuhkosyövän [23], ja tehdä yhteistyötä

myc

[22] .

Ainutlaatuinen miRNA ilmaisu allekirjoitukset on havaittu olevan yhteydessä bio-molekyyli ja prognostisia ominaisuudet ihmisen keuhkosyövän ja krooninen lymfaattinen leukemia [8], [24], mikä osoittaa, että miRNA allekirjoituksia voidaan käyttää määrittämään biologisten tai kliinisiä piirteitä ihmisen syövissä. Uusien miRNA merkkiaineiden lähitulevaisuudessa edustaa yksi tärkeimmistä tavoitteista molekyylilääketieteen kuin miRNA ekspressioprofiileja ehkä parempi luokitella huonosti eriytetty kasvaimet verrattuna transkriptio-pohjainen luokittelijoiden [19].

On rajoitettu määrä tutkimuksia kirjallisuudessa roolit miRNA munasarjasyövän. Zhang et ai. raportoitu suurtaajuus genomista muutoksiin liittyy miRNA geenien 227 ihmisen munasarjasyöpä, rintasyöpä ja melanooma yksilöt [15]. Toisessa tutkimuksessa 84 kudokset (15 normaali ja 69 pahanlaatuinen) ja 5 solulinjoja analysoitiin muutosta miRNA profile [16]. Lopuksi tutkimus, jossa analysoidaan 10 munasarjojen kasvaimia ja 10 erilaista normaalia valvontaa äskettäin raportoitu [17]. Tässä raportissa kuvaamme sarjan kokeita valottaa muutosten miRNA ilmentymistä munasarjasyöpää ja tunnistaa mahdolliset kohteet asiaan ehdokas miRNA.

Tulokset

miRNA Expression malleja munasarjakudoksessa

miRNA ilmentymisen profiilit määritettiin 34 munasarjasyöpä kudoksissa (taulukko 1) sekä 10 munasarjasyövän solulinjoissa. Immortalisoitu ihmisen munasarjan pintaepiteelin solulinjaa käytettiin ei-transformoitujen ohjaus. Ilmaisu profiilit määritettiin käyttämällä miRCURY ™ LNA miRNA Arrays. LNA: t ovat luokan konformationaalisesti rajoitettu nukleotidianalogeja, jotka lisäävät affiniteettia oligonukleotidin sen komplementaarisen RNA: n tai DNA-kohteeseensa. Exiqon miRNA array on tällä hetkellä kattavin koetinsarjaa saatavilla erilaisia ​​alustan ja mahdollistaa perusteellisen analyysin miRNA ilmaisua. Sen jälkeen RNA hybridisaatio- ja erilaisia ​​analyysi, näytteet ryhmiteltiin niiden miRNA profiilin käyttäen hierarkkinen klusterointi algoritmi JMP 6.0.0 ohjelmisto. Kuvio 1A esittää hierarkkinen klusterointi analyysi kasvaimen kudosten ja solujen linjat, jotka perustuvat yleiseen miRNA ilme. Profiilit osoittaneet ovat suhteessa munasarjojen pinnan epiteelisolujen (HOSE-B-solut). Näytteet on jaettu kolmeen pääryhmään. Keskimmäinen klusteri koostuu kokonaan kasvaimia (17 näytettä), kun taas vasemmalla klusteri sisältää 2 solulinjoja ja 7 ensisijaisen kasvaimia. Oikea klusteri on rikastunut solulinjoissa ja sisältää 8 solulinjojen joukosta 18 jäsentä klusteriin. Hierarkkinen klusterointi toistettiin sitten perustuu paljon pienempi joukko geenejä ja mukana vain 70 erittäin ilmennetty eri miRNA munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Tämä ryhmittely analyysi johti useisiin klustereihin, mutta jälleen, solulinjoja ryhmitelty yhteen 2 eri klustereiden kun ensisijainen kudokset ryhmiteltiin (kuvio 1 B), ehdotetaan tiettyjä eroja miRNA ilmaisun välillä munasarjasyövän kudosten ja solulinjoissa.

Tree syntyy klusterianalyysillä munasarjasyöpä kudosten ja solujen linjat, jotka perustuvat (A) kaikissa testatuissa miRNA kudoksissa ja solulinjoissa, ja (B) differentiaalisesti säännelty miRNA (kertaluokkamuutos 2,0 tai 0,5 yli 60 % näytteistä) kudoksissa ja solulinjoissa verrattuna normaaliin säätelyyn HOSE-B-solujen.

Käyttämällä pääkomponenttianalyysi (PCA) huomasimme, että globaali miRNA ilmaisu voisi erottaa munasarjasyöpä kasvaimia munasarjojen syöpäsolulinjasta (kuvio 2). Ei-tuumorigeeniset ohjaus HOSE-B oli myös ainutlaatuinen ilme kuvio, erotettavissa molemmissa solulinjoissa ja kudoksissa.

Kaksiulotteinen PCA osoittaa, että maailmanlaajuinen miRNA ilmaisu kuviot ovat erilaisia ​​munasarjasyövän solulinjoissa (merkitty sinisellä ), munasarjasyöpä kudokset (näkyy vihreänä), ja ei-tuumorigeenisen HOSE-B-solujen (punaisella).

Differentially ilmaisi miRNA

jälkeen tunnistetaan miRNA, jotka olivat eri tavalla ilmaistuna välillä ei-neoplastisten ja neoplastisten näytteet (kuvio 3A, taulukko 2). Vain miRNA että muutettiin vähintään 2-kertainen vähintään 60% näytteistä pidettiin merkittävinä ehdokkaita. Käyttämällä näitä tiukkoja kriteerejä, tunnistimme 25 ilmen- tymisen lisääntymisen ja 31 vaimentua miRNA välillä ohjaus ja syövän kudoksissa. Samoin tunnistimme 5 voimistunut ja 23 vaimentua miRNA munasarjasyövän solulinjoissa verrattuna ei-neoplastisten HOSE-B-solujen. 14 miRNA vapautui molemmissa kudoksissa ja solulinjoissa ja on lueteltu kuviossa 3A. Määrä miRNA jotka osoittivat downregulation Tuumorinäytteissä (n = 31) sekä syöpäsolulinjoissa (n = 23) olivat korkeampia kuin määrä ilmen- tymisen lisääntymisen (n = 25 kasvainkudoksissa, n = 5 solulinjoissa) miRNA . Tämä on yhtäpitävä aiemmin julkaistu miRNA profilointi tutkimuksia, joista useimmat ovat osoittaneet downregulation miRNA olevan yleisempää kuin säätelyyn ylöspäin syövän [8], [13], [19], [25], [26].

(EN) Venn-kaavio näyttää, kuinka monta miRNA differentiaalisesti ilmaistut munasarjojen solulinjoissa, munasarjasyövän kudoksissa ja molemmissa. Kussakin luokassa, miRNA koholla (merkitty punaisella) ja vaimentua (merkitty vihreällä) esitetään alla kaaviossa. (B) toinen Venn-kaavio näyttää, kuinka monta ilmentyvät eri miRNA yksilöity nykyisessä tutkimuksessa ja määrä miRNA tunnistettavissa 3 edellisessä munasarjasyövän tutkimuksissa. MiRNA yhteistä esitetään alla kaaviossa ja värikoodattu (punainen: kohonnut, vihreä: vähentynyt).

miR-221

oli pisimmälle koholla miRNA molemmissa kudoksissa ja solulinjoissa (9-kertaisesti ja 7-kertaiseksi), kun taas

miR-21

oli merkittävästi vähentynyt molemmissa näytteille (3-kertaiseksi ja 9-kertaiseksi) (taulukko 2). Joukossa eri

let-7

perheenjäsenet,

let-7e

ja

let-7f

osoitti yli 2-kertainen sääntelyn vähintään 60% kasvain näytteiden . Toinen

let-7

perheenjäsenet (

let-7 g

,

let-7d

,

let-7c

,

let-7a -e

,

let-7i

,

let-7a

,

let-7b

ei vaimentua johdonmukaisesti, mutta jokainen niistä löydettiin pieneni 2 kertainen tai enemmän vähintään 20%: n kasvaimia. Kaiken kaikkiaan 94% kasvaimista oli ainakin yksi

let-7

perheenjäsen vaimentua vähintään 2-kertainen. Solulinjat näytteillä downregulation

anna-7

perheen jäsenten kanssa.

let-7f

säädeltiin vähentävästi yli 4-kertaisesti solulinjoissa, kun taas

let-7d

ja

let-7a- e

myös merkittävästi vähentynyt (yli 2,3-kertaisesti ja 2-kertaiseksi).

vertasi differentiaalisesti säännellyn munasarjojen miRNA tunnistettu tässä tutkimuksessa raportoitujen kolmessa edellisessä tutkimuksessa [15] – [17]. Niistä yhteensä 136 miRNA löytyi vapautettiin aiemmissa tutkimuksissa, 16 havaittiin myös tutkimuksessamme (kuva 3B). näistä 16 miRNA, 9 olivat vaimentua (

let-7d

,

miR-106b

,

miR-122a

,

miR-141

,

miR-183

,

miR-195

,

miR-200a

,

miR-335, mir424

) ja 7 voimistunut (

miR-100

,

miR-199

,

miR -296

,

miR-29a

,

miR-29c

,

miR-99a, mir-494

). Mielenkiintoista, raportoimme 56 miRNA että ei ole aikaisemmin löydetty vapautettiin munasarjasyöpä (kuva 3B).

Arvioitu geenikohteet of miRNA geenien

miRNA voi säädellä useita kohdegeenien ja useat tietokannat perustuvat erilaisiin algoritmit ovat käytettävissä ennustamiseen tavoitteiden valitun miRNA. Target Scan 3.0 ja PicTar käytettiin ennustamaan geenikohteet of vapailla miRNA tunnistettu tässä tutkimuksessa. Taulukossa 2 luetellaan top 3 ennustettu tavoitteet mukaan sekä Target Scan ja PicTar kunkin ilmentyvät eri miRNA. Oli vähän päällekkäisyyttä tavoitteiden tunnistetaan kaksi eri tietokantojen ja vain 7 tavoitteet (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2, ja TNKS2) 7 miRNA (

let-7

perhe,

miR-98

,

miR-155

,

miR-195

,

miR-346

,

miR-206

,

miR-335

) on jaettu näiden kahden tietokantojen kun top 3 tavoitteet tutkittiin.

Kokeellinen tunnistaminen miRNA tavoitteiden

lisätutkimuksia mahdollisia kohteita keskeisten munasarjojen miRNA, me yli-ilmentynyt

miR-34c

,

miR-98

,

miR-424

, ja

let-7f

2 munasarjasyövän solulinjoissa (BG -1 ja UCI-101).

miR-424

ja

let-7f

oli vaimentua molemmissa kudoksissa ja solulinjoissa (kuvio 3A), kun taas

miR-34c

ja

miR-98

havaittiin vaimentua munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa, vastaavasti. Kuvio 4 esittää onnistunut yli-ilmentyminen miRNA 72 tuntia transfektion jälkeen. Sitten käytimme Illumina mikrosiruja tutkia mRNA tasoeroja jälkeen yliekspressio näistä ehdokkaista. Taulukot 3 ja 4 luetellaan selostukset, jotka olivat eniten muuttunut merkittävästi seuraavien yli-ilmentyminen miRNA in BG-1 ja UCI-101 solulinjoissa, vastaavasti. Mielenkiintoista, nämä taulukot ovat geenit, kuten

GPX3, MCM7, MSN

jotka ovat aikaisemmin liitetty munasarjasyövän. Niistä merkittävästi muuttunut geenejä (absoluuttinen Z-suhde 1,5), on 10 tunnettuja syöpää geenejä (

MSN, PIM1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1

), 4 kasvain synnyssä (

HF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP

), 26 solusyklin geenit (

ACAT2, CDK5, FDPS, ID1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, SKP2, SNRPA1, VAMP8, WEE1-

), ja 6 liittyvät geenit chromatin remodeling (

ASF1A, GCN5L2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3

). Hyvin vähän päällekkäisyyttä havaittiin ennustetun (Pictar ja Target Scan) ja kokeellinen tavoitteita. Mielenkiintoista, kokeellinen tavoitteet vaihtelivat solulinjan käytetty, viittaa merkittävän vaikutuksen molekyyli- taustalla miRNA kohdistinvalinta. Jotta validoimiseksi Illumina data, RT-PCR suoritettiin 8 geenejä havaittiin tavoitteisiin

let-7f

(

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

yhteissijoitusyhtiöiden-101-solut, ja

TFF1, EEF1A2, ESM1, VIM

, BG-1-solut) (kuva 5). Olemme havainneet, että, vaikka absoluuttiset arvot olivat erilaiset, suuntaukset olivat samoja.

KIF1A

ja

ASS

havaittiin koholla UCI-101, kun taas

FDPS

ja

NTS

oli vaimentua näissä soluissa.

TFF1

ja

EEF1A2

vahvistettiin olevan koholla BG-1, kun taas

ESM1

ja

VIM

oli vaimentua.

pre-

miR-34c

,

Pre-miR-98

, Pre

miR-424

, Pre

let-7f

oli yli-ilmentynyt BG-1 ja UCI-101. Tuotteet kunkin miRNA on esitetty kahtena kahden käytetyt solulinjat. Merkittävä yli-ilmentyminen miRNA vahvistetaan. RT-PCR 18S RNA esitetään kunkin ehdon osoittaa yhtä suuri kuormitus.

Transcripts tunnistaa Illumina paneelit muutettava seuraavat let-7f yliekspressio validoi RT-PCR. Kertamuutoksia geenien

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

(in UCI-101-solut), ja

TFF1

,

EEF1A2, ESM1, VIM

(BG-1 solut) esitetään ja vahvistaa muutokset tunnistetaan Illumina paneelit.

näiden kokeellisten tavoitteet lähtökohtana (taulukko 3 ja taulukko 4), käytimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) paljastaa mahdollisia sairauksia , molekyyli toiminnot, fysiologisten järjestelmien, ja kanoninen reitit ekspressioon liittyviä näiden miRNA BG-1 (taulukko 5) ja UCI-101 (taulukko 6). Ei ole yllättävää, analyysi tunnistettu ”syöpä” on tärkein tauti liittyy näihin ekspressiokuviot molemmissa solulinjoissa. GI tauti myös yleisesti tunnistettu. Mielenkiintoista, solu liike, solusykliä, ja sydän-toiminnot järjestelmien usein liittyvän näihin ekspressiokuvioita. Oli vähän johdonmukaisuuden kanoninen polkuja yksilöity IPA ja lukuun ottamatta integriini signalointia (löydetty seuraavat miR34c tai miR98 ilmentymistä BG-1), yksikään kanoninen polkuja havaittiin useammin kuin kerran taulukoissa 5 ja 6. Tämä arvio viittaa siihen, että samalla kun yleinen reitit vaikuttavat

miR-34c

,

miR-98

,

miR-424

, ja

let-7f

ilmentymistä näissä kahdessa solulinjat liittyvät syöpään, tarkka molekyyli polkuja kohdistettuja ovat vaihtelevia ja riippuvat solulinjassa ja miRNA. Tämä taas viittaa korkean tason monimutkaisuutta miRNA kohdistinvalinta ja sääntelyä.

Keskustelu

Aiempi tutkimus on osoittanut, että tiettyjä miRNA ilmaisu allekirjoituksia eri ihmisen syövissä voi liittyä diagnoosi, ennuste, ja terapian vasteen [27]. Lisäksi on ehdotettu, että tietyt miRNA voi olla ratkaiseva rooli aloittamiseen ja /tai etenemisen ihmisen syövissä kautta niiden vaikutukset eri molekyyli polkuja. Parempi käsitys miRNA ilmentymisen syöpä voi paljastaa uusia molekyyli polkuja, tai uusien mekanismien aktivoinnin tunnettuja reittejä. Käyttämällä Exiqon miRNA array, kattavin miRNA array saatavilla, olemme saaneet miRNA ilmaisun allekirjoitusta munasarjasyövän ja tunnistettu useita miRNA differentiaalisesti ilmaistut munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa sekä otaksuttu tavoitteet useille näistä miRNA.

Olemme tunnistaneet yhteensä 70 miRNA vapautettiin munasarjakudoksessa ja 14 näistä myös poikkeuksellisesti ilmaistu munasarjasyövän solulinjoissa (kuvio 3A). Kaiken kaikkiaan oli suhteellisen vähän miRNA löytyy yhteistä on tässä tutkimuksessa ja aiemmissa tutkimuksissa (kuvio 3B). On olemassa useita mahdollisia selittävät tätä eroa. Ensinnäkin array alustan, jota käytetään tunnistamiseen miRNA on erilainen, ja se voi tuottaa erilaisia ​​kuvioita. Toiseksi materiaali käytimme normaalisti valvonta on erilainen kuin mitä käytettiin aiemmissa tutkimuksissa ja valinta normaalin tiedetään vaikuttavan tulokseen geenin profilointijärjestelmän [28]. Käytimme kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen, kun taas kaksi muuta kolmen miRNA munasarjojen tutkimuksissa käytettiin koko munasarjat. Uskomme, että koko munasarjojen bulk kudos ei ole sopivin normaalin valvonnan munasarja koostuu useista solutyyppejä ja että epiteeli muodostaa vain pienen osa munasarjakudoksen. Käyttö kuolemattomaksi -solukanta myös haittoja, mutta uskomme sen olevan parempi likiarvo normaalin munasarjan epiteelin kudosten kuin seoksen läsnä koko munasarjat. Joka tapauksessa riippumattoman validointi ekspressiokuvioiden on ratkaisevaa, lähteestä riippumatta normaalin kudoksen tai kasvainten tutkimuksessa käytettyjen.

Tunnistamme

let-7f

kuten erittäin vaimentua molemmissa solussa linjat ja kasvaimia. Expression erilaisten

let-7

miRNA on raportoitu olevan alaspäin säänneltävä rintasyöpiä [7], keuhkosyövässä [29], kilpirauhassyöpä [11], eturauhassyöpä [13], ja munasarjasyöpä [15 ] – [17]. Yhdistyksen välillä

let-7

downregulation ja huono ennuste on raportoitu ihmisen keuhkoissa [29] ja rintasyövän [7]. Havainto, että

let-7

perheen miRNA säätelee ilmaus RAS onkogeeni perhe tarjoaa potentiaalisen molekyylitason perustan rooliin

let-7

miRNA ihmisen syövässä [20].

let-7

vuoksi katsotaan olevan tuumorisuppressorina miRNA ja kiinnostavaa,

let-7

geenien kartta lokuksiin poistettu useita syöpiä, kuten munasarjasyöpä [20]. Lisäksi,

let-7f

on raportoitu edistämään angiogeneesiä kohdistamalla anti-angiogeenisten geenien [30]. Nykyinen työ sekä aiemman raporteissa [15] – [17] osoittaa, että jäsenet

let-7

perheen muutellaan munasarjasyövän viittaavat siihen, että

let-7

voi olla tärkeä pelaaja tässä sairaudessa. On tärkeää tunnistaa

let-7

loppupään tavoitteet liittyvät munasarjojen kasvaimien syntyyn.

eniten johdonmukaisesti ja erittäin yliaktiivista miRNA molemmissa kudoksissa ja munasarjasyövän solulinjoissa oli

miR-221

(taulukko 2).

miR-221

on osoitettu olevan erittäin yliaktiivista haimasyöpä [12], glioblastoma [31] ja oli mukana kilpirauhassyöpä [32].

miR-221

on osoitettu kohdistaa onkogeenin KIT [33] sekä tuumorisuppressorigeenin p27kip1 [34].

Vaikka

miR-21

yli-ilmentyminen on havaittiin useita syöpiä, kuten glioblastoma [31], rintasyövän [7], [35], keuhkosyöpä [8], haimasyöpä [36], ihmisen pahanlaatuinen cholangiocyte solulinjoissa [37] ja paksusuolen syöpä [38], löysimme tämän geenin erittäin vaimentua meidän näytteitä. Koska itse asiassa,

miR-21

oli merkittävin vaimentua miRNA munasarjasyövän kun meidän tiedot on keskiarvo kaikkien näytteiden ja solu- linjojen. Meidän havainto on vasta-intuitiivinen, koska on havaittu, että

miR-21

downregulation liittyi lisääntynyt apoptoosi ja laski soluproliferaatiota [35].

miR-21

ehdotettiin toimia onkogeeninä moduloiva tumorigeneesin säätelemällä geenien kuten BCL2 [35], PTEN [37] ja PDCD4 [39]. Tutkimme parhaillaan mahdollisia tavoitteita

miR-21

meidän soluissa sekä mahdolliset syitä sen downregulation järjestelmäämme. On mahdollista, että tavoitteet tiettyjen miRNA voisi olla kudosspesifisiä, joka selittäisi eroja roolit eri miRNA eri kudoksissa.

Muut miRNA löytyi differentiaalisesti ilmaistut sekä kudoksissa ja solulinjoissa ovat

miR-146b

,

miR-508

,

miR-106b

,

miR-134

,

miR-155

,

miR-346

,

miR-422a

,

miR-424

,

miR-519A

,

miR-648

,

miR-662

. Useat näistä miRNA on osallisena muiden maligniteettien tai valvontaa kasvun ja apoptoosin. Esimerkiksi

miR-134

vaimentua solujen kasvua, ja

miR-155

lisääntynyt solujen kasvua keuhkosyövän solut, A549 [40]. Osuus kaikkien näiden pelaajien munasarjojen kasvaimien syntyyn on vielä määrittämättä.

miR-34c

on äskettäin osoitettu olevan transkription kohteena p53 [41], [42] ja voi tukahduttaa leviämisen ja pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa neoplastisten munasarjan epiteelin soluja [42]. Mielenkiintoista, löysimme

miR-34c

vapautettiin munasarjasyövän kudoksiin ja tämä havainto viittaa siihen, että

miR-34c

voi olla rooli munasarjojen kasvainten synnyssä kautta rooli p53-reitin.

Koska kudosspesifisyys miRNA, erilaista miRNA todennäköisesti voimistuvan tai vaimentua syövät eri solun alkuperää, vaikka se on raportoitu, että miRNA allekirjoitukset eri syöpätyyppien erityisesti epiteelin voisi jakaa joitakin yksittäisiä miRNA [ ,,,0],38]. Niistä miRNA jotka ilmoitettiin tästä ilmentyä erilailla munasarjasyövän, useat samalla lailla vapautettu muissa syövissä. Kaiken 31 miRNA tunnistettu olevassa tutkimuksessa on raportoitu myös de-säädellään muu syöpä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi 16 miRNA tunnuksena tässä on aiemmin raportoitu muuttaa munasarjasyöpä (kuvio 3b). Enemmän kiinnostavaa, tunnistamme 56 miRNA joita ei ole aikaisemmin todettu ekspressoituu differentiaalisesti munasarjasyöpä. Nämä miRNA voi olla rooli munasarjojen kasvainten synnyssä ja parhaillaan tutkitaan.

Jotta voitaisiin tunnistaa mahdolliset kohteet ja ilmentyvät eri miRNA munasarjasyövän etsimme kaksi suurta tietokantoja, PicTar ja Target Scan. Huomasimme, että oli hyvin vähän päällekkäisyyttä ennustetun tavoitteet kunkin algoritmin. Itse asiassa vain 7 (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2, ja TNKS2) ennusti tavoitteet jaettu näiden kahden tietokantoihin. Tämä tulos havainnollistaa hyvin dokumentoitu vaikeuksia ennustamisen tavoitteet miRNA [43]. Lisäksi on mahdollista, että tavoitteet voivat riippua solun ympäristöön, (suhteellisesti vähiten eri mahdollisia kohteita voivat vaikuttaa niitä todennäköisimmin vaimentua) lisätään toinen kerros monimutkaisuutta miRNA kohdistinvalinta. Jotta kokeellisesti tutkia muutoksia mRNA-tasojen, me yli-ilmentynyt 4 erilaista miRNA ehdokkaat (

miR-98

,

miR-424

,

miR-34c

ja

let-7f

) 2 solulinjoissa ja arvioidaan transkriptipitoisuuksissa käyttäen Illumina oligonukleotidia array. On selvää, että tämä lähestymistapa voi tunnistaa miRNA tavoitteet, jotka ovat muuttaneet mRNA-tasot (vastakohtana käännös inhibition tavoitteet), mutta se on aiemmin osoitettu, että miRNA voi downregulate tasoja suuri määrä transkriptien [44]. Vaikka jotkut selostukset muuttunut saa edustaa kohdistu suoraa vastaavan miRNA, analysoida tarkemmin yksittäisten ehdokas mRNA: iden voi todistaa siitä ne edustavat suoraan tai toissijaisiin kohteisiin. Nerokkuus Pathway analyysi tavoitteiden paljasti useita reittejä ja järjestelmän mahdollisesti säätelee yliekspressoitu miRNA (taulukko 5 ja taulukko 6). Mielenkiintoista, ennustettu reittejä eivät olleet johdonmukaisia ​​välillä 2 solulinjojen ja jälleen ehdotti, että miRNA tavoitevaihtoehdon ja siksi miRNA toiminto on erittäin kudosta riippuvainen.

Kun ennustettu tavoitteita (saatu PicTar ja Target Scan) verrattiin kokeellisia tavoitteet saadaan Illumina microarray, havaitsimme ole päällekkäisyyksiä. Tämä voi johtua useista syistä. Ensinnäkin algoritmeja tunnistamiseksi miRNA tavoitteita voidaan edullisesti tunnistaa tavoitteet, jotka johtavat translaation tukahduttaminen, joka ilmeisesti ei voida tunnistaa meidän microarray kokeilu. Lisäksi, kuten edellä, on todennäköistä, että miRNA tavoitteet ovat kudosspesifisiä. Suostumuksella tämä mahdollisuus on se, että tavoitteet tunnistimme kokeellisesti olivat täysin erilaiset kahdessa solulinjassa käytimme. Mielenkiintoista, useimmat hyvin ylös säännelty ja säädeltiin (top 10) geenejä on jo raportoitu olevan roolista syövässä tai solun muiden toimintojen liittyvät syöpään (taulukko 3 ja 4), kuten GSTP1 [45], [46], HIF-1 [47], [48], ja SGK [49].

tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet miRNA differentiaalisesti ilmaistut munasarjasyöpä. Ensimmäisenä askeleena määrittäessään roolit munasarjojen kasvainten synnyssä, olemme alkaneet kohteiden tunnistamiseen näiden miRNA. Osoitamme, että ennustettu tavoitteet ovat erilaiset kokeellisten ja että kokeellinen tavoitteet vaihtelevat solujen taustan, jossa miRNA on ilmaistu. Sen vuoksi on tärkeää järjestelmällisesti tutkia jokaisen miRNA useita malleja selventämään niiden roolit munasarjasyöpä. Lisäksi yhdistelmä yliekspressio /kohdistaminen tapahtumia miRNA yhdessä proteiinijärjestelmäksi tekniikka on ratkaisevan tärkeää tunnistaa miRNA: mRNA pelaajat munasarjasyöpä. Kuva, joka todennäköisesti syntyy on erittäin monimutkainen vuorovaikutus miRNA ja kohde- mRNA: iden. Parempi käsitys näistä reiteistä vie meidät vielä lähemmäksi ymmärrystä molekyylimekanismin taustalla tämän taudin ja toivottavasti uusia lähestymistapoja havaitsemista ja hoitoa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Tissue näytteet

Munasarjasyöpä linjat BG-1, UCI-101, hei, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR2, OVCAR3 ja OVCAR5 soluja viljeltiin McCoyn 5A-kasvualustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ( FBS) ja antibiootteja (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä). Munasarjasyövän solulinja OV90 viljeltiin MCBD 105 väliaineessa (Sigma) + Medium 199 (Invitrogen), jota oli täydennetty 15% FBS: ää ja antibiootteja. HOSE-B, munasarjojen pinnan epiteelisolujen mukaisesti kuolemattomiksi E6 ja E7 [50], viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää, antibiootteja ja 5 ng /ml EGF: ää. Kahdeksantoista jäädytetty primääri munasarjojen syöpiä saatiin kautta Collaborative Human Tissue Network Gynecologic Oncology Group (lastensairaala, Columbus, OH). Lisäksi yhdeksän jäädytetty ensisijainen munasarjasyöpä näytteitä ja seitsemän RNA-näytteet (peruskoulusta munasarjasyöpä kudokset) saatiin patologian osaston The Johns Hopkins Medical toimielimet (Baltimore, MD). Histologinen luokittelu kaikissa kudoksissa, on esitetty taulukossa 1, ja kaikki näytteet havaittiin sisältävän suurempi kuin 80% syöpäsoluja.

RNA kvantifiointi

Kokonais-RNA saatiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin ja arvioitiin käyttäen RNA 6000 Nano Kit ja 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, Iso-Britannia).

miRNA mikrosirujen hybridisaatio

miRCURY ™ LNA miRNA Array (Exiqon), koostuvat ohjaus antureista, epäsuhta antureista ja 1458 sieppauskoettimien, täydellisesti yhteensopivat koettimet kaikkien miRNA kaikkiaan organismien selityksin in miRBase Release 8.1, heinäkuu 2006 (ihmisen miRBase 8.2 on myös katettu) käytettiin tässä tutkimuksessa. Pyydystäminen koettimet kattavat 92,3% of miRNA selityksin in miRBAse 9.0. Ohjaus koettimet sisältää 10 piikki-hallinnassa mittapäistä optimaalisen merkintöjä ja hybridisaatio, kahdeksan negatiivinen sieppauskoettimien ja kaksitoista sieppauskoettimien jotka hybridisoituvat pienen ydin- RNA: ita. RNA merkintöjä ja hybridisaatio valmistui mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, RNA: ta kustakin näytteestä leimattiin Cy3: lla käyttäen miRCURY ™ LNA miRNA Array -leimauskittiä. Sen jälkeen merkintöjä, näytteet ladattiin microarray luistin ja inkuboitiin 16-18 tuntia 60 ° C: ssa.