Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resistance TKI hoito on merkittävä este tehokkaan hoidon NSCLC. Paitsi EGFR mutaatio asema, vaikutusmekanismeista ovat suurelta osin tuntemattomia. Jotkut todisteet tukevat rooli microRNA 21 moduloinnissa huumeiden herkkyyden kemoterapiaa mutta sen rooli NSCLC TKI vastus on edelleen tutkimaton. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, NSCLC miR-21 välittämää vastus TKI johtuu myös PTEN kohdistaminen. Täällä näytämme miR-21 edistää syövän negatiivisesti säätelevä PTEN ilmentymistä ihmisen NSCLC kudoksissa: korkea miR-21 ekspressiotasoja liittyivät lyhyempi DFS 47 pienisoluista keuhkosyöpää; korkea miR-21 /alhainen PTEN ekspressiotasot osoitti huono TKI kliininen vaste ja lyhyempi kokonaiselossaoloaika toisessa 46 NSCLC potilailla, jotka saavat TKI hoitoa.

In vitro

määritykset osoittivat, että miR-21 oli säädelty samanaikaisesti alas-säätely PTEN in PC-9 /GR soluja verrattuna PC-9 solua. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-21 väheni merkittävästi gefitinibin herkkyyttä alaspäin säätäminen PTEN ilmaisun ja aktivoimalla Akt ja ERK reittejä pc-9 solua, kun taas miR-21 Knockdown dramaattisesti palautettu gefitinibi herkkyys pc-9 /GR solujen ylä- sääntely PTEN ilmentymisen ja inaktivaation AKT ja ERK polkuja,

in vivo

ja

in vitro

. Ehdotamme muuttaminen miR-21 /PTEN ilmaus uutena mekanismi TKI vastarinnan NSCLC syöpä. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusi perusta käyttäen miR 21 /PTEN-pohjainen hoitostrategioiden kääntää gefitinibin vastarinnan NSCLC.

Citation: Shen H, Zhu F, Liu J, Xu T, Pei D, Wang R, et al. (2014) muutos Mir-21 /PTEN Expression Moduloi Gefitinibi Resistance in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10,1371 /journal.pone.0103305

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2014; Hyväksytty: 27 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 24 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (81101705 ja 81272532), Jiangsun maakunnassa kliinisen tieteen ja teknologian hankkeita (kliininen tutkimuskeskus, BL2012008) ja Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (BK2011852). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti. [1] Valitettavasti huolimatta kehitys syövän varhainen havaitseminen, suurimmalla osalla potilaista NSCLC diagnosoidaan myöhäisvaiheen tauti, johtaen huonon ennusteen kanssa mediaanielossaolosta vain 10-12 kuukausi. [2], [3] kehittäminen lääkkeiden, jotka kohdistuvat epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), kuten EGFR-TKI (gefitinibi ja erlotinibi) on parantanut tehokkuutta NSCLC hoitoa. Itse asiassa läsnäolo aktivoivia EGFR eksonin mutaatioita avainasemassa ennustettaessa terapeuttista tehoa EGFR-TKI. [2] Nämä aktivoivat EGFR mutaatioita usein merkittävästi korreloi adenokarsinooma liittyvä histologia, tupakointi asema, sukupuoli, ja etnisyys. [3] Siten EGFR-TKI on suositeltavaa, koska ensimmäinen rivi hoito pienisoluista keuhkosyöpää EGFR mutaatioita. Valitettavasti niiden kliinisestä tehokkuudesta rajoittaa kehittämällä hankittu resistenssi: Useimmilla potilailla, jotka alunperin reagoivat sittemmin kokemaan sairauden etenemisen kanssa jatkuvan käytön TKI noin 9-11 kuukautta; [4] noin 50% potilaista, jotka aluksi vastata EGFR-TKI resistenteiksi EGFR-TKI, kun taas EGFR T790M mutaatio exon20 osuus 50% tästä hankittu resistenssi; [4] toinen 20%: TKI hankittu resistenssi johtuu MET vahvistusta. [2] On edelleen epäselvää, kuinka jäljellä 30% potilaista kehittää hankittu resistenssi.

MicroRNA (miRNA), tiedetään luonnostaan ​​tukahduttaa mRNA pariksi kanssa 3′-alue (UTR) mRNA oli osoitettu moduloivat negatiivisesti ilmentymisen kohdennettuja geenejä. [5], [6] geenejä sääntelyviranomaisten miRNA säädellä noin kolmasosa geenien ja tärkeitä rooleja solun toimintoja kuten solujen lisääntymisen, kasvun, erilaistumisen ja apoptoosin. [7], [8] Viime vuosina keskeistä roolia miRNA in on osoitettu syövän. [9] Lisäksi jotkut miRNA toimivat tuumorisuppressoreilla

in vitro.

[10], [11] Näin ollen, yli-ilmentyminen tällaisten miRNA voi tukahduttaa kohdeproteiinit, jotka toimivat syöpää tekijöitä. [7], [12] Toisin kuin lyhyt häiritsevä RNA, miRNA uskotaan säädellä samaa reittiä eri tasoilla. [10] MiR-21 on tärkeä onkogeenisen miRNA, liittyy läheisesti tuumorin kasvun ja etäpesäkkeiden. [13], [14] Itse asiassa ilmaus miR-21 osoitettiin liittyvän huonoon ennusteeseen ja Chemo-herkkyyttä koolonadenokarsinooma. [15], [16] Lisäksi anti-miR-21 tukahdutti solujen kasvua rintasyövän kautta alas-sääntely antiapoptoottisten tekijä, B-solulymfooma 2 (Bcl-2). [17], [18] Nämä tiedot, yhdessä tukevat tärkeä tehtävä muuttaa miR-21 ilmentyminen aikana kasvainten kehittymiseen. Joten, tutkimme miR-21 moduloi TKI herkkyyttä NSCLC potilaille.

Huomasimme, että säätely ylöspäin miR-21 ja alas-säätely PTEN 47 NSCLC kasvaimen kudokset verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, ja että niiden ekspressiotasot korreloivat negatiivisesti. miR-21 ilmentyminen korreloi lyhyempi DFS 47 pienisoluista keuhkosyöpää. Lisäksi meidän tiedot osoittivat hyvää korrelaatiota korkean miR-21 /alhainen PTEN ekspressiotasot ja huono TKI herkkyys lyhyillä eloonjäämiseen 46 NSCLC potilailla, joille tehdään TKI hoitoa. Siksi me arveltu, että muuttaminen miR-21-PTEN ilmaisu moduloi TKI herkkyys keuhkojen syöpäsoluja. Huomasimme, että miR-21 oli säädelty concomittantly down-regulation PTEN in PC-9 /GR soluja verrattuna pc-9 solua,

in vitro

. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-21 väheni merkittävästi gefitinibi herkkyyttään säätely alaspäin PTEN ilmaisun ja aktivointi Akt ja ERK polkuja, kun taas knockdovvn miR-21 dramaattisesti palautettu gefitinibi herkkyys pc-9 /GR soluihin ajan säätelemällä PTEN ilmaisun ja inaktivoimalla AKT ja ERK signalointireitteihin, sekä

in vivo

ja

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

gefitinibi oli ystävällinen lahja AstraZeneca (Tocris, Yhdistynyt kuningaskunta). Vasta-aineet PTEN, fosfo-ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser-473), ja koko AKT ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet ERK2 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Vasta-aineet GAPDH saatiin Kangcheng Company (Shanghai, Kiina). Lipofectamine ja TRIzolia reagenssit hankittiin Life Technologies (Grand Island, NY, USA). MiR-21 jäljittelee ja miR-21-estäjä toimittivat GenePharma (Shanghai, Kiina). High Capacity RNA-cDNA Kit ja Power SYBR Green PCR Master Mix hankittiin Applied Biosystems (Carlsbad, CA). PC-9 solulinjat hankittiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences, Shanghai, Kiina. PC-9 gefitinibi resistentti solulinja (PC-9 /GR), joka indusoitiin arkun PC-9 solujen kasvavia pitoisuuksia gefitinibin kuten raportoitu aiemmin [19], [20], oli ystävällisesti Syöpätautien, Shanghai Keuhkojen sairaala, Tongjin yliopisto, Shanghai.

Kliiniset näytteet

Pariksi ihmisen NSCLC näytteitä (n = 47) ja vastaaviin normaaleihin vieruskudos kerättiin potilailta, joille suoritetaan standardin kirurgisten ensimmäisessä Affiliated Hospital Nanjing Medical University, Jiangsu (Kiina), kirjallisen tietoisen suostumuksen potilaista. Osa kustakin kudosnäyte oli heti pikajäädytettiin nestemäisessä typessä kun taas toinen osa kiinnitettiin formaliiniin histologista tutkimusta varten.

Parafiini upotettu näytteitä potilaista, joilla NSCLC (n = 46), jotka saivat EGFR- TKI hoito, kerättiin patologian osaston ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University, Jiangsu (Kiina), joissa kirjallinen lupa potilaista. Kaikki näytteet histologisesti luokitellaan ja porrastettu TNM vaiheessa sokkoutettu kliininen patologi. Kaikki koeprotokollaa hyväksynyt Institutional Review komitean ensimmäinen Affiliated sairaala Nanjing Medical University, Nanjing (Kiina).

Soluviljely

Ihmisen pc-9 ja pc-9 /GR solu linjat, ja HEK293T-soluja viljeltiin RPMI ja DMEM, vastaavasti, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ympäristössä, joka sisältää 5% CO

2 .

Cell transfektio

Hsa-miR-21 tai HSA-miR-NC jäljittelee transfektoitiin PC-9-soluissa käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Life Technologies), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lopulliset pitoisuudet HSA-miR-21 tai HSA-miR-NC jäljittelee varten transfektion oli 40 nM. Samanlaista menettelyä käytettiin transfektoimaan miR-21-estäjä (40 nM) tai NC osaksi PC-9 /GR-solut.

solunelinkykyisyysmääritys

Pc-9 ja Pc-9 /GR-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 4 x 10

3 solua /kuoppa ja annettiin kiinnittyä yön yli. Samanaikaisesti, Pc-9-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja transfektoitiin miR-21 matkivat ja NC 24 tuntia, kun taas PC-9 /GR-solut transfektoitiin miR-21-estäjä. Jälkeen soluadheesiota, gefitinibi lisättiin loppukonsentraatioon 2,5-40 umol /l. 72 tunnin kuluttua inkubaation Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jokainen näyte maljattiin kolmena kappaleena ja kolmen erillisen kokeen tehtiin.

Lentivirusvektorikonstruktit pakkaus ja vakaa solulinjan perustaminen

vakaasti pudotus miR-21 ilmentyminen PC-9 /GR soluja, lentiviruksen pakkaus kit (Thermo Fisher Scientific) käytettiin. Lentivirusta kuljettavat miR-21-estäjän tai negatiivinen kontrolli (miR-NC) pakattiin seuraten valmistajan ohjeita. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) geenin, insertoitiin pakkausjärjestelmän ja koekspressoitiin miRNA. Lentivirus pakattiin HEK293T-soluissa ja eritetyn. Pc-9 /GR-solut tartunnan lentivirus kuljettavat miR-21-estäjä tai miR-NC läsnä polybreenin (Sigma-Aldrich), ja valitaan puromysiinin (Sigma-Aldrich) ja 2 viikkoa, jolloin saatiin pc-9 GR /miR -21-estäjän ja pc-9 GR /miR-NC stabiilit solulinjat.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja leimattiin Alexa Fluor 647 anneksiini V (Biolegend) ja 7-AAD (BD Pharmingen), ja analysoitiin virtaussytometrialla. Solut pidetään apoptoottisia, kun he olivat anneksiini V-positiivisia, ja 7-AAD-negatiivinen.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) analyysi

Yhteensä-RNA: t uutettiin viljellystä soluja tai ihmisen kudosnäytteiden käyttäen TRIzol reagenssia mukaan valmistajan ohjeiden. Mitata miR-21 ekspressiotasoja, RNA: t transkriboidaan kantasilmukan RT pohjamaali käyttäen PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) kuten aiemmin on kuvattu [21], [22]. Sekvenssit RT alukkeet olivat seuraavat: miR-21-RT, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 ’; U6-RT, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 ’. qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos DimerEraser (Takara) on 7900HT järjestelmään (Applied Biosystems). miR-21 qPCR alukkeet olivat: sense, 5’-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 ’; anti-sense, 5’TGGTGTCGTGGAGTCG -3 ’. U6 snRNA qPCR alukkeet olivat: sense, 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ’; anti-sense, 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ’. Ilmaisu Mir-21 oli normalisoida tasoa U6 ja vertailevan sykli kynnys menetelmä (2

-ΔΔCT) käytettiin U6 kontrollina.

Proteiinin uutto ja Western blotting

Solut tai kudokset kerättiin ja lyysattiin jäillä 30 minuutin ajan RIPA-puskurissa (Beyotime), jota oli täydennetty 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Lysaatit alistettiin Western blotting määritys edellä kuvatulla [23] ja havaita vasta-aineita PTEN, fosfo-AKT (Ser-473), yhteensä AKT, fosfo-ERK yhteensä ERK, GAPDH.

Immunohistokemia (IHC ) B

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut kudokset kerätään potilailta, joilla on NSCLC (n = 46), leikattiin 5 um, ja niitä inkuboitiin vasta-aineiden PTEN (Cell Signaling Technology). Arviointi IHC signaaleja suoritettiin kaksi kokenutta patologia pidennetyn tavalla. Viisi suuritehoiset kentät (200 x) valittiin sattumanvaraisesti jokaisessa näytteessä. Prosenttiosuudet kasvainsolujen luokiteltiin viiteen puolikvantitatiivinen luokat: 0 (≤5% positiivisia soluja), 1 (6% -25% positiivisia soluja), 2 (26% -50% positiivisia soluja), 3 (51% -75 % positiivisia soluja), ja 4 ( 76% positiivisia soluja). Värjäytymisen intensiteetti oli myös semi-kvantitatiivisesti määrittää asteikolla 0-3 seuraavasti: 0 (negatiivinen), 1 (heikosti positiivinen), 2 (kohtalaisen positiivinen), ja 3 (voimakkaasti positiivinen). Tuotteet prosenttiosuus partituureja värjäytymisen intensiteetti saatiin lopullinen IHC Pisteet: 0 (negatiivinen), + (1-4), ++ (5-8), ja +++ (9-12) kuten aiemmin on kuvattu [24].

In situ -hybridisaatio

ISH suoritettiin parafiiniupotusta näytteitä NSCLC tutkia kliinistä vastetta TKI ja miR-21 ilme. Lyhyesti, kalvot käsiteltiin ja hybridisoitiin 10 pmol koetinta (LNA-modifioitu ja DIG leimatun oligonukleotidin, Exiqon) komplementaarinen miR-21, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kun oli inkuboitu anti-DIG-HRP Fab-fragmentteja konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin, hybridisoitu koettimet havaittiin inkuboimalla 3’3-diaminobentsidiinillä ratkaisu ytimet vastavärjättiin Carazzi hematoksyliinia. Värjäyskuviot analysoitiin 3 asiantuntijaa ja osuus positiivisesti värjättyä kasvainsolujen luokiteltiin seuraavasti: 0 (ei positiivisia soluja), 1 ( 10% positiivisia soluja), 2 (10% -50% positiivisia soluja), 3 ( 50% positiivisia soluja). Solut kussakin värjäytymisen intensiteetti rekisteröitiin asteikolla 0 (ei värjäystä), 1 (heikkoa värjäytymistä, vaaleansininen tai keltainen), 2 (kohtalainen värjäytyminen, sininen tai keltainen) ja 3 (voimakas värjäytyminen, tumman sininen tai keltainen) . Kasvaimia, jotka osoittivat heterogeeninen värjäys, vallitseva malli pidettiin pisteytys. Värjäytyminen (SI) laskettiin suhteessa positiivisesti värjättyä kasvainsolujen × värjäytymisen intensiteettiä. Käyttämällä tätä menetelmää, ilmaus miR-21 pisteytettiin 0, 1, 2, 3, 4, 6 tai 9. Jos erimielisyyttä (pisteet ristiriita 1), dioja tarkasteltiin uudelleen ja päästiin asiantuntijat .

Vieraslajisiirteen kasvainmuoto nude-hiirissä

kasvaimen kasvua määrityksiä, 6 viikon ikäisiä uros- nude-hiirten (BALB /ca-nu (nu /nu) hankittiin SLAC Animal Center ( Shanghai, Kiina), ja Erityistiloissa taudinaiheuttajista vapaiden (SPF) olosuhteissa. Menetelmät eläinkokeiden hyväksyttiin animal Welfare komitean Nanjing Medical University. Solueriä (4 x 10

6) suspendoitiin 150 ul FBS-vapaa RPMI DMEM-alustassa ja ihon alle injektoidaan taka karvattomien hiirten kyljen (n = 6). kasvaimen koko mitattiin käyttäen mikrometrillä seitsemän päivän välein, kunnes ne lopetettiin päivänä 35 implantoinnin jälkeen ja tuumorin tilavuus oli johdettu 0,5 x pituus × leveys

2.

tilastollinen

Arvot saatiin vähintään kolmen erillisen kokeen ja esitetään keskiarvoina ± SE. Opiskelijan pariton

t

Testi suoritettiin ja arvoja pidettiin merkittävästi erilainen, kun

P

0,05.

Tulokset

Up-regulation of miR-21 ja alas-säätely PTEN negatiivisesti korreloivat lyhyempi DSF kasvainkudoksissa ihmisen NSCLC potilaiden

määrittämiseksi ilmentymisen tasojen miR-21 ja PTEN proteiinin tuumorikudoksissa ihmisen NSCLC potilaiden, arvioimme 47 paria syöpä kasvain näytteet ja viereisten normaaleissa kudoksissa (taulukko S1) by qRT-PCR ja löysi merkittävästi korkeampi ilmaus miR-21 37/47 (78,7%) kasvainkudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa (Fig. 1A). Koska PTEN on yksi tärkeimmistä tavoitteista miR-21, [25], [26] tutkimme suhdetta ilmaus miR-21 ja PTEN ihmisen NSCLC yksilöt sekä immunoblottauksella ja immunohistokemia (IHC). Huomasimme, että PTEN-proteiinin tasot olivat vähentyneet huomattavasti 34/47 (72,3%) tuumorikudoksista verrattuna viereiseen terveisiin (Fig. 1 B). Lisäksi suhteellinen ekspressiotasot PTEN arvioitiin kaksi kokenutta patologia pidennetyn tavalla, ja ne on merkitty lopullisen IHC tulokset 0 (negatiivinen), + (heikko), ++ (kohtalainen) ja +++ (vahva) (Fig. 1 C ). Tasot miR-21 vähenivät suurella PTEN intensiteetti (Fig. 1 D). Lisäksi sirontakuvaaja analyysi osoitti käänteinen korrelaatio miR-21 ekspressiotasot ja IHC tulokset PTEN signaaleja (Fig. 1 E). Nämä tulokset osoittivat, että miR-21 ilmentymistasot korreloi käänteisesti PTEN tasojen NSCLC kudoksissa. Arvioitava edelleen korrelaatio miR-21 /PTEN ekspressiotasot ja ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää, käytimme Kaplan-Meier selviytymisen analyysin ja log-rank-testi arvioida normalisoitu miR-21 ekspressiotasot (kasvain /normaali) ja Disease elinaika ( DFS). Tulokset osoittivat, että potilailla, joilla on korkea miR-21 ekspressiotasot oli lyhyempi taudista elinaika (DFS) verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen miR-21 lauseke (Fig. 1 F).

(A) Expression tasot asennuspalveli- 21 olivat säädellään ylöspäin 37/47 paria NSCLC kudosten suhteen viereiseen normaaliin yksilöitä. MiR-21 analysoitiin kantasilmukan qRT-PCR, ja normalisoidaan tasot U6. Kertamuutoksia saatiin suhde miR-21 runsaus syövän kudoksissa, että viereisten normaaleissa kudoksissa. *

p

0,05 osoittaa merkittävää eroa verrattaessa miR-21 ilmentyminen kasvainkudoksissa viereisten normaaleissa kudoksissa. (B) edustaja PTEN proteiinin tasot NSCLC kudoksissa (T) ja viereisen normaali yksilöt (N) arvioi immunoblot, GAPDH käytettiin latauskontrollina. (C) PTEN immunohistokemia (IHC) tulokset NSCLC kohdat, 0 (negatiivinen), + (heikosti positiivinen), ++ (kohtalaisen positiivinen), ja +++ (voimakkaasti positiivinen). (D) Korrelaatioanalyysiä välillä PTEN proteiinin tasot ja miR-21 ekspressiotasoja NSCLC kudoksissa. IHC tulokset käytettiin kuvaamaan PTEN proteiinin tasot kasvainkudoksissa, arvioi kokenut patologia pidennetyn tavalla. (E) Lineaarinen regressio käyrät miR-21 ilmentyminen ja PTEN-proteiinin tasoja. (F) Kaplan-Meier käyrät kuvaavat Tautivapaa elinaika mukaan ilmentymisen miR-21. Kynnysarvo on alaryhmiin (korkea ja matala) Mir-21 ilmentymistaso oli 50. prosenttipiste.

Up-regulation of miR-21 ja alas-säätely PTEN proteiinin yhteydessä huonoon TKI herkkyys ja lyhyempi kokonaiselossaoloaika kasvainkudoksissa ihmisen NSCLC potilaalla, joille TKI hoidon

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-21 indusoi sisplatiinin vastus NSCLC [27]. Lisäksi Wang et al. havaitsi, että miR-214 säätelee hankittu resistenssi gefitinibille kautta PTEN /AKT Pathway in EGFR-mutantti solulinjat [28]. Ottaen huomioon mahdolliset vaikutukset miRNA moduloinnissa huumeiden herkkyyden, tutkimme onko muuttamista miR-21 /PTEN ilmaisu korreloi TKI herkkyys. Sen jälkeen seurata kliinisen hoitoon 47 NSCLC potilaat, löysimme vain 5 potilaalla käytetty TKI hoitoon. Yksi potilas osoittaa osittainen vaste (PR) osoitti miR-21 ekspressiotaso (kasvain /normaali) on vain 0,16; kolme potilasta, joilla oli stabiili tauti (SD) näkyy keskimääräinen miR-21 ekspressiotasot 2,57; yksi potilas, jolla on etenevä sairaus (PD) osoittivat korkeaa miR-21 ilmentymistä 33.15 (Fig. 2A). IHC määrityksiä kudosten näistä viidestä potilaista osoittivat, että PTEN ekspressiotasoja korreloi negatiivisesti kliiniseen vasteeseen TKI: yksi PD potilaskudos osoitti PTEN ilmentymistä (-); PTEN ilmentyminen loput neljä potilasta, joilla PR ja SD vaihtelivat (++) ja (+++) (Fig. 2B). Edelleen vahvistavat havaintomme, arvioimme miR-21 ekspressiotasot käyttämällä ISH määrityksiä (Fig. 2D) ja PTEN ekspressiotasot IHC on parafiiniin näytettä 46 NSCLC saaneilla potilailla TKI (gefitinibi tai erlotinibi) hoidon ja seurannan kliinisestä vaste ja selviytymisen tila (taulukko S2). Kuten odotettua, miR-21 ekspressiotasot Parkinson-potilailla olivat merkittävästi korkeammat kuin PR ja SD ryhmät (Fig. 2C). Korkeampi miR-21 ekspressiotasot osoitti myös lyhyempiä eloonjäämiseen in TKI hoidetuilla potilailla (Fig. 2E). Lisäksi PTEN ekspressiotasot Parkinson-potilailla oli huomattavasti pienempi kuin PR ja SD potilasryhmille (Fig. 2F), ja korkeampi PTEN ilmaisun korreloi pidentymistä selviytymisen TKI hoidetuilla potilailla (Fig. 2G). Nämä havainnot ovat kaikki samaa mieltä ja ehdottaa osallistumista korkean miR-21 /alhainen PTEN ilmentymisen modulaatioon TKI herkkyyden NSCLC.

(A) Kliiniset vaste TKI ja miR-21 ekspressiotasot 5 NSCLC potilaalta Q-RT-PCR. (B) kliininen vaste TKI ja PTEN ekspressiotasot 5 pienisoluista keuhkosyöpää testannut immunohistokemiallisesti. PR (osittainen vaste) ja SD (stabiili tauti) potilailla oli suhteellisesti pienempi miR-21 ekspressiotasot ja korkeammat PTEN ekspressiotasoja verrattuna PD (etenevä sairaus) potilasta. (*

p

0,05). (C) Korrelaatio analyysin välillä miR-21 ekspressiotasot ja kliinistä vastetta TKI. (D) edustaja miR-21 tasoa ja arvosanat NSCLC kudoksissa olevien TKI hoitoa arvioitiin in situ -hybridisaatiolla. (E) Kaplan-Meier käyrät kuvaavat eloonjäämiseen mukaan ilmentymisen miR-21 46 NSCLC potilailla, joille tehdään TKI hoitoa. (F) Korrelaatio analyysin välillä PTEN ekspressiotasot ja kliinistä vastetta TKI. (E) Kaplan-Meier käyrät kuvaavat eloonjäämiseen mukaan ilmaus PTEN 46 NSCLC potilailla, joille tehdään TKI hoitoa.

PC9 /GR solut osoittavat merkittävää vastustuskykyä gefitinibin, säätely ylöspäin miR-21, alassäätöä PTEN ja aktivoinnin AKT, ERK verrattuna PC9 solujen

sen testaamiseksi, onko vaikutus korkean miR-21 /low PTEN ilmentymisen modulaatioon TKI herkkyyden, valitsimme pc-9, joka on TKI herkkä solulinja, ja gefitinibi kestävä solulinja PC-9 /GR (ystävällisesti Syöpätautien, Shanghai Keuhkojen sairaala, Tongji University, Shanghai) indusoitiin arkun PC-9 solun kasvavien pitoisuuksien gefitinibin raportoitu aikaisemmin . [19], [20] Käytimme CCK-8 määrityksessä havaitsemaan gefitinibin herkkyyttä pc-9 ja pc-9 GR soluja ja totesi, että pc-9 GR solut olivat resistenttejä gefitinibille verrattuna pc-9-soluissa (kuvio. 3A , Fig. 3B). IC50 gefitinibin PC9 /GR solut olivat noin 2,54 umol /L, 200times korkeampi kuin PC9 soluissa (0,0127 umol /L, P 0,001) (Kuva. 3C). 72 tunnin kuluttua 1 umol /l gefitinibi hoito, käytimme Virtaussytometriaa arvioida gefitinibin aiheuttamaa apoptoosia hinnat. Tuloksemme osoittivat apoptoosin hinnat huomattavasti korkeampi PC9 soluissa verrattuna PC9 /GR (15,04% vs. 3,08%) (Fig. 3d). qRT-PCR tiedot osoittivat, että miR-21 oli 3,70-kertainen yläreguloituja PC9 /GR soluja verrattuna PC9 soluihin (kuvio. 3E). Käyttämällä western-blot määritykset, osoitimme PTEN menetys ja aktivointi AKT ja ERK PC-9 GR soluissa verrattuna PC-9 solua, mutta ei näytä koko AKT ja yhteensä ERK ilmaisun välinen ero solulinjoista (kuvio. 3F, 3G).

(A, B) pC-9 ja pc-9 /GR-soluja käsiteltiin gefitinibin 72 h 0,1% seerumia sisältävällä RPMI. Solukasvu mitattiin CCK-8 määrityksessä kolmena kappaleena. Solujen kasvun 72 h piirretty gefitinibi keskittymistä. (C) gefitinibi IC 50 pc-9 ja pc-9 /GR solujen kolmena kappaleena, jotka suoritettiin. ** Osoittaa p 0,01. (D) Apoptosis hinnat PC-9 /GR ja pc-9-soluissa indusoiman gefitinibin arvioitiin virtaussytometrialla. PC-9 /GR ja pc-9-soluja käsiteltiin 1 umol /l gefitinibin 72 tuntia ennen apoptoosin arviointi. (E) Suhteellinen ekspressiotasot miR-21 pc-9 ja pc-9 /GR solut arvioitiin kantasilmukan qRT-PCR, ja normalisoidaan U6 tasolle. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kullekin RNA-näytettä. Merkittäviä eroja on merkitty * (P 0,05). (F) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK proteiinit pc-9 ja pc-9 /GR solut analysoitiin Western blot. (G) kvantitointi western blot-analyysi osoitti, että PTEN proteiinin ilmentyminen väheni PC-9 /GR solu verrattuna PC-9 solua ** P 0,01; p-AKT ja p-ERK proteiinien ilmentyminen oli säädellään ylöspäin PC-9 GR soluissa verrattuna PC-9 solua ** P 0,01; ei ollut merkittäviä eroja koko AKT ja yhteensä ERK proteiinien välillä PC-9 ja PC-9 /GR soluja.

Kohonnut ekspressio miR-21 pienentää gefitinibin herkkyys, parannettu invasiivisia kykyä ja vähennetään gefitinibin aiheuttamaa apoptoosin pc-9 soluihin alaspäin säätäminen PTEN ja aktivoimalla AKT ja ERK polkuja

edellä kuvattujen tulosten osoittivat, että miR-21 oli säädelty ja PTEN oli alassäädetty PC-9 GR soluissa verrattuna PC-9-soluja. Siksi me hypoteesi, että miR-21 /PTEN-ilmentymisen muutos on tärkeä rooli moduloimaan gefitinibin herkkyys pc-9-soluja ja PC-9 /GR-solut. Transfektoimme pc-9-solujen miR-21 matkii ja sitten kotransfektoidaan nämä solut PTEN plasmidilla tarkkailla, onko PTEN voisi pelastaa miR-21 indusoi biologisia muutoksia pc-9 solua. qPCR tiedot vahvistivat, että miR-21 ilmentyminen lisääntyi merkittävästi miR-21 matkivat transfektoidut solut verrattuna NC transfektoituja soluja, ** p 0,01 (Fig. 4A). Sitten käytimme CCK-8 iinianalyysikitissä havaitsemaan gefitinibin herkkyys 24 tuntia transfektion jälkeen. Kuten odotettua, miR-21 teki vähentää gefitinibi herkkyyttä pc-9 solua ja yli-ilmentyminen PTEN voisi pelastaa tämä gefitinibille herkkyys muutos. ** P 0,01 (Fig. 4B, 4C). Tarkkailla muita parametrimuutokset jälkeen miR-21 transfektio, teimme siirtokuoppaan määritys määrittää vaikutuksen miR-21 invasiivisen kyvyn. Huomasimme, että miR-21 transfektoitujen pc-9-soluja enemmän invasiivisia kuin NC ryhmä ja yli-ilmentyminen PTEN voisi pelastaa tämä invasiivisia kyky ** p 0,01 (Fig. 4D, 4E). Jotta voidaan havaita vaikutuksia miR-21 gefitinibi indusoitua apoptoosia, edellä kuvattujen solu- jen käsiteltiin 1 umol /l gefitinibin 72 tuntia. Virtaussytometriaa käyttämällä, olemme havainneet, että pc-9-soluissa, vähentyneen merkittävästi apoptoosin havaittiin miR-21 matkivat transfektoituja soluja verrattuna NC transfektoituja soluja ja miR-21 matkivat ja PTEN-plasmidi ko-transfektoitiin soluihin jälkeen gefitinibin hoidon (Fig. 4F). Jotta paremmin ymmärtää molekyylitason mekanismeja miR-21 aiheuttama gefitinibi vastustusta pc-9 solua, western-blot määrityksiä arviointiin käytettiin ilmaisua liittyvien proteiinien. PC-9 solua, kohonnut ilmentyminen miR-21 johti tukahduttaminen PTEN ilmaisun ja aktivointi p-AKT ja p-ERK verrattuna NC ryhmä, mutta ei muuttanut kokonaisproteiinia ilmaus AKT ja EKR. Yli-ilmentyminen PTEN ilmaisun voisi pelastaa säätely ylöspäin miR-21 aiheuttama aktivointi p-AKT ja p-ERK. (Fig. 4G, 4H).

(A) Suhteellinen ekspressiotasot miR-21 pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoitujen solujen ja pc-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidia transfektoidut solut arvioitiin kantasilmukan qRT-PCR, ja normalisoidaan U6 tasolle. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kullekin RNA-näytettä. Merkittäviä eroja on merkitty ** (P 0,01). (B) gefitinibi herkkyys pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidia transfektoidut solut arvioitiin CCK-8 määritys. (C) IC50 gefitinibin pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoiduista soluista. ** P 0,001, # P 0,01. (D) pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidia transfektoituja soluja käytettiin soluinvaasiota määrityksissä. Invasion solut värjättiin 0,1% kristalliviolettia laskettiin 24 tunnin kuluttua pinnoitus. Ylempi paneeli: edustaja valokuvia invasiivisia soluja (x 200). (E) määrä invasiivisen solua alalla on saatu vähintään kolme jäljitellä kaivoja ja edustaa keskiarvo ± SD (alhaalla kaavio). ** Osoittaa merkittävää eroa pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoiduissa soluissa (P 0,01). ## Osoittaa merkittävää eroa pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoiduissa soluissa (P 0,01). (F) Apoptosis hinnat PC-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoitujen solujen aiheuttama gefitinibin arvioitiin virtaussytometrialla. Kaikki soluja käsiteltiin 1 umol /l gefitinibin 72 tuntia ennen apoptoosin arviointi. (G) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, ja ERK proteiineja pc-9 /NC + pCMV 6 transfektoituja soluja, pc-9 /miR-21 matkivat + pCMV 6 transfektoituja soluja ja PC-9 /asennuspalveli- 21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoidut solut analysoitiin Western blotilla. (H) kvantifiointi western blot-analyysi osoitti alas-säätely PTEN proteiinin PC-9/21 jäljittelee + pCMV 6 transfektoituja soluja verrattuna PC-9 /NC + pCMV 6 transfektoidut solut (* P 0,05) ja pc-9 /miR-21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoiduissa soluissa (# P 0,05); p-AKT ja p-ERK proteiinien ilmentyminen oli säädellään ylöspäin PC-9/21 jäljittelee + pCMV 6 transfektoituja soluja verrattuna PC-9 /NC + pCMV 6 transfektoidut solut (* P 0,05) ja pc-9 /asennuspalveli- 21 matkivat + PTEN plasmidi transfektoiduissa soluissa (# P 0,05). Ei ollut merkittäviä eroja koko AKT ja yhteensä ERK proteiinien joukossa kolme solua.

knockdovvn miR-21 palautettu gefitinibi herkkyys, vähensi invasiivisia kyky ja parannettu gefitinibi indusoi apoptoosin pc-9 /GR solut jopa sääteleviä PTEN ja inaktivoimalla AKK ja ERK polkuja

edelleen varmistamiseksi toimintaa miR-21 gefitinibiryhmässä herkkyys sääntelyn pc-9 /GR soluja, pc-9 /GR-solut transfektoitiin miR -21 estäjä pienentää miR-21 ilmentyminen ja sitten kotransfektoidaan näiden solujen kanssa PTEN siRNA. Ensin testataan vaikutusta PTEN siRNA, transfektoimme pc-9 /GR-solujen kahdella PTEN siRNA: t ja ryntäily siRNA (siSCR). Sekä WB ja qRT-PCR määritykset osoittivat, että siPTEN # 1 voi pienentää PTEN-proteiinin (kuvio. S1A), ja mRNA (kuvio. S1B) ilmentymistaso tehokkaammin kuin siPTEN # 2. Joten päätimme siPTEN # 1 tehdä edelleen kokeilu. qPCR Tulokset vahvistivat, että miR-21 ilmentyminen väheni merkittävästi miR-21-estäjä transfektoiduissa soluissa verrattuna NC soluihin, ** p 0,01 (Fig. 5A). CCK-8 koetulokset osoittivat, että miR-21 Knockdown merkittävästi vähentynyt gefitinibi herkkyys pc-9 /GR ja vähentää PTEN ekspressiotaso voitaisiin palauttaa gefitinibi herkkyyttä pc-9 /GR ** p 0,01 (Fig. 5B, 5C). Yang et ai.