Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksi lupaavimmista mahdollisuuksista kliininen käyttö kylmää plasmaa, niin sanottu kylmä ilmakehän plasma (CAP), on sen sovellus pahanlaatuisia soluja ja syövän kudosta käyttämällä antineoplastisia vaikutuksia, pääasiassa toimituksen reaktiivisen hapen ja typen lajien (ROS, RNS). Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus YMP solujen lisääntymisen ja peräkkäisen molekyylitason torjuntamekanismeissa perustettu eturauhassyöpä (PC) solulinjat. PC solut osoittivat merkitsevästi vähäisempi solujen kasvuun seuraavan CAP hoidon seurauksena sekä välittömiä solunsisäisen peroksidia tasoilla ja apoptoosin induktio osoittaa anneksiini V määritystä TUNEL määritys ja arviointi muutoksista ydin- morfologiassa. Varsinkin samanaikainen N-asetyylikysteiini (NAC) täysin neutraloitu CAP vaikutuksia NAC otto ja nopea siirtyminen glutationin (GSH). C-vitamiini voi torjua CAP aiheuttamaa vaikutusta solun kasvuun. Yhteenvetona, suhteellisen lyhyt hoitoja CAP 10 sekuntia olivat riittäviä indusoimaan merkittävää inhibitiota syövän proliferaation, kuten havaittiin ensimmäisen kerran vuonna virtsa- ja syöpä. Siksi on tärkeää ymmärtää tilan CAP liittyvien solukuoleman ja selkeyttää ja optimoida CAP kuten syövän hoidossa. Lisääntyvät peroksideja voidaan muuttaa redox-säänneltyjen signalointireittien ja voivat johtaa kasvun pysähtymiseen ja apoptoosiin. Oletamme, että yleinen solunsisäinen redox homeostaasiin, erityisesti tasot solun GSH ja peroksidaasit kuten peroxiredoxins vaikuttaa lopputulokseen YMP hoitoa.

Citation: Weiss M, Gümbel D, Hanschmann EM, Mandelkow R, Gelbrich N , Zimmermann U, et ai. (2015) Cold Ilmakehän Plasma hoito sai aikaan antiproliferatiivisia vaikutuksia eturauhassyöpäsoluissa Redox ja Apoptotic signalointireitteihin. PLoS ONE 10 (7): e0130350. doi: 10,1371 /journal.pone.0130350

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 syyskuu 2014; Hyväksytty: 18 toukokuu 2015; Julkaistu: 01 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Weiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Osa työstä rahoitettiin avustusta CHL: (1) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), LI984 /3-1 (https://www.dfg.de), (2) Science Network molekyylilääketieteen, University Medicine Greifswald, FOMM-2013-06 (https://www.medizin.uni-greifswald.de/fvmm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka uusien lupaavien hoitostrategioita vastaan ​​varhain ja kehittyneitä urogenitaalimuutoksia kasvaimia kuten eturauhas-, munuais- tai virtsaputken syöpä, radikaaleja edelleen tavanomaista hoitoa kuin parantava lähestymistapa. Ensisijaisesti eturauhassyöpä (PC) on yksi eniten diagnosoitu pahanlaatuinen sairaudet ja yhä toiseksi suurin syy kasvaimeen liittyviä kuolemia mies läntisen pallonpuoliskon [1]. Useimmilla aloilla kirurgiset onkologian vallitsee laaja yksimielisyys poisto kasvaimen yhteensä ja on riittävän suuri kirurginen marginaali (R0-resektio). Yllättäen kliiniset kokeet osoittavat, että syöpä-positiiviset kirurgiset marginaalit ovat väistämättömiä huomattava määrä tapauksia [2, 3, 4]. Kuitenkin edullisesti täydellinen paikallinen leikkaaminen pahanlaatuisia soluja riskiä vahingoittaa reunustavien kudosten ja elinten. Siksi uusia terapeuttisia sovelluksia estämiseksi tarvitaan syöpäpositiivisille kirurginen marginaalit poistamalla mikroskooppisen jäämiä jälkeen resektio urogenitaalimuutoksia kasvaimia, ja samalla mahdollistaa vähentää minimietäisyyden kasvaimen ja ympäröivän kudoksen.

Äskettäin kylmä ilmakehän plasma (CAP) osoitti lupaavia antineoplastisia vaikutuksia useisiin kasvaimiin, esim melanooma, gliooma, ja haiman syöpäsoluja [5, 6, 7], ja siksi voi olla tehokas tapa anti-syövän hoitoon kliinisissä urologian tulevaisuudessa. Fyysinen plasma on määritelty erittäin reaktiivinen ionisoitua kaasua, joka sisältää erilaisia ​​biologisesti reaktiivisia tekijät, jotka liittyvät varautuneita hiukkasia (ionit, elektronit), kiihtynyt atomien ja molekyylien (toisin sanoen reaktiivisen hapen ja typen lajit, ROS, RNS), vapaita radikaaleja (atomeja tai molekyylejä, jotka sisältävät parittoman elektroni), fotonit ja sähkömagneettisia kenttiä, jotka johtavat päästöjen näkyvän ultravioletti, tyhjiö-ultravioletti sekä infrapunasäteilyä [8, 9]. Lämpötilaa voidaan säätää kehon lämpötilaa. Reaktiivinen yhdisteitä, jotka tulevat biokemiallisesti aktiivisia, ilmaantua sukupolven plasmasta vuorovaikutus molekyylien ympäröivän ilman, ja /tai kosketukseen plasman kanssa joko väliaineen, kehon nesteen tai kudoksen käsiteltävän [10, 11, 12]. Hoito biologisten kudosten ja solujen CAP tulee toteuttamiskelpoinen, koska elektronit lämpenee paljon nopeammin sähkökentässä verrattuna ioneja, jolloin ympäristön lämpötilan plasma jet [13]. Selkeyttäminen taustalla biologisia vaikutuksia ja vaikutusmekanismeja on edelleen merkittävä haaste, mutta on olemassa yhä enemmän todisteita siitä raportointi, että ROS vastaavat ensisijaisesti CAP-riippuvaista solukuolemaa [14]. Syöpäsolujen kasvua liittyy usein häiriöitä fysiologisten redox homeostaasin ja signalointi, esimerkiksi kohonneeseen 8-hydroksi desoxyguanosin ja vetyperoksidi on osoitettu useissa kohdunkaulan soluissa [15]. Redox signalointi välittyy jäsenten tioredoksiinin perheen (esim. Tioredoksiini, TRX, glutaredoxins, Grxs; peroxiredoxins, Prxs), jotka ohjaavat ratkaiseva solun prosesseja, kuten solujen lisääntymisen ja apoptoosin. TRX ja Grxs säännellä proteiinien toimintaa kautta tilapäisesti heikentynyttä /hapettuminen erityisiä kysteinyylitähteiden ja hallita solunsisäisiä vetyperoksidia tasojen vähentämällä Prxs, mikä puolestaan ​​vähentää solujen peroksidit veteen. Tioredoksiinin isoformit ekspressoituvat nisäkkäillä, on lokalisoitu koko lokeroitu soluja, ja osoittavat selvästi muutoksia ilmaisun eri sairauksista kuten syöpää (yleiskatsaus katso Hanschmann ym. [16]). Vahva ja kestävä häiriöitä redox signalointi, koska se voi johtua CAP altistuminen voi johtaa esto häiriintyy tai keskeytyy toiminnot proteiinien ja olennaisten solusignalointi reitit [17].

Tässä tutkimuksessa kuvaamme vaikutuksia CAP hoito ihmisen PC solulinjoissa. Tutkimuksemme ei ainoastaan ​​tue edellinen tietoa CAP-driven muuttaminen ROS, mutta lisäksi vahvistaa erityisiä induktion peroksidien, että heti muuttavat redoksitilassa Prxs palautuvasti ja mahdollisesti muita proteiineja, jotka edistävät solujen kasvua pidätys ja apoptoosin vastaavasti.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen epiteelisolujen PC solulinjat LNCaP ja PC-3 (Cell Lines Service, Eppelheim, Saksa) kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10 % vasikan sikiön seerumia ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (PAN Biotech) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kosteutetussa ilmakehässä. Solun siirto päälle soluviljelylevy kiinnittyneet solut irrotettiin 0,1% trypsiiniä /0,04% etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) ja suspendoitiin uudelleen RPMI-väliaineessa. Lisäkokeita varten RPMI oli täydennetty 5 mM N-acetylcysteine ​​(NAC; Carl Roth, Karlsruhe, Saksa), 100 uM C-vitamiini (Carl Roth) tai 5 ug /ml sykloheksimidiä (Merck, Darmstadt, Saksa), tässä järjestyksessä.

CAP hoito

tuottavan CAP argon kantokaasuna, ilmanpaine plasma jet kINPenMed (Neoplas GmbH, Greifswald, Saksa) käytettiin (kuvio 1). Keskeytetty soluja käsiteltiin 500 ui RPMI 1640 -alustaa (PAN Biotech, Aidenbach, Saksa) päällystämättömälle soluviljelylevy. Suurin syy solujen käsittelyä suspensiossa oli välttää sivuvaikutuksia CAP lähteestä hoidettaessa kiinnittyneet solut, eli mekaanisia vaurioita ja kuivaus. Proliferaatiomääritykset kasvatettiin kanssa 3×10

4 LNCaP-ja PC-3-solut. Muita määrityksiä ja Western blot-analyysi suoritettiin 6×10

5 LNCaP ja PC-3-solujen YMP lähde haettiin 10 s ja valvonta hoidettiin ionisoitumaton argon kaasulla 10 s, vastaavasti. Seuraavat CAP hoito-solut siirrettiin välittömästi poly-L-lysiinillä (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) päällystettiin soluviljelylevyille ja viljeltiin RPMI 1640 väliaineessa ilmoitettuina ajankohtina. Sillä CAP hoidon kINPen09 seuraava asetus käytettiin: Argon kaasun virtaus: 3 l /min; käyttöjännite = 65 V DC; taajuus: 1.1 MHz; valotusaika: 10 s. Ohjaus solut: Argon kaasun virtaus: 3 l /min; valotusaika: 10 s [18, 7].

(A) Plasma jet kINPen09 (Neoplas GmbH, Greifswald, Saksa), (B) kaavamainen jälleenrakentaminen kINPen09 ja koostumuksen fyysisen plasma.

Proliferaatiomääritys

Cellular leviämisen LNCaP ja PC-3-solut analysoitiin 24-syvennyksen soluviljelmälevyihin (1 ml /kuoppa) käyttäen CASY Cell Counter ja Analyzer Malli TT (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) aikana 120 h. Kiinnittyneet solut irrotettiin 0,1% trypsiiniä /0,04% etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) ja suspendoitiin uudelleen CASYton liuokseen (Roche Applied Science). Lukumäärä eläviä soluja määritettiin kahtena kappaleena kullekin näytteelle.

anneksiini V-määritys

LNCaP-ja PC-3-soluja suspendoitiin 500 ul: ssa RPMI-elatusaineeseen, ja ne CAP käsiteltiin 10 sekuntia. Argon käsitellyt solut toimivat kontrollina. 4 h inkubaation kiinnittyneet solut irrotettiin 0,1% trypsiiniä /0,04% EDTA, pestiin PBS: lla ja suspendoitiin uudelleen sitoutumispuskuriin. AnnnexinV analyysi suoritettiin käyttäen FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Bioscience, Saksa) suosittelemia toimittaja.

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys

6×10

5 keskeytettiin LNCaP-ja PC-3-soluja suspendoitiin 500 ui RPMI median ja CAP käsiteltiin 10 sekunnin ajan. Argon käsitellyt solut toimivat kontrollina. 24 tunnin inkubaation kiinnittyneet solut irrotettiin 0,1% trypsiiniä /0,04% EDTA. TUNEL apoptoosin analyysi suoritettiin käyttäen HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) sen jälkeen, toimittaja suosituksia. Tiedot hankittiin käyttäen Infinite 200 PRO multimode (TECAN) ja analysoitiin käyttämällä i-ohjaus 1.9 ohjelmisto (Tecan).

Nuclear morfologia määritys

6×10

5 keskeytetty LNCaP ja PC-3-soluja CAP käsiteltiin 10 sekunnin ajan ja ympättiin 6-kuoppaiselle soluviljelyn levylle, joka sisältää 2,5 ml RPMI. Argon käsitellyt solut toimivat kontrollina. Soluja viljeltiin 24 h ajan, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan, huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 0,2% Triton-X-100: ssa 5 min. Solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Carl Roth) fluoresenssin analyysi käyttäen BZ-9000 fluoresenssimikroskoopilla järjestelmän (Keyence, Osaka, Japani) ja BZ II Analyzer-ohjelmisto (Keyence ). Apoptoosin aikana solut ovat pohjana ydin- morfologia muuttuu, kromatiinin kondensaatio ja hajoaminen osaksi ydin- kehon fragmentteja [19, 20, 21]. Toteamiseen morfologisia muutoksia fluoresoivien mikroskooppiset kuvat otettiin 10 asentoa kohden 3,5 cm Soluviljelymaljassa eli 0,5% koko kasvualue. Laskennallinen morfometrisiin analyysi suoritettiin kunkin yksittäisen ydin. Kokonaismäärät DAPI positiiviset ytimet vaihteli 400-600 (CAP /sykloheksimidiä käsitellyt solut) ja 700-1000 (argon /ajoneuvo käsiteltyihin soluihin). Morfometrisiin parametrit laskettiin BZ II Analyzer ohjelmisto. Näin ollen, Hybrid Cell Count BZ-H2C-moduuli on käytetty määrittämään parametrien valinta. Yhden tumat määritelty rinnakkaispaikantumisen toimivat DAPI positiivisia alueita alueella 0,3-200 um

2, lukuun ottamatta ytimet klusteri ja hajanainen ytimet. Morfometrisiin parametrit saatiin ohjelmiston analyysityökalut alue, kehä, pääakseli, pienempi akseli, ja kirkkaus. Apoptoottinen tiivistyminen edustaa ytimien kutistuminen on ominaista väheneminen ydin- alueen ja kehä. Edelleen morfologiset mahdollisuudet mukana ydin- muodonmuutoksia ja disrounding muodostavat epäsuhtaisuuksien parametrien suurten ja pienempi akseli, sekä kasvua ydinvoiman kirkkauden.

Western blotting

2-Cys Prxs redox blot.

Voit selvittää CAP aiheuttamiin muutoksiin solujen tasojen ja redoksitilassa Prx1, Prx2 ja Prx3 6×10

5 keskeytettiin LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin CAP tai argonilla 10 s. Soluja sentrifugoitiin 1000 rpm: ssä 5 min. Supernatantti kerättiin ja sekoitettiin täyteväriä (0,3 M Tris /HCl (pH 7,0), 50% glyserolia, 5% SDS, 0,1% bromifenolisinistä) ja jäädytettiin -20 ° C: ssa myöhempää analyysia varten mahdollisten eritystä Prx1 ja Prx2. Soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan PBS: ssä, joka sisälsi 100 mM alkylointiaineen Netyylimaleimidin (NEM), joka sitoutuu palautumattomasti vapaata tioliryhmää. Kun oli sentrifugoitu 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan, supernatantti heitettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudelleen NEM sisältävällä puskurilla (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, proteaasi-inhibiittoreita, 100 mM NEM ) 15 minuutin ajan ja liuotettiin lisäämällä 2% CHAPS. Kokonaisproteiinin määrä määritettiin Bradfordin ja 10-20 ug proteiinia laimennettiin ja sekoitettiin täyteväriä. SDS-PAGE suoritettiin käyttäen esivaletulle geelit (4-20%, BioRad) ja tahra-vapaa tekniikka (BioRad). Analysoida redox tilan solun Prxs, proteiinit analysoitiin ei-pelkistävällä SDS-PAGE. Sen analysoimiseksi eritetyn Prxs supernatantissa, yhtä suuret tilavuudet pelkistettiin 100 mM DTT: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja 10 minuutin ajan 94 ° C: ssa. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille käyttäen puolikuiva tekniikkaa. Membraanit blokattiin 5% maitojauhetta ja 1% BSA: ta TBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween-20. Prx1, Prx2 ja Prx3 analysoitiin käyttäen spesifisiä primaaristen vasta-aineiden (tuotettu ja arvioitiin kuten [22] ja [23]), joka on HRP-leimatun sekundaarisen vasta-aineen ja parannettu kemoluminesenssin kehityksen tekniikkaa käyttäen ChemiDoc järjestelmän (BioRad). Tasot hapettuneen Prxs kvantitoitiin densitometrisellä analyysillä käyttäen ImageJ ja ImageLab ohjelmisto (BioRad) ja normalisoitiin kokonaismäärä tietyn Prx. Lisäksi, proteiinin kokonaismäärän kvantitoitiin perustuu tahra-free-tekniikkaa, ja sitä käytettiin normalisointiin blotting saadut tiedot densitometrisen analyysin.

Glutationi (GSH) määritys

LNCaP-ja PC-3-soluja inkuboitiin läsnä ollessa tai ilman 5 mM NAC aikana 12 h. Solut kerättiin talteen 0,1% trypsiiniä /0,04% EDTA, pestiin PBS: llä ja lyysattiin lyysipuskurissa (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, proteaasi-inhibiittorit, ja 2% CHAPS). Proteiini määrä määritettiin Bradford. 100 ug proteiinia saostettiin yli yön käyttäen 4% sulfosalisyylihappoa. Näytteet sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan 13000 rpm. Supernatantit neutraloidaan NaOH ja analysoitiin yhteensä GSH sisällön kolorimetristä määritystä vastaan ​​GSH standardi tunnettuja pitoisuuksia (0-0,2 mM). Määritys perustuu muodostumista keltainen TNB 5,5′-Ditio-bis- (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) läsnä ollessa GSH. Määritys suoritettiin 96-kuoppaisella levylle; reaktioseos sisälsi 1,5 mM NADPH: ta (Carl Roth), hiiva GSH-reduktaasin ja 1,5 mM DTNB: tä (Carl Roth) ja mitattiin 412 nm: ssä, kuten päätepisteeseen määritys käyttäen Infinite 200 PRO multimode (TECAN).

tilastot

Tilastolliset vertailut tehtiin vähintään 9 riippumatonta kasvua kineettinen kokeita ja kyseessä ovat muut määritykset alkaen vähintään 3 itsenäisen kokeen käyttämällä paritonta Studentin

t

testiä. Tulokset

p

0,05 pidettiin merkittävinä. Tiedot annetaan keskiarvoina ± SD.

Tulokset

CAP hoito esti solujen lisääntymisen ihmisen PC solulinjojen

Tässä tutkimuksessa, jonka tarkoituksena on analysoida lyhyen ja pitkän aikavälin vaikutukset CAP proliferaatioon ihmisen PC solulinjojen LNCaP-ja PC-3 kerta CAP hoidossa 10 s. Argon käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina. Käyttämällä CASY Cell Counter ja Analyser Model TT solujen kokonaismäärästä analysoitiin ajaksi 120 h (kuvio 2A ja 2B). 10 s CAP sovellus aiheutti merkittäviä vähennyksiä yhteensä solujen määrä tarkkailtavan solulinjojen LNCaP (kuvio 2A, 4 h: 2,15 kertainen,

p

= 0,1138; 24 h: 1,36 kertainen,

p

= 0,2034; 48 h: 1,79 kertainen,

p

= 0,0227; 72 h: 1,88 kertainen,

p

= 0,0584; 96 h: 1,96 kertainen,

p

= 0,0148; 120 h: 2,30 kertainen,

p

= 0,0050) ja PC-3 (kuvio 2B, 4 h: 3,23 kertainen,

p

= 0,0040; 24 h: 1,82 kertainen,

p

= 0,0007; 48 h: 1,90 kertainen,

p

= 0,0177; 72 h: 2,01 kertainen,

p

= 0,0011; 96 h: 2,58 kertainen,

p

= 0,0010; 120 h: 2,96 kertainen,

p

= 0,0015) verrattuna argon-käsiteltyihin kontrolleihin.

jälkeen CAP hoito 10 s LNCaP ja PC-3-solut laskettiin käyttäen CASY Cell Counter ja Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) ilmoitetuilla ajankohtina seuraava. Ohjaus-soluja käsiteltiin 10 s argonilla (contr). Elävään soluun lukumäärä (A) LNCaP-soluja, ja (B) PC-3-soluja käsiteltiin CAP paljasti väheni merkittävästi solujen määrä verrattuna kontrolleihin. (C) LNCaP inkuboitiin 10 nM doketakselin verrokkeja esti solujen kasvua, verrattavissa CAP hoitoon. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD solujen määrä. *

p

0,05; ***

p

0,001, määritettynä Studentin

t

testiä.

CAP aiheuttaman apoptoosin LNCaP ja PC-3-solujen

todiste siitä vähentämistä solujen määrä jälkeen CAP hoito on seurausta apoptoottisen solukuoleman, me tutki vielä vaikutuksia CAP hoidon anneksiini V ja TUNEL määritys sekä arvio ydinvoiman morfologia ydin- morfologian määrityksessä. Värjäys kalvomainen fosfatidyyliseriinin kautta anneksiini V, eli muun muassa ratkaiseva tekijä apoptoosin, kun niitä ulkoistaa ulomman solukalvon osoitti kertyminen anneksiini V-signaalin 4 h kuluttua CAP hoitoon LNCaP ja PC-3-solut (kuvio 3; LNCaP : 1,25 kertainen,

p

= 0,0007, PC-3: 1,60-kertaiseksi,

p

= 0,2954). Tulokset olivat merkittäviä LNCaP, kun taas huolimatta kunnioitettavan lisäystä anneksiini V signaalia, ei merkittäviä PC-3. Tästä syystä täytäntöön apoptoosin havaitsemiseen TUNEL määrityksen ja ydinvoiman morfologia määritys visualisoida muutoksia ydinvoiman morfologiassa.

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin CAP 10 s ja viljeltiin 24 tuntia. Argon käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina (contr). Solut kerättiin ja käsitellään käyttäen FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Bioscience, Saksa) mukaan valmistaa ohjeiden mukaisesti. 24 h kuluttua CAP hoidon LNCaP-ja PC-3-solut osoittivat kasvua fosfatidyyliseriinin sitoutuneen anneksiini V Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ***

p

0,01, määritettynä Studentin

t

testiä.

merkinnöin DNA-fragmentit kautta TUNEL määritys sekä LNCaP-ja PC-3-solujen osoitti huomattavasti suurempi vakavuus DNA: n fragmentoituminen ja siksi kasvu TUNEL positiivinen solu rajalta CAP hoidon verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin (Kuva 4A, LNCaP, 4 h: 3,07 kertainen,

p

= 0,0068; 24 h: 1,93 kertainen,

p

= 0,0012, kuvio 3B, PC-3, 4 h: 3,35 kertainen,

p

= 0,0078; 24 h: 2,24 kertainen,

p

= 0,0384). Lisäksi ydin- morfologia määritys on laajassa käytössä havaitsemiseksi apoptoosin eukaryoottisoluissa ja muiden solutyyppien, koska se on indikaattori morfologisia muutoksia ytimen. Kuten kuviossa 5, ydin- morfologia määritys CAP käsiteltyjen LNCaP-ja PC-3-solujen paljastaneet merkittäviä ja apoptoosiin liittyvä korjauksilla ydin- morfologia koskeva alue (kuvio 5A, LNCaP: 1,04-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0022 , kuvio 5F, PC-3: 1.27-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0021), ympärysmitta (kuvio 5B, LNCaP: 1,02-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0310; kuvio 5G, PC-3 : 1,11-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0065), pääakselin (kuvio 5C; LNCaP: 1,02-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0405; kuvio 5H, PC-3: 1.13-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0050) ja pienempi akseli (kuvio 5D; LNCaP: 1,03-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0085; kuvio 5I, PC-3: 1,14-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0051) sekä kirkkaus solua kohden (kuvio 5E; LNCaP: 2,25-kertainen kasvu,

p

0,0001; Kuva 5J, PC-3: 1,45-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0034) verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin. Apoptoosin sykloheksimidillä inkuboimalla toimi sisäisenä kontrollina [24] ja aiheutti verrattavissa muutoksia alueen (kuvio 5A, LNCaP: 1,27-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0028; kuvio 5F, PC-3: 1,14-kertainen pieneneminen

p

= 0,0006), ympärysmitta (kuvio 5B, LNCaP: 1,13-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0071; kuvio 5G, PC-3: 1,09-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0005), pääakselin (kuvio 5C; LNCaP: 1,15-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0099; kuvio 5H, PC-3: 1.13-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0001) ja pienet akselin (kuvio 5D; LNCaP: 1,13-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0012; kuvio 5I, PC-3: 1,02-kertainen pieneneminen,

p

= 0,4306), sekä kirkkautta solua kohden ( Kuva 5E; LNCaP: 1,23-kertainen kasvu,

p

0,0001; Kuva 5J, PC-3: 1,55-kertainen pieneneminen,

p

= 0,0002).

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin CAP 10 s ja viljeltiin 4 h tai 24 h. Argon käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina (contr). Solut kerättiin ja käsitellään erityisiä merkintöjä tuman DNA pirstoutuminen kanssa HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) mukaan valmistaa ohjeiden. (A) Nuclear DNA pirstoutuminen LNCaP ja (B) PC-3-solujen 10 sekunnin kuluttua CAP hoito (CAP) verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin (contr). Leimaamatonta kontrollisoluja (leimaamaton Contr) toimi negatiivisena kontrollina ja nukleaasin käsiteltyjen solujen (nukleaasi Contr) toimi positiivisena kontrollina, vastaavasti. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *

p

0,05, **

p

0,01, määritettynä Studentin

t

testiä.

LNCaP ja PC -3-soluja CAP käsiteltiin 10 sekunnin ajan, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja ne värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) fluoresenssin analyysi. Nuclear parametrit ala (A, F), kehä (B, G), pääakselin (C, H), pienempi akseli (D, I) ja kirkkauden solua kohti (E, J), kun DAPI fluoresenssia LNCaP-ja PC-3-soluja kun CAP ja argon (contr) käsittely. Inkubointi sykloheksimi- (sykloheks) ja sen ajoneuvon toimi sisäisenä positiivisena kontrollina apoptoosin. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001, määritettynä Studentin

t

testi.

Inkubointi NAC päinvastaiseksi antiproliferatiivisia CAP vaikutukset

Viime aikoina on yhä enemmän näyttöä, että antiproliferatiivisia CAP vaikutuksia nisäkässoluissa johtuvat induktion reaktiivisia lajeja kuten ROS ja RNS [4]. Voit selvittää, reaktiiviset lajit ovat vastuussa laskua solujen kasvun PC, laskimme eläviä soluja CAP tai argon käsitelty LNCaP-ja PC-3-solut, jotka inkuboitiin läsnä tai poissa NAC ja C-vitamiinia jopa 120 tuntia ( kuva 6). Molemmat reagenssit tiedetään välittävän universal antioksidanttivaikutuksia [22]. Jälleen soveltaminen CAP soluihin kasvatettiin RPMI soluviljelyalustassa paljasti merkittävästi vähentynyt solujen määrä LNCaP (kuvio 6A; 4 h: 2,04 kertainen,

p

= 0,0328; 24 h: 1,30 kertainen,

p

= 0,1277; 48 h: 1,58 kertainen,

p

= 0,0298; 72 h: 1,77 kertainen,

p

= 0,0275; 96 h: 2,00 kertainen,

p

= 0,0189; 120 h: 2,30 kertainen,

p

= 0,0205) sekä PC-3-solut (kuvio 6B; 4 h: 2,63 kertainen,

p

= 0,0005; 24 h : 2,08 kertainen,

p

= 0,0008; 48 h: 2,07 kertainen,

p

= 0,0044; 72 h: 2,61 kertainen,

p

= 0,0048; 96 h: 2,29 kertainen,

p

= 0,0509; 120 h: 2,12 kertainen,

p

= 0,0056) verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin ja oli verrattavissa siihen, mitä me olemme osoittaneet aiemmin (kuvio 2). Erityisesti täydentämistä NAC CAP käsitelty LNCaP-ja PC-3-solujen pitkälti poistettu kasvua estävä vaikutus YMP NAC-inkuboitiin solulinjoissa ilmeni kohonneita solukasvun jälkeen plasmakäsittely verrattuna CAP käsiteltyjen solujen puuttuessa NAC (kuvio 6A; LNCaP, 4 h: 2,30 kertainen,

p

= 0,1084; 24 h: 1,27 kertainen,

p

= 0,1474; 48 h: 1,38 kertainen,

p

= 0,1853; 72 h: 1,50 kertainen,

p

= 0,0952; 96 h: 1,52 kertainen,

p

= 0,1323; 120 h: 1,60 kertainen,

p

= 0,0134; kuvio 6B , PC-3, 4 h: 1,95 kertainen,

p

= 0,0287; 24 h: 1,81 kertainen,

p

= 0,1111; 48 h: 1,61 kertainen,

p

= 0,1011; 72 h: 1,73 kertainen,

p

= 0,0571; 96 h: 1,43 kertainen,

p

= 0,0917; 120 h: 1,57 kertainen,

p

= 0,2247 ). Mitä mielenkiintoisinta on, antiproliferatiivinen CAP vaikutuksia ei rajoita antioksidantin C-vitamiinia leviämisen CAP käsiteltyjen solujen läsnä ollessa tai ilman C-vitamiinia tilastollisesti erilainen. CAP käsitellyt solut täydennetty C-vitamiinia oli tilastollisesti merkittävä väheneminen LNCaP ja PC-3 leviämisen verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin (LNCaP, kuvio 6C, 4 h: 1,85 kertainen,

p

= 0,0397; 24 h: 1,61 kertainen,

p

0,0001; 48 h: 1,76 kertainen,

p

0,0001; 72 h: 1,91 kertainen,

p

= 0,0020; 96 h: 2,16 kertainen,

p

= 0,0007; 120 h: 2,20 kertainen,

p

= 0,0001, PC-3, kuvio 6D; 4 h: 2,24 kertainen,

p

0,0001; 24 h: 1,80 kertainen,

p

0,0001; 48 h: 1,74 kertainen,

p

0,0001; 72 h: 2,25 kertainen,

p

0,0001; 120 h: 2,30 kertainen,

p

= 0,0002).

Living solujen määrä LNCaP ja PC -3 solut jälkeen CAP hoidon 10 s. CAP-käsitellyt solut inkuboitiin solujen elatusaineeseen ilman NAC ja C-vitamiinia (○ ja ●), (A + B) soluviljelyalustaa, joka sisälsi 5 mM NAC (□ ja ■), ja (C + D) soluviljelmässä väliaineessa, joka sisälsi 100 uM C-vitamiinia (VITC, □ ja ■) ajan 120 tuntia. Solut laskettiin käyttäen CASY Cell Counter ja Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) on ilmoitettuina ajankohtina. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD solujen määrä. *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001, määritettynä Studentin

t

testi.

NAC on vakiintunut lähde GSH synteesin ja siten lähde runsain kahden elektronin luovuttajan, kun taas C-vitamiini on tehokkaampi yhden elektronidonorin. Seuraavaksi arvioimme onko suojaavia vaikutuksia NAC hoito voisi perustua solunsisäinen GSH tasoilla kolorimetristä määritystä varten totaalisoluproteiinia GSH (Kuva 7). Itse asiassa, NAC hoito johti solunsisäisen GSH tasoilla vain muutaman tunnin käsittelyn jälkeen (LNCaP, kuvio 7A, 4 h: 1,18-kertainen, 8 h: 1,66-kertainen, 12 h: 1,66-kertainen, PC-3; kuvio 7B , 8 h: 1,47-kertainen, 12 h: 1,37-kertainen).

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin 5 mM NAC ajaksi 12 tuntia. Solut kerättiin ja lysoitiin eri ajankohtina. Yhteensä GSH-tasot analysoitiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen 5,5′-Ditio-bis- (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) substraattina. GSH tasojen määrä vastaan ​​GSH mukaisesti ja jota kuvataan umol /mg kokonaisproteiinia. 4 h (LNCaP) ja 12 h (PC-3) jälkeen, NAC hoidon kokonaismäärä kasvaa merkittävästi GSH tasoilla havaittiin. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD solujen määrä.

Sen analysoimiseksi, onko CAP hoito indusoi tuotanto ROS tai pikemminkin nostaa solunsisäisiä tasoja peroksidit, olemme analysoineet proteiinin tasot ja redox tila 2-Cys Prx1, Prx2 ja Prx3. Lisäksi olemme tutkineet mahdollinen erityksen Prx1 ja Prx2, jotka ovat pääasiassa paikallisia sytosoliin, solunulkoiseen tilaan; Prx3 yksinomaan sijaitsee mitokondrioissa, ja siksi Prx3 eritys ei odotettu [16, 17]. Aikana katalyyttisen mekanismin vähentää peroksidien vettä, Prxs muodostavat disulfidisidoksen. Muutos koko voidaan helposti havaita Prx redox blot, solujen näytteissä on esikäsitelty alkyloivan aineen NEM, joka sitoutuu palautumattomasti vähentää tioliryhmien ja suojaa niitä edelleen hapettamalla. Koska ROS tuotanto mahdollisesti on välitön syy YMP hoito, me korjataan LNCaP-ja PC-3-solujen välittömästi ja 1 tunnin kuluttua 10 s CAP hoitoa. Verrattuna argon käsiteltyihin kontrolleihin, CAP hoito liioiteltu eritystä sytosolisen Prx1 solunulkoiseen nestetilaan 1 h kuluttua (tuloksia ei ole esitetty). Ei merkittäviä muutoksia eritystä Prx2 voitu havaita. Lisäksi emme voineet havaita merkittäviä muutoksia proteiinin tason tahansa 2-Cys-Prxs (kuvio 8). Kuitenkin molemmissa solulinjoissa LNCaP-ja PC-3, Prx1 ja Prx3 osoitti lisääntynyt määrä hapetetun, dimeerisessä muodossa seuraavat heti CAP jälkeen (kuvio 8, Prx1, LNCaP: 1,41-kertainen, PC-3: 1,67-kertainen, Prx3; LNCaP: 3,63 kertainen, PC-3: 1,67-kertainen), mitattuna suhde hapetettu, dimeerinen proteiini verrattuna koko (monomeerinen plus dimeeristä) proteiini kun CAP hoitoa, verrattuna argon hoidettuun kontrolliryhmään soluissa. Yllättäen tämä välitön hapettuminen jälkeen CAP altistumista ei voitu havaita Prx2. Analysoida, parannetun määrää hapettuneen Prx proteiineihin on vain lyhyen aikavälin vaikutus CAP hoidon, analysoimme myös LNCaP-ja PC-3-solut 1 tunnin kuluttua CAP hoidon. 1 h kuluttua CAP hoidon emme voineet havaita mitään selvempi muuttaminen määrän hapetetun, dimeerinen muoto Prx1, Prx2 ja Prx3 molemmissa solulinjoissa verrattuna argon-käsiteltyjen kontrollisolujen. Jälleen, ei merkittäviä muutoksia ilmaisua tai erityksen 2-Cys Prxs oli havaittavissa (kuvio 8A). Olemme kuitenkin havainneet hieman koholla Prx2 hapettumista LNCaP-soluissa 1 h seuraavan CAP hoitoa käyttäen 2-Cys redox blot (kuvio 8).

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin 10 s CAP tai argon (contr), tässä järjestyksessä. Välittömästi sekä 1 h käsittelyn jälkeen, solut käsiteltiin alkyloivan aineen N-etyylimaleimidin (NEM), joka sitoutuu palautumattomasti vähentää tioliryhmiä ennen solu- lyysiä. Proteiinin tasot sytosolin Prx1 ja 2, sekä mitokondrioiden Prx3 analysoitiin solulysaateista, sekä redox tilassa käyttäen ei-pelkistävässä SDS-PAGE ja Western Blot. A) edustaja Prx redox blotit kolmesta analysoitu peroksidaasit Prx1, Prx2 ja Prx3, osoittaa monomeerisen Prx ja aikana katalyyttinen mekanismi tuotti hapettunut, dimeerinen muoto. B) Densitomet- kvantifiointiin hapettuneen Prxs verrattuna yhteensä Prx proteiinin (monomeeristä ja dimeerimuodoksi).

Keskustelu

CAP: n molekyyli- vaikutustapa on huonosti. Tämä tutkimus tarkastelee kriittisesti vaikutusta CAP PC-soluissa ja pyrkii tutkimaan toistaiseksi tuntemattoman molekyylitason mekanismit maatalouspolitiikan hoitoa.