Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

histonideasetylaasi estäjät (HDACis) ovat lupaavia syöpälääkkeiden; kuitenkin, molekyylimekanismeja johtavat HDACi aiheuttama solukuolema ei ole hyvin ymmärretty eikä selvää resistenssimekanismi on selvitetty selittämään rajoitettu tehoa HDACis kliinisissä kokeissa.

menetelmät ja havainnot

Tässä osoitamme, että proteiini tasot Checkpoint kinaasi 1 (Chk1), joka on merkittävä rooli G

2 solusyklin Checkpoint asetusta, oli merkittävästi pienentää proteiinin ja transkription tasot keuhkosyöpäsoluissa käsitelty yleiseurooppalaisia ​​ja valikoiva HDACis LBH589, Scriptaid, valproiinihappo, apicidin, ja MS-275. Vuonna HDACi käsitellyt solut Chk1 toiminta oli heikentynyt määritettynä vähentynyt estävä fosforylaatio cdc25c ja sen loppupään tavoite cdc2 ja lisääntyneen ilmentymisen cdc25A ja fosforyloidun histoni H3, merkkiaine mitoottisen merkintä. Ajan tietenkin kokeissa Chk1 downregulation jälkeistä HDACi hoidon edellisen apoptoosin. Ektooppinen ilmentyminen Chk1 voitti HDACi solukuolema, ja esikäsittelemällä solut, joilla on cdc2-inhibiittori purvalanol lamaantuminen pääsyn mitoosiin ja estää solukuoleman HDACis. Lopuksi farmakologinen esto Chk1 osoitti vahvaa synergistinen vaikutus LBH589 keuhkojen syöpäsoluja.

Johtopäätökset

Nämä tulokset määrittävät polun, jonka kautta Chk1 estäminen voi välittää HDACi aiheuttama mitoottisia tulon ja solukuoleman ja viittaavat siihen, että Chk1 voisi olla varhainen farmakodynamiikkamarkkeri arvioida HDACi tehoa kliinisissä näytteissä.

Citation: Brazelle W, Kreahling JM, Gemmer J, Ma Y, Cress WD, Haura E, et ai. (2010) histonideasetylaasi- estäjät downregulate Checkpoint Kinase 1 Expression aiheuttavan solukuolemaa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 5 (12): e14335. doi: 10,1371 /journal.pone.0014335

Editor: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Saksa

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 26 marraskuu 2010; Julkaistu: 14 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Brazelle et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoitettiin osittain Moffitt Cancer Center SPORE avustuksen keuhkosyöpä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

histonideasetylaasi-estäjät (HDACis) ovat lupaava uusi luokka yhdisteitä syövän hoitoon [1]. Jotkut HDACis osoittavat laaja aktiivisuus useita HDAC luokkia (Scriptaid, LBH589), kun taas toiset ovat luokka-tai isotyyppi selektiivinen (MS-275) [1], [2].

Tarkat mekanismit, joilla HDACis kohdistavat sytotoksiset vaikutukset eivät ole tiedossa; kuitenkin antituumorivaikutukset näiden lääkkeiden uskotaan johtuvan hyperasetylaation histonien, demetylaatio genomista DNA: ta, ja geenien aktivaation, jotka inhiboivat proliferaatiota ja indusoivat apoptoosin [1]. Lisäksi niiden epigeneettiset vaikutusten HDACis on myös osoitettu olevan merkittäviä translaation jälkeisiä vaikutuksia kuin histoniproteiineista, kuten transkriptiotekijät p53, lämpösokkipromoottereista proteiini 90 (HSP90), ja α-tubuliinin [3]. Lisäksi suora antituumorigeenistä vaikutuksia, tukahduttaminen angiogeneesin HDACis voi olla vaikutusta kasvaimen kasvun estäminen [4].

Olennainen sääntelyn askel G

2 /M solusyklin siirtyminen eukaryooteissa on aktivointi cdc2-sykliini B kompleksin [5]. Asianmukainen sääntely cdc2 edellyttää aktivoiva fosforylaatio treoniini-161 ja estävä fosforylaatiot on treoniini-14 ja tyrosiini-15 (Tyr15) [6]. Inhiboiva fosforylaatio Tyr15 ylläpitää cdc2-sykliini B monimutkainen aktiivisessa tilassa, jos on epätäydellisesti monistaa DNA: ta tai vaurioitunut DNA solussa [7], [8]. Cdc2 aktivointi kautta poistamalla sen estävä fosforylaation cdc25 fosfa- sallii solujen tulla mitoosi vaiheen solusyklin [9]. Chk1 on kriittinen osa DNA-replikaation, sisäiset S-vaiheessa, G

2 /M vaiheessa, ja sukkularihmaston-kokoonpano tarkistuspisteitä [10]. Vastauksena erilaisiin genotoksinen stressitekijöitä, Chk1 aktivoituu, jonka ylävirran kinaasien, kuten ATM ja ATR, mikä lisää proteosomal hajoamisen fosfataasin cdc25A ja inhibitio cdc25C kautta seriini-216 (Ser216) fosforylaatio, yhdessä aiheuttavat inaktivoitumista cdc2 ja näin ollen G

2 /M pidätys [10] – [14].

Lisäksi yhdistämällä HDACis sääntelijöihin G2 tarkastuspiste voisi parantaa tehokkuutta ja tukea voittamisessa vastarintaa. Itse asiassa, suora farmakologinen esto tai siRNA knockdovvn Chk1 on osoitettu aiheuttavan tarkistuspisteen kumoamista, cytokinetic regressio, ja multinucleation, sekä kromosomin missegregation ja kromosomi-epävakaus [15]. Siksi Chk1 estäjät, joka tehokkaasti kumota S ja G

2 tarkistuspisteitä, tutkitaan kliinisissä tutkimuksissa joko yksinään tai yhdessä sytostaattien [16] – [18] ja niitä voitaisiin tehokkaasti yhdistää HDACi tehostamiseksi sytotoksisia vaikutuksia .

Tässä osoitamme, että HDACi hoito downregulates Chk1 proteiinin ilmentymisen, mikä puolestaan ​​johtaa suunnittelematon cdc2 aktivointi, mitoosi merkintä, ja solukuoleman ihmisen keuhkosyövän soluja. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat, että Chk1 downregulation ja kumoamisesta G

2 tarkistuspiste ovat tärkeitä sääntelyn askelia herkkyys ja kestävyys sytotoksista vaikutusta HDACi hoidon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. Tuloksemme viittaavat siihen, että Chk1 saattaa olla varhainen farmakodynamiikkamarkkeri ennustaa ja arvioida tehoa HDACis ja Chk1 estäjät saattavat lisätä sytotoksisia vaikutuksia HDACis kliinisissä tutkimuksissa.

Tulokset

hoito NSCLC-solujen kanssa HDACis aiheuttaa G

2 /M solusyklin pysähtymiseen ja solun kuolemaan

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yhteistä HDACi LBH589 (IC

50 vaihtelee välillä noin 9 ja 54 nmol /l) aiheuttaa kasvun pysähtymistä ja solukuoleman NSCLC soluissa [19]. Analysoida molekyylitason mekanismeja, joilla HDACis säätelevät solusyklin etenemisen ja solukuoleman, asynkronisesti kasvava A549 (EGFR villityyppinen, K-Ras mutantti, ja p53 villityypin) ja PC9 (EGFR mutantti, K-ras villityypin, ja p53 mutantti) [20] – [22] soluja käsiteltiin LBH589 (40 nM) 24 tuntia ja kerätään virtaussytometria-analyysiä. Kuvio 1 osoittaa, että PC9 ja A549-soluja LBH589 hoito tuotti huomattava kasvu solujen G

2 /M vaiheessa viittaavia G

2 /M saarto ja vähentää merkittävästi S-vaiheen soluissa. Nämä tulokset ovat yhtä mieltä edellisten raporttien mukaan HDACis johtaa G

2 /M pidätyksen ja apoptoottisen solukuoleman NSCLC soluissa [19].

, The asynkronisesti kasvavia soluja inkuboitiin väliaineessa, jossa oli 5% FCS: ssa 24 tunnin ajan ilman (kontrolli, C) tai läsnä ollessa (L) LBH589. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin määritettiin virtaussytometria-analyysillä.

B

, histogrammi esitys solusykliä koskevat tiedot määritettiin virtaussytometria-analyysillä.

Kuten kuviossa 2A, mikroskooppinen tutkimus käsiteltyjen solujen LBH589 tuottanut erilaisia ​​ydin- morfologioita, alkaen binucleation ja multinucleation. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että LBH589 hoito aiheuttaa solukuolemaa, jotka liittyvät epänormaaliin mitoosia ja epäonnistunut sytokineesi, joka on viittaavia mitoosi katastrofin, tyyppi solukuoleman, joka tapahtuu mitoosia ja on kuvattu aikaisemmin soluissa käsitelty HDACi trikostatiini [ ,,,0],23].

A549-soluja käsiteltiin vehikkelillä (kontrolli) tai 40 nM LBH589 24 tuntia.

, nuolet osoittavat bi- tai monitumaisia ​​soluja, joilla on heikentynyt sytokineesiin in LBH589 saaneilla NSCLC soluissa.

B

solut kiinnitettiin ja värjättiin DAPI tai halkaistut poly (ADP-riboosi) polymeraasin (cPARP) vasta-aineella (x 100 tai × 400 suurennus).

C

, Western blot-analyysi osoittaa, että HDAC esto LBH589 aiheuttaa histoni H3 fosforylaatiota (H3-P10), histoni H4 asetylointi (asetyyli-H4), ja PARP pilkkominen (cPARP) A549 käsiteltyjä soluja LBH589 24 tuntia. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Koska solut G

2- ja M-vaiheen ei voi syrjiä perustuu niiden eroihin DNA sisällön virtaussytometrianalyysissä testasimme onko solut pidätettiin G

2 /M jälkeen HDACi hoidon tulla mitoottisiin vaiheeseen. Tätä varten ensin suoritetaan immunofluoresenssivärjäyksen käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​katkaistun poly (ADP-riboosi) polymeraasin (cPARP) ja osoittaneet, että LBH589 hoito aiheuttaa apoptoottisen solukuoleman 78% binucleated mitoottisia soluja (kuvio 2B). Seuraavaksi Western blot analyysissä testasimme HDAC inhibitio parantaa histoni H3 fosforylaatio seriini-10, joka tapahtuu puhkeamista mitoosin. Kuvio 2C havainnollistaa, että LBH589 hoito aiheutti histoni H3 fosforylaatio liittyy lisääntynyt histoni asetylaatio ja PARP pilkkominen, mikä osoittaa, että HDACi hoito aiheuttaa NSCLC-solujen tulla mitoosin ja tehdään solukuolemaa. Sen määrittämiseksi, onko solujen kasvun ja elinkelpoisuuden havaittujen muutosten jälkeen LBH589 hoidon ovat yleinen vaikutus HDAC inhibition, käytettiin myös toista pan-HDACi, Scriptaid (1 uM), joka biokemiallisia muutoksia voi erottaa esitetty edellä käyttäen LBH589 (kuvio 3).

, A549, PC9, H1299, H292, H358, H441 ja HCC827 soluja viljeltiin, kun läsnä on ajoneuvon (C), tai LBH589 (LBH) 40 nM: ssa 24 tunnin ajan ja ekspressiotasot cPARP fosforylaatio cdc2 (pCDC2

Y15), CHK1, ja asetyloitua histoni H4 (asetyyli-H4) määritettiin Western blot ja kvantitatiivisesti käyttäen AlphaEase ohjelmistoa. p-aktiini käytettiin latauskontrollina.

B

, PC9 ja A549-soluja viljeltiin, kun läsnä on ajoneuvon (C), tai LBH589 (LBH) 40 nM, tai Scriptaid (S) 1 uM: ssa 24 tuntia ja ekspressiotasot cPARP, tyrosiini-15 fosforylaatiota cdc2 (pCDC2

Y15), seriini-216 fosforylaation CDC25C (pCDC25c

S216), CDC25A (T-CDC25A), CDC25C (T-CDC25C) ja cdc2 (T-cdc2), asetyloitu histoni H4 ( asetyyli-H4), ja sykliini B1 määritettiin Western blot -analyysillä. p-aktiini käytettiin latauskontrollina.

C

, huumeiden välittämää muutoksia ilmaisun CHK1, Chk2, AKT, ja c-RAF määritettiin Western blot-analyysi. p-aktiini käytettiin latauskontrollina.

D

, PC9 tai A549-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 40 nM LBH589 ja analysoitiin anneksiini-positiivisia soluja käyttämällä BD anneksiini V-FITC /7-AAD Virtaussytometria kit.

E

, A549-soluja käsiteltiin MS-275 (MS), (500 nM), valproiinihappoa (VA) (1 mM), tai apicidin (API) (400 nM) 24 tuntia. Ekspressiotasot cPARP, CHK1, pCDC2

Y15, ja β-aktiini määritettiin Western blot -analyysillä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

HDAC inhibitio johtaa aktivoinnin cdc25 ja cdc2 proteiineja, joita tarvitaan mitoosi pääsyn

aktivointi cdc2 proteiinikinaasi, että cdc25-proteiinin fosfataasit on keskeinen sääntelyn askel G

2 /M siirtyminen eukaryooteissa [9]. Defosforyloitumista cdc25C on Ser216 lisää sen aktiivisuuden aikana M-vaiheen siirtymän, mikä johtaa aktivointi cdc2-kinaasin [10]. Sen tutkimiseksi, onko HDACi aiheuttama mitoottisia tulon ja solukuoleman välittyvät aktivoitumisen cdc25 /cdc2-reitin, PC9, A549, H1299, H292, H358, H441 ja HCC827 soluja käsiteltiin kanssa tai ilman LBH589, ja Western blot -analyysi suoritettiin. Kuvio 3A esittää HDACi hoito johti kohonneeseen PARP pilkkominen, lasku estävä fosforylaatio cdc2 ja 45-94%: n lasku (kvantitatiivisten Western blot-analyysi) yhteensä Chk1 yli 7 eri NSCLC solulinjat, jossa A549s osoittaa merkittävin lasku Chk1 proteiinia. Nämä muutokset liittyvät kaikki lisääntyminen histoni asetylaatio. Lisätutkimuksia A549 ja PC9 soluja käsiteltiin pannulla HDACis (kuvio 3B), LBH589 ja Scriptaid, ilmeni aktivoitumista cdc25C ja cdc2, joka arvioidaan heikentää niiden estävä fosforylaatio Ser216 ja Tyr15, vastaavasti, jotka oli liitetty lisääntynyt histoni H4 asetylaatio. Ei laskua havaittu ekspressiotasot yhteensä cdc25C ja cdc2-proteiineja (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että HDACi aiheuttama mitoosi merkintä välittyy lisääntynyt cdc25 /cdc2 aktiivisuutta. Lisäksi HDACi hoito myös lisääntynyt ekspressiotaso cdc25A, joka on kohdistettu Chk1 nopean hajoamisen (kuvio 3B). Nämä tiedot osoittavat, että HDACi käsiteltyjä soluja, biologinen toiminta Chk1 estyi.

Lisäksi fosforylaatiota klo Tyr15 asemassa, toinen merkittävä mekanismi säätelevä cdc2 aktiivisuutta ja eteneminen mitoosi vaiheen solusyklin on sen monimutkaisen muodostumista sykliini B, tarvittava kofaktori cdc2 kinaasiaktiivisuuden. Niinpä seuraavaksi ratkaistava, onko HDACi hoito vaikuttaa sykliini B ekspressiotasoja. Kuten kuviossa 3B, NSCLC-solut käsiteltiin LBH589 tai Scriptaid näkyvissä nostaa yleistä tasoa sykliini B1 ilmaisua. Yhdessä kanssa vähentynyt Tyr15 fosforylaatiota cdc2, tämä havainto antaa suuren cdc2-sykliini B aktiivisuuden HDACi käsiteltyjä soluja, antaa lisätukea, että solut käsiteltiin HDACis ovat kykeneviä mitoosin.

esto HDAC korreloi vähentynyt Chk1 ilmaisua NSCLC soluissa

järjestys ja uskollisuus solusyklin liittyvät eheyden Chk1 ja cdc25 fosfataasi polkuja. Huolto Chk1 /cdc25 reitti on välttämätöntä solujen edetä normaalisti läpi häiriöttömät solunjakautumisen aikana ja soluille pidättämään vastauksena Checkpoint aktivointi [10].

määrittämiseksi roolin Chk1 in HDACi aiheuttaman aktivointi cdc25C ja cdc2, analysoitiin muutokset tasot Chk1 proteiinin käsitellyissä soluissa HDACis. Immunoblot-analyysi paljasti, että hoito LBH589 tai Scriptaid aiheuttaa merkittävää laskua ilmentymisen Chk1-proteiinin (kuvio 3C). Tämä inhibitio näyttää olevan spesifinen, koska mitään muutosta ei havaittu ilmentymistä Chk2 proteiinin, toinen säädin DNA-vaurion tarkistuspisteen signalointireitin [10], [11].

HDACis, mukaan lukien LBH589, on raportoitu toiminnallisesti inaktivoivat HSP90 läpi proteiinin asetylaatio, mikä johtaa ehtyminen asiakkaan proteiineja, kuten AKT ja c-RAF [22]. Mielenkiintoista on, Chk1 proteiini on myös raportoitu olevan HSP90 asiakas [24], [25], mikä viittaa siihen, että inaktivointi HSP90 mukaan HDACis voi olla vastuussa hajoamista Chk1 havaittu kokeissa. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, analysoimme onko Chk1 downregulation osuu vähentynyt ilmentyminen AKT ja c-RAF uutteissa valmistettiin soluista käsitelty LBH589 tai Scriptaid. Kuten kuviossa 3C, mitään muutoksia ei havaittu ekspressiotasot AKT tai c-RAF proteiineja olosuhteissa, joissa LBH589 ja Scriptaid aiheutti Chk1 downregulation.

osoittavat lisäksi sytotoksisia vaikutuksia HDACi hoidon NSCLC-solujen mittasimme apoptoottisen solukuoleman käyttämällä anneksiini V havaitsemista. Kuten on esitetty kuviossa 3D, PC9 ja A549-solut osoittivat mitatun määrän kasvu anneksiini-positiivisten solujen osoittaa, että hoito HDACi johtaa merkittävään kasvuun apoptoosin alaisten solujen.

Sen määrittämiseksi, onko valikoiva HDACis myös aiheuttaa Chk1 inhibition , A549 ja PC9 soluja käsiteltiin MS-275, joka selektiivisesti estää HDAC1, ja vähemmässä määrin HDAC3. Kuten kuviossa 3E, MS-275 (0,5 uM) on tuotettu muutokset ilmentymisen Chk1, fosforyloidun cdc2 (Tyr15), ja cPARP samanlaisia ​​tuloksia havaittiin LBH589 ja Scriptaid. Kaksi muuta luokan I HDACis valproaatti (1 mM) ja apicidin (400 nM) tuotti myös samanlaisiin tuloksiin (kuvio 3E). Nämä tiedot osoittavat, että HDACi välittämä Chk1 downregulation ei ole huumeriippuvaisia ​​ja luokan I HDAC todennäköisesti välittäjäaineiden HDACi vaikutus Chk1 downregulation in NSCLC soluissa.

Chk1 kumoamista edeltää aloittamisesta apoptoosin LBH589

Chk1 on raportoitu sovelletaan kaspaasivälitteinen hajoaminen soluissa olevien apoptoottisen solukuoleman [26]. Niinpä me analysoidaan kokeet, onko downregulation Chk1 proteiinin havaittiin HDACi käsiteltyjä soluja on syy tai seuraus apoptoottisen solukuoleman. Kuten kuvassa 4A on esitetty, hoito A549-solujen LBH589 johti 70%: n lasku Chk1 proteiinia 1 tunnin kuluessa hoidon, joka perustuu kvantitoimiseksi western blotit, jotka oli liitetty vähentynyt fosfo-cdc25C (Ser216) ja fosfo-cdc2 ( Tyr15) määritelmän mukaiseen toiminnallisen inaktivoinnin Chk1 toimintaa. On tärkeää, nämä muutokset tapahtuivat ennen havaittavissa kaspaasin aktivaatio, mistä on osoituksena PARP pilkkomalla että havaittiin ensin 12 tuntia hoidon jälkeen. Samanlainen ajan kulku profiilin havaittiin PC9 käsitellyissä soluissa LBH589 tai Scriptaid (tuloksia ei ole esitetty).

A549-solut olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin LBH589 (40 nM) ja eri ajankohtina. Solulysaatit valmistettiin ja proteiinin ekspressiotasot cPARP, CHK1, Tyr15 fosforylaatiota pCDC2 (pCDC2

Y15), Ser216 fosforylaatio CDC25C (pCDC25

S216), asetyyli-H4, ja sykliini B1 määritettiin.

B

, Quantitative Chk1 mRNA ilmentymisanalyysiä. Kokonais-RNA valmistettiin A549-soluja 24 tunnin kuluttua hoidon 40 nM LBH589 tai ajoneuvon. mRNA: n ilmentymisen tasojen määrä käyttäen Reaaliaikainen PCR-analyysi. Kaikki tulokset normalisoitiin GAPDH mRNA-tasoja, ja keskiarvo ja standardipoikkeamat arvot neljästä itsenäisestä kokeesta on esitetty.

C

, ektooppinen ilmentyminen Chk1 kumoaa HDACi indusoiman apoptoosin, mutta ei histoni asetylaatio. A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi tyhjällä vektorilla (kontrolli) tai GFP- tai FLAG-merkitty (GFP-CHK1 tai FLAG-CHK1) Chk1 ekspressioplasmidin. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen soluja viljeltiin ilman (kontrolli, C) tai LBH589 (L) (40 nM) vielä 24 tuntia ennen korjuuta varten Western blot-analyysi. Hoidon aiheuttamat muutokset cPARP, asetyyli-H4, fosfo-cdc2

Y15, ja ektooppisesti ilmaistuna GFP-CHK1 tai FLAG-CHK1 proteiineja määritettiin Western blot -analyysillä. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. Kokeet toistettiin 3 kertaa, ja edustava koe esitetään. Nuolet osoittavat asemaa GFP-CHK1 ja FLAG-CHK1 proteiineja.

D

, perusterveydenhuollossa NSCLC potilaiden näytteistä, Chk1 proteiini downregulation korreloi lisääntynyt cPARP

ex vivo

. Kasvain kerättiin, jossa on 23-gaugen neula potilaasta peräisin kasvaimia, ja soluja käsiteltiin kahtena vehikkelillä (kontrolli) tai LBH589 (40 nM) 18 tuntia. Hoidon jälkeen, joka tarttuu ja tarttumattomat solut yhdistettiin, solu-uutteet valmistettiin ja ekspressiotasot cPARP, Chk1, ja asetyyli-H3 analysoitiin Western blot. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. SCC: okasolusyöpä; AC: adenokarsinooma.

Yhdessä nämä tulokset tukevat sitä mallia, jossa esto Chk1 ekspression HDACis johtaa solun kuolemaan kautta suunnittelematon aktivoitumisen mitoosia edistää kinaasin cdc2 in NSCLC soluissa.

HDACi hoito johtaa transkription downregulation Chk1

Voit selvittää HDACi hoitoa säätelee Chk1 ilmaisu transkriptionaalisella tasolla NSCLC soluissa, suoritimme reaaliaikainen PCR. Kuten on havainnollistettu kuviossa 4B, kvantitatiivinen RNA-analyysi paljasti enemmän kuin 50%: n vähennys Chk1 mRNA-tasojen A549-soluissa 24 tunnin kuluttua LBH589 (40 nM) hoitoon. Tämä havainto osoittaa, että HDACi hoito johtaa transkription tukahduttamisen Chk1 in NSCLC soluissa.

ektooppinen ilmentyminen Chk1 voitetaan LBH589 indusoiman apoptoosin

määrittämiseksi tärkeyden Chk1 downregulation in HDACi aiheuttaman apoptoottisia cell kuolema, me haluttiin selvittää, onko ektooppinen ilmentyminen Chk1 voi voittaa solukuolemaa laukaisi LBH589. Näin ollen A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi Chk1 koodaava plasmidi GFP-leimatun Chk1 fuusioproteiinin. Kuten on esitetty kuviossa 4C, lyhytaikaisen ekspression ektooppisen Chk1 proteiinin tukahdutetaan LBH589: n indusoiman apoptoosin, kun havaitaan PARP-proteiinin pilkkominen. Lisäksi soluissa, jotka ilmentävät kohdunulkoinen Chk1, LBH589 hoito ei aktivoida cdc2, joka arvioidaan Tyr15 defosforyloimalla (kuvio 4C), kun taas mitään muutoksia ei havaittu HDACi aiheuttama histoni asetylaatio. Samanlaisia ​​tietoja saatiin lippu-tagged Chk1 ilmentämisplasmidin NSCLC soluissa (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat, että Chk1 downregulation olennainen rooli HDACi välittämän solukuoleman.

Chk1 downregulation korreloi apoptoottisen solukuoleman ensisijainen NSCLC käsitellyissä soluissa LBH589

ex vivo

Voit tarkistaa downregulation Chk1 kliinisesti merkittäviä kasvain näytteet, tuumorisolut kerättiin NSCLC potilaiden kasvaimia käsiteltiin ex vivo LBH589. Yhteensä proteiinit uutettiin, ja huumeiden-välitteinen muutoksia ilmentymisen Chk1, histoni asetylaatio, ja PARP pilkkominen analysoitiin Western blot. Kuten kuviossa 4D, ex vivo solujen käsittely LBH589 (40 nM) aiheutti lisääntynyt histoni H4 asetylointi kaikissa kasvain näytteissä, kun taas, LBH589 hoito lisäsi PARP pilkkominen vain 2 5 näytettä, jotka läheisesti korreloi Chk1 downregulation. Nämä tulokset tukevat havainnot edellä esitetty NSCLC solulinjojen ja viittaavat siihen, että vähentynyt Chk1 ja fosfo-cdc2 (Tyr15) pitoisuudet voivat olla herkkiä farmakodynaamisia merkkiaineita HDACi teho potilaiden kasvain näytteissä ennustaa ja arvioida potilaan vaste HDACi hoidon kliinisissä tutkimuksissa.

HDACi välittämä solukuolema vaatii mitoosi merkintä

edellä esitetyt tiedot tukevat sitä mallia, jossa epäonnistuminen Chk1 välittämän tarkastuspiste aktivointi on keskeinen rooli HDACi välittämän solukuoleman. Täten oletamme, että salpaus mitoosi tulon vähentäisi herkkyyttä syöpäsolujen sytotoksisille vaikutuksille HDACi hoidon. Tämän hypoteesin testaamiseksi A549-soluja esikäsiteltiin voimakas cdc2 estäjä, purvalanol [27], estää pääsyn mitoosiin. Virtaussytometrianalyysin osoittaa, että 40 nM LBH589 24 tuntia aiheutti merkittävän kasvun soluja G

2 /M ja noin 20-kertainen osa-G

1 huippu (hypodiploid solut) 24 tunnin kuluttua hoito, sopusoinnussa lisääntynyt solukuolema. Kasvu osa-G

1 väestöstä jälkeen LBH589 hoidon, oli kuitenkin merkittävästi vähentää solujen esikäsittely purvalanol A (kuvio 5), mikä osoittaa, että mitoottisen salpauksen aiheuttaa resistenssiä sytotoksisia vaikutuksia LBH589. Tämän havainnon varmistamiseksi, teimme Western blot-analyysi, jossa uutteet valmistettiin A549-solut altistettiin LBH589 kanssa tai ilman purvalanol esikäsittely. Kuvio 5 esittää, että purvalanol esikäsittely esti LBH589 indusoiman apoptoottisen solukuoleman, mitattuna cPARP, antaa lisätukea, että HDACi solukuolema pitkälti edellyttää pääsyä mitoosiin.

Solut, jotka käsitelty LBH589 40 nM tai ilman purA (10 uM) esikäsittelyn analysoitiin virtaussytometrialla solusyklin jakelua tai Western blot määrittää lääkeaineen-välitteisen muutoksia cPARP. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

HDAC ja Chk1 inhibiittorit osoittavat synergististä vaikutusta NSCLC soluissa

Tuloksemme osoittivat, että HDACi hoitotavoitteita Chk1 aiheuttaa sopimatonta mitoottisiin merkintä ja mikä saa aikaan sen sytotoksisia vaikutuksia kasvainsoluihin. Vähäisemmälle solujen herkkyys HDACi hoidon havaittiin A549-soluja ektooppisesti ilmentävät Chk1 (kuvio 4C) esittää, että aktivointi Chk1 ja sen alavirran signalointireitin, jotka ohjaavat G

2 Check Point, voivat aiheuttaa resistenssin HDACi hoidon. Näin ollen on todennäköistä, että Chk1: n estäjät voivat voimistaa sytotoksisia vaikutuksia HDACis kasvainsoluissa, jotka ovat resistenttejä HDACis. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi A549-soluja käsiteltiin LBH589 ja Chk1 estäjä (UCN-01) 24 tunnin ajan. Kuvio 6A esittää, että pieninä pitoisuuksina, eikä LBH589 (4 nM) eikä UCN-01 (250 nM) yksinään voi aiheuttaa PARP lohkaisu A549-soluja, kun taas näiden kahden lääkkeiden määrä kasvoi voimakkaasti PARP-proteiinin pilkkominen, mikä viittaa mahdollisen synergian. Vahvistavan synergistisen vuorovaikutuksen HDAC ja Chk1 estäjät, me seuraavaksi suoritetaan mediaaniannos vaikutuksen analyysi. Tätä tarkoitusta varten A549-solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia LBH589, UCN-01 tai näiden yhdistelmä lääkkeiden kiinteässä suhteessa. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen CT-Blue-kokeessa, ja vaikutus analysoitiin käyttämällä mediaani vaikutus analyysiä. Kuten kuvioissa 6B ja 6C, altistuminen solujen yhdistelmä LBH589 ja Chk1 estäjät kohdistuu voimakas synergistinen vaikutus. Käyttämällä näitä samoja menetelmiä, synergistinen vuorovaikutus havaittiin myös välillä LBH589 ja uusi Chk1 estäjä AZD7762 [28] NSCLC-soluja, jotka johtivat CI-arvo 0,76 osoittaa kohtalaisen synergistinen vaikutus (tuloksia ei ole esitetty).

, A549-soluja käsiteltiin LBH589 40 nM ja /tai UCN-01 (250 nM) 24 tunnin ajan, solu-uutteet valmistettiin ja Western blot -analyysi suoritettiin PARP (t: yhteensä, c: halkaistut). Kokeet toistettiin ainakin 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

B

, A549-soluja käsiteltiin LBH589 ja UCN-01 joko yksinään tai yhdistelmänä tasaisella nopeudella (01:40) 72 tunnin ajan. Lääkeainepitoisuudet on merkitty vaaka-akselilla ja funktiona solujen elinkelpoisuuden kontrollikuoppia, joka on mielivaltaisesti asetettu 100% elinkelpoisuuden kutakin koetta varten. Virhe pylväät edustavat ± SD 4 rinnakkaisten kaivojen.

C

, yhdistetyt vaikutukset LBH589 ja Chk1 estäjä UCN-01 kvantitoitiin kanssa Chou ja Talalay yhdistelmä indeksi (CI) menetelmä (40). CI käytetty lääkeyhdistelmä analyysit määritettiin isobologram- yhtälö (katso teksti). Sijoitus symbolit (+/-) osoittavat keskimääräinen laskennallinen Chou ja Talalay yhdistelmä indeksi (CI) alue (+++, epätehokkaalla).

Edellä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että huumeiden inhiboimalla proteiinien säädellä negatiivisesti funktio cdc2-sykliini B kompleksi voidaan lisätä G

2 tarkistuspiste kumoamisen ja sytotoksisia vaikutuksia HDACis tuumorisoluissa.

keskustelu

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että HDACi aiheuttama solukuolemaan liittyy poikkeava mitoosia ja häiriöitä solusyklin tarkastuspisteiden [29] – [34]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit, joilla HDACi käsittely johtaa mitoottisiin solukuolemaa ei ole hyvin ymmärretty. Täällä, osoitimme, että HDACi hoitoon ihmisen NSCLC-solujen johtaa downregulation koko Chk1 proteiinin tasoja. Osoitimme, että downregulation on biologisesti relevantteja osoittamalla samanaikainen lasku tasot estävää fosforylaation avaimen solusyklin säätelyproteiineja cdc25c ja cdc2. Vähentynyt veren kokonaiskolesterolia Chk1 proteiinin edelsi apoptoosin induktio ja histoni asetylaatio, joka osoittaa, että Chk1 downregulation on varhainen tapahtuma HDACi toimintatapa ja että se on keskeinen rooli huumeiden välittämän solukuoleman.

Chk1 ilme on osoitettu vaihdella solusyklin aikana [35]. Kuitenkin, koska Chk1 pääasiassa ilmaistiin S M vaiheen solusyklin sekä RNA ja proteiini tasoilla [35], on epätodennäköistä, että HDACi estoa Chk1 on seurausta kasvun pysähtymistä G

2 /M vaihe. RT-PCT-kokeet osoittivat, että transkription inhibitio Chk1 on tärkeä rooli HDACi-välitteinen säätely Chk1 proteiinia. Mekanismi, jolla HDACis säätelevät transkription ilmentymistä Chk1 on tuntematon, ja on vielä selvittämättä.

kasvainten solujen pan HDACis on raportoitu aiheuttavan asetylaatio Hsp90 estämällä HDAC6 ehtyminen ja useita Hsp90 asiakkaan proteiineja kuten AKT ja c-RAF [22], [36], [37]. Tulokset osoittavat, että olosuhteissa, joissa LBH589 indusoi Chk1 downregulation, ei inhibitiota havaittiin ekspressiotasot AKT ja c-RAF. Lisäksi valikoivat HDAC estäjät valproaatti, apicidin ja MS-275, josta ei aiheudu estovaikutusta HDAC6 kykenivät estämään Chk1 ilme. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että esto Chk1 ilmentymisen HDACi käsiteltyjä soluja ei todennäköisesti ole välittyy inaktivaation HSP90-proteiinia, vaan johtui pikemminkin tukahduttamisen CHK1 ilmaisun.

Yksi suurimmista haasteista kehittämisessä of HDACis on määritelmän kliinisesti merkittäviä päätepisteet arvioida lääkkeen tehoa potilaan kasvaimissa alkuvaiheessa hoidon ennustaa kliiniseen tulokseen. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että downregulation yhteensä Chk1 proteiinin tasot korreloivat paljon voimakkaammin sytotoksisten vaikutuksen mieluummin kuin histonien hyperasetylaation molemmissa solulinjoissa ja primaarisissa NSCLC jotka oli saatu potilaasta kasvaimista ex vivo. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että downregulation Chk1 ja Tyr15 fosforylaation cdc2 tasoja voi olla herkkä ja kliinisesti merkittävä farmakodynaaminen markkereita tehoa HDACis.

Huolimatta lupausta nousevana syöpähoidon kliinisiin tutkimuksiin, tehokkuutta HDACis on ollut vähäistä, eikä selvää resistenssimekanismi on selvitetty [1]. Nykyinen tulokset tarjoavat mahdollisen käsityksen mekanismi HDACi toiminta ja kestävyys. Olemme osoittaneet, että ektooppinen ekspressio Chk1 ja ehkäisy mitoosi tulon, jonka cdc2-inhibiittori purvalanol vähentynyt LBH589 solukuolema. Nämä havainnot viittaavat siihen, että taso Chk1 ilmentymisen tai aktivoitumista entsyymien asema säätelemällä M-vaiheen merkintä, kuten cdc25 ja cdc2-sykliini B monimutkainen, voi olla tärkeä rooli päätettäessä herkkyyttä tai resistenssiä syöpäsolujen HDACis. Tässä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että malli, jossa mitoosi merkintä on tarvittava askel HDACi välittämän solukuoleman. Lisäksi solumekanismeja jotka estävät Chk1 downregulation ja /tai ohituksen Chk1 ja sitä toimimaan G

2 tarkistuspisteen kontrolli estämään solujen pääsemästä mitoosi vaihe aiheuttaisi vastustuskykyä HDACis. Esimerkiksi, Chk1: n on osoitettu olevan erittäin ilmaistaan ​​NSCLC kasvaimissa [38], jotka voivat resistenssin HDACi aiheuttaman mitoottisia tulon ja solukuolemaa. Siten kasvaimissa lisääntynyt Chk1 aktiivisuus, rationaalinen yhdistelmät HDACis lääkkeiden kanssa samanaikaisesti estävät Chk1 ja sen loppupään signalointireitteihin ohjaamalla G

2 /M solusyklin tarkastuspiste voi lisätä sytotoksisia vaikutuksia HDACis.

HDACis on osoitettu synergisesti DNA: ta vaurioittavat aineet [1]. Kuitenkin molekyylimekanismeihin tätä synergiaa ei hyvin ymmärretty.