Krooninen sairaus

tiivistelmä

Bezielle on kasvitieteellinen ote, joka on valikoiva antituumorivaikutuksen, ja on osoittanut lupaavia tehoa alkuvaiheessa kliinistä testausta. Bezielle estää mitokondrion hengitystä ja aiheuttaa reaktiivisen hapen (ROS) mitokondrioita kasvainsolujen, mutta ei ei-transformoiduissa soluissa. Suurien ROS kasvainsoluissa johtaa raskaisiin DNA-vaurioita ja hyper-aktivointi PARP, minkä jälkeen inhibitio glykolyysin. Bezielle siis kuuluu ryhmään lääkkeitä, jotka kohdistuvat kasvainsolujen mitokondrioita, mutta sen sytotoksisuus liittyy esto sekä solun energiaa tuottavien reittejä. Olemme havainneet, että sytotoksinen aktiivisuus Bezielle poimia

in vitro

yhteistyössä puhdistettiin määritelty osa sisältää useita flavonoideja. Olemme eristäneet useita näistä Bezielle flavonoideja, ja tutkitaan niiden mahdolliset roolit selektiivinen kasvaimen vastaisen sytotoksisuuden Bezielle. Tuloksemme tukevat hypoteesia, että suuri Scutellaria flavonoidi, scutellarein, hallussaan monia jos ei kaikki biologisesti merkittävät ominaisuudet koko uutetta. Kuten Bezielle, scutellarein indusoi yltyviin ROS mitokondrioiden alkuperää, progressiivinen DNA-vaurioita, proteiinia hapetus, ehtyminen pelkistetyn glutationin ja ATP, ja tukahduttaminen sekä OXPHOS ja glykolyysin. Kuten Bezielle, scutellarein oli valikoivasti sytotoksisille kohti syöpäsoluja. Carthamidin, joka on flavonone löytyy Bezielle, myös aiheuttama DNA-vaurioita ja oksidatiivista solukuolemaa. Kaksi tunnettua kasvi flavonoidit, apigeniiniä ja luteoliini, oli rajallinen eikä valikoiva sytotoksisuutta, jotka eivät riipu niiden pro-hapetin toimintaa. Tarjoamme myös todisteita siitä, että sytotoksisuus scutellarein lisääntyi, kun muut Bezielle flavonoideja, ei välttämättä erittäin sytotoksinen tai valikoiva omasta, oli läsnä. Tämä osoittaa, että toiminta koko Bezielle ote saattaa riippua yhdistelmä useista eri yhdisteistä sisällä.

Citation: Chen V, Staub RE, Baggett S, Chimmani R, Tagliaferri M, Cohen I, et al . (2012) tunnistaminen ja analyysi Active Fytokemikaalit alkaen Anti-Cancer kasvit Pura Bezielle. PLoS ONE 7 (1): e30107. doi: 10,1371 /journal.pone.0030107

Editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Kanada

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat kokonaan BioNovo, Inc. rahoittaja oli vaikutusta päätökseen tutkimukseen Bezielle kuin solunsalpaajaksi, mutta ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat julistaa taloudellinen kilpailevan edun. Tekijät myöntävät, että he ovat palkattuja työntekijöitä ja varastossa haltijoille BioNovo, Inc, ja että tämä tutkimus, kokonaisuudessaan, tukivat varoja BioNovo. Bezielle (BZL101) on Bionovo patentoima kasvitieteellinen lääkeainekandidaatti (FDA-IND: 59521) ja metastaattisen rintasyövän. Bionovo: n US-patentti nro 7700136 koskee menetelmää, jolla hoidetaan rintasyöpää käyttäen uutetta Scutellaria Barbata. Tämä patentti kattaa myös käyttöä Bionovo n oma BezielleR formulaatioon monoterapiana rintasyövän. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Bezielle (BZL101) on vesipitoinen uute maanpäällisten osien yrtti Scutellaria barbata pitkään käytetty hoitoon kuume ja syövän perinteisen kiinalaisen lääketieteen. Bezielle on selektiivisesti sytotoksinen tuumorisoluille säästäen normaalia ja ei-transformoitujen solujen

in vitro

[1]. Bezielle uute oli osoitti lupaava syövän vastaista aktiivisuutta in varhaiseen kliiniseen testaukseen [2], [3], mutta kliinistä jatkokehitystä Bezielle olisi edennyt kemiallisen tunnistamisen yhdisteen (t) Bezielle jotka ovat suoraan vastuussa sen anti -cancer toimintaa. Tämä strategia on johtava periaate syövän tutkimus suoritettiin BioNovo että tavoitteena on tuoda käytäntöön länsimaisen lääketieteen joidenkin kasviperäisten tietoa kertynyt perinteinen kiinalainen lääketiede. Tavoitteena on siltana kasvitieteellinen perustuvan perinteisen lääketieteen ja yhdiste-pohjainen Western lääke, joka pakostakin liittyy tunnistaminen aktiivisen fytokemikaalit koko yrttiuutteet. Tässä artikkelissa kuvataan tunnistaminen ja analysointi aktiivisen phytochemical (t) Bezielle. Toiminta-ohjattu fraktiointi Bezielle johti tunnistamiseen erillinen osa, joka oli selektiivisesti sytotoksinen

in vitro

. Edelleen kemiallinen analyysi tämän murto paljasti, että se sisältää useita läheisten yhdisteiden perheeseen kuuluvan flavonoideja. Flavonoidit ovat phytochemicals löytyy monenlaisia ​​kasveja, mukaan lukien yleinen normaalia ruokavaliota. Flavonoidit, yleensä katsotaan olevan tulehdusta, antioksidantti ja syöpää ehkäisevien (tarkistetaan muiden muassa [4], [5], [6]).

Liitteenä paperia tässä kysymys ja meidän tulokset julkaistiin aiemmin [1] osoittavat, että Bezielle tappaa kasvainsolut indusoimalla reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), DNA vaurioita, romahdus redox tilan ja aineenvaihdunnan tukahduttaminen, johon liittyy esto sekä mitokondrioiden hengityksen ja glykolyysin sekä ehtyminen mitokondriaalisen varakapasiteettia. Kaikki nämä toimet on Bezielle poistetaan kasvainsoluissa vammaisten mitokondriaalisen hengityksen. Siksi olemme tutkineet Bezielle johdettuja flavonoideja toiminnalle ominaisia ​​Bezielle. Erityisesti neljä suurta Bezielle flavonoideja tunnistettu kautta aktiivisuus-ohjattu eristäminen analysoitiin (a) selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluihin; (B) kyky aiheuttaa progressiivisesti lisääntyvää ROS; (C) riippuvuus ROS induktion ja sytotoksisuus läsnäolo respiring mitokondrioita; (D) induktio DNA-vaurioita; (E) vaikutuksia solun hapetus asema; (F) aineenvaihdunnan suppression.

ilmoittaa, että joitakin flavonoideja, kaukana ottaa antioksidantti ominaisuuksia, aiheuttaa ROS ja DNA-vaurioita edullisesti kasvainsoluissa. Erityisesti, scutellarein oli selektiivisesti sytotoksinen kasvainsolujen, mutta ei ei-transformoitujen solujen. Scutellarein indusoi progressiivisesti korkeampia ROS ja DNA-vaurioita kerrallaan riippuvaisella tavalla, samanlainen koko Bezielle. Scutellarein myös aiheuttama metabolinen tukahduttaminen, estämällä sekä OXPHOS ja glykolyysin. Jälkimmäinen toiminta scutellarein sekä sen sytotoksisuutta tehostettiin kun se yhdistetään muihin flavonoideja, jotka itse eivät ole kovin sytotoksinen ja eivät aiheuta DNA-vaurioita.

Materiaalit ja menetelmät

Toiminta Ohjattu eristäminen syövän yhdisteiden Bezielle

Tee kaltainen otteita

Scutellaria barbata

toimintaa varten opastettu eristäminen valmistettiin lisäämällä vettä maahan, kuivatut yrtti (10:01, tilavuus : massa), sitten seos saatetaan kiehuvaksi. Kasviperäisiä Liuoksen annettiin hautua 45-60 minuuttia noin 70 ° C: ssa, imusuodatettiin (Whatman 1 paperisuodatin) tuottamaan raakaa teetä. Yhtä suuri tilavuus asetonia lisättiin uutteen luoda sakka. Asetoni: vesi liuos imusuodatettiin (Whatman 1 suodatinpaperi) ja konsentroitiin sitten pyöröhaihduttimella

tyhjiössä

asetonin poistamiseksi ja edelleen pienentää vesipitoisen tilavuuden mukaan 60-70%. Konsentroitu teen suodatettiin uudelleen (0,45 um).

Konsentroitu uute ajettiin avata pylväskromatografialla Diaion HP-20-hartsia (Supelco, Bellefonte, PA). Näyte ladattiin pylvääseen 20% metanolia vedessä ja eluoitiin 20%, 50%, 75% ja 100% metanolia (kolme kolonnin tilavuutta kutakin vaihe). Fraktiot testattiin sytotoksisuus käyttäen CCK8 määritystä, ja DNA vahingollisen toiminnan avulla Comet määritystä. Molemmat toimet havaittiin liittyvän 75% ja 100% metanolia jakeet.

Aktiiviset fraktiot HP-20 -pylväästä yhdistettiin, konsentroitiin ja sille suoritettiin avata pylväskromatografisesti Sephadex LH20-hartsia (Sigma-Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI). Näyte ladattiin 1:01 metanoli-vedellä ja eluoitiin neljässä vaiheessa 50%, 60%, 75% ja 100% metanolia vedessä. Sytotoksisuus koetulokset määritetty, että suurin aktiivisuus oli fraktioissa, jotka eluoituivat pylväästä 75-100% metanolia. Fraktio samanlainen kokoonpano ja toiminta valmistettiin myös jakamalla Bezielle etyyliasetaatilla (kuvio 1).

Tämä fraktio eristettiin, kuten on kuvattu kokeellisessa menettelyjä. Rakenteet joitakin yhdisteitä, jotka analysoitiin tarkemmin esitetään.

Preparatiivinen HPLC suoritettiin aktiiviset fraktiot, jotka otettiin talteen LH20 sarakkeen tai vastaava etyyliasetaatti osio Bezielle. Preparatiivinen HPLC käytetään lineaarista gradienttia 10%: sta 60% asetonitriilillä 0,1% vesipitoista trifluorietikkahappoa 30 min Phenomenex Luna C18 (2) -pylvääseen (150 x 21,1 mm, 5 um), virtausnopeudella 20 ml /min. Useat yhdisteet puhdistettiin preparatiivisella HPLC: llä ja niiden rakenteet selvitetty. Scutellarein, luteolin ja apigeniiniä tunnistettiin perustuen LC /MS ja NMR vertailu kaupallisen vertailustandardeista. Isoscutellarein ja carthamidin tunnistettiin perustuen LC /MS, 1D ja 2D NMR ja vertailu saaduilla tiedoilla. Apigeniini ja luteoliini ostettiin Indofine Chemical Company, Inc. (Hillsborough, NJ). Scutellarein hankittiin Apin Chemical Company (Abingdon, Oxfordshire UK). Scutellarein, isoscutellarein ja carthamidin syntetisoitiin myös nimellä BioNovo. Data rakenteellisen selvittämiseen yhdisteiden ja synteesimenetelmiä löytyy Menetelmät S1.

Reagenssit ja vasta-aineet

Kaikki reagenssit ja inhibiittorit hankittiin Sigmalta. Fluoresoiva indikaattorit ROS, mitokondrioiden superoksidi ja typpioksidin, CM-H

2DCFDA, MitoSox ja CM-H

2DAFDA ja olivat Molecular Probes /InVitrogen. Vasta-aineita nitrotyrosiini olivat Millipore, vasta PAR oli Becton-Dickinson.

Soluviljely ja hoitoja

Kaikki solulinjat saatiin ATCC, ja lisättiin RPMI 10% FCS ( MDAMB231), DME 10% FCS (Hs578T, SKBr3) ja DME /F12 5% FCS ja lisäykset (MCF10A ja 184A1). Väliaineena MCF10A ja 184A1 sisälsi myös 50 ug /ml aivolisäkeuutetta, 10 ug /ml insuliinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia ja 0,02 ug /ml EGF: ää (Sigma). Kaikki media olivat pyruvaatti-ilmaiseksi. Soluja käsiteltiin BZL101 pitoisuutena 250 ug /ml (kuivapaino per tilavuus) tai vedellä (merkitty ”käsittelemätön” koko paperi). Flavonoidit liuotettiin DMSO: hon, ja ohjaus viljelmiä käsiteltiin pelkästään DMSO: lla.

Mittaukset solujen elävyyden, mitokondrion potentiaali, ATP: n ja GSH

Solujen elävyys määritettiin käyttäen CCK-8 kit (Dojindo) . Mitokondrion transmembraaninen potentiaali (ΔΨM) elävissä soluissa analysoitiin käyttämällä mahdollisia herkän kationinen väriaine JC-1 (Molecular Probes) inkuboimalla soluja 2 uM JC-1 30 minuuttia. Solut pestiin, ja punainen fluoresenssi (ohjeellinen terveiden mitokondrioita) sekä vihreän fluoresenssin (merkki mitokondrioita alhainen ΔΨM) määritettiin FACScan. ATP tasojen määrä käyttämällä ATP bioluminisenssimääritys Kit HS II (Roche Applied Science). Määrittämiseksi tasojen pelkistettyä glutationia, solut 96-kuoppaisilla levyillä inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi 8 ​​uM monobromobimane (MBB). Eri aikoina lisäämisen jälkeen Mbb fluoresenssi luettiin levylukijalla suodattimilla asetettu heräte 360 ​​nm ja emissio 460 nm.

analyysi oksidatiivisen proteiinin muunnoksia

Karbonyylifluoridi muuttaminen proteiinien soluja käsiteltiin Bezielle ja flavonoideja kvantitoitiin käyttäen FlowSellect Oksidatiivinen stressi Kitin Millipore. Sarja sisältää 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNP), kemikaali, joka kovalenttisesti sitoutuu karbonyyli muutokseen proteiineissa. Kun oli muodostettu johdannainen karbonyyliryhmien, DNP sitoutuneet proteiinit havaitaan A FITC-konjugoitu anti-DPN-vasta-aine.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateille elektroforeesi SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle kalvot. Membraanit blotattiin vasta-aineita suositellaan pitoisuuksina yli yön 4 ° C: ssa ja sitoutuneet primaaristen vasta-aineiden havaittiin käyttäen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Blotit kehitettiin käyttäen SuperSignal tehostetun kemiluminesenssin (Pierce) ja kuvattiin Kodak Imager ISR2000.

Comet määritys

Alkaline komeetta analyysit suoritettiin käyttäen Comet määritys pakki Trevigen mukaan valmistajan ohjeiden. Elektroforeesin jälkeen tumat värjättiin SYBR vihreä ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla. Prosenttiosuudet solujen komeettoja kvantitoitiin sokko tarkkailija identiteettiä dioja. Olive tail hetkellä määritelty tuote prosenttiosuus DNA häntää ja siirtymä aseman keskimääräinen massakeskipisteisiin päät ja hännät, määritettiin vähintään 40 solua näytettä kohti. Solut valokuvattiin ja analysoitiin TriTek CometScore kuva-analyysi-ohjelmisto.

Metabolinen analyysit Seahorse XF96 Solunulkoisilla Flux Analyzer

Solut maljattiin yön XF96 PET 96 kuoppalevyille kokeellisesti ennalta määrätty määrä (10 × 10

3 solua kohti hyvin MDAMB231 ja 12 x 10

3 solua kohti hyvin MCF10A). Metabolinen vuot analysoitiin Seahorse XF96 analysaattori mukaisesti valmistajan ohjeita kuten aikaisemmin on kuvattu [7]. Pohjapinta ECAR arvot (mph /min), PPR (in pmolH + /min) ja OCR-arvot (in pmoolia O

2 /min) mitattiin 4 sykliä. Mittaamisen jälkeen pohjapinta tasoilla, mitokondrioiden uncoupler FCCP 1 uM automaattisesti ruiskutettiin koekaivoja määrittämiseksi maksimaalisen mitokondrion hengitystä, tai varakapasiteettia. Seuraavat: yksi sykli mittausten estäjä mitokondrion kompleksin III Antimysiini- 5 uM ruiskutettiin koekaivoja, ja toinen mittausjakso suoritetaan. Jokainen kokeellinen piste oli keskimäärin 6-10 replica kaivoja, ja kokeet toistettiin vähintään 4 kertaa. Normalisoituminen ECAR, PPR OCR saadut arvot XF96 määrityksissä suoritettiin käyttäen määrällistä solun DNA kanssa CyQuant määritystä (Promega) kokeellisista levyille. Kaikki XF96 tiedot ilmaistaan ​​ECAR tai OCR-arvot normalisoitu DNA-sisältöä tai prosenttia toimintaa suhteessa näihin mitattuna samassa kokeessa soluissa pidetään kokonaan media (normalisoinnin jälkeen kaikkien tietojen sarjat).

tulokset

eristäminen ja aktiivisten fraktioiden puhdistukseen ja yhdisteiden Bezielle poimia

toiminta-ohjattu eristäminen aktiivisia fraktioita ja yhdisteitä aktiivisessa jakeet kuvataan materiaalit ja menetelmät. Fraktio korkea ja selektiivinen sytotoksinen aktiivisuus eristettiin (kuvio 1). Tämä murto-osa, joka on samanlainen yhteensä Bezielle uute oli erittäin sytotoksinen kohti rintasyövän solulinjat MDAMB231 ja SKBr3, mutta ei tuota merkittävää solukuolemaa kuolemattomaksi ei-transformoitua solulinjaa MCF10A tai primaarisista ihmisen fibroblastit IMR90 (ei esitetty). Kuten on kuvattu Koejärjestelyt, yhdisteet osa erittäin runsaasti sytotoksinen aktiivisuus havaittiin flavonoideja. Useat niistä puhdistettiin homogeeniseksi, jonka tunnuksena Menetelmät kuvatulla tavalla S1 ja analysoitiin solujen määrityksissä.

Sytotoksinen aktiivisuus valittujen Bezielle flavonoideja

Ensinnäkin, sytotoksisuus useita flavonoideja eristetty Bezielle testattiin rintasyöpä linjat MDAMB231 ja ei-transformoitu rintarauhasen solulinjaa MCF10A. Kuvio 2A esittää sytotoksisuus kaksi läheistä sukua flavoneista apigeniiniä (A) ja luteoliini (L), jotka ovat laajasti tunnettu julkaistusta kirjallisuudesta, useimmat kuvaavat raportit antioksidantti näiden yhdisteiden ominaisuuksia. On selvää, nämä flavonit oli rajoitettu sytotoksisuuden MDAMB231 soluissa ja hieman korkeampi aktiivisuus MCF10A soluja, mikä on juuri päinvastoin selektiivisyyden nähty Bezielle. Lisäksi, doze vaste MCF10A ja MDAMB231-solujen A ja L on suhteellisen tasainen yli konsentraatioalueella 5-20 ug /ml (kuvio 2A), viitaten siihen, ettei annos-vaste. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ei ole apigeniini eikä luteoliinia erikseen vaikuttaa merkittävästi selektiivistä sytotoksista aktiivisuutta Bezielle.

. Sytotoksinen aktiivisuus apigeniini (A), luteoliini (L) ja Bezielle rintasyöpäsoluissa MDAMB231 ja ei-transformoitujen rinnan epiteelisolujen linja MCF10A. Soluja käsiteltiin 24 tuntia ennen analyysiä pitoisuuksien flavonoideja merkitty oikealle kaavioita (5, 10 ja 20 ug /ml), tai Bezielle (BZL), 250 ug /ml. B. sytotoksiset toiminta scutellarein (S), isoscutellarein (IS) ja carthamidin (C), kuten A. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 4).

Kuvio 2B esittää solukuoleman induktioon, jotka liittyvät läheisesti flavoneista scutellarein (S) ja isoscutellarein (IS) sekä flavonone carthamidin (C). Scutellarein oli vähäinen vaikutus elinkelpoisuuden MCF10A soluja, mutta oli erittäin sytotoksinen kohti MDAMB231 (ja muut syöpäsolulinjat, jota ei ole esitetty), annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B). Isoscutellarein oli merkitsevästi vähemmän sytotoksinen MDAMB231 soluja kuin scutellarein, ja ei tappanut MCF10A soluja, osoittaa rajallinen mutta selektiivinen sytotoksisuus. Carthamidin oli aktiivisempi MDAMB231-soluja kuin MCF10A solut kahden pienemmillä pitoisuuksilla. Kuitenkin solukuoleman käsitellyissä viljelmissä 20 ug /ml carthamidin oli hyvin merkittävä ja ilmeinen jo 4-5 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta, mikä osoittaa vaikeaa myrkyllisyys carthamidin suurempi pitoisuus.

kaksi ylimääräistä rintasyövän solulinjat, Hs578T ja SKBr3 oli sama kuvio herkkyys flavonoideja MDAMB231 (kuvio S1 ja ei ole esitetty). Olemme myös testattu muita kuolemattomiksi ei-transformoitu solu, joka on peräisin rintarauhasen epiteelin 184A1 ja MCF12A, joka vastasi hoitoon flavonoideja samalla MCF10A (ei esitetty).

Nämä tulokset tunnistaa scutellarein kaikkein sytotoksiset ja, tärkeintä, selektiivisesti sytotoksinen, Bezielle flavonoidi ulos yhdisteiden analysoitu täällä. Isoscutellarein osoitti selektiivisyyttä syöpäsoluja, mutta ei tutkittu tarkemmin, koska se marginaalinen sytotoksisuuden. Carthamidin oli myös selektiivisiä syöpäsoluja pienemmillä pitoisuuksilla, kun taas apigeniiniä ja luteoliini- olleet lainkaan valikoiva.

Generation of ROS tekijänä Bezielle flavonoideja

Prosessi Bezielle aiheuttama kuolema syöpäsoluissa aloitetaan by sukupolven korkeita ROS. Lisäksi tasot ROS, sekä peroksidi tyyppi ja mitokondrioiden superoksidi aikaansaama Bezielle lisää huomattavasti ajan tuumorisoluissa mutta ei MCF10A soluissa (Chen et ai., Esitti). Siksi tutkittiin, jos yksittäisten flavonoidien Bezielle tuottaa ROS ja superoksidi syöpäsoluissa, mutta ei ei-transformoiduissa soluissa, ja jos induktio ROS kasvaa ajan myötä, kun nähdään Bezielle. Tasot peroksidi tyyppi ROS (havaittavissa H

2DCFDA) tutkittiin käsitellyissä soluissa eri aikoina, ja kaksi ajankohtina on esitetty kuviossa 3A. Kaksi erillistä ominaisuudet ovat selviä: a) kaikki flavonoideja indusoivat paljon korkeampia peroksidi tyyppi ROS MDAMB231 kuin MCF10A soluissa, ja b) vain scutellarein esittää ajasta riippuva nousu tasoilla ROS, samanlainen Bezielle. Induktioon peroksidi tyyppi ROS by apigeniiniä, carthamidin ja luteolin ei kasvanut ajan myötä, mutta pysyi joko ennallaan tai oli hieman vähentynyt, vaikka aluksi apigeniiniä indusoi korkeimmat ROS. Pitoisuuksien nousu DNA vahingoittamatta peroksidi tyyppi ROS aiheuttama scutellarein ajassa riippuvalla tavalla tukee edelleen sitä mahdollisuutta, että scutellarein on mukana selektiivinen kasvaimen vastaisen sytotoksisuuden Bezielle.

. Induktio peroksidi tyyppi ROS jonka flavonoidit MDAMB231 ja MCF10A soluja. Soluja käsiteltiin 30 minuuttia tai 6 tuntia, jossa on esitetty flavonoideja 10 ug /ml ja analysoitiin vihreän fluoresenssin (FL1) FACScan lataamisen jälkeen H

2DCF-DA. Tulokset esitetään kertainen lisäys FL1 havaittiin käsittelemättömissä soluissa analysoitiin samalla kokeissa (FL1 tasot käsittelemättömillä soluilla, on merkitty katkoviivalla). B. induktio mitokondrioiden superoksidia Bezielle flavonoideja. Käsittelyn jälkeen kuten A, solut ladattiin MitoSox Red ja analysoitiin tasot punaisen fluoresenssin (FL2). Tulokset esitetään samalla tavalla kuin A, ja ovat keskiarvo ± S.E. kolmesta viiteen kokeissa C. Survival of MDAMB231 käsiteltyjen solujen flavonoideja 10 ug /ml 24 tunnin ajan puuttuessa tai läsnä ollessa 10 mM pyruvaattia tai NAC. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 3). Merkittäviä eroja (** P 0,01, * P 0,05) solujen välillä on käsitelty flavonoideja tai Bezielle yksinään tai läsnäollessa antioksidantit ovat e näkyvät. D. Sama kuin C, ja MCF10A soluja.

induktio mitokondrioiden superoksidi tutkittiin käyttäen indikaattorina MitoSox Red osoitti, että flavonoideja aikaan ajasta riippuva nousu mitokondrioiden superoksidia MDAMB231-soluja (kuvio 3B). Kasvu oli erittäin merkittävä (vähintään 5-kertainen) kolme flavonoideja mutta ei carthamidin, joka osoitti vain 30%: n nousu 6 tunnin kuluttua. Yllättäen apigeniiniä ja luteoliini, jotka olivat vähemmän sytotoksisia in MDAMB231 soluissa indusoi korkeimman mitokondrioiden superoksidi joka entisestään ajassa riippuvaisella tavalla (kuvio 3B). Tämä oli toisin kuin puute kasvu tasojen peroksidi tyyppi ROS ajan käsitellyissä soluissa näillä flavonoideja (kuvio 3A). Scutellarein, samanlainen Bezielle, oli vähäinen vaikutus mitokondrion superoksidi alussa inkuboinnin, mutta nostivat superoksidi noin seitsenkertainen 6 tunnin jälkeen (kuvio 3B).

induktio ROS mukaan Bezielle on kriittinen sen sytotoksisuus, joka lakkautettiin läsnäollessa hapettimen scavengers kuten N-asetyylikysteiini (NAC) ja pyruvaatti [1]. Olemme tutki NAC tai pyruvaatti voi estää solukuolema yksittäisten flavonoideja. Sekä pyruvaatti ja NAC erikseen esti indusoimaa solukuolemaa carthamidin ja scutellarein in MDAMB231-soluja (kuvio 3C), mikä viittaa siihen, että nämä yhdisteet indusoivat solukuoleman kautta oksidatiivista stressiä, samanlainen Bezielle. Kuitenkin, ei pyruvaatti eikä NAC voisi suojata MDAMB231 soluja rajoitettu aiheuttaman solu- kuoleman induktion apigeniini ja luteoliini (kuvio 3C), mikä osoittaa, että kuolema sai aikaan näiden yhdisteiden ei ollut seurausta oksidatiivisia vaurioita.

Samanlaiset kokeet olivat suoritettiin MCF10A soluja, jotka ovat hieman herkempiä tappaminen apigeniiniä ja luteoliinia. Kuten MDAMB231 soluja, oli minimaalinen suojan pyruvaattia ja NAC kuolemasta aiheuttama apigeniiniä ja luteoliini, mutta hyvä suoja havaittiin scutellarein ja Bezielle käsiteltyjä soluja (kuvio 3D). Kokeissa NAC ja pyruvaatin suoritettiin myös korkeamman pitoisuuden flavonoideja (20 ug /ml), ja tässä pitoisuudessa solut myös suojattu tappamista carthamidin ja scutellarein, mutta ei apigeniini ja luteoliini (ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että scutellarein ja carthamidin aiheuttaa solukuoleman kautta mekanismeja käsittäen oksidatiivisen stressin, kun taas Apigenin ja luteoliini, vaikka ne saavat aikaan solujen ROS, aiheuttaa rajallinen solukuoleman, joka ei ole oksidatiivista luonteeltaan.

Scutellarein indusoi enimmäkseen mitokondrion ROS jotka ovat kriittisiä sen sytotoksisuuden

Bezielle indusoi ROS pääasiassa mitokondrioissa koska käsittely Rho-0 variantti MDAMB231 että puuttuu hengitys-toimivaltaisen mitokondrioita, ei aiheuttaa joko mitokondrioiden superoksidi tai peroksidi tyyppi ROS. Vielä tärkeämpää on, MDAMB231 Rho-0-solut ovat erittäin resistenttejä Bezielle indusoidun kuoleman (Chen et ai., Esitti). Siksi tutkimme jos puuttuminen respiring mitokondrioita vaikuttaa ROS induktion yksittäisten flavonoideja. Kuvio 4A osoittaa, että induktio mitokondrioiden superoksidi kaikkien flavonoideja on voimakkaasti heikennetty MDAMB231Rho-0 solujen. Erityisesti superoksidi synnyttämät scutellarein ja carthamidin inhiboitui täydellisesti. Samoin induktio DCF-DA havaittavissa peroksidi tyyppi ROS mukaan carthamidin, scutellarein ja Bezielle oli myös estää lähes täysin. Tämä vahvasti siihen, että mitokondriot ovat ensisijainen lähde ROS aiheuttamien nämä flavonoidit kuitenkin apigeniiniä ja luteoliinia silti indusoi merkittäviä määriä DCF-DA havaittavissa ROS Rho-0 solujen. Tämä osoittaa, että apigeniiniä ja luteoliini- voitaisiin kohdistaa solun ROS muista lähteistä mitokondrioita.

. MDAMB231 ja MDAMB231Rho-0-soluja käsiteltiin flavonoideja 6 tunnin ajan, ja tasot ROS ja mitokondrioiden superoksidi kvantitoitiin kuten kuviossa 2. Tulokset ovat keskiarvo ± S.E. (N = 3). B. MDAMB231 Rho-0 solujen ja MDAMB231 soluja käsiteltiin Bezielle, scutellarein tai apigeniiniä 24 tuntia, ja prosenttiosuudet elossa solun määrällisesti. Tiedot ovat keskiarvo kolmesta kokeesta. C. Dissipation mitokondrion transmembraani- potentiaalia flavonoideja. Soluja käsiteltiin 2 tunnin ajan, täynnä mahdollisia herkkä väriaine JC-1 ja analysoitiin virtaussytometrialla. FL2 fluoresenssi pienenee soluissa madallettu ΔΨM; FL2 käsittelemättömien solujen annettiin tasolle 100%. Kaikki hoidot aikaan tilastollisesti merkitsevän hukkaamisen ΔΨM vertailuryhmän soluihin. Merkittäviä eroja havaittiin myös solujen välillä käsitelty scutellarein ja muiden ryhmien ja osoitetaan (** P 0,01, * P 0,05). D. havaitseminen karbonyloidaan proteiinien soluissa, joita käsiteltiin osoitetuilla flavonoidien tai Bezielle 4 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin, käsiteltiin DNP, pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoidun vasta-aineen DNP, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 3). Merkittäviä eroja (** P 0,01, * P 0,05) verrattuna hoitamattomiin on esitetty.

Me ja muut ovat osoittaneet, että käytetään laajasti NOx estäjä DPI on voimakas estävä vaikutus mitokondrion hengitystä. DPI estää voimakkaasti Bezielle aiheuttamaa ROS sukupolvi ja solukuolemaan (Chen et al., Toimitettu). Olemme tutkineet, onko DPI pystyy lieventäviä ROS induktion flavonoideja, ja havaittiin voimakas esto ROS, hyvin samankaltainen kuin Rho-0-solut (kuva S2). Esto hengityksen Rho-0 solujen ja soluissa akuutisti käsitelty DPI oli siis hyvin samankaltainen estovaikutusta induktioon mitokondrioiden ROS mukaan flavonoideja (kuva S2).

seuraava tutki estämällä mitokondrion hengitystä suojaa soluja flavonoidi aiheuttama kuolema. Scutellarein, samanlainen Bezielle (Chen et ai., Esitti), ei onnistunut indusoimaan solukuolemaa Rho-0-solut (kuvio 4B). Kuitenkin solukuoleman induktio apigeniiniä (kuva 4B) ja luteoliini (ei kuvassa) ei vaikuttanut puute toiminnallisten mitokondrioiden.

Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että apigeniiniä ja luteoliini- eivät todennäköisesti edistää oksidatiivista kapasiteettia of Bezielle. Vaikka molemmat flavoneista indusoi korkeita mitokondrioiden superoksidi, eikä hoito antioksidantteja eikä poistamalla mitokondrion hengitystä vaikuttanut niiden rajallinen sytotoksisuutta. Siksi osuus apigeniiniä ja luteoliini- sen sytotoksisuuden Bezielle ei ehkä liity ROS. Sen sijaan sytotoksisuus scutellarein ja carthamidin voimakkaasti esti joko käsittelemällä ROS puhdistavien tai Rho-0 solujen samanlainen Bezielle.

Flavonoidit esiin vähentäminen mitokondrion transmembraanisen potentiaali

Olemme osoittaneet aikaisemmin, että Bezielle indusoi voimakkaan hukkaamisen mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨM) tuumorisoluissa [3]. Siksi tarkasteltiin mahdollisten flavonoidien vaikutuksissa ΔΨM. Kuten nähdään kuviossa 4C, neljästä flavonoideja testattu, scutellarein aiheuttama vahvin menetys ΔΨM, vaikka carthamidin ei ollut erityisen aktiivinen, suostumuksella alhainen mitokondrion ROS se aiheuttaa. Apigenin ja luteolin aiheuttamaa hajoamista ΔΨM; kuitenkin, se ei ollut niin dramaattinen kuin menetys aiheuttama joko scutellarein tai Bezielle. Me tarkasteltiin myös hukkaamisen mitokondrion transmembraanisen potentiaalin flavonoideja voitaisiin vaimentaa antioksidantteja. Kuvio S3 osoittaa, että NAC esti osittain menetys ΔΨM aiheuttama scutellarein mutta ei apigeniini (ja luteoliini, jota ei ole esitetty). Pyruvaattia oli samanlainen vaikutusta (ei esitetty). Yhdessä edellä kuvattujen tulosten, tämä viittaa voimakkaasti siihen, että scutellarein (ja Bezielle) indusoivat suoraan hapettumista mitokondrioissa kasvainsoluissa. Apigenin ja luteolin voisi saada soluvasteita, joissa mitokondriot, mutta ei välttämättä riipu suoraan hapettumista mitokondrioita.

induktio proteiinin hapettumisen

Oksidatiivinen stressi aiheuttaa vahinkoa biomolekyylien muita kuin DNA. Olemme tutki Bezielle ja sen flavonoideja aiheuttaa yhteistä hapettavaa muutosta proteiinien, karbonylointi-. Kuva 4D osoittaa, että Bezielle ja scutellarein merkittävästi lisäävän solun sisällön karbonyloidaan proteiineja, ja hieman enemmän havaittiin apigeniiniä. Carthamidin ja luteolin ei aiheuttanut hapettumista solun proteiinien. Induktion proteiinin karbonylaatio- mukaan Bezielle ja scutellarein antaa lisävahvistusta varten hypoteesi, että scutellarein on merkittävä sytotoksinen aine Bezielle.

induktio DNA vaurioita flavonoidien Bezielle

Bezielle indusoi oksidatiivista DNA vahinko, joka on kriittinen sen kyky valikoivasti tappaa syöpäsoluja [1]. Olemme tutkineet, mitkä yksittäiset Bezielle flavonoideja aiheuttaa DNA-vaurioita. MDAMB231-soluja käsiteltiin flavonoideja ja määrällisesti kaksi parametrien DNA-vaurioiden käyttäen Comet määritystä: prosenttia solujen vaurioitunut DNA, ja oliivien hetkellä (jälkimmäinen heijastaa laajuus DNA-vaurioita solua kohti). Flavonoideja testattiin Comet määrityksellä käyttäen pitoisuuksia 5-20 ng /ml, ja inkubointia kertaa 30 minuutista 6 tuntiin. Jopa korkeimmalla testatulla pitoisuudella, 20 ug /ml, apigeniini ja luteoliinia ei aiheuttanut DNA-vaurioita havaittavissa Comet määrityksessä (ei esitetty).

Scutellarein ja carthamidin indusoi merkittävää DNA-vaurion pitoisuuksina 5 gg /ml ja edellä. Isoscutellarein indusoi myös DNA-vaurioita, mutta vain suurilla pitoisuuksilla (ei esitetty). Kuvio 5A osoittaa, että solujen prosenttiosuus muodostavien comets läsnä ollessa scutellarein nostettiin vähitellen ajan mittaan.