Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human CMTM3 on ehdotettu otaksutun tuumorisuppressorigeenin. Menetys CMTM3 on havaittu useissa karsinoomissa. Kuitenkin sääntely CMTM3 ilmaisun ja sen tehtävä syövän etenemisen edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Täällä, tutkimme säätelyyn CMTM3 ilmaisun, toiminta ja molekyylimekanismin ihmisen kivessyöpä soluja. CMTM3 oli usein vaimentua tai vaiennettu in kivessyöpä solulinjoissa ja tuumorikudoksia mutta erittäin ilmentyy normaaleissa kiveksissä kudoksissa. Uudelleen ilmentymä CMTM3 merkittävästi tukahdutti pesäkkeiden muodostumista, leviämisen, ja muuttoliike kapasiteetti kivessyöpä solujen aiheuttamalla G2 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Lisäksi uudelleen ilmaus CMTM3 aktivoinut transkriptio p53, aiheuttama p53 kertymistä, sääteli ilmentymistä p21, ja lisäsi lohkaisu kaspaasi 9, 8, 3, ja PARP. Vaimennussäätely

CMTM3

kliinisissä tuumorikudoksissa liittyi metylaatio yhden CpG sijaitsevat SP1 /Sp3 reagoivan alueen ytimen promoottori. Nämä tulokset osoittavat, että CMTM3 voi toimia kasvaimia estävä indusoimalla G2 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. CMTM3 on siis mukana kivessyöpä synnyssä, ja se on usein ainakin osittain vaiennetaan metylaation yhden, tietyn CpG kasvainkudoksissa.

Citation: Li Z, Xie J, Wu J, Li W , Nie L, Sun X, et al. (2014) CMTM3 Estää Human Kivessyöpä Cell Growth kautta indusoimaan Cycle pidätys ja Apoptosis. PLoS ONE 9 (2): e88965. doi: 10,1371 /journal.pone.0088965

Editor: Thomas G. Hofmann, Saksan Cancer Research Center, Saksa

vastaanotettu 15. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 16 tammikuu 2014; Julkaistu: 28 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program of China (Grant No. 2014CD745200, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx), National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81272840, http: //www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm), ja nuorten tutkijoiden Fund of National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81201579, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kivesten itusolukasvaimet (TGCTs) ovat yleisiä vuotiaat miehet 15-35 vuotta ja niiden osuus 1% kaikista pahanlaatuisten kasvaimien miehillä [1]. Esiintyvyys TGCTs on lisääntynyt dramaattisesti viime vuosisadan [2].

TGCTs peräisin muuttaneet gonocytes tai erilaistumaton spermatogonioiden, joka on johdettu sikiön itusolujen ja aikuisten sukusolujen kantasolut, vastaavasti. TGCTs luokitellaan seminomas tai ei-seminomatous itusolukasvaimet niiden histologista ominaisuudet [1]. Seminomas ovat yleisimpiä (50-70%) kivesten sukusolujen kasvaimia. Non-seminomatous sukusolujen kasvaimia ovat alkion solujen karsinooma, ruskuaispussi kasvaimet, choriocarcinoma, ja teratomas [1]. TGCTs on tullut yksi parannettavissa kiinteä kasvainten takia kehitys diagnostisia ja terapeuttisia menetelmiä [3]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit toimivat TGCTs ei täysin tunneta.

CKLF kaltainen MARVEL transmembraanidomeeni, joka sisälsi 3 (CMTM3) kuuluu kemokiinin kaltainen tekijä geeni-superperheen, uusi perhe, joka on samanlainen kuin kemokiinin ja transmembraaninen 4 superperheistä signalointimolekyylien.

CMTM3

on yksi monista kemokiinin kaltainen tekijä geenit sijaitsevat klusterissa kromosomissa 16q22. CMTM3 proteiini sisältää yhden leusiinivetoketjupeptidit ja kaksi LXXLL motiiveja. Tämä 20 kDa: n proteiini on lokalisoitu sytoplasmaan ja toimii tukirakenteena proteiinien endoplasmakalvostossa ja tumakalvon [4].

CMTM3

ilmenee vahvasti miehen sukuelimiin, korkein ilmentymistaso kiveksissä [4].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että useat jäsenet CMTM superperheen voi tärkeitä rooleja immuunijärjestelmän ja miehen sukupuolielimet järjestelmien ja kasvainten synnyssä [5] – [12]. Äskettäin on osoitettu, että

CMTM3

hiljennetään tai alassäädetty mahalaukun, rinnan, nenänielun, ruokatorven, paksusuolen ja munuaiskarsinoomissa [8], [13]. Sen ilmentyminen korreloi käänteisesti sen promoottorin CpG metylaatiostatuksen [8], [13]. Uudelleen ilmentyminen CMTM3 kasvainsoluissa puuttuu sen ilmentyminen johtaa suppression solujen kasvua ja apoptoosia, mikä viittaa siihen, että CMTM3 on uusi tuumorisuppressori [8]. Kuitenkin sen rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä ei ole selkeästi määritelty tasalla.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

CMTM3

oli usein säädellä vähentävästi kivessyöpä kudoksissa kautta metylaatio klo erityisiä, yhden CpG sijaitsevat SP1 /Sp3 reagoivan alueen promoottorin. Kohdunulkoinen ilmaus

CMTM3

esti pesäkkeiden muodostumista, jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invasiivisia kapasiteetti kivessyöpä soluja. Nämä toiminnot CMTM3 saavutettiin muuntamalla solusyklin etenemisen ja apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Syöpäsolut ja kliinisissä näytteissä

Ihmisen seminoomasta solulinja (NCCIT), eturauhasen syöpäsolulinjoissa (LNCaP, DU145, PC3 ja 22RV1), munuaisten syöpäsolulinjoissa (Kuvaruutukaukosäätimen-2 ja 786-O), virtsarakon kasvainsolulinjoja (HTB9-5637 ja T24) ja HEK-293-ihmisen epiteelisolujen munuaisen solulinjaa . Soluja viljeltiin RPMI 1640 media (GIBCO /BRL), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa atmosfäärissä, 5% CO

2.

Kaksikymmentä paria kivessyöpä kudosten ja sovitetun ei-syöpä kives kudokset saatiin potilailta, joille suoritetaan ensisijainen kirurgian Shenzhen Second kansan sairaalan ja Peking University Shenzhen sairaala potilas- tai huoltajien kirjallinen suostumus, ja on hyväksynyt eettinen komitea Shenzhen Second kansan sairaalassa, Shenzhen, Kiina. Näytteet joko välittömästi kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin histologiaa varten ja immunohistokemia tai jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa vielä PCR. H

GAPDH

-F: 5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ’, ja

GAPDH

R: 5′- CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′. Reaaliaikainen PCR-kokeet suoritettiin käyttäen Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Määritys suoritettiin kolmena kappaleena eri alukesarjoja:

CMTM3

-F: 5′-GCTTCTTTGCTACCATCGTGTTTG-3 ’, ja

CMTM3

R: 5′-GCCTTCAGTCAG AGTCCGAGTC-3′;

GAPDH

-F: 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3 ’;

GAPDH

R: 5′- ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3 ’. Suhteellinen ekspressiotaso

CMTM3

määritettiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmä [16].

Proteiinin uutto ja Western blot-analyysi

Kudokset tai solut lyysattiin RIPA-puskuriin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta ja fosfataasi-inhibiittorit. Tietty määrä 30 ug kokonaisproteiinia erotettiin SDS-12% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Hybond-P, Amersham Biosciences Piscataway, NJ, USA). Kun oli salvattu 5% BSA: lla tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa oli 0,1% Tween 20 (TBST), huoneenlämpötilassa 2 tuntia, membraani tutkittiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-puskurilla, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua lgG: llä. Blotting signaalit visu- Super Signal West Pico Chemiluminescent substraattia (Pierce, Rockford, IL, USA). Kalvot riisuttu kanssa strippaus puskuri 40 ° C: ssa 30 minuuttia varovasti ravistellen ja uudelleenseulottiin kanin polyklonaalisella vasta-aine β-aktiini (1:10000, Santa Cruz Biotechnology) kontrollina Proteiinilisäyksen.

Rakentaminen promoottorin reportteri plasmidien transfektio ja lusiferaasianalyysissä

rakentamiseksi joukon

CMTM3

promoottoriajetun lusiferaasireportterista plasmideja, kuusi DNA fragmentteja ylävirtaan

CMTM3

aloituskodonin monistettiin PCR: llä (PCR Primers taulukossa S1 File S1) ja kloonattiin pGL3-Basic-vektoriin (Promega). Lisäykset varmistettiin suoralla sekvensoinnilla. 293FT ja PC3-soluja maljattiin 24-kuoppaisille viljelylevyille 1 x 10

5 solua /kuoppa ja transfektoitiin lyhytaikaisesti pGL3-promoottori reportteri ja pRLSV40 kuten aiemmin on kuvattu [15], [17]. Milloin on osoitettu, pCMV-SP1 tai pCMV-Sp3 ekspressioplasmidien (Origene, Rockville, MD, USA) kotransfektoitiin soluihin. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Kukin koe suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena. Aktiivisuus määritettiin suhteena tulikärpäsen lusiferaasi Renilla lusiferaasi. Sillä

in vitro

metylaatiomääritystä on

CMTM3

promoottori fragmentti, Sss minä metylaasin käytettiin raportoitu aiemmin [15].

DNA bisulfiittikäsittelyn ja metylointianalyysi

bisulfiittimodifikaatio DNA: n ja bisulfiitin genominen sekvensointi (BGS) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15], [18]. Bisulfiitti sekvensointi PCR-alukkeet (BGS-F, TAGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA, ja BGS-R, ACCTTTAAAAAAACAAAAAAAAACCC) suunniteltiin käyttämällä online-ohjelma, MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) [19]. PCR suoritettiin 40 sykliä, joissa Hotstart Taq-polymeraasia (Qiagen, Hilden, Saksa). PCR-tuotteet kloonattiin pGEM-T (Promega, Madison, WI) vektori. Kahdeksasta kymmeneen valkoinen kloonien kunkin näytteen valittiin sattumanvaraisesti sekvensointiin.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen analyysi CMTM3 suoritettiin käyttäen standardia kahden vaiheen menetelmää, kuten on kuvattu aiemmin [15]. Jälkeen deparaffinization ja nesteytys, kudoksen diat keitettiin hakea antigeenin mikroaaltouunissa 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6) 15 min ajan. Objektilasit upotettiin 3% H

2O

2: ssa 20 minuutin ajan endogeenisen peroksidaasi- aktiivisuuden peittämiseksi, pestiin PBS: llä, ja niitä inkuboitiin 3% normaalin naudan seerumin TBS: ssa 30 minuutin ajan, jotta ei-spesifisen sitoutumisen primaarisen vasta-aineen. Sitten kudosta laseja inkuboitiin puhdistetulla kanin polyklonaalinen vasta-aine CMTM3 (1:500, ystävällisesti Dr. Han, Pekingin yliopiston Center for Human Disease Genomics) tai kaniinin normaalilla IgG kontrollina 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, levyt inkuboitiin vuohen anti-kani-lgG-HRP: tä (sc-2030, Santa Cruz, CA, USA). Pesun jälkeen kudokset värjättiin juuri valmistettu DAB ratkaisu (DAKO, Carpinteria, CA) ja visualisoitiin ja valokuvattiin Leica DM4000B (Leica Microsystems, Inc.).

Immuunihistokemialliset ilmentymistä CMTM3 arvioitiin perustuu edustavan suuri teho kentän 2 kudoksesta array paikkoja kaksi riippumatonta tutkijat. Ilmentyminen CMTM3 perusteella laskemalla yhteensä immuunivärjäysmenetelmällä pisteet (TIS) kuin tuote osuuden pisteet (PS) ja intensiteetti pistemäärä (IS), kvantitoitiin mikroskoopilla ja luokitellaan neljään alaryhmään: no lauseke (0-4) ; heikko lauseke (+: 5,6,8); kohtalainen ilmentyminen (++: 9,10,12); voimakas ilmaus (+++: 15) [20].

adenovirusinfektio

Adenovirus kantaen

CMTM3

geeni (Ad-

CMTM3

) ja tyhjä adenovirus (Ad-nolla) on ystävällisesti toimittanut Dr. Han Lab [7]. NCCIT solut ympättiin 5000 solua /cm

2 osaksi kudosviljelylevyille, ja 24 tunnin kuluttua, infektio suoritettiin altistamalla solut adenoviruksen vaaditulla infektiokertoimella (MOI) seerumivapaassa soluviljelyväliaineet 60 min, minkä jälkeen lisättiin seerumia sisältävällä elatusaineella ja 1-4 päivää.

solujen lisääntyminen

analyysi solun proliferaatioon, NCCIT solut infektoitiin kuten edellä, ja solujen lisääntyminen mitattiin 24, 48 ja 72 h käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) seuraten valmistajan ohjeita. Spektrofotometrinen absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut infektoitiin Ad-

CMTM3

tai Ad-null. 24 h infektion jälkeen, 1000 solua maljattiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppaisille levyille ja pidettiin täydellisessä median 2 viikkoa. Elossa pesäkkeet (≥50 solua pesäkkeen) kiinteään metanolilla, värjättiin kristallivioletilla, laskettiin ja valokuvataan. Kukin koe suoritettiin kolminkertaisina ja suoritettava kolme kertaa.

haavanparantumis- määritys

in vitro arpeutumisprosessit määritystä solut infektoitu Ad-

CMTM3

tai Ad -null viljeltiin kuuden kuoppalevyillä, kunnes konfluentteja. Suora naarmu luotiin poikki solukerrokselle käyttäen steriiliä mikropipetin kärki, ja roskat poistettiin pesemällä solut seerumittomalla media. Solut valokuvattiin 0 ja 36 h jälkeen haavoittaen. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Apoptosis määrityksissä

Apoptoottista solukuolemaa arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 72 tunnin jälkeen solut kerättiin ja niitä inkuboitiin anneksiini V-FITC: llä ja PI: 30 min pimeässä 4 ° C: ssa. Virtaussytometria-analyysi suoritetaan välittömästi. Tiedot esitetään bi-parametrinen pistekuvioita osoittaa anneksiini V-FITC vihreän fluoresenssin vs. PI punaisen fluoresenssin. Kokeet suoritettiin kolme kertaa.

Kvantitatiivinen PCR apoptoosireittiä

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun solut infektoitiin Ad

CMTM3

tai Ad-null, solut kerättiin , ja kokonais-RNA eristettiin ja puhdistettiin RNeasy RNA: n eristäminen Kit (Qiagen). Tietty määrä 2 ug kokonais-RNA: ta käytettiin syntetisoimaan cDNA kanssa RT2 First Strand Kit (SABiosciences, QIAGEN). CDNA: t lisättiin 96-kuoppalevylle päässä RT

2 Profiler PCR array järjestelmä (ihmisen apoptoosin PCR array). Kvantitatiivinen RT-PCR: llä 84-geenit, jotka liittyvät ihmisen apoptoosin suoritettiin käyttäen iCYCLER iQ5 Real-Time PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA). Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen ΔΔ

C

T

menetelmä viisi siivous geenien (

GAPDH

,

RPL13A

,

B2M

,

ACTB

, ja

HPRT1

) valittu normalisoimiseksi. Tekstitystiedostojen pidettiin poissa jos C

t 35 ja poistettiin analyysiä. Muutoksia geenien ilmentyminen määritettiin vertaamalla geenin transkription tasoja infektoitujen solujen Ad-CMTM3 soluihin oli infektoitu Ad-null.

Solusyklianalyysiä

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun solut infektoitiin Ad-

CMTM3

tai Ad-null, solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa, suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla. Sen jälkeen, kun solut värjättiin propidiumjodidilla (PI), solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla on fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu skanneri. Solusyklin jakautumisen analysoitiin Cell Quest ohjelmisto.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS version 19 ohjelmisto. Ilmaisu analyysi CMTM3 välillä kivessyöpä kudosten ja vastaavien viereisten kudosten arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Vertailut kategorisen muuttujien suoritettiin käyttäen x

2 test tai 2-tailed t-testiä. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos ap arvo oli alle 0,05.

Tulokset

CMTM3 usein vaimentua vuonna kivessyövät

tutkimiseksi CMTM3 rooli urogenitaalimuutoksia syöpään, ensin kysyi Oncomine tietokanta [21] arvioida suhteellisen ekspressiotasot

CMTM3

in urogenital syöpä. Kaksi itsenäistä tutkimukset osoittivat, että

CMTM3

ilmentyminen tilastollisesti merkitsevästi väheni kiveskasvaimia [22], [23] (kuvio 1A, 1 B). Olemme myös mitattava

CMTM3

mRNA tasot 10 urogenitaalimuutoksia syöpäsolun linjat. Verrattuna korkea ilmaus

CMTM3

normaaleissa ihmisen kives kudoksissa, ilmaus

CMTM3

hiljennettiin joka seminoomasta solulinjassa (NCCIT) ja alassäädetty tai vaiennettu 2 4 eturauhasen syöpäsolulinjoissa, 2 3 munuaissyövän solulinjoja ja yksikään virtsarakon kasvainsolulinjojen tutkittu (kuvio 1C). Olemme edelleen analysoineet ilmaus

CMTM3

20 pariksi kiveksissä kasvain kudosten ja vastaavien hyvänlaatuinen viereisiin kudoksiin.

CMTM3

mRNA hiljennettiin tai voimakkaasti vaimentua 16 20 kiveksen syöpätapauksista kokonaispituudeltaan 5-kertainen pieneneminen verrattuna vastaavaan hyvänlaatuinen viereiseen kudokseen (

P

= 0,002) (kuvio 1 D) . Tulokset vahvistettiin proteiinin tasot immunohistokemiallisesti värjäytymistä (kuvio 1 E).

(A ja B) ilmentymistä CMTM3 yksittäisissä näytteissä normaaleista kives kudoksista tai kivessyöpä näkyy (data normalisoida log2 asteikolla Sperger aineistot [23] ja Korkola [22]). Vertailut ryhmien välillä suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, jossa P-arvot ilmoitetaan kussakin paneelissa. (C) ilmentymistä

CMTM3

normaaleissa kiveksen kudoksissa ja urogenitaalimuutoksia syöpäsolulinjojen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. kolme riippumatonta koetta. (D) ilmentymistä

CMTM

3 20 kiveskasvaimen yksilöitä ja pariksi normaali kives kudoksissa määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. (E) edustaja immunohistokemiallisesti värjäytymisen CMTM3 kivesten kasvain näytteet ja pariksi normaali kiveksissä kudoksissa.

Lisäksi olemme laajentaneet analyysin CMTM3 ilmaisun riippumattomalle kohortti kiveksen kudos microarray immunohistokemiallisesti (taulukko 1, Kuva S1 File S1). 75 tapausta kiveksen kasvaimet, 36 (48%) tapauksista kasvaimia ei havaittu CMTM3 ilmentymistä, 27 (36%) tapauksessa kasvainten oli alhainen CMTM3 ilmaisun, ja 12 (16%) tapauksista kasvain oli kohtalainen CMTM3 ilmaisua. Kaikki 18 (100%) syöpätapausta viereisten normaaleissa kudoksissa, ja normaalin kiveksen kudoksissa oli voimakas tai voimakas intensiivinen CMTM3 ilmentymisen (taulukko 1). Kaikki 8 (100%) osalta surkastuminen oli intensiivinen CMTM3 ilme. Mikä tärkeintä, ei yksittäinen tapaus havaittu jossa CMTM3 värjäytymistä oli voimakkaampi kasvaimen kuin normaalissa kiveksissä, edelleen korostaen spesifisyys Havaittu (taulukko 1). Tutkimme myös korrelaatio CMTM3 ilmaisut seminoomasta kanssa patologinen parametreja, ja huomannut, että vähentynyt CMTM3 liittyy merkittävästi kehittynyt T vaiheessa (taulukko S2 File S1).

Re-ilmentymä CMTM3 estää solun kasvua ja solujen vaeltamiseen

vaiennettu

CMTM3

vuonna kivessyöpä osoitti, että CMTM3 voisi olla toiminnallinen tuumorisuppressori kivesten karsinogeneesissä. Tutkia kasvua estävää vaikutusta

CMTM3

, uudelleen ilmentymisen

CMTM3

on lyhytaikaisesti tartunnan NCCIT soluissa varmistettiin RT-PCR: llä ja Western-blottauksella (kuvio 2A). Kuten kuvassa 2B on esitetty, solujen kasvua merkittävästi vähentynyt Ad

CMTM3

infektoiduista NCCIT soluja verrattuna Ad-null-tartunnan kontrollisoluihin. Suppressiivinen vaikutus syöpäsolujen kasvua edelleen vahvistettu pesäkemuodostusta. Pesäkemäärät vähensi merkittävästi kontrolliin verrattuna solujen 32% NCCIT infektoiduissa soluissa Ad

CMTM3

(P 0,01) (kuvio 2C).

(A) Expression of CMTM3 vuonna NCCIT solujen infektion jälkeen Ad-CMTM3 varmistettiin käyttämällä RT-PCR ja Western blotit. (B) Solujen proliferaatio havaittiin, WST-1 määritys NCCIT solujen infektion jälkeen Ad-nolla tai Ad

CMTM3

. (C) edustavat tulokset pesäkkeitä muodostumisen määritykset kanssa NCCIT soluihin. (D) Migration määritettiin haavan paranemista määritystä NCCIT soluissa tartunnan Ad-nolla tai Ad

CMTM3

. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Lisäksi vaikutus CMTM3 on kivessyöpä solun liikkuvuus tutkittiin haavan paranemista määrityksessä. Konfluentit yksikerroksiset solut naarmuuntunut muodostamiseksi haavat ja viljeltiin sitten 24 tuntia. Kohdunulkoinen CMTM3 ilmaus johti merkittävästi vähentää haavan paranemista solumigraation verrattuna Ad-null-tartunnan saaneiden solujen (kuvio 2D). Ad-

CMTM3

-transfected solut tuli pyöreä ja irrottaa, kun taas mitään ilmeistä muutosta ei havaittu Ad-null-tartunnan saaneiden solujen, joka on yhdenmukainen aiemman raportin [8].

Re- ilmaus CMTM3 indusoi solusyklin pysähtymisen G2 faagin ja solujen apoptoosin

merkittävä suppressio lisääntymisen CMTM3 sai meidät arvioimaan vaikutuksia CMTM3 on solusyklin jakautumisen ja apoptoosin kivessyöpä soluja. Edustavia tuloksia solusyklin jakautumisen Ad-null- tai Ad

CMTM3

infektoiduista NCCIT solut on esitetty kuvassa 3A. Virtaussytometria-analyysi paljasti merkittävän G2 solusyklin pysähtymisen CMTM3-ilmentävissä soluissa verrattuna kontrolliin-infektoituneissa soluissa (kuvio 3A).

(A) edustaja solusyklin analyysi. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D ja perustuvat kolmen erillisen kokeen (p 0,01). G1 ja G2 vaiheet punaisella, S vaiheita valkoinen. (B) NCCIT infektoidut solut Ad-null ja Ad

CMTM3

leimattiin FITC-anneksiini V /PI, ja apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla. (C) Western blot analyysi solun cycle- ja apoptoosiin liittyvien proteiinien Ad-null- ja Ad

CMTM3

infektoiduista NCCIT soluja. β-aktiini käytettiin kontrollina. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa. (D) kaavamainen esitys ehdotetun mallin, joka kuvaa p53-riippumattoman apoptoosin väylän kiveskasvaimia.

Tutkimme myös apoptoottisen vaikutuksen CMTM3 kives- syöpäsolujen käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen määrityksiä. Osuus anneksiini V-positiivisia /PI-positiivisia soluja kasvoi 15,4% in Ad

CMTM3

-transduced NCCIT soluja (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että inhiboiva vaikutus soluproliferaation CMTM3 on todennäköisesti välittyy G2 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.

CMTM3 indusoi solukierron pysähtymisen ja apoptoosin p53-riippumattomalla tavalla

tutkia molekyylimekanismi CMTM3 aiheuttaman solusyklin pysähtymisen, arvioimme vaikutus CMTM3 uudelleen ilmentymisen ilmentyminen solusyklin säädin, p21. Kuten kuviossa 3C on esitetty, CMTM3 voi lisätä mRNA: n ja proteiinin tasot p21.

määrittämiseksi molekyylimekanismi CMTM3 indusoiman apoptoosin, käytimme ihmisen Apoptosis RT

2 Profiler PCR Array, joka sisältää 84 tunnettua apoptoottiset geenit, seurata ilmentymisen profiilit NCCIT infektoitujen solujen Ad-

CMTM3

. Yllätykseksemme, tulokset osoittivat, että

TP53

ja joukon geenejä (

APAF1

,

BAX

, ja

BCL10

) olivat merkittävästi ylös- säännelty (taulukko 2). Nämä tulokset varmistettiin qPCR eri alukkeita kuin ne, joita käytetään PCR-array. Proteiini-tasot kasvoivat myös samaa suuruusluokkaa (kuvio 3C, taulukko 2).

Seuraavaksi tutkitaan aktivointi apoptoottisen reitin Western-analyysillä. Kuten kuviossa 3C on esitetty, pilkotun kaspaasi-3: n fragmentti oli merkittävästi lisääntynyt, kun taas pro-kaspaasi-3-oli huomattavasti pienempi CMTM3 uudelleen ilmentävien kivessyöpä soluja verrattuna kontrolleihin (kuvio 3C). Re-ilmentäviä CMTM3 myös selvästi edistänyt kaspaasi-9-proteiinin ilmentymistä kivessyöpä soluissa. Samaan aikaan lisääntynyt lohkaista poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkoutuminen havaittiin CMTM3-transfektoiduissa soluissa, mutta harvoin havaittu kontrolli-soluissa (kuvio 3C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CMTM3 helpottaa kivessyöpä solujen apoptoosia p53-riippumattomalla tavalla, kuten p53 ei ole täysin toiminnallinen NCCIT soluihin [24] (kuvio 3D).

metylaatio tietyn, yhden CpG kliinisissä kivessyöpä yksilöt liittyy merkittävästi CMTM3 transkriptioekspressiokuvio

Kuten epigeneettisellä sääntely on mukana ilmaus

CMTM3

[8], kysyimme, onko

CMTM3

promoottori DNA: n metylaatio on liittyvä vastaava vähennys CMTM3 ilmaisun kivessyövät.

Jos haluat määrittää promoottorialueen ohjaamalla

CMTM3

ilme, sarja katkaistun promoottorikonstrukteja syntyi ja työnnetään pGL3 lusiferaasireportterilla vektoreita, ja promoottorin aktiivisuus määritettiin mittaamalla lusiferaasin. Kuten kuviossa 4A on esitetty, merkittävin promoottorin aktiivisuuden havaittiin on ~400 emäsparin fragmentti (-343–83 bp aloittaa kodonin site). Kahden mahdollisen sitoutumiskohtia SP1 /SP3 elementtejä ~400 emäsparin fragmentti tunnistettiin transkriptiotekijä motiivi ennustus ohjelmia.

(A) Promoottori aktiivisuus ihmisen CMTM3 deleetiorakenteita vuonna 293FT ja PC3-soluissa. Solut transfektoitiin 0,8 ug: pGL3-basic tai lusiferaasireportteri konstrukteja, jotka sisältävät eri kokoa promoottorin fragmentteja. (B) vaikutukset SP1 /SP3 reportterigeeniekspressiota. 293FT ja PC3-solut transfektoitiin pCMV

SP1 /Sp3

ekspressioplasmideilla tai tyhjän vektorin kontrollina. (C) promoottori fragmentti (pGL-D), ja in vitro metyloitu fragmentti (pGL-PD SSSI) transfektoitiin 293FT ja PC3-soluja, ja lusiferaasi-määritys suoritettiin. Kaikki rakenteet kotransfektoitiin pRLSV40 vektori sisäisenä kontrollina transfektion tehokkuuden. Lusiferaasiaktiivisuus ilmaistaan ​​prosentin aktiivisuus valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SE

Vahvista onko kyseinen

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT elementtejä, SP1 ja SP3, osallistuvat säätelyyn

CMTM3

geenin ilmentymisen, 293FT ja PC3-solut ko-transfektoitiin konstruktilla pGL3-

PD

ja pCMV

SP1

tai pCMV

Sp3

. Lusiferaasireportterigeenianalyysissä osoitti, että yli-ilmentyminen SP1 tai SP3 voi merkittävästi lisätä

CMTM3

promoottorin aktiivisuutta (kuvio 4B). Lisäksi CMTM3 promoottorin aktiivisuus väheni dramaattisesti jälkeen metylointi (kuvio 4C).

vieressä suoritti bisulfiitti sekvensointi 53 CpG kohteisiin, kuten

CMTM3

ydin promoottorialue (-353-126 emäsparin alkaen alkaa kodoni sivusto) 13 pariksi ensisijainen kives kasvainnäytteet (kuvio 5A). Tulokset osoittivat, että yhden CpG-sivustosta osoitteessa -155 bp, joka sijaitsee risteyksessä kahden SP1 /SP3 sitoutumiskohtia, oli enemmän merkittävästi metyloitavaa tuumorikudoksissa (40,4% ja 9,0%, vastaavasti), jossa

CMTM3

oli alassäädetty, kuin vastaavat ei-tuumorikudoksista (kuvio 5B). Mitään merkittävää DNA: n metylaatio havaittiin toisessa 52 CpG sivustoja. Tilastollisesti vastakkainen vaikutus havaittiin välillä metylaation yhden CpG-sivustosta osoitteessa -155 bp ja taso

CMTM3

mRNA ilmaisun kliinisissä näytteissä (

P

= 0,01, R

2 = 0,246) (kuvio 5C). Tämä havainto viittaa siihen, että

CMTM3

transkription kivessyöpä määritetään, ainakin osittain, jonka metylaatio tietyn, yhden CpG-

CMTM3

promoottorialueen.

(A) Kaavamainen rakenne CMTM3 geenin CpG-saarekkeiden, oletetun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia ja transkription aloituskohdasta. Eksonit on merkitty vihreällä suorakaiteen. Translaation aloituspaikasta on merkitty kaareva nuoli. Alaspäin Nuoli osoittaa mahdollisen sitoutumiskohta SP1 /SP3. BGS alukkeet metylaation analyysit on esitetty. (B) metylaatio on CMTM3 promoottorialueen analysoitiin BGS. Metylaatio 8 CpG sivustoja ytimen promoottori alueella 3 pariksi kasvain ja vastaavat hyvänlaatuinen viereisten kudosten näkyy. (C) metylaatio yhden CpG-sivustosta osoitteessa -155 bp CMTM3 promoottorialueen 13 pariksi kasvain ja vastaavat hyvänlaatuinen viereisiin kudoksiin, piirrettiin CMTM3 mRNA: n ekspression kivessyöpä kudoksissa. Tilastollisesti merkittävä negatiivinen korrelaatio havaitaan. Pearsonin korrelaatio, p = 0,01, R

2 = 0,246.

Keskustelu

CMTM3

ilmentyy voimakkaasti normaalissa kiveksissä [25], mutta sen rooli kivessyöpä edelleen heikko. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

CMTM3

on usein vaimentua tai vaiennettu kivesten syöpäsolulinjoissa ja primaareja kasvaimia (kuvio 1, taulukko 1) Meillä suoritetaan edelleen toiminnallisia tutkimuksia NCCIT soluissa paljastaa biologisen toiminnan CMTM3. Huomasimme, että uudelleen ilmaus CMTM3 voimakkaasti heikentynyt NCCIT soluliikkuvuus ja tukahdutetaan pesäkkeiden muodostumista (kuva 2), joka oli yhdenmukainen aikaisempien raporttien muissa syövissä [8], [13]. Solusyklin analyysi osoitti, että CMTM3 inhiboi solujen lisääntymistä lisäämällä solujen osuus G2 vaiheessa ja edistämällä solujen apoptoosia (kuvio 3A, 3B). Nämä tiedot osoittivat, että CMTM3 toimii tuumorisuppressori TGCTs. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CMTM proteiinit, mukaan lukien CMTM3 [8], CMTM5 [26], [27], ja CMTM8 [28], [29], voi indusoida apoptoosin. Kuitenkin apoptoottisen reitin ja mekanismi pysyy vaikeasti. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että uudelleen ilmentymistä CMTM3 vuonna NCCIT soluissa edistänyt transkriptio

TP53

,

P21

, ja

BAX

, ja kasvattivat proteiini tasoja samaa suuruusluokkaa (taulukko 2, kuvio 3C). p53 ei ole täysin toiminnallinen NCCIT soluissa, mikä viittaa siihen, että ei ole selvää korrelaatiota trans-aktivoitumisen p53 ja apoptoosin induktio NCCIT soluihin [24]. Kuitenkin p21 oli merkittävästi lisääntynyt. Siten mahdollisuus nostettiin että CMTM3 voisi aiheuttaa G2 solusyklin pysähtymiseen ja helpottaa solujen apoptoosin kautta p21 tai muita reittejä p53-riippumattomalla tavalla, kuten on raportoitu muissa tutkimuksissa (kuvio 3D) [30] – [32].

alas-säätely tuumorisuppressoreilla liittyy transkription inhibition kautta induktion tukahduttavia epigeneettiset muutoksia promoottori, mukaan lukien DNA: n metylaation ja histonimodifikaation [33].