Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehitys kohdennettujen molekyylien hoitomuotojen on tarjonnut merkittävää ennakot osaksi ihmisen syöpien hoidossa. Useimmissa kasvaimia selektiivinen paine laukaisee syövänvastaisten aineiden kannustaa syöpäsolujen hankkia resistenssimekanismeja. Sukupolvi Uusien rationaalisesti suunniteltu kohdentamisaineita toimivat onkogeenisel- polku (t) eri tasoilla on lupaava lähestymistapa molekyyli hoitoja. 2-fenyyli-imidatso [2,1-

b

] bentsotiatsoli johdannaisia ​​on korostettu niiden ominaisuuksien kohdistaminen onkogeenisten Met Reseptorityrosiinikinaasin (RTK) signalointi. Tässä tutkimuksessa arvioimme vaikutusmekanismin yksi aktiivisen imidatso [2,1

b

] bentsotiatsol-2-yylifenyyli osa-pohjainen aineet, Triflorcas, paneelissa syöpäsolujen erillisistä ominaisuudet. Osoitamme, että Triflorcas heikentää in vitro ja in vivo kasvaimen kehittymisen syöpäsolujen kuljettaa Met mutaatioita. Lisäksi Triflorcas vaikeuttaa selviytymistä ja kiinnittymisestä riippumaton syöpäsolujen kasvun ominaista ”RTK swapping” häiritsemällä PDGFRβ fosforylaatiota. Hillitty vaikutus Triflorcas aineenvaihduntaan geenit korreloi ilman merkittäviä sivuvaikutuksia in vivo. Mekanistisesti lisäksi suunnattu Met, Triflorcas muuttaa fosforylaation tasot PI3K-Akt-reitin, joka välittää onkogeeninen riippuvuudesta Met lisäksi Retinoblastooma ja nucleophosmin /B23, jolloin muuttunut solusyklin etenemisen ja mitoottisten vika. Meidän tulokset osoittavat, kuinka epätavallinen sitova plastisuus Met aktiivisen kohti rakenteellisesti erilaisia ​​estäjiä voidaan hyödyntää tuottaa lääkkeitä pystyy kohdistamaan Met onkogeenisen riippuvuuden at eri tasolla. Lisäksi taudin suuntautunut NCI Anticancer Drug Screen paljasti, että Triflorcas saa aikaan ainutlaatuisen profiilin kasvua estävän-vasteet syöpäsolulinjoissa, joka osoittaa uuden mekanismin lääkeaineen vaikutuksen. Anti-kasvain aktiivisuuden aikaansaama 2-fenyyli-imidatso [2,1-

b

] bentsotiatsolijohdannaiset yhdistelmillä estämällä erillisiä efektorien syöpäsoluissa paljastavat niiden olevan lupaavia syöpälääkkeiden jatkotutkimuksia varten.

Citation: Furlan A, Roux B, Lamballe F, Conti F, Issaly N, Daian F, et ai. (2012) yhdistettyyn Drug Action 2-fenyyli-imidatso [2,1-

b

] bentsotiatsoli johdannaisten Syöpäsolut Mukaan Heidän onkogeeninen Molecular allekirjoitukset. PLoS ONE 7 (10): e46738. doi: 10,1371 /journal.pone.0046738

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 25, 2012; Hyväksytty: 04 syyskuu 2012; Julkaistu: 05 lokakuu 2012

Copyright: © Furlan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Inca (Institut National du Cancer), ARC (Association pour la recherche contre le syöpä), FRM (Fondation pour la recherche médicale), FDF (Fondation de France), Fondation Bettencourt-Schueller, Marie Curie Fellowship siirrolle Knowledge (MTKD-CT-2004-509804), Protisvalor, Valorpaca ja OSEO FM. Tämä tutkimus on kehitetty CM0602 COST Action ”angiogeneesin estäjiä: suunnittelu, synteesi ja biologinen hyväksikäyttö”. AF tukivat inkojen ja ARC; NI by Valorpaca, FC Italian Association of Cancer Research (ARC) ja OSEO. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat saaneet rahoitusta Protisvalor. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Reseptorityrosiinikinaasin (RTK) signalointi on osallisena kasvaimen kehittyminen sen kykyä vaikutus solujen kohtalo muutosten kautta sääntelykysymystä piirien [1] – [3]. Osoituksena syöpä genomista tutkimuksissa, RTK signalointi on yksi keskeinen polku usein muuttunut ihmisen syövässä [4], [5]. Olemme äskettäin osoittaneet merkitystä signaloinnin solmuja toisiinsa RTK ja p53 ydin reittejä ja vaikutuksia kohdistaminen tällaisten solmujen aikana kasvaimen kehittyminen [6], [7]. Merkitystä muuttuneen RTK kasvaimen synnyssä on vetänyt valtava kiinnostusta tunnistaa aineet, jolla voidaan kiinnittää heidän toimintansa ja tehtävänsä. Tähän mennessä molekyylitason hoitomuotoja ”RTK-addiktoitunut” syöpäsolut perustuvat pääasiassa soveltamiseen yhdisteitä, jotka valikoivasti tavoite onkogeenisel- RTK [1]. Menestys kuitenkin näistä strategioista on ollut rajoitettu, koska esto ”ensisijainen RTK-riippuvuus” laukaisee selektiivinen painetta syöpäsolujen hankkia vastarintaa kautta ”RTK swapping” [8], [9]. Nämä rajoitukset asettavat tunnistamisen, tai yhdistetty käyttö, on aineita, jotka eivät vain kohdistaa RTK signalointi riippuvuutta, mutta myös vaikeuttaa sopeutumista aiheuttamaa redundanssia RTK signalointiverkon [10].

Yksi lähestymistapa kiertää ”RTK vaihtamisen ”voisi olla tunnistaminen huumeiden häiritsee onkogeeni riippuvuutta toimimalla eri tasoilla sisällä riippuvuus polku. Eräs esimerkki tämän käsitteen on järjestetty sorafenibi, pieni kemiallista ainetta, joka kykenee estämään useita RTK: t, mukaan lukien VEGFR, PDGFRβ, Kit, FGFR1, Ret, ja solunsisäinen Raf-kinaasin [11]. Laajakirjoinen aktiivisuus Sorafenibi useilla syövän malleissa johtuu todennäköisesti monenlaisia ​​tavoitteensa. Kuitenkin Sorafenibi aktiivisuus tietyntyyppisissä kasvainmuotoja johtuu samanaikaisesta eston RTK-ajettu angiogeneesiä ja RTK alavirran Raf /MAPK-reitin [11]. Sukupolvi aineita, jotka kohdistuvat onkogeeninen polku (t) eri tasoilla, ei ole yksinkertainen asia erotuksena tavoitteet edellyttävät tarkkaa huume rakenne ja kemiallisia muunnoksia huumeiden voi joko vaikuttaa valikoivuus (esim moniosaisia ​​RTK), tehokkuus, tai toxcicity . Toisin kuin muut RTK: t, hepatosyytti- kasvutekijän (HGF) -reseptorin Met on tunnusomaista epätavallinen rakenteellinen plastisuus kuin sen aktiivisen voi antaa erilliset estäjä sidontavaihtoehdoista [12]. Itse asiassa, laajan valikoiman pieniä molekyylejä, on löydetty, koska Met-estäjät [13], [14]. Kuitenkin jatkuvat paljastaa uusia anti-Met aineita kohdennettuja hoitomuotojen ja liittyvät resistenssimekanismeja [8], [15] – [17].

Tunnistaa kemiallisia aineita, jotka kykenevät inhiboimaan onkogeenisten Met signalointi syöpäsoluissa, me aiemmin soveltaneet Met-keskittynyt solu-pohjainen näyttö. Olimme päätteli, että tällainen strategia tarjoaisi mahdollisuuden tunnistaa yhdisteitä, jotka voivat: a) saada estovaikutus suoraan Met; b) kohdistaa muita keskeisiä komponentteja Met signalointikaskadissa; c) on hyvin siedetty rajallisuuden vuoksi myrkkyvaikutuksia biologisesti aktiivisia pitoisuuksilla [18] – [20]. Me kertoi, että uusi aminohappoamideista sisältävä imidatso [2,1

b

] bentsotiatsol-2-yylifenyyli osan tavoite Met suoraan ja estävät onkogeeniset Met toiminto, ilman aiheuttivat merkittäviä sivuvaikutuksia in vitro [19]. Tässä tutkimuksessa selvitimme syövän vastaisen aktiivisuuden yksi aktiivisten aineiden olemme tunnistaneet, Triflorcas (TFC), paneelissa syöpäsolujen Tunnusomaista ja tutkitaan sen mekanismi lääkkeen toimintaa erilaisia ​​täydentäviä lähestymistapoja. Osoitamme, että Triflorcas kohdistuu syöpäsolut joko kuljettaa Met mutaatioita tai ominaista RTK vaihtamalla. Osoitamme, että Triflorcas on hyvin siedetty in vivo, eikä se muuta merkittävästi ilmaus useiden solun myrkyllisyyttä ja stressiä geenejä. Biokemialliset ja fosfo-seulonta array tutkimukset paljastivat, että Triflorcas pääasiassa muuttaa fosforylaation tasot PI3K /Akt-reitin, joka takaa onkogeeninen riippuvuutta Met, samoin kuin retinoblastooma (Rb), ja nucleophosmin /B23. Nämä muutokset toiminnallisesti korreloivat muutosten solusyklin etenemisen taustalla mitoottisiin vika. Vaikka Triflorcas syövän vastaista aktiivisuutta korreloi sen estovaikutusta Met, sen lääke vaikutusmekanismit ei saa rajoitu pelkästään Met kohdistaa itse. Ainutlaatuinen kyky Triflorcas moduloida useita reittejä vapautettiin kasvainsoluissa poikkeavaan Met signalointi vahvistaa edelleen mahdollisuus hyödyntää joustavan sitova tila kapasiteetti Met aktiivisen tunnistaa uusia aineita, joilla estäviä ominaisuuksia kohti signalointi tavoitteita suorittamiseen tarvitaan onkogeenisel- ohjelmaa. Lopuksi, arviointi inhiboivan-vasteen profiili on syöpäsolujen kautta National Cancer Institute syövän huumeiden näyttö viittaa siihen, että Triflorcas on tunnusomaista uudella mekanismilla lääkeaineen vaikutuksen. Bioinformatiikan tutkimukset osoittivat aihetta molekyyli allekirjoituksia, jotka korreloivat syöpää herkkyys imidatso [2,1

b

] bentsotiatsol-2-yylifenyyli osaan perustuva aineita.

Tulokset

Triflorcas estää Survival ja Anchorage riippumaton kasvu ihmisen syöpäsoluja kantaminen mutaation Met

ensin tutkittiin, mikä vaikutus Triflorcas kahden ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin kuljettavat Met mutaatioita: H2122 ja H1437 soluja, kätkeminen pistemutaatiot aminohappotähde N375S ja R988C, vastaavasti [21]. Triflorcas heikentynyt selviytymisen ja ankkurointi riippumatonta kasvua H2122 ja H1437, vastaavasti (kuva 1A ja B). Mikään Met-inhibiittorit käytetään viitteenä yhdisteitä, kuten SU11274, crizotinib, ja PHA665752 häiritsi selviytymisen ja in vitro tuumorigeneesiin näiden solujen (kuvio 1A ja B). Sen sijaan kaikkien testattujen inhibiittorit alentunut selviytymisen ja ankkurointi riippumattomaan kasvuun ihmisen mahakarsinooman GTL-16 tunnettu siitä, että Met monistuksella (kuvio 1A ja B), kuten aikaisemmin on raportoitu [19], [21]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Triflorcas kohdistaa merkittävä estävä vaikutus syöpäsolujen kanssa Met mutaatioita, jotka eivät ole herkkiä muille Met-inhibiittorit, lisäksi soluja, jotka sisältävät Met vahvistusta.

(A) Survival of H2122 ja GTL-16 solut pienensivät Triflorcas ilmoitetuilla konsentraation (uM; n = 3). Sen sijaan, SU11274 (SU), crizotinib (crizo), ja PHA665752 (PHA) heikentynyt selviytymisen GTL-16, mutta ei H2212-soluissa. Soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin yhdisteiden kanssa 48 tunnin ajan. (B) Triflorcas estetty kiinnittymisestä riippumatonta kasvua H1437 ja GTL-16-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (n = 3). SU11274, crizotinib, ja PHA665752 heikentynyt in vitro kasvainten synnyssä on GTL-16, mutta ei H1437 soluja. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. ** P 0,01; *** P 0,001; Student-

t

testiä.

Triflorcas häiritsee Met-fosforylaation, jossa Met lokalisointi, ja PI3K-Akt Pathway Activation

Olemme aiemmin osoittaneet, että Triflorcas häiritsee jossa Met fosforylaation elävissä soluissa ja Met aktivaation in vitro [19]. Siksi tutkittiin vaikutuksia Triflorcas on Met H1437 soluissa seuraamalla Met fosforylaation kahteen tyrosiinitähdettä sijaitsee sen kinaasidomeenista, Tyr

1234 ja Tyr

1235. Immunosytokemiallisessa analyysi paljasti, Met-fosforylaation pääasiassa solukalvon kun H1437-solut altistettiin HGF stimulaation (kuvio 2A). Erityisesti olemme havainneet, että Triflorcas johtaa muutoksiin fosforyloidun Met: a) alas-säätely sen fosforylaation tasoja ja b) hallitseva lokalisointiin solunsisäisiin osastoihin (kuvio 2A). Hoidon klooripromatsiini, kationista amfipaattista lääke, joka estää clathrin endosytoosin avulla, palauttaa fosfo-Met lokalisointi solu- kalvo, mikä osoittaa, että Triflorcas parantaa Met sisäistämisen (kuvio 2A) Alennettu Met-fosforylaation havaittiin myös proteiinin teissa H1437-solujen mukana vähennetään Met-proteiinin tasoja (kuvio 2B). Densitometri-analyysi osoitti, että Met alassäätöä endosytoosin aiheuttaa väheneminen Metin fosforylaatiota (tuloksia ei ole esitetty). Johdonmukaisesti löydettiin vähentynyt fosforylaatio Gab1, joka on välittömästi signalointi kohde Met (kuvio 2B).

(A) Met-fosforylaatiota analysoitiin immuno- sytokemian on H1437-solut käsittelemättömiä, käsiteltiin HGF, jossa Triflorcas (TFC; 10 uM 24 tuntia) tai Triflorcas (10 uM 24 tuntia) plus klooripromatsiini (kloori; 10 ug /ml 2 tunnin ajan) ja sen jälkeen HGF stimulaatio (20 ng /ml 30 minuutin ajan). Triflorcas vähensivät Metin fosforylaation aiheuttamien HGF. Huomaa myös, että HGF-indusoitua fosfo-Met on paikallistaa solukalvon ohjaus soluja, kun taas se vaikuttaa sisäistetään altistuneiden solujen Triflorcas. Endosytoosin inhibitiovyöhykkeet klooripromatsiini lääkkeen palautettu fosfo-Met lokalisointi on solukalvon. Nuolet osoittavat klusterin fosforyloidun Met solukalvon (40X suurennos). (B) HGF-indusoidun (20 ng /ml) fosforylaation tasoja Met, Gab1, Akt, ja p70

S6K vähenivät H1437 altistuneiden solujen Triflorcas. Sen sijaan, mitään muutoksia ei havaittu ERK fosforylaation tasolla. Samanlaisia ​​ekspressiotasot yhteensä Gab1, Akt, ja p70

S6K todettiin myös, mikä osoittaa, että Triflorcas häiritsi niiden fosforylaatiota sijaan niiden ekspressiotasot. Western blot analyysit suoritettiin kokonaisproteiinin lysaatit. (C) fosforylaatio tasot Akt, p70

S6K, ja S6 ribosomaalinen proteiini, mutta ei ERK: t, vähenivät GTL-16-solut altistettiin Triflorcas. Aktiini tai Tubulin proteiinin tasot käytettiin lastaus valvonta kaikissa kokeissa (alempi paneelit B ja C). (D ja E) ankkurointi-riippumaton kasvu H1437 (D) ja GTL-16 (E) solujen heikentynyt läsnä Triflorcas (TFC), LY294002 (PI3K-estäjä) tai A443654 (Akt-estäjä). Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. ** P 0,01; *** P 0,001; Student-

t

testiä.

biologinen vaikutus Triflorcas soluihin kuljettaa Met mutaatioita ja Met vahvistusta (kuvio 1) [19], johti meidät arvioimaan fosforylaation asema RTK loppupään efektorit. Niistä reittejä vaaditaan syöpäsolujen onkogeenisella Met, on osoitettu, että vain osa Met-aktivoituvien reittien ylläpitää riippuvuutta syövän solujen Met. Erityisesti Ras /ERK: t ja PI3K /Akt kaksi polkuja, jotka pääasiallisesti varmistaa riippuvuus kasvaimia synnyttävän Met [22]. Siksi tutkimme, Triflorcas rajoittaa aktivoinnin näiden kahden reitin seuraamalla fosforylaation taso ERK: t ja Akt in H1437 soluissa. Ei merkittäviä muutoksia havaittiin HGF-indusoitua ERK-fosforylaation, kun H1437-solut altistettiin Triflorcas (kuvio 2B). Sen sijaan, Akt-fosforylaation merkittävästi vähentää, kun Triflorcas hoidon (kuvio 2B). Alennettu fosfo-Akt rinnastettiin pienentynyttä fosforylaation tasojen sen loppupään signaali p70

S6K (kuvio 2B). Johdonmukaisesti, vähentää fosforylaation tasoja Akt ja sen loppupään signaalit p70

S6K ja S6 ribosomaalinen proteiini, mutta ei ERK: t, havaittiin myös GTL-16-soluissa (kuvio 2C). Varmistimme toiminnallinen merkitys ehjä PI3K /Akt signalointi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua H1437 ja GTL-16-solujen farmakologisesti estämällä sen aktivointi LY294002 (PI3K-estäjä) tai A-443654 (Akt-inhibiittori) (kuvio 2D, E, S1A, ja 1B). Väheneminen Akt-fosforylaation jälkeen Triflorcas hoidon havaittiin myös, että erbb1-addiktoitunut ihmisen rintasyövän BT474-solut, joissa erbb1 fosforylaatio pysyivät ennallaan (kuvio S1C) [19]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että vähentäminen PI3K /Akt-reitin aktivaatio Triflorcas ei ole pelkästään seurausta eston ylävirran RTK toimintaa. Olemme myös havainneet, että Akt-aktiivisuutta ei tarvita eloonjäämisen BT474-solujen (kuvio S1D). Nämä tulokset tarjoavat oivalluksia BT474 solun resistentiksi Triflorcas hoitoon näyttämällä, että niiden riippuvuus kasvaimia erbb1 varmistetaan polku (t) muu kuin PI3K /Akt. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että antituumorivaikutus aikaansaamaa Triflorcas tapahtuu yhdistetyn lopputuloksista selvä efektoreja mukana RTK-ajettu onkogeenisiä riippuvuutta.

Triflorcas heikentää in vivo kasvaimen kasvu ihmisen syöpäsoluja kantaminen Met Mutaatio, ilman aiheuttaen merkittäviä sivuvaikutuksia

Olemme raportoi äskettäin, että Triflorcas sietävät hyvin ensisijainen neuronit ja maksasoluissa [19]. Arvioida edelleen mahdollista terapeuttista soveltamista tätä yhdistettä, arvioimme, onko se myös hyvin siedetty in vivo annon jälkeen. Triflorcas oli intraperitoneaalisesti injektoidaan hiiriin annoksella 30 mg.kg

-1 joka päivä. Koska paino on yleinen indikaattori eläinten fysiologiasta vaikutteita, esimerkiksi aineenvaihdunnan, eläinten toimintaa, ja ruokinta käyttäytyminen, painon Triflorcas käsiteltyjen hiirten seurattiin ajan kuluessa. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu vastaan ​​kontrollit ja koko hoidon ajan (

P

0,05, kuvio 3A). Meillä on myös mitattu paino sydämen, pernan, munuaisten ja maksan hoidetuista hiiristä 21 päivän ajan, ja ei havaittu mitään eroja näiden kahden ryhmän välillä (

P

0,05; kuvio 3B).

(A) Evolution kehon painoa hiirillä, käsiteltiin intraperitoneaalisesti joko vehikkelillä tai Triflorcas (TFC; 30 mg.kg

-1 päivittäin) ei osoittanut mitään merkittäviä eroja. Kehon paino ilmaistaan ​​paino evoluution yli 21 päivän hoitojakson aikana. (B) paino sydän, perna, munuainen ja maksa tutkittiin hiirillä päivittäin ruiskutetaan Triflorcas (30 mg.kg

-1) tai ajoneuvon 21 päivää. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m.

P

0,05. (C ja D) Triflorcas hoitoon (i.p. 30 ja 60 mg.kg

-1 joka toinen päivä) vähensi kasvainten tilavuuden (C) ja painon (D) nude-hiirissä, joihin injektoitiin subkutaanisesti kanssa H1437-soluja. Crizotinib (50 mg.kg

-1 vuorokaudessa) ei heikennä kasvaimen kasvua. Arvot ilmoitetaan boxplots ja ilmaistiin keskiarvoina ± s.e.m. *

P

0,05; Student-

t

testiä.

Osoitimme aikaisemmin, että Triflorcas saa aikaan kasvaimen kasvun inhibition GTL-16-solujen in vivo (kuvio S2) [19]. Siksi määrittää, onko antitumor toimintaa Triflorcas havaittu in vitro H1437 soluja voidaan myös osoittaa in vivo käyttäen ksenosiirrettyjä nude-hiirissä. H1437-solut (5 x 10

6) olivat ihon alle ruiskutetaan nude-hiiriin. Sen jälkeen, kun kasvaimen muodostumista, hiiriä käsiteltiin Triflorcas, crizotinib, tai pelkästään vehikkeliä, ja kasvaimen kasvu tutkittiin aikana ja sen jälkeen. Erityisesti olemme löytäneet 58,7% ja 59% vähennys kasvaimen kun Triflorcas annettiin annoksella 30 mg.kg

-1 tai 60 mg.kg

-1 joka toinen päivä, vastaavasti (kontrolli: 82,4 mm

3 ± 78,2; 30 mg.kg

-1 Triflorcas injektio: 34,0 ± 24,5;

P

= 0,04; 60 mg.kg

-1 Triflorcas injektio: 33,8 ± 24,2;

P

= 0,04; kuvio 3C). Vähentäminen kasvaimen painon havaittiin myös Triflorcas saaneilla hiirillä (kontrolli: 147,1 mg ± 92,5; 30 mg.kg

-1 Triflorcas injektio: 79,1 ± 58,1,

P

= 0,03; 60 mg. kg

-1 Triflorcas injektio: 62,0 ± 38,9,

P

= 0,01, kuvio 3D). Sen sijaan, ei vähentynyt tuumorin kasvun havaittiin hiirissä, joita käsiteltiin crizotinib annoksilla 50 mg.kg

-1 joka päivä (kasvaimen tilavuus: 118,6 mm

3 ± 69,4, kasvaimen koko: 205,0 mg ± 84,8; Kuva 3C ja D), yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [21]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että in vivo Triflorcas aikaansaa tuumorin kasvun inhibition syöpäsolujen onkogeenisella Met. Lisäksi sivuvaikutusten puuttuminen osoittaa, että Triflorcas on hyvin siedetty, kun injektoidaan hiiriin annoksilla tarvitaan saamaan aikaan sen antituumorivaikutuksia.

Minor Muutokset geeniekspressioprofiili Stressin ja myrkyllisyys väylät Triflorcas korreloivat Lack Toxic Effects in vivo

Koska Triflorcas on hyvin siedetty sekä in vitro [19] ja in vivo (kuvio 3A ja B), me seuraavaksi seurasi geeniekspressiotasot ihmisen RT-PCR array keskittynyt myrkyllisyyttä ja stressiä reittejä. Ilmaisu profiilia 84 liittyvistä geeneistä solujen stressiä ja myrkyllisyyttä analysoitiin GTL-16-solut altistettiin Triflorcas, SU11274 tai ajoneuvo. SU11274 muuttunut ilmentyminen 39 geenien vähintään 2-kertainen (lisäämällä tai vähentämällä niitä;

P

0,05). Nämä geenit kuuluvat apoptoosin /nekroosi (n = 10), tulehdus (n = 7), oksidatiivisen /metabolisen stressin (n = 7), lämpösokkiproteiinin (n = 6), proliferaation /karsinogeneesi (n = 5), ja kasvu pidätyksen /vanhenemista reitit (n = 4, kuvio 4A ja taulukko S1). Sen sijaan, Triflorcas johti tilastollisesti merkittävän muutoksen ilmentymistä vain 14-geenien (

P

0,05). Niistä 13 geenit päällekkäin ne muuttunut SU11274, ja kuului apoptoosin /nekroosin (n = 3), oksidatiivisen /metabolisen stressin (n = 3), ja kasvun pysähtymisen /Vanheneminen (n = 3, kuvio 4A ja taulukko S1) . Ei merkittävää laskua geenin ilmentymisen yli 50% verrattuna kontrolliin soluja voitiin havaita. Geenit osoittaa yli 2-kertainen ilmaisun tasoja

tnf

(3,83-kertainen;

P

= 0,0008),

gdf15

(3,18-kertainen;

P

= 0,0007),

egr1

(2,68-kertainen;

P

= 0,003), ja

serpine1

(2,42-kertainen;

P

= 0,005). Kiehtovan, Triflorcas johti vankka ja hallitseva ajan sääntely sytokromioksidaasi

CYP1A1

geeni (611-kertainen;

P

= 0,0001, kuvio 4A). Ilmentäminen

CYP1A1

geeni lisäsivät myös SU11274, mutta huomattavasti alemman tason (22-kertainen;

P

= 0.02; kuvio 4A). CYP1A1 on jäsen CYP1 perheen sytokromi P450 osallisena syöpäsolujen vastauksena terapeuttisia aineita. Western blot-analyysi vahvisti ylössäätöä CYP1A1 proteiinin Triflorcas, joka heikensi sen estäjä acacetin (kuva 4B) [23]. CYP1A1 ylössäätöä by Triflorcas oli riippumaton sen vaikutuksesta Met jollainen löytyy myös soluissa, kuten ihmisen rintasyövän BT474-solut (kuvio 4C), jotka ovat riippuvaisia ​​erbb1 signalointi. Yhdessä nämä tutkimukset korostavat selektiivinen aineenvaihdunnan aktiivisuutta profiilin aikaansaama Triflorcas liittyvät säätely ylöspäin pienessä määrässä stressiä ja myrkyllisyyden geenejä. Täten minimaalinen määrä geenejä vaikuttaa Triflorcas osoittaa, että tämä yhdiste saa aikaan enemmän selektiivinen vaikutus stressiin ja myrkyllisyyttä geenejä verrattuna muihin Met syöpälääkkeiden kuten SU11274.

(A) Ilmaus profiilia 84 liittyvistä geeneistä solujen stressiä ja myrkyllisyyttä analysoitiin GTL-16-soluissa. Soluja käsiteltiin joko Triflorcas (mustat pylväät, 3 uM) tai SU11274 (har- maat pylväät; 1 uM) 24 tunnin ajan, ja geenin ilmentyminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Geenejä ryhmitelty vastaa oksidatiivisen /metabolisen stressin lämpösokkipromoottoreita, leviämisen /Karsinogeneesin kasvun pysähtymisen /Vanheneminen, tulehdus, ja apoptoosin /nekroosin signalointi. Vain tilastollisesti merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen on merkitty (

P

0,05). Triflorcas muuttunut ilmentyminen vain 14 geenien verrattuna muuttumiseen 39 geenien aiheuttama SU11274 hoitoa. On huomattava, että ilmaus

CYP1A1

nousi 611-kertaiseksi, kun läsnä on Triflorcas. (B) Western blot -analyysi, joka esittää säätely ylöspäin CYP1A1-proteiinin tasot, jotka oli altistettu Triflorcas (3 tai 10 uM). Acacetin (ACA; 10 uM) käsittely esti CYP1A1 ylössäätöä by Triflorcas (TFC). (C) CYP1A1 ylössäätöä by Triflorcas esiintynyt myös erbb1-riippuvainen syöpä BT474 soluja. Gefitinibi (GEF; 10 uM) ja SU11274 (SU; 2 uM) käytettiin kontrolleina.

Triflorcas mekanismit Drug Action ja sen vaikutukset solusyklin etenemisen Johtavat mitoottisiin jättäminen

vaikutukset Triflorcas on PI3K-Akt-reitin osoituksena biokemiallisista tutkimuksista (kuvio 2B ja C) viittaavat siihen, että Triflorcas syövän vastaisia ​​ominaisuuksia voi liittyä toimintansa erillisiä signalointi tavoitteiden lisäksi Met. Eräs seulontaan yleisesti käytetään kohteiden tunnistamiseen tietyn kemiallisen aineen on KINOME

scan

, jonka avulla arvioidaan yhdisteiden aktiivisuus vastaan ​​paneelin kinaasien kautta sitoutumismääritykset [24]. Triflorcas seulottiin vastaan ​​98 kinaasien yhdellä pitoisuudella 10 uM, kanssa vakioprotokollia. Kuitenkin alhainen liukoisuus Triflorcas puskuriin käytetyt olosuhteet tämäntyyppisen näytön rajoitettu mahdollisuus tunnistaa kohdennettuja kinaasien. Olemme kuitenkin havainneet, että Triflorcas vähentää yli 30% sitoutumis- vakio vain 5 yli 98-kinaasien analysoitiin: Abl-1 (joko villityypin tai E255K ja T315I mutanttimuotojen), IKK-beta, JAK2, MKNK1, ja ZAP70 (kuvio 5 ja taulukko S2). Vaikka kuvio kinaasien vuorovaikutuksessa Triflorcas näyttää erittäin keskittynyt, nämä tulokset on otettava huomioon, että osa tavoitteita mahdollisesti ei havaittu vähäisen liukoisuuden Triflorcas puskuriin olosuhteita käytettiin tämän näytön. Esimerkiksi Met ei tunnistettu, vaikka Triflorcas Estoaktiivisuus aiemmin vahvistettu käyttäen Kinexus yhdistettä profilointi palvelu [19].

Yhdiste seulottiin vastaan ​​KINOME

scan

(http: //www.kinomescan.com) paneeli 98 kinaasien. (A) Taulukossa on esitetty kinaasien jolle Triflorcas vähensi yli 30% sitova vakiona. Ligandia sitovan kutakin kinaasia (% valvonta ehto) on merkitty. (B) TREEspot kuvan 98 kinaasien seulottiin asemaan Triflorcas tavoitteet: Abl villityyppinen, Abl E255K ja Abl T315I mutantti muotoja, IKK-beeta, JAK2, MKNK1, ja ZAP70. Täydellinen aineisto on esitetty taulukossa S2. TK: tyrosiinikinaasin; TKL: tyrosiinikinaasin kuten; STE: STE kinaasi; CK1: cell kinase1; AGC: PKA, PKC, PKG kinaasien; CaMK: kalsium kalmoduliinista säännelty kinaasi; CMGC: CDK, MAP, GSK, CDK-kuin kinaasi.

Siksi lisätutkimuksia mekanismia lääkeaineen vaikutuksen Triflorcas, haimme soluun perustuva määritys, joka mahdollistaa arvioida aineen vaikutuksista useita onkogeeninen signalointireittien viljelyolosuhteissa yhteensopiva Triflorcas liukoisuus ja biologinen aktiivisuus. Fosforylointireaktio tasot useita signaloinnin molekyylien vuoksi tutkittiin käyttämällä Kinexus fosforyloidun proteiinin näyttö array. Erityisesti, vertasimme fosforylaation tasoja 44 signaloinnin fosfo-epitooppien in GTL-16-soluissa, joita käsiteltiin tai ei ole Triflorcas (kuvio 6, S3, ja taulukko S3). Vastaa meidän biokemiallisista tutkimuksista, olemme huomanneet, että fosforyloitumisaste useiden komponenttien PI3K /Akt-reitillä on muutettu altistuneiden solujen Triflorcas. Erityisesti vähennettävä fosforylaatio tasot havaittiin Akt1, mTOR /FRAP, p70

S6Kb1, ja S6 ribosomaalinen proteiini (kuvio 6A ja B, punaiset ympyrät). Kiinnostavaa, olemme huomanneet, että Triflorcas merkittävästi muuttaa fosforylaation tilan kaksi proteiinia: fosforylaation Rb eri Ser /Thr-ryhmään väheni (kuvio 6A ja B, sininen ympyrät); fosforylaatio nucleophosmin /B23, eli nucleolar proteiini todettiin olevan huomattavasti runsaasti kasvaimissa [25], lisättiin (kuva 6A ja B, vihreä ympyrä). Western blot-analyysi vahvisti muutoksia fosforyloitumisaste Rb ja nucleophosmin /B23-proteiinien jälkeen Triflorcas hoidon (kuvio 6C).

(A) fosforylaatio tila useita solukierron proteiinit analysoitiin käyttämällä fosfo-array KPSS 10,1 (Kinexus bioinformatiikan). GTL-16-soluja käsiteltiin vehikkelillä (kontrolli) tai Triflorcas (TFC, 3 uM) 72 tunnin ajan (vasen ja oikea paneeli, vastaavasti). Punaiset ympyrät korostavat aineosien Akt /mTOR /S6 kautta. Vihreä ja sininen ympyrä surround nucleophosmin /B23 ja Rb fosfo-epitooppeja, vastaavasti. (B) Kaavio näyttää suhde fosforylaation tasojen osoitettu proteiinien soluissa käsittelemättömän verrattuna niihin altistuvat Triflorcas. (C) fosforylaatio tasot nucleophosmin /B23 Ser

4 ja Rb S

780 lisättiin ja vähentynyt, vastaavasti, GTL-16-solut altistettiin Triflorcas (TFC, 3 uM 24 tuntia).

Koska sekä Rb ja nucleophosmin /B23 ovat keskeisiä säätelijöitä solusyklin etenemisen, me seuraavaksi arvioitava, ovatko kyseiset muutokset fosforyloitumisaste olivat rinnastettavissa muuttaminen solusyklin. Solut värjättiin propidiumjodidilla ja niiden jakautuminen eri solusyklivaiheista arvioitiin virtaussytometrianalyysillä. Hoitamaton GTL-16-solut lisääntyvät, mikä vahvistetaan virtaussytometrialla kuvio (kuvio 7A ja tietoja ei ole esitetty). Triflorcas hoito muuttaa GTL-16 solukierron jakelu, jossa lisäystä G0 /G1 solupopulaation kustannuksella S ja G2 /M väestöstä (kuvio 7A ja tuloksia ei esitetty). Kontrolleina, hoito GTL-16-soluja joko SU11274 tai nocodazol johti tukos osaksi G0 /G1 tai G2 /M-vaiheessa, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty). Siten Triflorcas vaikuttaa solusyklin etenemistä GTL-16-soluissa. Morfologinen analyysi altistettujen solujen Triflorcas kasvoi merkittävästi määrän monitumaisia ​​soluja, mikä osoittaa, mitoottisia vajaatoiminta (kuvio 7B ja C). Sen sijaan ei ole mitoosi vika havaittiin soluissa, joita käsiteltiin SU11274, crizotinib tai PHA665752 (kuvio 7C). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että antituumorivaikutus aikaansaamaa Triflorcas saattaa osittain selittää fosforylaatiota muutosten erillisen viestinnän tavoitteet, kuten osat PI3K /Akt-reitin, Rb, ja nucleophosmin /B23, joka korreloi muutoksia solusyklin etenemisen ja mitoottisten epäonnistumisen.

(A) Kaavio, jossa esitetään suhde prosentteina GTL-16-solujen in G0 /G1 faasin solujen prosenttiosuus S + G2 /M-vaiheessa. Soluja käsiteltiin Triflorcas (TFC, 3 uM), tai vehikkeliä (LASK) 48 tunnin ajan, sitten värjättiin propidiumjodidilla. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. *** P 0,001; Student-

t

testi (n = 3). Prosenttiosuudet solut G0 /G1, S ja G2 /M-vaihetta on esitetty taulukossa. (B) GTL-16-soluja kasvatettiin, kun läsnä on Triflorcas tai ajoneuvon ja tumat visualisoitiin käyttäen DAPI-värjäyksellä. Nuolet osoittavat esimerkiksi solujen useita ytimiä (40X suurennos). (C) kvantifiointi solujen mitoosi vika ilmaistaan ​​prosenttiosuutena solujen lukumäärä analysoitiin. Triflorcas (TFC, 3 tai 10 uM), mutta ei SU11274 (SU; 1 uM), crizotinib (crizo; 1 uM), tai PHA665752 (PHA; 1 uM) johti merkittävään lisääntymiseen solujen mitoottisten vajaatoiminta. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. *** P 0,001; Student-

t

testiä.

Triflorcas heikentää Survival ja Anchorage riippumaton kasvu ihmisen syöpäsoluja Ominaista RTK vaihtaminen

Yksi merkittävä rajoitus molekyyli hoitojen avulla aineita kohdistaminen erillistä RTK: t on lääkeresistenssi mekanismi, joka voi olla joko konstitutiivista tai hankittu hoidon jälkeen. Tässä yhteydessä on osoitettu, että Met, ErbBs, ja PDGFRs voi vastavuoroisesti korvata toisiaan aktiivisuuden säilyttämiseksi RTK-ajettu onkogeenisen reittejä [9], [26] – [29].