Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on tuhoisa sairaus rajoitettu hoitovaihtoehtoja. Koska sen varhainen metastaattisen luonne ja nopea kasvu, kirurginen resektio on harvinaista. Standard hoidon hoito-ohjelmat pysyvät pääosin ennallaan 1980-luvulta lähtien, ja viiden vuoden eloonjääminen viipyy lähellä 5%. Potilaasta johdettujen ksenografti (PDX) mallit on vahvistettu muissa elimissä, voimistamalla materiaalia tutkimukseen ja palvelevat malleina prekliinisen kokeiluihin; kuitenkin rajallinen saatavuus ensisijainen kudos on rajoitettu kehitys näissä mallien SCLC. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli luoda PDX malleja yleisesti kerätään ohuella neulalla aspiroi koepaloja ensisijainen SCLC kasvaimia, ja arvioida niiden käyttökelpoisuus tutkimusmalleja ensiarvoisen SCLC kasvaimia. Nämä transbronchial neula aspiraatteja tehokkaasti Siirto tehty niin ksenograftit, ja kasvain histomorphology oli samanlainen ensisijainen kasvaimia. Tuloksena kasvaimia tunnettu lisäksi H Hyväksytty: 23 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Anderson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: WCA, jA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, ja SJD ovat työntekijöitä Stem CentRx, Inc., biotekniikan yritys keskittyy terapeuttinen kohdentaminen Cancer Stem Cells. Rahoittaja antoi tukea muodossa palkkojen tekijöille WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, ja SJD, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, ja SJD ovat osakkaina Stem CentRx, Inc ., yksityisomistuksessa oleva ja rahoittaa yritys. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa tietojen jakamiseen ja materiaalien

Johdanto

keuhkosyöpätapauksista suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Näistä pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) on korkein kuolleisuus, osuus ~ 15% keuhkosyöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Viiden vuoden elossaololuku SCLC potilaille jää lähes 5%, ja suurin sortuminen tauti vuoden kuluessa diagnoosin. SCLC on erittäin metastaattinen ja etenee nopeasti. Kirurginen resektio ei paranna eloonjäämistä, ja sen vuoksi on harvoin määrätty. Siten kemoterapian edelleen ensimmäinen rivi hoidon [2].

Yleisimmin kemoterapeuttisten hoito-SCLC on Sisplatiini ja Etoposidi (P /E), koska se on ollut yli kolmen vuosikymmenen ajan [2]. Tämä hoito kasvatti merkittävästi ensimmäisen vastauksen useimmilla potilailla, usein vähentää kasvaimia havaittavissa tasolle. Valitettavasti kasvaimet lähes aina uusiutua pian hoidon lopettamisen jälkeen. Toistuva kasvaimet ovat yleensä aggressiivisempia ja kestävät myöhemmin yritetty hidastaa kasvaimen kasvua käyttämällä P /E tai muuta hyväksyttyä solunsalpaajahoitojen, kuten topotekaani [3-5]. Vuonna vielä vähemmän onnekkaita potilaille, ensimmäinen rivi P /E hoito tuottaa osittain vastaus, kiihdyttää tarvetta toisen linjan hoito, kun siedetty. Vaikka nykyinen solunsalpaajahoitojen pidentää elinaikaa SCLC potilaille (versus ei käsittelyä), hyödyt ovat rajallisia, ja 5 vuoden pysyvyys vaikutus on vähäpätöinen. Yksi selitys merkityksetön edistystä keksimiseen ja kehittämiseen uusien terapeuttisten jotka vaikuttavat SCLC elossaololuku on puute sopiva kasvaimen malleja, joilla tutkia tautia. Oikea mallien pitäisi mahdollistaa prekliininen arviointi tutkittavien terapioiden, morfologisesti muistuttavat potilaan kasvaimia, ja vastata samalla tavalla standardin solunsalpaajahoitojen

in vivo

.

Patient johdettuja ksenografti (PDX) malleja, jotka generoidaan juuri resektoitiin kasvainkudoksen istutettu, kasvanut, ja yksinomaan kuljetettiin vakavasti immunosuppressoiduilla hiirillä, yhä enemmän tuotetaan ja käytetään tutkia ihmisen tuumoribiologiassa [6-8]. Nämä mallit säilyttää merkittäviä yhtäläisyyksiä potilaan kasvaimia, josta ne tuotetaan. PDX kasvainmuodoista syntyvät eri muissa elimissä yleensä säilyttävät herkkyys profiilin mukaisen hoidon kemoterapiaa vasteita havaittiin kliinisesti. Lisäksi helpotetaan kasvua ihmisen kasvaimista

ex vivo

tutkimuksessa PDX kasvaimia myös fysiologisesti relevantti malleja, joilla tutkitaan tuumoribiologiassa ja arvioida prekliinistä tehoa terapeuttisten aineiden

in vivo

. PDX kasvainmuodoista voi myös olla kylmäsäilytetyt ja tutkittu perusteellisesti ajan kuluessa ilman laajaa johtamisella, estää kielteiset tulokset pitkittynyt

in vitro

kulttuuriin, kuten genomisen muutokset, jotka vaivaavat sekä solulinjoja ja niiden tuloksena perinteisen solulinja ksenografteja [ ,,,0],9, 10].

Koska SCLC harvoin kirurgisesti poistettu, tutkimus tässä indikaatiossa ei ole hyötynyt saatavuutta PDX kasvainmuotoja syntyvät asemointia, vaikka jotkut SCLC PDX mallit eivät ole [10-13]. Pääsy ensisijainen SCLC kasvain materiaali on pääosin rajoitettu diagnostinen ohuella neulalla pyrkimykset, joita yleisesti pidetään liian pieni helpottamiseksi siirteen toimiminen. Leong et ai. ovat osoittaneet, että nämä ohuella neulalla pyrkimykset voivat tuottaa PDX kasvaimet morfologisesti ja geneettisesti samanlainen yhteensopivien primaarikasvainten [11]. Nämä ohuella neulalla pyrkimykset ovat usein kerätään klinikoilla ja sairaaloissa ilman paikan päällä pääsyä immuunipuutteisilla eläimille tai infrastruktuuria tuottaa uusia PDX linjat. Tässä osoitamme, että yksittäinen, ensisijainen SCLC hieno neula pyrkimys yksilöitä, ottanut keruuta seuraavan diagnostisten näytteiden ja kuljetetaan yön aikana yhteistyötä tutkimuslaitos, pystyvät tehokkaasti luomaan PDX kasvaimia morfologisesti samanlaisia ​​primaarikasvaimen, josta ne ovat peräisin. Lisäksi osoitamme, että

in vivo

kemiallis-vaste näistä PDX kasvainten hoitoon yhdistettynä P /E on yleisesti konservoitunut primäärikasvaimissa niiden vastaavat PDX hiirissä. Tämä työ osoittaa, että tutkijat ja kliinikot, työskentely yhteistyönä jopa pitkiäkin matkoja, voi nopeasti ja tehokkaasti luoda suuria kokoelmia PDX kasvaimen rivit runsaasti saatavilla ohuella neulalla aspiraatteja SCLC. Konservoituneisiin histomorphology ja kyky vastata tavanomaista hoitoa solunsalpaajahoitojen nämä erinomaiset malleja, joilla voidaan paremmin tutkia SCLC tuumoribiologiassa, ja helpottaa löytämisestä ja kehittämisestä hoitomuotoja, jotka parantavat potilaan selviytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

tutkimus hyväksynyt Carilion Clinic Institutional Review Board. Kaikki 12 potilasta, joilla pienisoluinen keuhkosyöpä antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen ennen tutkimukseen osallistuneiden. Näytteet ottanut endobronkiaalinen ultraääni-ohjattu transbronchial neula toive (EBUS-TBNA), joko keskitetysti primäärikasvain tai epäillään solmukohtien osallistuminen. Lavastus Luokitus vastaa sekä Veterans Administration Lung tutkimusryhmän ja International Association for Study of Lung Cancer pysähdyspaikan järjestelmiä [14, 15]. Suorituskyky tila määritettiin aikaan alustavan diagnoosin [16] .Patients tarjottiin tavanomaista hoitoa hoidon ja tulosten mittaamisen seurattiin.

EBUS-TBNA

Kaikki toimenpiteet suoritettiin alle syvä sedaatio käyttämällä joustavan ultraääni bronkoskoopin (CP-EBUS XBF-UC260F, Olympus, Tokio, Japani) [17] ja 21G Vizashot neula. Vähintään 6 transbronchial neulabiopsiaan otettiin jokaisessa epäillään kasvain tai solmukohtien asemalle. Alkuperäinen Näytteet käsitellään standardin institutionaalisten tavalla, jossa valmistelu dioja nopeasti paikan päällä Sytologisten tulkinta, sekä kerätä materiaalia rakentaa solun lohko viivästyneen patologisen arvioinnin. Viimeinen näyte kerätään erotettiin jääkylmään HypoThermasol-FRS (Sigma, St. Louis, MO) kanssa 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää määrän vähintään 10 kertaa suurempi kuin tilavuus, kudoksen, ja kuljetetaan yli yön, Stemcentrx, Inc. istutettavaksi 30 tunnin koepala.

Kliininen hoito SCLC luovuttajan potilaiden jälkeisen koepala

kahdeksan kahdestatoista potilaita, joilta kasvain näytteet otettiin biopsiat saivat laskimoon 60-80 mg /m

2 Sisplatiini päivänä 1 plus 80-120 mg /m

2 Etoposidi päivinä 1-3 jokaisessa 21-28 päivää, joiden ennakointi on vähintään neljä kierrosta hoidon. Molempia hoitoja tarvitaan nesteytyksestä ja hallinnon antiemeettisten huumeita. Jos valkosolujen määrä laski alle 2,000 mm

3, tai neutrofiiliarvot laskivat alle 1000 mm kohden

3, rekombinantti ihmisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä annettiin kunnes leukosyytti- ja /tai neutrofiiliarvot palautettiin. Annosmuutokset tehtiin perustuen tunnistamiseen solunsalpaajahoitoon liittynyt toksisuudet. Kolme potilasta jättäytynyt hoitoa. Yksi potilas katosi seurannasta ja siten niiden hoitojakso on tuntematon.

seuraavat kriteerit arviointiin käytettiin potilaan vastauksia tavanomaista hoitoa hoidon Sisplatiini ja Etoposidi (P /E). Radiologinen kuvantaminen, joko tietokonetomografia Rinta tai positroniemissiotomografia, käytettiin määrittämään vastaus standardihoitoa hoitoa. Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) käytettiin luokan kasvaimen vasteaika: Täydellinen vaste (CR): katoaminen kaikkien tavoite vaurioita. Osittainen vaste (PR): Ainakin 30%: n lasku summasta pisin halkaisija (LD) kohde- vaurioita ottaen vertailukohdaksi lähtötilanteessa summa LD. Vakaa tauti (SD): Kumpikaan riittävä kutistuminen saada PR eikä riittävää lisäystä saada Etenevä sairaus (PD), siten, että viitteenä pienimmän summan LD sillä hoito aloitettiin. PD: vähintään 20% lisäys summa LD kohde vaurioita, kun vertailukohdaksi pienimmän summan LD kirjattu koska hoidon aloittamista tai ulkonäkö yhden tai useamman uuden vaurioiden [18]. Kaiken Survival (OS) määriteltiin väli alustavan diagnoosin ja potilaan kuoleman mitataan viikoissa.

PDX sukupolven

Tutkimus hyväksyi Stemcentrx Institutional Animal Care ja Käytä komitea (Protocols SCAR -3-2008 ja SCAR-5-2008). Hiiren tutkimukset suoritettiin mukaisesti American Association for Laboratory Animal Science. Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluraanianestesiassa, ja yritettiin vähentää eläinten kärsimystä. Hiiret lopetettiin käytetään puristettua CO

2 kaasu, mukaan viimeisimmät AVMA suuntaviivat Eutanasia. Saatuaan by Stemcentrx, kukin SCLC Tuumorinäytteiden yksilö pelletoitiin valo sentrifugoimalla (50 RCF 5 minuuttia), suspendoitiin uudelleen 100-150μL Medium-199 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) ja sekoitetaan samaan tilavuuteen Matrigel (BD Biosciences, Milpitas, CA). Sitten 100 ui liuosta injektoitiin ihonalaisesti alapuolelle utarerasvaa tyynyt 8-10 viikkoa vanha nainen NOD /SCID-vastaanottaja-hiirissä. Hiiren terveys, paino, ja kasvaimen tilavuus (s) arvioitiin ainakin viikoittain. Kun kasvain tilavuudet mitataan 800-1,500 mm

3, saajat inhimillisesti eutanasia ja kasvaimet resektoitiin.

eteneminen ja analysointi PDX kasvainten

Juuri resektoitiin kasvainten hajotettiin yhteen soluun suspension kuten aiemmin on kuvattu [19, 20]. Kunkin kanavan kasvaimen etenemisen, ihmisen epiteelin peräisin varmistettiin positiivista värjäytymistä virtaussytometrialla käyttäen anti-ihmisen EpCAM (klooni 9C4), ja negatiivinen värjäys anti-ihmis-CD45 (klooni HI30), anti-hiiri-CD45 (klooni 30-F11 ), ja anti-hiiri-H-2K

d (Clone SF1.1) vasta-aineiden (kaikki BioLegend, San Diego, CA). Kaikki virtaussytometrillä vasta-aineita käytettiin lopullisessa konsentraatiossa 10 ug /ml. Levittämään PDX kasvaimet Dissosioidut solut suspendoitiin 1: 1 tilavuudesta Matrigel pitoisuudella 50000 solua 100 ui lopputilavuudessa injektiokohtaa kohti. Solut istutettiin bilateraalisesti alapuolelle utarerasvaa tyynyille käyttäen 27G neulaa ja kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain.

Aika taudin etenemiseen (TTP) määriteltiin väli hoitovasteita ja tunnistaminen etenevä sairaus, jonka RECIST mitattuna viikkoja. Mittaamiseen potilaasta johdettujen vierassiirrettä tuumorivasteita standardin hoidon sisplatiinihoidolle ja Etoposide, seuraavat kriteerit käytettiin: kaksinkertaistaminen Time määriteltiin keskimääräinen ajanjakso jossa kasvaimen tilavuus kaksinkertaistui (päivää); Nopeus kasvaimen kasvua seurattiin, lasketaan kaavalla d

DBL = (d

id

f) /log

2 (v

iv

f) ja keskiarvot kaikki kasvaimet samalla alueella 150mm

3-1200mm

3; Prosenttiosuus tuumorikasvun inhibitio (% TGI) laskettiin keskimääräinen tilavuus chemo-käsiteltyjen kasvainten jaettuna keskimääräinen tilavuus vehikkelillä käsiteltyjen kasvainten 21 päivän kuluttua hoidon aloittamisesta.

Ensisijainen SCLC koepaloja ja PDX kasvaimet olivat formaliini kiinteiden ja parafiiniin (FFPE), ja tasomaisia ​​osia kudospaloista leikattiin ja kiinnitettiin lasisten objektilaseille. IHC, ksyleeni de-paraffinized kudosleikkeet esikäsiteltiin antigeenin Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA), blokattiin 10% aasi seerumissa 3% BSA: lla PBS-puskurissa, ja inkuboitiin sitten primaarisen vasta-aineen. Primaaristen vasta-aineiden olivat seuraavat: synaptofysiinin (1: 200, Clone SP11, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), kromograniini A (0,2 ug /ml; Clone SP12, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), ja CD56 (0,2 ug /ml; Clone EP2567Y; Origene, Rockville, MD), keratiini 5 (1,4 ug /ml; Clone SP178, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), keratiini 6 (0,15 ug /ml; Clone SP87, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), keratiini 7 (0,7 ug /ml; Clone SP52, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), keratiinin 14 (1 ug /ml; Clone LL002, Abcam, Cambridge, MA), keratiinin 20 (01:50, Clone SPM140, Abcam, Cambridge , MA), TTF1 (Clone 8G7G3 /1, Biocare Medical, Concord, CA), TP63 (0,125 ug /ml; Clone 4A4, Biocare Medical, Concord, CA), napsiini A (Clone TMU-Ad02, Biocare Medical, Concord, CA). Leikkeitä inkuboitiin biotiini-konjugoitu, lajikohtaisia ​​sekundaarisia vasta-aineita (Immuno- research, West Grove, PA), jota seurasi inkubointi streptavidiini-HRP: tä (ABC Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Kromogeeninen tunnistus on kehitetty 3, 3′-diaminobenzadine (Thermo Scientific, Rockford, IL) ja kudosten vastavärjättiin hematoksyliinillä ja kuvattiin valomikroskoopilla kanssa 40X suurennoksella.

IHC värjäys, seuraavat negatiivisen kontrollin vasta-aineiden ja positiivinen kontrolli kudoksia käytettiin. CHga: Mouse IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) ja normaalin ihmisen haimassa. Synaptofysiinin: Rabbit IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen haima. CD56: Rabbit IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen haima. Keratiini 5: Rabbit IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen eturauhasen. Keratiini 6: Kani IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen eturauhasen. Keratiini 7: Kani IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen eturauhasen. Keratiini 14: Hiiren IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) ja normaalin ihmisen ihon. Keratiini 20: Hiiren IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, CA) ja normaalin ihmisen paksusuolen. Näpsiini V: Kani IgG (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) ja normaalin ihmisen keuhkoissa. P63: Mouse IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, CA) ja normaalin ihmisen eturauhasen. TTF-1: Mouse IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) ja normaalin ihmisen keuhkojen.

Tulokset

turvallisuus vähän invasiivisia näytteenottotekniikka

Kustakin 12 suostuu SCLC potilaalla, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen, yksi ylimääräinen neulabiopsian näyte kerättiin EBUS-TBNA varten yritetään aloittaa ksenograftikasvaimissa. Näiden solujen aspirate näytteet peräisin joko primaarinen keuhko- kasvainten, tai mukana solmujen eri potilailla keskimäärin 62 vuotta vanha (taulukko 1). Kymmenen näistä kahdestatoista kasvainten diagnosoitiin metastaattinen (

i

.

e

. Laaja tauti) ja näiden kahden näytteet kerättiin mukana imusolmukkeet. Potilaille ei haittavaikutuksia johtuvia ylimääräisiä biopsia näytteen keräämistä.

PDX kasvaimen sukupolvi ja luonnehdinta

Talteen näytteet toimitetaan yön jään Carilion Clinic Hospital Roanoke, Virginia että Stemcentrx San Franciscossa, Kaliforniassa. 30 tunnin kuluessa koepala, soluja pyrkimys näytteet ihon alle istutettiin immuunipuolustus NOD /SCID saajahiiret ja seurattiin kasvaimen kasvua jopa 32 viikkoa. Kun yksittäinen solu aspiraatista näytteessä ei ehkä täysin vastaa solujen monimuotoisuus potilaan kasvain, perusteellisempi ja edustavan näytteenoton saman potilaan kasvain olisi tarpeettomasti suurentunut potilaille. 26 viikon kuluttua implantaatiosta, 8 12 (67%) potilaan näytteistä tuotettu vahvisti SCLC kasvaimia, jossa saavutettiin keskimäärin 150 mm

3 vaihtelevat 81-151 päivää siirron jälkeen. Helpottaakseen sekä välittömiä ja tulevien tutkimusten tuloksena ”passage 1” (P1) kasvaimet kiinnitettiin formaliiniin, tai erottaa yksisolususpensioi- välittömästi leviäminen uusiin saajahiiret edelleen fenotyyppiset ja /tai geneettinen karakterisointi, tai kylmäsäilytys. Niistä 4 SCLC potilaan näytteitä, jotka eivät johda käyttökelpoinen SCLC PDX tuumorilinjoja, kolme ei ollut aloittanut kasvaimia (LU108, LU112, LU125) ja yksi (LU122) koostui seuraus ihmisen B-solulymfooma. Varmistaakseen uskollinen eteneminen saastumatonta kasvaimia, SNP sormenjälkien määritys suoritettiin ensisijaisesti kasvainsoluihin ja PDX solut kussakin kulkua. Nämä tulokset vahvistavat, että jokainen PDX kasvain on ainutlaatuinen ja johdettu sen sukulais primaarikasvaimen.

SCLC kasvaimet ovat selvä morfologia ominaista tasaisuutta solujen, ydin- laudaksi, ja harva solulimassa [21]. Useimmissa tapauksissa nämä ominaisuudet voidaan selvästi erottaa SCLC Eri muodot ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). SCLC kasvaimet ovat vaihteleva morfologia, jotka vaihtelevat korkea cellularity vähäisten kasvainsoluihin keskellä strooman ja nekroottista kudosta. Kuitenkin tunnusmerkki kaura solumorfologia, ydin- laudaksi, ja niukka sytoplasma voidaan helposti vahvistetaan PDX kasvain näytteissä (kuvio 1A ja 1B, S1 ja S2 kuviot). Sytologinen leviää solujen aspiraateissa potilaasta kasvaimia ja FFPE osastoja täsmäsi PDX kasvaimista värjättiin Kwik-JM tahra. Morfologiset samankaltaisuuksia ei havaittu ensisijaisen ja ksenograftikasvaimissa (S5 kuvio). Vaikka sytologinen leviää solusta aspirates huonosti säilyttää kasvainkudoksen organisaatio, solu morfologit ovat samankaltaisia.

FFPE osat valmistettiin PDX kasvaimista (LU086p1 on edustettuna). (A) Kudosleikkeet värjättiin IHC diagnostisiin SCLC markkereita Kromagraniini A (cHga), synaptofysiinin (SYP), tai CD56. Mittaviivat edustaa 10um. (B) Kudosleikkeet värjättiin IHC diagnostisiin kuin SCLC markkereita Keratin 5 (KRT5), Keratin 6 (KRT6A), keratiini 7 (KRT7), keratiini 14 (KRT14), keratiini 20 (KRT20), napsiini A (Näpsä) , TP63, tai TTF1. Mittaviivat edustaa 10um. (C) PDX kasvainsoluja hajotettiin yksisoluiset suspensiot ja analysoitiin virtaussytometrialla ilmentämiseen EpCAM (CD326) ja NCAM1 (CD56). Histogrammit näytetään ekspressiotasot esitetään (tumma musta viiva), kun taas tausta signaali määritettiin käyttäen sovitetun isotyypin kontrollivasta-aineen (täytetty harmaa).

vahvistavat SCLC identiteetit, kasvaimet arvioitiin niiden ilmentymistä useita tunnusmerkki proteiineja käytetään yleisesti vahvistaa diagnoosin. Ensinnäkin FFPE kudososat PDX kasvaimista värjättiin IHC positiivisen SCLC diagnostinen antigeenejä Kromograniini-A, synaptofysiinin, ja CD56 (kuvio 1A ja S1 kuviossa). Edelleen, PDX kudosleikkeiden yleensä ei ilmaista antigeenejä ominaisuus ei-pienisoluisen keuhkosyövässä, kuten keratiini 5, keratiini 6, keratiini 7, keratiini 14, keratiini 20, TTF1, TP63, ja napsiini A (kuvio 1 B ja S2 kuvassa). Positiivinen värjäys Keratiini 5, keratiini 6, keratiini 14 tai TP63 voi ilmoittaa okasolusyöpää keuhkojen. Positiivinen värjäys Keratiini 7, TTF1 tai napsiini A voi ilmoittaa keuhkoadenokarsinooma. Keratiini 20 ilmaistaan ​​yleensä syövät ruoansulatuskanavassa ja sen negatiivinen ilmaus voidaan jättää syövät nonpulmonary alkuperää. Vain 3 8 SCLC PDX tässä tutkimuksessa olivat positiivisia TTF-1 ilme. Vaikka TTF-1 ilmentymisen SCLC on yleinen, se on ensisijaisesti käytetään tunnistamaan keuhkojen adenokarsinooma ja positiivinen värjäytyminen on todennäköisesti vaikuttavat vasta-klooni. Lopuksi, kasvaimet hajotettiin ja yksisoluiset suspensiot ja ominaista virtaussytometrialla tarkistaa niiden ihmisen epiteelin alkuperä (

i

.

e

. Ihmisen EpCAM +) ja vahvista CD56 ilmaisu (kuvio 1C ja S3 Kuva). Edustavia IHC ja virtaussytometria kuvat on esitetty LU086 kuvassa 1 ja yhteenveto IHC värjäytymisen kaikkien testattujen PDX linjat on esitetty taulukossa 2.

PDX kasvaimet, me myös suorittaa kohdennettua resequencing onkogeenien (S1 taulukko). TP53 on yleisimmin mutatoitunut geeni SCLC, vaikuttaa noin 3 4 kasvaimia. Löysimme TP53 mutaatioita 6 8 kasvaimia. RB1 on mutatoitunut noin puolet SCLC ja löysimme RB1 mutaatiot 3 meidän 8 testattujen SCLC PDX kasvaimia. Nämä mutaatio taajuudet ovat yhdenmukaisia ​​raportoitu taajuuksia SCLC.

Yhteenvetona SCLC PDX kasvaimet säilyttävät silmiinpistävä yhdennäköisyys heidän ensisijainen SCLC kasvaimia vaikka sille on aloitettu hyvin vähän materiaalia. Lisäksi tehokkuus, jolla PDX kasvaimia voidaan muodostaa käyttäen neulabiopsiaan materiaalia viittaa siihen, että kasvaimen ylläpitävät solun (TPC;

i

.

e

. Syöpä kantasolujen) taajuus on suhteellisen korkea, mikä voidaan oletaa aggressiivisuus ja tulenkestävä luonne SCLC.

PDX kasvaimen vaste P /E ilmentää kliinisen vasteen

Voit selvittää SCLC PDX kasvaimet, perustettiin tässä kuvatulla tavalla säilyttää P /E reagointiominaisuudet havaittu potilailla, joilta PDX kasvaimia kertyi, PDX kasvaimet olivat altistuneet yhdistettiin P /E-ohjelmissa on lähellä suurinta siedettyä annosta joka rinnastaa samanlaisiin annoksia hoito käytetään potilailla (

i

.

e

. 5 mg /kg sisplatiini 24 mg /kg Etoposide, mikä vastaa noin 20 mg /m

2 Sisplatiini ja 94 mg /m

2 Etoposide). Ihon alle istuttaminen SCLC PDX kasvainsolujen ja satunnaistamista kohortteja 5-8 hiirtä ryhmää kohden kerran kasvaimet saavuttivat 150 mm

3-200 mm

3, hiiret annosteltiin päivänä satunnaistamisen 5 mg /kg sisplatiini ja 8 mg /kg Etoposide, ja jälleen on seuraavat kaksi päivää lisäksi 8 mg /kg Etoposide joka päivä. Ikäluokat väliainetta saaneen annettiin 0,9% NaCl samassa määriä käytettiin annostelemaan hiiriä P /E. Useimmat SCLC PDX kasvaimia vastasi tämän yhden aikana P /E kemoterapiaa, jolloin keskimääräinen kasvaimen kasvun inhibitio 79 ± 17% versus vehikkelillä käsitellyillä hiirillä (taulukko 3). Huolimatta vankka vastaus useimmat PDX kasvaimia, kuten havaitaan ihmisillä oli muuttumaton kasvaimen uusiutumisen, havaitaan yleensä 3 viikon kuluessa satunnaistamisen (17 ± 10 vuorokautta; n = 8), jossa kaikki SCLC PDX kasvaimet toistuvia enintään 5 viikon. Esimerkiksi LU073 PDX kasvaimet vastannut hyvin P /E, joka osoittaa 82% kasvaimen kasvun esto ja 35 päivää (

i

.

e

. 5 viikkoa) aika taudin etenemiseen (kuvio 2A ja taulukko 3), kun taas potilas, jolta LU073 PDX kasvaimia perustettiin näytteillä 31 viikkoa aika taudin etenemiseen klinikalle jälkeen koko hoidon (taulukko 1). Sitä vastoin LU086 PDX kasvain malli aloitetaan laaja vaiheessa potilas ei reagoi hyvin kliinisen hoito P /E (kliininen TTP = 7 viikkoa) oli minimaalisesti reagoi hoidon P /E (41% TGI TTP = 0; kuvio 2B). Yhteenvetona, valtaosa perustettu SCLC PDX kasvainmuodoista osoitti tuumorivasteita jotka korreloivat TTP mittarit havaittu kliinisesti (kuvio 2C; n = 5; R-neliö = 0,77;

P

-arvo = 0,050). Yksinäinen harha tästä kehityksestä oli PDX LU064 (kuvio 2C; harmaa avoin ympyrä). Yleinen välistä yhdenmukaisuutta ensisijainen potilaan kasvaimen ja PDX kasvaimen vaste P /E

in vivo

tukee johtopäätöstä, että SCLC PDX kasvaimia aloitetaan kasvainbiopsioissa heijastaa potilaan tuumoribiologiassa ja toimivat erinomainen malleja, joilla paremmin tutkia ja ymmärtää tämä aggressiivinen maligniteetti.

Kun saavutetaan keskimääräinen kasvaimen 150-200 mm

3, hiirillä, joilla on A) LU073p2 tai B) LU086p3 PDX kasvaimia satunnaistettiin, annettiin joko vehikkeliä (suljetut kolmiot) tai P /E (avoimet ympyrät, 5 mg /kg sisplatiinia päivänä 1 ja 8 mg /kg Etoposide päivinä 1, 2 3 hoidon), ja kasvaimet mitattiin viikoittain. Kiinnike osoittaa aika taudin etenemiseen (TTP). C) keskimääräinen TTP PDX kasvainten seuraamalla yhtä aikana P /E hoidon funktiona havaitun kliinisen TTP. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM ja heijastaa kohortteja n = 5 hiirtä ryhmässä.

Keskustelu

Pieni keuhkosyöpä on erittäin tappava tauti, jota vastaan ​​pikku on edistytty vuosikymmeniin. Osittain edistymisen puutetta on jäljitettävissä vähäisyys saatavilla erittäin tärkeitä kasvainmuodosta tutkimukseen, jotka johtuvat koettu niukkuus ensisijaisen kudoksen joihin voitaisiin potilaasta johdettujen ksenograftikasvaimissa hiirillä. SCLC rutiininomaisesti diagnosoitu keräämällä koepalojen mukaan TBNA. Kynnyksellä EBUS ohjausta helpottaa turvallisempaa, helpompaa ja tarkempaa koepaloja, joiden lisääntynyt saatavuus tätä materiaalia tutkimustarkoituksiin. Tässä osoitamme, että pienet kudosnäytteitä nämä koepaloja ovat tarpeeksi tehokkaasti ympätä ja luoda ksenograftin kasvainlinjojen hiirillä pienellä riskillä luovuttajalle potilaille. Nämä PDX kasvaimet voidaan tuottaa kaukainen yhteistyökumppanit ja niiden terapeuttisen vaikutuksen matkivat niitä niiden Hyväksytty primaarikasvaimia.

tehokkuus toimivasti siirtyviä Primaarikasvaimen yksilöt immuunipuutteisilla hiirillä vaikuttavat monet tekijät, kuten kudosalkuperää, elinkelpoisuutta, kasvain tyyppi, näyttämö ja aggressiivisuus, vastaanottaja hiirikanta ja muut tekniset ja ympäristötekijät [6-8]. Esimerkiksi ensisijainen rinta- kasvaimia on raportoitu ympätä kuten ksenografteissa 12,5% hyötysuhde, kun taas NSCLC ksenografteissa ovat raportoineet siirteen tehokkuutta jopa 90% [22-24]. Tässä osoitamme, että SCLC ksenograftikasvaimissa voidaan laatia korkea hyötysuhde, ylläpitää vanhempien kasvain histomorphology ja pitkälti toistavat vanhempien tuumorivaste P /E kemoterapiaa.

Vaikka SCLC PDX tuumorilinjoja on luotu ja kuvattu aiemmin [9-13], käytettävissä olevien SCLC PDX kasvainmuodoista yhä äärimmäisen rajoitettu, ja koko sukupolvi näiden mallien ei pyritty vuoksi katsottu kykenevän aloittamaan ksenograftien alkaen neulabiopsian materiaalista. Tässä tutkimuksessa pieni yhteistyönä peräisin yhdellä klinikalla tuotettu 8 onnistunut SCLC PDX kasvainlinjojen vain 19 kuukautta ilman vaatimusta paikallisten pääsyä heikentynyt immuunivaste eläimille. Todellakin, yön toimitus SCLC ohuella neulalla aspiroi yksilöitä näytti olleen vähäinen vaikutus kasvaimen siirteen toimiminen tehokkuuteen, vaikka vielä parempaa siirteen tehokkuutta voitaisiin odottaa kanssa samana päivänä ksenotransplantaatio. Ihmeellinen menestys Tämän tutkimuksen, nopeasti luoda suuri kokoelma SCLC PDX kasvaimen linjat monipuolisista luovuttajan käyttävistä potilaista EBUS-TBNA yksilöitä, osoittaa, että tämä lähestymistapa voidaan onnistuneesti toteuttaa.

Koska PDX kasvain mallit olivat syntyy yhdestä neulabiopsian joko ensisijaisena tai solmukohtien sivustoja, on mahdollista, että tuloksena PDX rivit eivät sisällä täydellistä klonaalinen heterogeenisyys läsnä potilailla. Kuitenkin 5 6 (83%) PDX radoille, joista sekä kliinisen ja PDX vaste datan P /E hoito-ohjelmat olivat tiedossa oli korreloivat vastaukset

in vivo

. Konkordanssi Tämän tiedot viittaavat siihen, että joko harvat kloonit olivat läsnä SCLC potilailla aikaan koepalan tai yksittäisen koepala pass saattoi saada ja antaa esitys kloonien läsnä. Yksinäinen poikkeus tähän havainto oli, LU064, joka näytti olevan heikentynyt vaste P /E hiirillä versus vankka vaste havaittiin potilaalla, josta se on peräisin. Tämä ristiriita voi johtua siitä, että aggressiivisemman subklooni perustettiin hiirillä tai muita mutaatioita on voinut aiheutua istutuksen jälkeen.

SCLC kasvainmuodoista jotka kuvaavat ihmisen sairauksia on ollut vaikea löytää. Perinteiset solulinjat rutiininomaisesti kasvatetaan ja tutkitaan käytettäessä

in vitro

ympäristössä; kuitenkin, nämä rivit ovat monipuolinen peruuttamaton eroavaisuuksia verrattuna kasvaimiin kuin ne ovat potilailla [9, 25-27]. Yllättäen monet yleisimmin käytetty solulinjoja, joilla tutkia SCLC tuumoribiologiassa kertyi yli 30 vuotta sitten [28], joilla on huomattava genomista poikkeavuuksia todennäköisesti liittyy vuosikymmenten

in vitro

kulttuurin ei- fysiologiset olosuhteet [29]. Daniel

et al

. viime aikoina osoittaneet, että jopa lyhyiksi jaksoiksi

in vitro

kulttuuri peruuttamattomasti muuttaa geeniekspressiota SCLC kasvainsoluissa [9], mikä solulinjat laajasti laajentunut

in vitro

eivät todennäköisesti asianmukaisesti vastaamaan vanhempien kasvain.